專利名稱：具有引起細胞程序性死亡的特征的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的具有引起髓系細胞程序性死亡(Apoptosis)的特征，并可做為藥物用于治療髓細胞性白血病的單克隆抗體及其片段，以及與之相關(guān)的，產(chǎn)生此單克隆抗體的雜交瘤。
由于本發(fā)明提供的單克隆抗體可作為抗體特異性地識別引起髓系細胞程序性死亡的抗原，并具有引起髓系細胞程序性死亡的特性，因此，可利用這一特性將其做為藥物用于髓細胞性白血病的治療領(lǐng)域。
以前，粒細胞集落刺激因子，例如，基因重組粒細胞集落刺激因子(rG—CSF)被認為是主要作為體液因子，刺激粒細胞分化和增生。已有報導(dǎo)在小鼠體內(nèi)實驗中給予rG—CSF，可增強骨髓的造血功能，并可通過脾臟內(nèi)造血干細胞及各種成血前細胞的增生，顯著地引起脾內(nèi)的髓外造血。這種脾內(nèi)髓外造血的機制被認為是由于rG—CSF的刺激，改變了脾內(nèi)的造血微環(huán)境，從而增強了造血潛能而引起的血生成過程。
由此，本發(fā)明人注意到通過向脾基質(zhì)細胞給予rG—CSF的闡明脾內(nèi)造血潛能和向小鼠脾給予rG—CSF建立造血基質(zhì)細胞系(CF—1細胞)以分析基質(zhì)細胞在rG—CSF作用下造血潛能增強程度，以及觀察這種潛能在造血基質(zhì)細胞造血中的作用效果，實驗結(jié)果是認識到體外的集落刺激活動和體內(nèi)造血干細胞的支持性潛能?！睟lood，80，1914(1992)〕。
但是，雖然已由一些脾基質(zhì)細胞建立起細胞系(CF—1細胞)，并已由此對其細胞學(xué)特點進行考察，但迄今為止，尚未制備出識別其細胞表面抗原的特定抗體，對其特性所知甚少。
因此，本發(fā)明人以上述有關(guān)脾基質(zhì)細胞的資料和研究成果為基礎(chǔ)，致力于潛心研究一種可識別脾基質(zhì)細胞的特定抗體，并以脾基質(zhì)細胞系作為致敏抗原，通過免疫法制備單克隆抗體，從而獲得了新的、未報導(dǎo)過的單克隆抗體。
對所獲得的單克隆抗體的性質(zhì)進行檢測的結(jié)果，本發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)該單克隆抗體具有引起髓系細胞程序性死亡的性質(zhì)，從而完成本發(fā)明。
本發(fā)明的目的是提供一種新的具有引起髓系細胞程度性死亡的性質(zhì)，并可作為藥物用于髓細胞性白血病的單克隆抗體及其片段，以及產(chǎn)生此單克隆抗體的雜交瘤。
本發(fā)明的單克隆抗體可極其有效的作為抗體來識別引起髓系細胞程序性死亡〔apoptosis，也稱細胞自滅，是一種核染色質(zhì)DNA以核小體為單位被消化，造成細胞死亡的現(xiàn)象〕的抗原或具有引起髓系細胞程序性死亡的功能。一般而言，髓系細胞包括除淋巴細胞以外的細胞，如中性粒細胞、巨核細胞、成髓細胞、髓細胞、肥大細胞、巨噬細胞、單核細胞和成紅細胞。本發(fā)明所提及的髓系細胞的含義與上述相同。迄今為止，尚無具有引起髓系細胞程序性死亡性質(zhì)的單克隆抗體，因此本發(fā)明提供的單克隆抗體定義為包括所有具有引起髓系細胞程序性死亡的性質(zhì)的單克隆抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體的基本制備方法如下述。
即，如本發(fā)明的單克隆抗體的制備方法可以是使用從給予過rG—CSF的動物體內(nèi)提取的脾基質(zhì)細胞，用常規(guī)的免疫法對其進行免疫，利用常規(guī)細胞融合的方法對致免疫的細胞進行細胞融合，并利用常規(guī)克隆法使融合細胞克隆化。
本發(fā)明的單克隆抗體的制備方法更可取的范例是用CF—1細胞系為抗原〔Blood，Vol.80，1914(1992)〕，本發(fā)明人利用給予了rG—CSF的動物的脾基質(zhì)細胞建立了人工培養(yǎng)細胞系，對以哺乳動物如小鼠的骨髓瘤細胞為抗原而致免疫的漿細胞(免疫細胞)進行融合，使得到的融合細胞(雜交瘤)克隆化，從中選取可產(chǎn)生識別上述細胞系的本發(fā)明抗體的克隆并進行培養(yǎng)，以重新獲得目的抗體。然而這種方法僅是一個示例，例如在這種情況下，不僅上述CF—1細胞系，而且從按照CF—1細胞系的方式得到的從人類脾基質(zhì)細胞中獲取的細胞系均可作為適當?shù)闹旅艨乖?，以制備與上述CF—1細胞系相同方式結(jié)合人類髓系靶細胞的抗體。
制備這種單克隆抗體的方法中，用上述抗原進行免疫的哺乳動物并無特別的限制。更值得考慮的是選擇適宜用于細胞融合的骨髓瘤細胞，一般可選用的適宜動物有小鼠、大鼠及倉鼠。
免疫按常規(guī)的方法施行，例如給哺乳動物腹腔注射脾基質(zhì)細胞，如上述的CF—1細胞。更具體的說是將一份免疫細胞稀釋或懸浮于適量PBS或等張生理鹽水，每月分數(shù)次給予動物。作為免疫細胞，最好使用在最后一次給予上述細胞系后摘出的脾細胞。
當哺乳動物的骨髓瘤細胞作為異源細胞與上述免疫細胞融合，可形成多種已知的細胞系，其中包括P3(P3×63Ag8.653)〔J.Im-munol.，123，1548(1978)〕，P3—U1〔Current Topics in Micro—bi-ology and Immunology，81，1-7(1978)〕，NS-1〔Eur.J.Im-munol.，6，511—519(1976)〕，MPC—11〔Cell，8，405—415(1976)〕，SP2/0—Ag14〔Nature276，269—270(1978)〕，F(xiàn)O〔J.Immunol.Meth.，35，1—21(1980)〕，S194〔J.Exp Med.，148，313—323(1978)〕和R210〔Nature，277，131—133(1979)〕。
上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合可按照常規(guī)的基本方法施行，如Milstein el al法〔Mechods Enzymol.，73，3—46(1981)〕。
更具體的說，上述細胞融合過程可在有融合促進劑存在的普通營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行。作為融合促進劑的有聚乙二醇(PEG)和仙臺病毒(HVJ)，此外，視需要適當加入佐劑如二甲亞砜可增強融合效果。考慮免疫細胞和骨髓瘤細胞的比例，前者的數(shù)量為后者的1—10倍為宜。用于上述細胞融合的培養(yǎng)基，包括適于上述骨髓瘤細胞增生的RPMI—1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基以及其它常用于培養(yǎng)此類細胞的培養(yǎng)基，另外可同時使用血清補液如新生小牛血清(FBS)。
細胞融合的操作是將規(guī)定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養(yǎng)基中充分混合，將預(yù)熱至37℃的PEG溶液加入培養(yǎng)基，PEG的平均分子量為1,000—6,000，通常添加的濃度為約30—60％(W/V)，混合之。然后，依次重復(fù)加入適宜培養(yǎng)基的操作，將反應(yīng)混合物離心并棄去上清液，即形成所需的雜交瘤。
使該雜交瘤通過接種于普通的選擇培養(yǎng)基進行篩選，如HAT培養(yǎng)基(含有附加成分次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基)。在HAT培養(yǎng)基中持續(xù)培養(yǎng)足夠的時間，以使所需雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)死亡，一般為幾天至幾周。然后，按常規(guī)的極限稀釋分析法對產(chǎn)生目的抗體的雜交瘤進行篩選和單克隆化。制備如此制得的產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的雜交瘤，可在普通培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)或在液氮中保存較長時間。
從雜交瘤中收集本發(fā)明的單克隆抗體時，可采用以常規(guī)法培養(yǎng)雜交瘤并從上清液獲得抗體的方法，或采用給適宜的哺乳動物注入雜交瘤使之增生并從動物腹水中獲取抗體的方法。前一種獲取抗體的方法適于獲得高純度的抗體，有一種方法適于獲取大量抗體。
另外，通過上述方法獲得的抗體，可采用常規(guī)提純法如鹽析法、凝膠過濾、親合色譜法進一步純化。
本發(fā)明的單克隆抗體可以是具有后文實施例中所述的固有特性，即具有引起髓系細胞程序性死亡特性的任意一種抗體，只要具有這種特性不論其抗原種類如何均包括在本發(fā)明范圍。利用此特性，本發(fā)明的單克隆抗體可作為藥物用于治療髓細胞性白血病。
不必說，利用本發(fā)明的單克隆抗體建立識別引起髓系細胞程序性死亡的特異性體系或利用其特殊性質(zhì)將其作為藥物用于髓細胞性白血病治療的具體系統(tǒng)的構(gòu)成，以及其改進和應(yīng)用，只要將其用常規(guī)法付以實踐對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說也顯然屬于本發(fā)明的范圍。
以下說明附圖。


圖1表示免疫熒光法分析(CF—1細胞，無抗體存在的對照組)。
圖2表示免疫熒光法分析的GSPST—1抗體與CF—1細胞結(jié)合特征。
圖3表示免疫熒光法分析的BMAPT—1抗體與CF—1細胞結(jié)合特征。
圖4表示免疫熒光法分析(骨髓細胞，無抗體存在的對照組)。
圖5表示免疫熒光法分析的GSPST—1抗體與骨髓細胞結(jié)合特性。
圖6表示免疫熒光法分析的BMAP—1抗體與骨髓細胞結(jié)合特性。
圖7表示免疫熒光法分析(NFS—60，無抗體存在的對照組)。
圖8表示免疫熒光法分析GSPST—1抗體與NFS—60細胞的結(jié)合特性。
圖9表示免疫熒光法分析(NFS—60，加入大鼠IgG1的對照組)。
圖10表示免疫熒光法分析的BMAP—1抗體與NFS—60細胞的結(jié)合特性。
圖11表示單克隆抗體(BMAP—1)對NFS—60細胞增殖抑制實驗。
圖12表示單克隆抗體(GSPST—1)對骨髓細胞移植抑制實驗。
圖13表示單克隆抗體(BMAP—1)對骨髓細胞移植抑制實驗。
圖14所示說明圖〔骨髓標本顯微鏡像照片(H.E染色)(×400)〕表示給予本發(fā)明的單克隆抗體BMAP—1經(jīng)6日后死亡的骨髓細胞(2)及無抗體存在(1)的對照組。
圖15所示說明圖(電泳色譜法的遷移照片)表示加入本發(fā)明單克隆抗體BMAP—1后觀察骨髓細胞DNA的梯狀結(jié)構(gòu)。
圖16表示TNFa對L929細胞的細胞毒實驗。
圖17表示單克隆抗體(BMAP—1)的細胞毒實驗。
圖18表示免疫熒光分析(BWV1，加入大鼠IgG2a的對照組)。
圖19表示免疫熒光法分析抗小鼠MHC—I抗原的抗體與BWV1細胞的結(jié)合特性。
圖20表示免疫熒光法分析(BWV1，加入大鼠IgG1的對照組)。
圖21表示免疫熒光法分析的BMAP—1抗體與BWV1細胞的結(jié)合特性。
符號說明a給予BMAP—1的小鼠胸腺的DNA(24小時)b給予BMAP—1的小鼠骨髓的DNA(24小時)c給予BMAP—1的小鼠骨髓的DNA(8小時)。
d給予BMAP—1的小鼠骨髓的DNA(4小時)。
e未處理的小鼠骨髓的DNA(骨髓細胞)。
f分子量標記接下來，根據(jù)參考例和實施例對本發(fā)明進一步具體說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。參考例脾基質(zhì)細胞系的建立及其性質(zhì)1)脾基質(zhì)細胞系的建立將rG—CSF以100μg/kg的劑量連續(xù)5日給予C57BL/6J小鼠，取初次培養(yǎng)的脾細胞建立脾基質(zhì)細胞系。即，給予rG—CSF后，在無菌條件下取其脾臟，在25cm2的塑料瓶(Corning Co.制)中培養(yǎng)6周。使用Isocove改良的Dulbeco培養(yǎng)基(JMDM)(Boehringer-Mannhcim Co.制)，加入10％熱滅活的新生小牛血清(FBS)(三光純藥社制、東京)、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，在37℃恒溫箱內(nèi)保持CO2濃度5％，每周兩次更換新鮮的培養(yǎng)基。
在融合培養(yǎng)中，粘附性細胞群(基質(zhì)細胞)通過加入含有0.05％胰蛋白酶加0.02％EDTA(SigmaChemical Co.制)的去Ca、Mg的PBS液從培養(yǎng)瓶中收獲，并移至新瓶中。此傳代過程每周約重復(fù)1—2次。在早期的傳代培養(yǎng)(1—10代)中，細胞分裂比率為1/4到1/8，之后的比率約為1/16到1/32。傳至約第10代以后，基質(zhì)細胞成為均一同種的纖維母細胞樣細胞。至第20代，以上述方法采集這些基質(zhì)細胞，并用極限稀釋法使細胞進一步克隆化；將細胞克隆化過程重復(fù)二次以建立基質(zhì)細胞系(CF—1細胞系)。
之后，這些細胞被保存在補加有10％熱滅活FBS、含5mlIMDM的25cm2瓶中(Corning Co.制)，每5天按1/32的細胞分裂比率傳代一次。脾基質(zhì)細胞系可由除小鼠外的其他哺乳動物建立，如通過與上述相同的方法，用SV—40腺病毒作媒介使細胞轉(zhuǎn)化可建立人類脾基質(zhì)細胞系?！睯.Cell.Physiol.，148，245(1991)〕。2)CF—1細胞的性質(zhì)以上述方法建立的CF—1細胞系采取標準細胞化學(xué)技術(shù)，以堿性磷酸酶、酸性磷酸酶，β-葡萄糖醛酸酶、α-萘基乙酸酯酶和油紅O檢驗。也可采用酶免疫組織化學(xué)的方法使用下列單克隆及多克隆抗體研究CF—1細胞的性質(zhì)macI(Sero Tec.制)；第VIII因子相關(guān)抗原(Dakopatts制)；和I型膠原、III型膠原及纖粘連蛋白(Chemicon International Inc.制)。吞噬作用可通過乳膠珠攝取實驗檢測(粒子直徑1.09μm；Sigma)。CF—1細胞的脂肪細胞轉(zhuǎn)化潛能測試，可在25cm2瓶中傳代培養(yǎng)后，與10-6mol/l的氫化可的松磷酸鹽(Sigma制)接觸培養(yǎng)四周觀察。
結(jié)果，CF—1細胞對堿性磷酸酶、第VIII因子相關(guān)抗原、mac—I和吞噬實驗呈陰性，而對I型膠原、III型膠原和纖粘連蛋白呈陽性。雖然CF—1細胞含有微量脂肪，但在存在10-6mol/l的氫化可的松的條件下傳代培養(yǎng)4周不能轉(zhuǎn)化為脂肪細胞。從這些資料看出，CF—1細胞不具有前脂肪細胞、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞的性質(zhì)，由此可見不同于上述細胞，CF—1細胞是從基質(zhì)細胞中提取得到的。3)CF—1細胞對造血干細胞的維持為了檢驗造血干細胞是否由CF—1細胞維持，采用Till和Mc-Culloch的技術(shù)施行CFU—S實驗(脾細胞集落形成實驗)。每群10只小鼠用900cGy(MBR—1520R；Hitachi制Tohyo)照射后，并靜脈內(nèi)注射骨髓單個核細胞(BM細胞)(1.0×105/頭，5.0×104/頭或2.5×104/頭)和CF-1細胞(1.0×105/頭，在第12天對脾內(nèi)形成的集落計數(shù)，即定為CFU—S集落(脾集落)。
結(jié)果，當將骨髓單個核細胞(BM細胞)和CF—1細胞移植入經(jīng)放射線照射的小鼠，與無CF—1細胞的小鼠相比，每一BM細胞群的脾集落數(shù)目顯著增加(在1.4—1.8倍之間)，且在移植后的第12天，同時移植有BM細胞和CF—1細胞的小鼠的存活率高于只注入BM細胞的小鼠，呈低死亡率。由此明顯看出CF—1細胞對造血干細胞的維持。
下面將對本發(fā)明的實施例作具體敘述。實施例單克隆抗體的制備1)抗原和免疫法以上述參考例中獲得的CF—1細胞為抗原進行免疫。細胞培養(yǎng)使用Isocove改良Dulbercco培養(yǎng)基(IMOH)(Bochringer—Mannheim Co.制)補加10％新生小牛血清(FBS；Sanko Junyaku制)，在37℃CO2濃度為5％的恒溫箱內(nèi)進行。
細胞用1mM EOTA/PBS處理，并用移液管移出培養(yǎng)瓶。將該細胞以細胞數(shù)約為1×107/ml懸浮于1mM EDTA/PBS中，給予Wister lmamich大鼠(7周齡，雌性；動物飼養(yǎng)研究實驗室)。初次免疫以細胞數(shù)約為1×107/ml的細胞懸液1ml對大鼠腹腔注射，1個月后以細胞數(shù)約為1×107/ml的細胞懸液1ml追加免疫。然后，間隔1個月以細胞數(shù)約為1×107/ml細胞懸液1ml追加免疫數(shù)次，直至致免疫大鼠的抗體與CF—1細胞的反應(yīng)性被確認，則以細胞數(shù)約為1×108/ml的細胞懸液1ml作最終免疫。最終免疫后第三天，將大鼠殺死取脾臟。2)細胞融合將取出的大鼠脾細胞切碎后，游離的脾細胞經(jīng)離心后懸浮于IMDM培養(yǎng)基(Boehringer—Mannheim Co.制)，并徹底洗凈。另一方面，通過在補加有10％新生小牛血清(FBS；三光純藥社制)的IMDM培養(yǎng)基(Boehringer—Mannheim Co.制)中培養(yǎng)小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0—Ag14〔Nature，276，269—270(1978)〕而獲得的細胞在上述培養(yǎng)基中以同樣的方法洗凈，將1×108個該細胞與2×108個上述脾細胞放入離心管混合，使用聚乙二醇4000(半井化學(xué)社制)按常規(guī)操作(Clin.Eox.Immunol.，42，458—462(1980))施行細胞融合。
然后，將獲得的融合細胞分配至含IMDM培養(yǎng)基并補加有20％FBS的96孔板，在CO2濃度5％，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。第二天，緩慢改用HAT選擇培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
培養(yǎng)開始后，每周兩次將上清液轉(zhuǎn)移至新的HAT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以維持細胞增生。
接著，用極限稀釋法按常規(guī)操作使獲得的融合細胞克隆化。即，利用上述融合細胞上清液中的抗體，檢驗其與抗原結(jié)合的性質(zhì)，從而采用極限稀釋法按常規(guī)操作將與抗原有強結(jié)合性的細胞系克隆出來。3)篩選融合細胞的篩選是采用間接熒光抗體技術(shù)用流式細胞計數(shù)(Flow Cytonretry)的方法進行。
以CF—1細胞作為靶細胞對產(chǎn)生目的抗體的克隆進行篩選。即，將懸浮于反應(yīng)緩沖液(PBS，加入2％FBS和0.02％NaN3)的細胞離心并以小丸狀回收，然后懸浮于100μl雜交瘤培養(yǎng)上清液(約1×106/100μl)在4℃反應(yīng)1小時。之后用上述緩沖液洗滌一次，加入FITC標記的羊抗大鼠IgG(Fc)抗體(Chemicon制)孵育1小時。洗滌一次，用流式細胞計數(shù)器(FACScan，Beclon Dickin—Son制)進行分析。4)抗體的提純按上述3)的方式篩選出的融合細胞，用常規(guī)方法培養(yǎng)，并用常規(guī)方法將其上清液中產(chǎn)生的抗體分離提純。
即，將從對上述致敏抗原高效價的孔中回收的雜交瘤分散在組織培養(yǎng)塑料皿(Corning Co.制中，在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)、增生，按常規(guī)方法純化以獲得單克隆抗體GSPST—1和BMAP—1。
GSPST—1，是通過將所得細胞腹腔注射給BALB/cAJc1—nu裸鼠(8周齡，雄性，日本Kurea制)。10—14天后回收所產(chǎn)生的腹水，用33％硫酸銨鹽析，用PBS透析。BMAP—1抗體，在補加10％FBS的Isowve改良MEM培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，取上清液濃縮，用33％硫酸銨鹽析，用PBS透析，用蛋白A配套柱(Amersham制)再次純化，用PBS透析。此外，上述實施例中記述的是將CF—1細胞作為抗原進行免疫的實例，但也有可能利用其它對造血干細胞具有支持潛能的基質(zhì)細胞的同樣的方法建立單克隆抗體，本發(fā)明并不僅限于上述單克隆抗體而是包括具有同樣性質(zhì)的所有單克隆抗體及所有產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。
本發(fā)明的產(chǎn)生單克隆抗體BMAP—1的雜交瘤是一種新的，以Wistar Imamich大鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞系SP2/0—Ag14為親代細胞的融合細胞，于1993年8月9日以BMAP—1(大鼠小鼠雜交瘤)為名按照國際認可的微生物委托布達佩斯條約，委托國際局，在日本工業(yè)科學(xué)技術(shù)院生命科學(xué)及人類技術(shù)研究所〔地址日本國茨城縣つくば市(郵編號305)〕辦理登記手續(xù)，登記號為FERM BP—4382。5)抗體的性質(zhì)(i)抗體的反應(yīng)性(對CF—1細胞的反應(yīng)性)免疫熒光法(Immunofluorescence analysis)檢測所獲得的單克隆抗體GSPST—1和BMAP—1對CF—1細胞的反應(yīng)性，結(jié)果見于圖1—圖3。這里，圖1顯示無抗體存在的對照組的分析結(jié)果，圖2顯示GSPST—1與CF—1細胞結(jié)合特性的分析結(jié)果，圖3顯示BMAP—1與CF—1細胞結(jié)合特性的分析結(jié)果。在圖中，縱軸表示相對細胞數(shù)，橫軸表示熒光強度。
從圖1—圖3中可明顯看出單克隆抗體GSPST—1和BMAP—1具有與CF—1細胞結(jié)合及識別CF—1細胞表面抗原的性質(zhì)。(對骨髓細胞的反應(yīng)性)接下來，使用流式細胞計數(shù)器(FACScan，Becton Dickinson制)檢測GSPST—1和BMAP—1對普通骨髓細胞的反應(yīng)性，結(jié)果見于圖4—圖6。這里，圖4顯示無抗體存在的對照組的分析結(jié)果，圖5顯示GSPST—1與骨髓細胞結(jié)合特性的分析結(jié)果，圖6顯示BMAP—1與骨髓細胞結(jié)合特性的分析結(jié)果。在圖中，縱軸表示相對細胞數(shù)，橫軸表示熒光強度。
從圖4—圖6中顯示GSPST—1完全沒有與骨髓細胞結(jié)合的性質(zhì)，而BMAP—1具有與所有骨髓細胞結(jié)合的性質(zhì)。(對髓細胞性白血病細胞系(NFS—60)的反應(yīng)性)使用流式細胞計數(shù)器(FACScan，Becton Dickinson制)檢測GSPST—1和BMAP—1對NFS—60細胞〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，6687—6691(1985)〕的反應(yīng)性，結(jié)果見于圖7—圖10。這里，圖7顯示無抗體存在的對照組的分析結(jié)果，圖8顯示GSPST—1與NFS—60細胞結(jié)合特性的分析結(jié)果，圖9顯示使用市售的大鼠IgG1(Zymed制)的對照組的分析結(jié)果，圖10顯示BMAP—1與NFS—60結(jié)合特性的分析結(jié)果。圖中，縱軸表示相對細胞數(shù)，橫軸表示熒光強度。
從圖7—圖10中顯示GSPST—1不與NFS—60細胞反應(yīng)，而BMAP—1具有與NFS—60細胞結(jié)合的性質(zhì)。(BMAP—1抑制NFS—60細胞增殖的實驗)在存在100ng/ml G—CSF和10-9M放線菌酮的條件下，按MTT實驗檢測BMAP—1與NFS—60細胞反應(yīng)的結(jié)果見于圖11。使用96孔培養(yǎng)板將濃度為0、10、100ng/ml及1、10、100μg/ml的BMAP—1溶液以10μl/孔加入4×103/孔/100μl的NFS—60細胞，兩日后用MTT法測量存活細胞數(shù)?？梢钥吹?，如圖11所示，NFS—60細胞的增生被BMAP—1顯著抑制。(ii)抗體的類型所獲得的單克隆抗體〔使用大鼠的單克隆抗體Ab—ID—Sphit(Zymed制)和生物素標記的小鼠抗大鼠IgG1抗體(Zymed制)〕，可見GSPST—1屬IgG2a，BMAP—1屬IgG1。(iii)對骨髓移植的抑制潛能下面用這些抗體進行骨髓移植抑制實驗以檢測其性質(zhì)。結(jié)果見于圖12和圖13，BMAP—1具有抑制骨髓移植的作用而GSPST—1沒有這種作用。上述結(jié)果的獲得是通過用致死量的放射線(900cGy)照射C57BL/6J小鼠，通過尾部靜脈給予1.0×105/頭的骨髓細胞及單克隆抗體，并對脾集落進行計數(shù)。需說明的是圖13中“未處理組”表示沒有給予骨髓細胞的情況。
如圖13中所示，進一步證實了BMAP—1在骨髓移植抑制試驗中，完全抑制移植，這是由于該單克隆抗體與骨髓細胞反應(yīng)造成其程序性死亡所致。因此，即，如果將產(chǎn)生BMAP—1的雜交瘤自腹腔給予裸鼠，當其腹水少量積存時，動物即刻死亡。另外，將BMAP—1的50μg頭靜脈內(nèi)給藥給予普通C57BL/6J小鼠，可見所有骨髓細胞消失，圖14中顯微照片說明靜脈內(nèi)給予BMAP—1第6日骨髓細胞消失的事實。從顯微照片中可見不僅淋巴細胞，而且中性粒細胞，巨核細胞、成髓細胞、髓細胞、肥大細胞、巨噬細胞、單核細胞及成紅細胞(也稱骨髓細胞)均消失。另外，將30μg/頭BMAP—1給予小鼠，對其骨髓細胞的DNA進行研究，結(jié)果如圖15所示梯形結(jié)構(gòu)明顯可見，這說明上述BMAP—1與骨髓細胞反應(yīng)引起程序性死亡。
用胃蛋白酶(Sigma制)消化BMAP—1抗體IgG的Fc段，用GPC柱純化F(ab′)2，以33.5μg/頭(相當于50μg/頭完整IgG)靜脈內(nèi)給予C57BL/6J小鼠，結(jié)果可見骨髓內(nèi)的骨髓細胞消失。基于上述事實，表明BMAP—1引起的骨髓細胞死亡，既無抗體依賴細胞的細胞毒作用，也無補體依賴細胞的細胞毒作用參予。
已報導(dǎo)的引起程序性死亡的抗原有細胞表面蛋白Fas抗原，該Fas抗原mRNA的表達已在胸腺、心臟、肝、肺和卵巢內(nèi)發(fā)現(xiàn)，但尚未在骨髓中檢測出其mRNA〔J.Immunol.，148，1274—1279(1992)〕，可見BMAP—1所識別的抗原不同于已知的Fas抗原。
此外，為澄清BMAP—1所識別的抗原是否是TNF的受體，使用L—929細胞與TNF反應(yīng)引起細胞死亡以研究BMAP—1的功能。按小鼠TNFa(Gen—zyme制)的最終濃度為0、1、10、100pg/ml，1、10、100ng/ml及1μg/ml，BMAP—1的最終濃度為0、10、100pg/ml，1、10、100ng/ml，及1，10μg/ml，在附加給予TNFa和BMAP—1的第二天用MTT法對存活的L929細胞數(shù)目進行測量。結(jié)果如圖16、圖17所示，TNFa使L—929細胞顯著減少，而BMAP—1對I—929細胞無作用。由此可見，BMAP—1所識別的抗原不是TNF的受體。
用流式細胞計數(shù)(FACScan，Becton Dickinson)檢測BMAP—1所識別的抗原是否是MHCI類抗原，其結(jié)果見于圖18—圖21。圖18顯示使用大鼠IgG1(Zymed制)的對照組的分析結(jié)果，圖19顯示抗小鼠NHCI類抗原抗體(大鼠IgG2a，BMA制)與BWV1細胞(自BW5147細胞提取的小鼠淋巴瘤)的結(jié)合特性的分析結(jié)果，圖20顯示使用大鼠IgG1(Zymed制)的對照組的分析結(jié)果，圖21顯示BMAP—1與BWV1細胞結(jié)合特性的分析結(jié)果。圖中，縱軸表示相對細胞數(shù)，橫軸表示熒光強度。結(jié)果可見BMAP—1不能識別BWV1細胞而MHCI類抗體與BWV1細胞反應(yīng)。
如上文所述，通過實驗進一步說明BMAP—1具有引起髓系細胞程序性死亡的功能；據(jù)本發(fā)明人所知，迄今尚無如上述的具有引起髓系細胞程序性死亡的單克隆抗體的報導(dǎo)，因此具有此功能的單克隆抗體是本發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的新的抗體。且由于以BMAP—1為代表的本發(fā)明單克隆抗體可以引起高水平表達抗原的髓細胞性白血病細胞程序性死亡，因此利用單克隆抗體引起骨髓細胞程序性死亡的功能，本發(fā)明的具有引起髓系細胞程序性死亡的功能的單克隆抗體可作為有效藥物用于髓細胞性白血病。
本發(fā)明的單克隆抗體已在上述實施例中作了明確的敘述，具有引起髓系細胞程序性死亡性質(zhì)的本發(fā)明單克隆抗體可用上述特定實施例說明，但并不僅僅限于上述實施例而是包括不考慮抗原種類的，具有相同特點和功能，以同樣方法制備的所有單克隆抗體。
由于本發(fā)明的單克隆抗體可作為抗體特異性識別引起髓系細胞程序性死亡的抗原，且具有引起髓系細胞程序性死亡的性質(zhì)，因此可利用這種性質(zhì)將其作為有效藥物用于髓細胞性白血病的治療領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種單克隆抗體，它具有通過與髓系細胞結(jié)合，引起髓系細胞程序性死亡(Apoptosis)的性質(zhì)。
2.一種單克隆抗體的片段，它具有通過與髓系細胞結(jié)合，引起髓系細胞程序性死亡(Apoptosis)的性質(zhì)。
3.產(chǎn)生權(quán)利要求1中所述單克隆抗體的雜交瘤。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種具有引起髓系細胞程序性死亡性質(zhì)的單克隆抗體。本發(fā)明涉及一種具有引起髓系細胞程序性死亡的性質(zhì)的單克隆抗體及其片段，且涉及產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。由于本發(fā)明的單克隆抗體可作為抗體特異性的識別引起髓系細胞程序性死亡的抗原，且具有引起髓系細胞程序性死亡的性質(zhì)，因此可利用這種性質(zhì)將其作為有效藥物用于髓細胞性白血病的治療領(lǐng)域。
文檔編號C07K16/28GK1130405SQ94193260
公開日1996年9月4日 申請日期1994年9月2日 優(yōu)先權(quán)日1993年9月3日
發(fā)明者福島直 申請人:中外制藥株式會社