一種從人外周血記憶性b淋巴細(xì)胞制備抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗體的制備方法，具體涉及一種從人外周血記憶性B淋巴細(xì)胞制 備抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗原特異性的單克隆或多克隆免疫球蛋白制劑在預(yù)防感染和治療免疫缺陷病中 非常重要(Nat Rev Immunol ,2010,10(5) :301-316)。目前，臨床上應(yīng)用的免疫球蛋白制劑 基本都分離自志愿者血漿(BioDrugs，2010，24(4): 211-223)。其來(lái)源受限，不同批次或來(lái)源 的質(zhì)量不同，且存在潛在的感染因素 (Adv Clin Exp Med,2015,24(1): 153-159)。此外，也 可通過基因工程技術(shù)制備，目前治療性抗體有人鼠嵌合體、人源化抗體和全人抗體等，存在 抗原性以及制備成本高、周期長(zhǎng)等不足之處(MAbs，2015，7( 1): 9-14)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了一種從人外周血記憶 性B淋巴細(xì)胞制備抗體的方法。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案:一種從人外周血記憶性B淋巴細(xì)胞制備抗體 的方法，所述方法包括以下步驟：
[0005] (1)將外周血記憶性B淋巴細(xì)胞懸于含體積濃度為10%~20%牛血清的細(xì)胞培養(yǎng) 液中，在37°C、5% (V/V)的二氧化碳條件下培養(yǎng)；
[0006] (2)在步驟（1)培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入活化劑，繼續(xù)培養(yǎng)3-10天，使外周血記 憶性B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞；
[0007] (3)將步驟(2)制備的漿細(xì)胞和在37 °C、5 % (V/V)的二氧化碳條件下復(fù)蘇的人骨髓 瘤細(xì)胞株融合，制備成雜交瘤細(xì)胞株，篩選可分泌抗原特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞株，通過 篩選的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗原特異性的抗體。
[0008] 在前期研究中，本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)活化劑組合(R848+IL-2+IL-4)，可顯著活化記 憶性B細(xì)胞，使之高效的轉(zhuǎn)換為漿細(xì)胞，進(jìn)而分泌大量的抗原特異性的抗體。再用人骨髓瘤 細(xì)胞株與漿細(xì)胞融合制備成雜交瘤細(xì)胞株，可持續(xù)分泌大量抗體，再用特異的抗原進(jìn)行篩 選，從而獲得大量的抗原特異性的多克隆或單克隆抗體。
[0009] 優(yōu)選地，所述步驟（1)中細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM、RPMI1640和DMEM/F12培養(yǎng)基中的一 種。
[0010] 優(yōu)選地，所述步驟（2)中活化劑包括以下濃度的組分：0.1~30μg/ml R848、1~ 200ng/ml IL-2和10~200ng/ml IL-4。
[0011]優(yōu)選地，所述步驟(3)中人骨髓瘤細(xì)胞株是對(duì)HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷)敏 感、對(duì)喹巴因和聚乙二醇耐受且不分泌抗體的人骨髓瘤細(xì)胞株。
[0012] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中融合所用的融合劑是濃度為30%-70% (W/V)的聚乙二醇， 所述聚乙二醇的分子量為1000-4000。
[0013] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中抗原是接種免疫的抗原、天然感染的病原體或自身抗原。
[0014] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中復(fù)蘇所用的培養(yǎng)基是含10%~20%(V/V)牛血清的細(xì)胞培 養(yǎng)液。
[0015] 優(yōu)選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)液是DMEM、RPMI 1640和DMEM/F12培養(yǎng)基中的一種。
[0016] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中人骨髓瘤細(xì)胞株與漿細(xì)胞的數(shù)量比為1:10。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供了一種從人外周血記憶性B淋巴細(xì)胞制備抗 體的方法，本發(fā)明提供的方法方便快捷、低成本，采用該方法能在體外制備大量抗體的，所 制備抗體在預(yù)防感染和治療免疫缺陷病中非常重要。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中復(fù)蘇的人骨髓瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)圖片；
[0019]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中得到的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)圖片；
[0020] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中ELISA檢測(cè)雜交瘤分泌抗輪狀病毒抗體的結(jié)果(實(shí)施例1中 的表1是以0D.450吸光值表示圖3的數(shù)字結(jié)果）。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為更好的說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明 作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0022] 實(shí)施例1:制備抗輪狀病毒抗體
[0023] (1)用商品化試劑盒(Human Memory B Cell Isolation Kit,Miltenyi Biotec)， 從接種輪狀病毒的志愿者外周血分離記憶性B淋巴細(xì)胞，于含10%牛血清的RPMI1640培養(yǎng) 液中，于37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0024] (2)向步驟（1)的培養(yǎng)液中加入活化劑，繼續(xù)培養(yǎng)5天，使記憶性B淋巴細(xì)胞分化為 漿細(xì)胞;所述活化劑組成為：l〇μg/ml R848、20ng/ml IL-2和 10ng/ml IL-4;
[0025] (3)復(fù)蘇培養(yǎng)人骨髓瘤細(xì)胞株，于含10 %牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，于37°C、5 % (V/V)二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如圖1所示；
[0026] (4)將步驟(2)制備的漿細(xì)胞和步驟(3)復(fù)蘇的人骨髓瘤細(xì)胞株融合，制備成雜交 瘤細(xì)胞株，篩選可分泌抗輪狀病毒抗體的雜交瘤細(xì)胞株，從而制備大量抗輪狀病毒抗體。 [0027]步驟(4)的具體步驟如下：
[0028]①取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的步驟(3)復(fù)蘇的人骨髓瘤細(xì)胞株，SOOrpm離心8分鐘，棄上清， 計(jì)數(shù)；
[0029] ②取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的步驟(2)制備的漿細(xì)胞，800rpm離心8分鐘，棄上清，計(jì)數(shù)；
[0030] ③將①中人骨髓瘤細(xì)胞株與②中漿細(xì)胞按數(shù)量比為1:10的比例混合，在50ml塑料 離心管內(nèi)用無(wú)血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液液洗1次，800rpm離心8分鐘，棄上清，用滴管吸凈殘留 液體；
[0031 ]④輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)；
[0032] ⑤60秒內(nèi)加入預(yù)熱的1ml 50% (W/V)PEG(分子量:4000)，沿著瓶壁逐漸滴加，邊加 邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管;靜置作用100秒；
[0033]⑥加預(yù)熱37°C的不含血清的RPMI1640,終止PEG的作用，每隔1分鐘分別加入lml， 2ml，3ml，4ml，5ml和 10ml。終體積為45ml JOOrpm離心8分鐘；
[0034]⑦棄上清，先用6ml含10%(V/V)牛血清、已加入1:100濃度的HAT(100X )的 RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液輕輕混懸，不能用力吹打，防止