專利名稱：抗cd26單克隆抗體作為對(duì)與表達(dá)cd26的細(xì)胞相關(guān)疾病的治療的制作方法
背景技術(shù)：
本申請(qǐng)要求2001年5月11日遞交的同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)序號(hào)60/290,531的優(yōu)先權(quán)。上述公開(kāi)內(nèi)容的全文不加放棄地特別引入本文作為參考。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總地涉及癌癥、免疫學(xué)和免疫治療領(lǐng)域。更特別地，其涉及抗CD26抗體的治療用途，包括單克隆、人源化以及多克隆抗CD26抗體，用于預(yù)防和治療癌癥和免疫疾病。描述了多種不同的給藥模式以及劑量。
2.相關(guān)技術(shù)的描述癌癥已成為西方世界死亡的主要原因之一，僅次于心臟病位居第二。當(dāng)前的估計(jì)預(yù)測(cè)美國(guó)每三人中有一個(gè)將會(huì)患上癌癥，并且每五人中有一個(gè)將會(huì)死于癌癥。目前，用于治療癌癥的有效選擇很少。最常規(guī)的癌癥治療選擇是外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法。通常，外科手術(shù)方法被用于癌癥的診斷(通過(guò)手術(shù)活檢)和治療(手術(shù)去除癌性生長(zhǎng))。然而，如果癌癥已轉(zhuǎn)移并擴(kuò)散，則手術(shù)不太可能導(dǎo)致痊愈，而必須采取替代的途徑。放射療法和化學(xué)療法是其他形式的癌癥治療。不過(guò)，放射療法和化學(xué)療法兩者都是全身療法，伴有數(shù)目眾多的副作用，因?yàn)檎＜?xì)胞也受到影響。目前所用的癌癥療法的副作用包括皮膚刺激、吞咽困難、口干、惡心、腹瀉、脫發(fā)、口腔潰瘍、疲勞、出血等等。因此，有關(guān)癌癥治療的重大挑戰(zhàn)仍有待克服。
靶向療法例如那些利用特異體抗體作為治療劑的療法，提供了超越非靶向療法例如經(jīng)由口服或靜脈內(nèi)給予藥物的全身化學(xué)療法或者放射療法的優(yōu)勢(shì)。有兩類基于抗體的療法。較為常見(jiàn)的類型是識(shí)別腫瘤抗原(也就是表達(dá)于腫瘤和癌細(xì)胞上而非正常組織中的蛋白)并開(kāi)發(fā)抗體，優(yōu)選是針對(duì)該腫瘤抗原的單克隆抗體(單抗)。隨后可將任何治療劑例如化學(xué)治療劑、放射性核素、修飾的毒素等偶聯(lián)到該抗體上，以通過(guò)到達(dá)腫瘤的治療劑實(shí)現(xiàn)靶向治療。另一類基于抗體的療法是通過(guò)提供本身具有治療特性的抗體來(lái)對(duì)抗其靶向的腫瘤/癌細(xì)胞。這第二種形式的基于抗體的療法的附加優(yōu)勢(shì)在于可額外再偶聯(lián)另外的治療劑到該治療抗體上以實(shí)現(xiàn)更為有效的治療。
抗體定向的療法特別是利用單克隆抗體(單抗)的療法的主要優(yōu)點(diǎn)是其能遞送增加劑量的治療劑到腫瘤，并更好地使正常組織免受治療劑的副作用。盡管已鑒定了若干用于癌癥治療的抗體，仍需要鑒定新的和更為有效的治療抗體以提供對(duì)各種不同類型癌癥的治療。
一種膜蛋白CD26與很多免疫相關(guān)功能有聯(lián)系，已知其在數(shù)種人類癌表面表達(dá)，尤其是處于晚期階段并因而伴隨著患者預(yù)后差的癌癥。例如肺腺癌呈CD26酶活性陽(yáng)性，而其他組織學(xué)類型的肺癌呈CD26活性陰性(Asada等，1993)；CD26在分化的甲狀腺癌中高表達(dá)而在良性甲狀腺疾病中無(wú)表達(dá)(Tanaka等，1995)；高水平的CD26蛋白和mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)于B-慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中(Bauvois等，1999)；而且CD26表達(dá)在侵襲性T細(xì)胞惡性腫瘤中高，例如T細(xì)胞成淋巴細(xì)胞淋巴瘤/急性成淋巴細(xì)胞白血病(LBL/ALL)、T細(xì)胞CD30+退行性大細(xì)胞淋巴瘤。這些癌癥類型難于治療，因?yàn)樗鼈儗?duì)當(dāng)前的治療方式特別耐受。亟需尋找可用于治療和預(yù)防這種侵襲性疾病的治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明通過(guò)鑒定抗CD26抗體的生長(zhǎng)抑制特性，克服了本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明從而提供了癌癥治療的方法，其中所述癌癥在其表面表達(dá)CD26蛋白，該方法利用治療性抗CD26抗體組合物。本發(fā)明的這種以抗CD26抗體為基礎(chǔ)的療法包括應(yīng)用非偶聯(lián)抗體，包括多克隆抗體、單克隆抗體(單抗)、抗體片段、人源化單抗、裸露抗體。還提供了偶聯(lián)抗體的應(yīng)用，其中抗體偶聯(lián)于藥物、其他靶向抗體、毒素、酶抑制劑、放射性核素、中子俘獲劑例如硼附加物、化學(xué)品以及其他生物活性劑。
所以，在有些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種治療患有表達(dá)CD26的癌癥患者的方法，包括向所述患者給予一種包含抗CD26抗體的藥物制劑，其中該抗CD26抗體結(jié)合CD26并使細(xì)胞周期停滯，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
多種不同的癌癥和腫瘤預(yù)期可以通過(guò)本發(fā)明的方法治療，其包括但不限于，T細(xì)胞癌、B細(xì)胞癌、血液系統(tǒng)癌癥、甲狀腺癌癥、T細(xì)胞淋巴瘤、肺腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、腦癌、淋巴癌、皮膚癌、骨癌、直腸癌或肉瘤。
在更具體的實(shí)施方案中，T細(xì)胞癌可以是T細(xì)胞淋巴瘤如成淋巴細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞CD30+退行性大細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性T細(xì)胞淋巴瘤、HTLV-相關(guān)T細(xì)胞白血病或成人T細(xì)胞白血病。在其他具體實(shí)施方案中，B細(xì)胞癌可以是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病或B細(xì)胞淋巴瘤。
本發(fā)明還構(gòu)想聯(lián)合治療，其中同時(shí)應(yīng)用兩種或多種治療方案以改善療效。從而，除了用抗CD26抗體治療之外，患者可以用第二治療劑進(jìn)行治療，其中的第二治療劑是治療性多肽、編碼治療性多肽的核酸、化學(xué)治療劑、免疫治療劑、細(xì)胞因子、趨化因子、活化劑、放射治療劑或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物。
第二治療劑可與抗CD26抗體同時(shí)給藥。作為選擇，第二治療劑可在不同于抗CD26抗體的時(shí)間給藥。這樣，第二治療劑可以在抗CD26抗體治療之前或之后給藥。
可構(gòu)想若干抗CD26抗體的給藥路徑，其中包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、口服、經(jīng)皮、經(jīng)鼻、口含、直腸或陰道給藥。
預(yù)期1μg/kg到1g/kg劑量范圍的抗CD26抗體可用于治療。從而，預(yù)期人們可用1μg/kg到5μg/kg、或5μg/kg到10μg/kg、10μg/kg到20μg/kg、20μg/kg到30μ/kg、30μg/kg到40μg/kg、40μg/kg到50μg/kg、50μg/kg到60μg/kg、70μg/kg到80μg/kg、90μg/kg到100μg/kg、100μg/kg到200μg/kg、200μg/kg到300μg/kg、300μg/kg到400μg/kg、400μg/kg到500μg/kg、500μg/kg到600μg/kg、600μg/kg到700μg/kg、700μg/kg到800μg/kg、900μg/kg到1mg/kg、1mg/kg到10mg/kg、10mg/kg到20mg/kg、20mg/kg到30mg/kg、30mg/kg到40mg/kg、40mg/kg到50mg/kg、50mg/kg到60mg/kg、70mg/kg到80mg/kg、90mg/kg到100mg/kg、100mg/kg到200mg/kg、200mg/kg到300mg/kg、300mg/kg到400mg/kg、400mg/kg到500mg/kg、500mg/kg到600mg/kg、600mg/kg到700mg/kg、700mg/kg到800mg/kg或者900mg/kg到1g/kg的范圍。還可考慮中間范圍，例如人們可用1μg/kg、或2μg/kg、或3μg/kg、或4μg/kg或5μg/kg等等。應(yīng)當(dāng)理解給藥的確切方法和給藥劑量可在治療時(shí)予以確定并加以調(diào)整，取決于患者的個(gè)體需要，考慮諸如年齡、疾病、性別、體能狀態(tài)等因素，而且這種調(diào)整可由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的醫(yī)師做出。所以，本發(fā)明絕非局限于列出的劑量。
在有些實(shí)施方案中，抗CD26抗體可以是單克隆抗體。在具體實(shí)施方案中，抗CD26單克隆抗體是由保藏在美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)的雜交瘤HB 10297分泌的1F7單克隆抗體。該1F7抗體及其制備方法在美國(guó)專利5,120,642中有詳細(xì)的描述，在此引為參考。
在其他具體實(shí)施方案中，抗CD26單克隆抗體是5F8單克隆抗體。一些其他被認(rèn)為是有用的單抗包括但不限于10F8A、12E3B、14D10、2F9、4G8、11H9、18H3A、9C11和/或16D4B。不過(guò)，對(duì)CD26蛋白的任何表位特異性的任何其他單克隆抗體，均被認(rèn)為可用于本發(fā)明中，并且本發(fā)明不局限于上述的實(shí)例。此外，所述單克隆抗體可作為片段給藥或者可被人源化以降低對(duì)人類患者的免疫原性。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明構(gòu)想應(yīng)用多克隆抗CD26抗體。
本發(fā)明的抗體可針對(duì)天然存在的CD26蛋白/多肽/肽、純化的CD26蛋白/多肽/肽、部分純化的CD26蛋白/多肽/肽、重組產(chǎn)生的CD26蛋白/多肽/肽或者CD26融合蛋白/多肽/肽而制備。
在其它實(shí)施方案中，構(gòu)想抗CD26抗體還進(jìn)一步連接于其他的物質(zhì)，例如但不限于化學(xué)治療劑、放射性核素、免疫治療劑、細(xì)胞因子、趨化因子、顯象劑、毒素、生物活性劑、酶抑制劑或者二抗。在一些具體實(shí)施方案中，酶抑制劑是腺苷脫氨酶抑制劑或者二肽基肽酶IV抑制劑。在其他具體實(shí)施方案中，化學(xué)治療劑可以是阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤或氨基蝶呤；蒽環(huán)類抗生素；絲裂霉素C；長(zhǎng)春花生物堿；秋水仙胺；依托泊苷；光輝霉素；或烷化劑例如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥或其他本說(shuō)明書后面部分所描述的藥劑。
在其它實(shí)施方案中，毒素可以是植物、真菌或細(xì)菌來(lái)源的毒素，例如A鏈毒素、核糖體失活蛋白、α-八疊球菌素、曲霉菌素、局限曲菌素、核糖核酸酶、白喉毒素或假單胞菌外毒素，這僅是其中一些實(shí)例?？膳c抗CD26抗體偶聯(lián)的放射性核素和顯象劑在下面部分描述。其他具體實(shí)施方案考慮其他生物活性劑，例如但不限于趨化因子、細(xì)胞因子、視黃酸及其衍生物、干擾素、生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)腫瘤消退的方法，包括向需要的患者給予一種包含抗CD26抗體的組合物。
此外，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)腫瘤壞死的方法，包括向需要的患者給予一種包含抗CD26抗體的組合物。
在一些實(shí)施方案中，發(fā)明人構(gòu)想了治療癌癥患者的方法，包括誘導(dǎo)癌細(xì)胞中CD26表達(dá)，并向所述患者給予一種包含抗CD26抗體的藥物制劑，藉此抗CD26抗體結(jié)合CD26并使細(xì)胞周期停滯、和/或生長(zhǎng)抑制、和/或細(xì)胞死亡和/或腫瘤消退。誘導(dǎo)CD26在細(xì)胞上表達(dá)可通過(guò)使細(xì)胞與生物因子接觸來(lái)完成，例如但不限于細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、類視黃醇、干擾素、白介素、佛波酯、可激活免疫系統(tǒng)的物質(zhì)、化學(xué)治療劑、抗體或抗原。作為選擇，人們可通過(guò)使細(xì)胞同化學(xué)劑接觸來(lái)誘導(dǎo)CD26在細(xì)胞上表達(dá)。誘導(dǎo)CD26在細(xì)胞中表達(dá)的方法是熟練技術(shù)人員所公知的。
本發(fā)明還提供了在表達(dá)CD26的細(xì)胞中增加p21表達(dá)的方法，包括使該細(xì)胞與抗CD26抗體接觸。在一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)CD26的細(xì)胞是癌細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，癌細(xì)胞可以是血液系統(tǒng)癌細(xì)胞、T細(xì)胞癌細(xì)胞、B細(xì)胞癌細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、骨癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病或B細(xì)胞淋巴瘤。T細(xì)胞癌可以是侵襲性T細(xì)胞癌例如T細(xì)胞淋巴瘤。在其他具體實(shí)施方案中，T細(xì)胞淋巴瘤可以是成淋巴細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞CD30+退行性大細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性T細(xì)胞淋巴瘤、HTLV-相關(guān)T細(xì)胞白血病或成人T細(xì)胞白血病。
在其它實(shí)施方案中，表達(dá)CD26的細(xì)胞是CD26轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系或人T細(xì)胞，例如人T細(xì)胞克隆，或活化的T細(xì)胞或活化的T細(xì)胞克隆。而在其它實(shí)施方案中，表達(dá)CD26的細(xì)胞是活化的免疫細(xì)胞。這樣的細(xì)胞可以是超活化的免疫細(xì)胞，例如活化的T細(xì)胞，在自身免疫病和涉及活化的免疫系統(tǒng)的疾病的發(fā)病中起作用的活化的T細(xì)胞，識(shí)別自身抗原的活化的T細(xì)胞，識(shí)別同種異體移植物的活化的T細(xì)胞，來(lái)自識(shí)別宿主組織的供體的活化的T細(xì)胞，識(shí)別自身抗原、同種異體移植物的表達(dá)CD26的活化的免疫細(xì)胞，在自身免疫病和涉及活化的免疫系統(tǒng)的疾病的發(fā)病中起作用的表達(dá)CD26的活化的免疫細(xì)胞，來(lái)自識(shí)別宿主組織的供體的活化的免疫細(xì)胞等。
在一些實(shí)施方案中，抗CD26抗體是單克隆抗體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗CD26單克隆抗體(單抗)是由保藏在美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)的雜交瘤HB 10297分泌的。該單抗也被稱為1F7抗體。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，抗CD26單克隆抗體(單抗)是5F8抗體。一些其他被認(rèn)為有用的單抗包括但不限于10F8A、12E3B、14D10、2F9、4G8、11H9、18H3A、9C11、16D4B。該單克隆抗體可進(jìn)一步被人源化以降低免疫原性。
在其它實(shí)施方案中，抗CD26抗體是多克隆抗體。而本發(fā)明的其它實(shí)施方案想到所述抗CD26抗體可進(jìn)一步連接/偶聯(lián)于另一種物質(zhì)，例如但不限于化學(xué)治療劑、放射性核素、免疫治療劑、細(xì)胞因子、趨化因子、顯象劑、毒素、生物活性劑、酶抑制劑或者二抗。在具體實(shí)施方案中，酶抑制劑是腺苷脫氨酶抑制劑或者二肽基肽酶IV抑制劑。
還提供了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包括使表達(dá)CD26的細(xì)胞與抗CD26抗體接觸。在該方法的一些實(shí)施方案中，表達(dá)CD26的細(xì)胞是癌細(xì)胞。在具體實(shí)施方案中，癌細(xì)胞可以是血液系統(tǒng)癌細(xì)胞、T細(xì)胞癌細(xì)胞、B細(xì)胞癌細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、骨癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，癌細(xì)胞可以是T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病或B細(xì)胞淋巴瘤。
而在其他具體實(shí)施方案中，T細(xì)胞癌可以是預(yù)后差的T細(xì)胞癌，非限制性的例子例如T細(xì)胞淋巴瘤，如成淋巴細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞CD30+退行性大細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性T細(xì)胞淋巴瘤、HTLV-相關(guān)T細(xì)胞白血病以及成人T細(xì)胞白血病。
在本方法的一個(gè)方面，被抑制的細(xì)胞生長(zhǎng)是轉(zhuǎn)移性細(xì)胞生長(zhǎng)。在本方法的其它方面，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)包括使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯。
而在其他實(shí)施方案中，表達(dá)CD26的細(xì)胞為CD26轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系或人T細(xì)胞，例如人T細(xì)胞克隆，或活化的T細(xì)胞或活化的T細(xì)胞克隆。而在另外的實(shí)施方案中，表達(dá)CD26的細(xì)胞是活化的免疫細(xì)胞。這樣的細(xì)胞可以是超活化的免疫細(xì)胞，例如活化的T細(xì)胞，在自身免疫病和涉及活化的免疫系統(tǒng)的疾病的發(fā)病中起作用的活化的T細(xì)胞，識(shí)別自身抗原的活化的T細(xì)胞，識(shí)別同種異體移植物的活化的T細(xì)胞，來(lái)自識(shí)別宿主組織的供體的活化的T細(xì)胞，識(shí)別自身抗原、同種異體移植物的表達(dá)CD26的活化的免疫細(xì)胞，在自身免疫病和涉及活化的免疫系統(tǒng)的疾病的發(fā)病中起作用的表達(dá)CD26的活化的免疫細(xì)胞，來(lái)自識(shí)別宿主組織的供體的活化的免疫細(xì)胞等。從而，本方法預(yù)期可用于提供對(duì)與超活化免疫細(xì)胞相關(guān)的免疫系統(tǒng)疾病的治療，例如自身免疫病、器官移植、移植物抗宿主疾病等。這包括的疾病有，例如但不限于阿狄森氏病、脫發(fā)、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、抗磷脂綜合征、白塞氏病、慢性疲勞綜合征、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、糖尿病、纖維肌痛、肺出血腎炎綜合征、突眼性甲狀腺腫、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、狼瘡、梅尼埃氏多發(fā)性硬化癥、重癥肌無(wú)力、尋常性天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬變、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕熱、結(jié)節(jié)病、硬皮病、脈管炎、白斑、韋格納肉芽腫病。
本發(fā)明還提供了誘導(dǎo)表達(dá)CD26的癌細(xì)胞調(diào)亡的方法，包括使該細(xì)胞與包含抗CD26抗體的組合物接觸。
如本說(shuō)明書中所用的“一個(gè)”或“一種”可以指一個(gè)(種)或多個(gè)(種)。如本文權(quán)利要求中所用的，當(dāng)與“包括/包含”一詞連用時(shí)，詞語(yǔ)“一個(gè)”或“一種”可以指一個(gè)(種)或多于一個(gè)(種)。如本文所用的“另一個(gè)(種)”可以指至少第二個(gè)(種)或更多。
本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)由下面的詳細(xì)描述會(huì)變得更明顯。不過(guò)，應(yīng)當(dāng)理解，這些詳細(xì)的描述和具體的實(shí)施例，盡管意味著本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但僅僅是用于解釋，因?yàn)楦鶕?jù)這種詳細(xì)描述，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和修正對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明下列附圖構(gòu)成本說(shuō)明書的一部分并用于進(jìn)一步闡釋本發(fā)明的某些方面。通過(guò)參考這些附圖中的一張或多張，并結(jié)合本文提供的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，可以更好理解本發(fā)明。


圖1A和1B.Karpas 299的表型表征。(圖1A)通過(guò)流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞的CD26、CD3和CD2表達(dá)。顯示了表達(dá)特定表面標(biāo)志的細(xì)胞百分比。(圖1B)在與抗CD26單抗1F7(1μg/ml)于37℃過(guò)夜溫育之后，評(píng)估Karpas 299細(xì)胞的CD26表達(dá)，并和與1F7溫育過(guò)夜之前的CD26表達(dá)進(jìn)行比較。a＝陰性對(duì)照，b＝抗CD26處理前，c＝抗CD26處理后。
圖2A和2B.可溶性抗CD26單抗對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。Karpas299細(xì)胞(圖2A)和H9細(xì)胞(圖2B)與含有可溶性抗CD26單抗1F7、抗CD26單抗5F8或同型對(duì)照單抗的培養(yǎng)基溫育，并進(jìn)行MTT攝取分析。數(shù)據(jù)代表每種細(xì)胞系的三次實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞毒性指數(shù)(％對(duì)照)＝1-處理細(xì)胞的OD×100-在單獨(dú)的細(xì)胞培養(yǎng)基中溫育的細(xì)胞的OD。
圖3A和3B.SCID小鼠中腫瘤形成之后在Karpas 299細(xì)胞上的CD26表面表達(dá)。(圖3A)將腫瘤注射入SCID小鼠前的CD26表面表達(dá)。將1×106的腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射到SCID小鼠中，在形成可觸及的腫瘤后接著收集瘤塊。然后制備單細(xì)胞懸液并用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD26表面表達(dá)。(a＝陰性對(duì)照，b＝CD26)(圖3B)來(lái)自從SCID小鼠收獲的瘤塊的單細(xì)胞懸液的CD26表面表達(dá)。將1×106的腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射到SCID小鼠中，在形成可觸及的腫瘤后接著收集瘤塊。然后制備單細(xì)胞懸液并用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD26表面表達(dá)。(a＝陰性對(duì)照，b＝CD26)。
圖4A和4B.1F7處理后攜帶Karpas 299的SCID小鼠存活提高。(圖4A)SCID小鼠以每鼠1×106的Karpas 299細(xì)胞腹膜內(nèi)接種后1天，接著用單獨(dú)的鹽水、同型對(duì)照抗體(5μg/注射或10μg/注射)、1F7(5μg/注射或10μg/注射)腹膜內(nèi)注射處理，隔天給藥，共計(jì)10次注射。臂1單獨(dú)鹽水(n＝13)；臂2同型對(duì)照抗體(5μg/注射，n＝10)；臂3同型對(duì)照抗體(10μg/注射，n＝5)；臂4抗CD26單抗1F7(10μg/注射，n＝10)；臂5抗CD26單抗1F7(5μg/注射，n＝14)(圖4B)SCID小鼠以每鼠3×106的Karpas 299細(xì)胞腹膜內(nèi)接種后1天，接著用單獨(dú)鹽水、同型對(duì)照抗體(20μg/注射)、1F7(5μg/注射、10μg/注射或20μg/注射)腹膜內(nèi)注射處理，隔天給藥，共計(jì)10次注射。臂1單獨(dú)鹽水(n＝5)；臂2同型對(duì)照抗體(20μg/注射，n＝5)；臂31F7(5μg/注射，n＝5)；臂41F7(10μg/注射，n＝5)；臂51F7(20μg/注射，n＝5)。
圖5.在腫瘤細(xì)胞皮下接種和用抗體皮下處理后SCID小鼠中最初的腫瘤顯現(xiàn)。對(duì)SCID小鼠皮下注射在單獨(dú)鹽水、100μg1F7或同型對(duì)照抗體中溫育的1×106的Karpas 299腫瘤細(xì)胞。隨后，從腫瘤細(xì)胞接種后1天開(kāi)始，SCID小鼠接著隔天接受鹽水、同型對(duì)照抗體(20μg/注射)或1F7(20μg/注射)皮下注射，溶在0.1ml無(wú)菌鹽水中，共10次注射，位置在皮下注射腫瘤的原部位。記錄最初出現(xiàn)可見(jiàn)腫瘤的日子以評(píng)價(jià)治療效果。臂1單獨(dú)鹽水(n＝10)；臂2同型對(duì)照抗體(n＝10)；臂3抗CD26單抗1F7(n＝10)。
圖6A、6B和6C.用抗CD26單抗1F7處理被CD26轉(zhuǎn)染的JurkatT細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯于G1/S。在諾考達(dá)唑(Noc)存在或缺乏的條件下，J.C26/DP+與單獨(dú)培養(yǎng)基、同型對(duì)照單抗4B4(Iso)或1F7溫育。依材料和方法中所述進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、染色以及細(xì)胞周期分析。顯示了G0/G1(圖6A)、G2/M(圖6B)以及S (圖6C)細(xì)胞的測(cè)量。條柱代表獨(dú)立進(jìn)行的三次實(shí)驗(yàn)的G0/G1、G2/M和S細(xì)胞百分比的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)表示樣品結(jié)果與J.C26/DP-和Jwt的結(jié)果有顯著差異(p＜0.05)。
圖7.抗CD26單抗1F7處理后p21表達(dá)增加。在諾考達(dá)唑存在下與1F7溫育后G0/G1增加％的時(shí)間過(guò)程分析。依材料和方法中所述進(jìn)行細(xì)胞周期分析。G0/G1增加百分比是單抗和非單抗處理的細(xì)胞之間G0/G1百分含量的差值。條柱代表3次獨(dú)立進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的G0/G1增加％的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。星號(hào)表示樣品結(jié)果與J.C26/DP-和Jwt的結(jié)果有顯著差異(p＜0.05)。
圖8.抗CD26單抗1F7處理后ERK磷酸化導(dǎo)致p21Cip1表達(dá)增強(qiáng)。與MEK激酶抑制劑PD98059和U0126溫育后，J.C26/DP+細(xì)胞在諾考達(dá)唑存在或缺乏的條件下與單獨(dú)培養(yǎng)基、同型對(duì)照單抗4B4(Iso)或1F7溫育。溫育6小時(shí)后，依材料和方法中所述進(jìn)行細(xì)胞周期分析。數(shù)據(jù)代表三次獨(dú)立進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。在J.C26-或Jwt中未觀察到PD98059和U0126對(duì)G0/G1停滯的影響。
圖9.抗CD26單抗1F7抑制人T細(xì)胞克隆的細(xì)胞增殖，伴有p21Cip1表達(dá)增強(qiáng)。人T克隆與培養(yǎng)基或含有圖示濃度的抗CD26單抗1F7或5F8、或者同型對(duì)照單抗4B4(Iso)的培養(yǎng)基進(jìn)行溫育，有或無(wú)抗-CD3單抗(OKT3)和PMA的刺激。將0.2*105個(gè)細(xì)胞溫育并用[3H]-胸苷脈沖。[3H]-胸苷摻入表示為一式三份樣品的平均cpm和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
例示性實(shí)施方案的說(shuō)明本發(fā)明提供了使用抗CD26抗體預(yù)防和治療癌癥的治療方法。已證明可溶性抗CD26單抗例如1F7或5F8的結(jié)合可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，這通過(guò)Karpas 299細(xì)胞，一種人CD30+退行性大細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，以及Jurkat細(xì)胞的體外和體內(nèi)研究得到例證?？笴D26結(jié)合導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯在G1/S關(guān)卡(checkpoint)，伴隨著依賴于蛋白重新(denovo)合成的p21(一種細(xì)胞周期蛋白)表達(dá)增加。此外，發(fā)明人已利用SCID小鼠腫瘤模型顯示，用抗CD26抗體處理導(dǎo)致荷瘤小鼠的存活顯著提高。從而，本發(fā)明提供了抗癌療法，其利用抗CD26抗體治療表達(dá)CD26的人類癌癥。
已證實(shí)CD26在一些人類癌癥中表達(dá)，包括侵襲性T細(xì)胞惡性腫瘤，其對(duì)當(dāng)前的治療方式耐受。本發(fā)明因而提供了利用抗CD26抗體抑制腫瘤生長(zhǎng)而治療這類癌癥的方法。預(yù)期幾種類型的抗CD26抗體可用于治療方案，包括多克隆抗體、單克隆抗體(單抗1F7；以及單抗5F8，作為某些非限制性的例子)、人源化的抗體以及抗體偶聯(lián)物。
雖然公知CD26蛋白參與多方面的功能，在結(jié)合抗CD26抗體后細(xì)胞中p21表達(dá)的增加首次顯示出在癌癥中CD26與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)物之間的功能聯(lián)系。
本發(fā)明人還證明可溶性抗CD26單克隆抗體的結(jié)合在CD26轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系和人T細(xì)胞克隆中誘導(dǎo)G1/S停滯。已知CD26在一個(gè)靜息CD4+記憶T細(xì)胞亞群上表達(dá)，而且這種表達(dá)在T細(xì)胞活化時(shí)增強(qiáng)。此外，CD26直接有助于增強(qiáng)晚期T細(xì)胞克隆的抗原敏感性?；顒?dòng)過(guò)強(qiáng)的免疫病，例如移植物抗宿主疾病(GVDH)和自身免疫病，涉及超活化的T細(xì)胞。所以，除了提供有效治療對(duì)抗表達(dá)CD26的癌癥之外，本發(fā)明人考慮抗CD26抗體治療活動(dòng)過(guò)強(qiáng)的免疫病癥的治療應(yīng)用，包括自身免疫病例如但不限于阿狄森氏病、脫發(fā)、關(guān)節(jié)強(qiáng)硬性脊椎炎、抗磷脂綜合征、白塞氏病、慢性疲勞綜合征、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、糖尿病、纖維肌痛、肺出血腎炎綜合征、突眼性甲狀腺腫、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、狼瘡、梅尼埃氏多發(fā)性硬化癥、重癥肌無(wú)力、尋常性天皰瘡、原發(fā)性膽汁性肝硬變、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕熱、結(jié)節(jié)病、硬皮病、脈管炎、白斑、韋格納肉芽腫病等，器官移植以及移植物抗宿主疾病。目前，僅在美國(guó)，每年診斷的自身免疫病估計(jì)有1-2千萬(wàn)例。因此，抗CD26抗體治療用于免疫相關(guān)疾病是一個(gè)重要發(fā)展。
A.CD26和抗CD26抗體CD26為110-kd的表面糖蛋白，具有一系列多種多樣的功能特性，其在許多組織中表達(dá)，包括上皮細(xì)胞和白細(xì)胞亞群(Morimoto和Schlossman，1998；von Bonin等，1998)。CD26蛋白是一種膜結(jié)合的外肽酶(ectopeptidase)，在其胞外結(jié)構(gòu)域具有二肽基肽酶IV(DPPIV)活性，并且能夠從倒數(shù)第二位是L-脯氨酸或L-丙胺酸的多肽上裂解氨基末端的二肽。
過(guò)去十年的工作表明CD26是一個(gè)在基礎(chǔ)的人T細(xì)胞生理中具有過(guò)多功能的分子。舉例來(lái)說(shuō)，CD26能裂解某些參與T細(xì)胞和單核細(xì)胞功能的趨化因子(Oravecz等，1997；Proost等，1998)。其他研究確定CD26為腺苷脫氨酶(ADA)結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)ADA表面表達(dá)。據(jù)信CD26/ADA復(fù)合體在催化去除局部腺苷以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能方面起著關(guān)鍵作用(Dang等，1996；Kameoka等，1993；Morrison等，1993)。
雖然CD26在肝、腸和腎中組成性表達(dá)，在T細(xì)胞上的CD26表達(dá)水平被緊密調(diào)控，并且其密度在T細(xì)胞活化后顯著增加。在靜息T細(xì)胞中，CD26表達(dá)于CD4+記憶T細(xì)胞亞群，而且這種CD4+CD26高T細(xì)胞群已經(jīng)被證明對(duì)記憶抗原產(chǎn)生最大的應(yīng)答。事實(shí)上，某些實(shí)驗(yàn)條件下CD26本身參與T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。CD26和CD3與固定化單克隆抗體(單抗)的交聯(lián)可誘導(dǎo)T細(xì)胞的活化和IL-2的產(chǎn)生。此外，抗CD26抗體處理T細(xì)胞經(jīng)由其內(nèi)化而導(dǎo)致CD26表面表達(dá)的下降，并且這種抗體誘導(dǎo)的T細(xì)胞上CD26的調(diào)節(jié)導(dǎo)致針對(duì)抗-CD3或抗-CD2刺激的增殖反應(yīng)增強(qiáng)。盡管抗CD26單抗1F7對(duì)CD26分子的連接誘導(dǎo)信號(hào)分子例如CD3ζ和p561ck的酪氨酸磷酸化增加，可溶性抗CD26單抗和DPPIV抑制劑在某些情況下抑制T細(xì)胞生長(zhǎng)和功能。
此外，各種不同刺激對(duì)T細(xì)胞的活化增加CD26表面表達(dá)，從而CD26被用作為T細(xì)胞活化標(biāo)志(Fox等，1984；Morimoto等，1989)。CD26還是參與T細(xì)胞活化的CD3和CD2途徑的共刺激表面分子。
除了參與免疫調(diào)節(jié)之外，認(rèn)為CD26可能在某些人類腫瘤的發(fā)病中起著作用。大多數(shù)肺腺癌是DPPIV-陽(yáng)性的，而其他組織學(xué)類型的肺癌是DPPIV-陰性的(Asada等，1993)。此外，CD26表達(dá)在分化的甲狀腺癌中高，但是在良性甲狀腺疾病中缺失(Tanaka等，1995)。它似乎還在黑素瘤的發(fā)病中起作用，因?yàn)槠浔磉_(dá)隨著黑素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化而喪失(Morrison等，1993；Wesley等，1999)。與正常靜息B細(xì)胞相比，于B-慢性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞和活化的B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高水平的CD26蛋白表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄(Bauvois等，1999)。同時(shí)，T細(xì)胞惡性腫瘤上的CD26表達(dá)似乎局限于侵襲性病理實(shí)體，例如T細(xì)胞成淋巴細(xì)胞淋巴瘤/急性成淋巴細(xì)胞白血病(LBL/ALL)以及T細(xì)胞CD30+退行性大細(xì)胞淋巴瘤，而僅僅在小比例的惰性病例如蕈樣霉菌病中檢測(cè)到。值得注意的是，在T細(xì)胞LBL/ALL亞群中，CD26表達(dá)為預(yù)后差的患者的獨(dú)立標(biāo)志(Carbone等，1995；Carbone等，1994)。
已經(jīng)產(chǎn)生和描述了數(shù)目眾多的抗CD26抗體，包括單克隆抗體例如1F7、Ta1、5F8、10F8A、12E3B、14D10、2F9、4G8、11H9、18H3A、9C11、16D4B、TA5.9，是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)形成的(Morimoto等，1989；Torimoto等，1992；U.S.專利5,120,642；DeMeester等，1994；Dong等，1998，全部并入本文作為參考)。
與CD26多樣的作用相應(yīng)，CD26抗體介導(dǎo)多形的細(xì)胞功能。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)與特異性單抗交聯(lián)時(shí)，CD26能夠激活T細(xì)胞活化的或選途徑，很可能是歸因于其與CD45，一種跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶的物理結(jié)合(Dang等，1990a；Dang等，1990b；Dang等，1990c；Dang等，1991；Fleischer，1987；Hegen等，1997；Dang等，1990d；Torimoto等，1991)。而其他的研究證明可溶性抗CD26單抗和DPPIV抑制劑在某些狀況下抑制T細(xì)胞生長(zhǎng)和功能(Dang等；1996；Kahne等，1998；Kubota等，1992；Mattern等，1993)。這些研究，以及上文描述的其他研究，提示CD26除了是一個(gè)免疫調(diào)節(jié)分子之外，可能在某些腫瘤的發(fā)病中具有潛在的作用，包括侵襲性T細(xì)胞血液系統(tǒng)惡性腫瘤(Carbone等，1995；Carbone等；1994)。
Dong及其同事，基于對(duì)CD26缺失突變體的缺失分析、免疫印跡和直接結(jié)合測(cè)定，將13種抗CD26抗體分成定位于CD26蛋白的第1-247、248-358、359-449、450-577以及359-653位氨基酸殘基間的5個(gè)不同的表位組。在該研究中，Dong等(1998)(并入本文作為參考)證明對(duì)不同的抗CD26單抗特異性的不同表位與CD26的不同功能結(jié)構(gòu)域相關(guān)。舉例來(lái)說(shuō)，盡管抗其中的兩組-第248-358和第359-449位氨基酸區(qū)域的單抗誘導(dǎo)CD26的調(diào)節(jié)并對(duì)T細(xì)胞增殖具有共刺激作用，這些抗第359-449位氨基酸區(qū)域的抗體中僅有一個(gè)還與ADA結(jié)合相關(guān)。這解釋了不同的抗CD26抗體所顯示出的一些不同的功能效應(yīng)。
因此，CD26及其抗體是具有廣泛功能的復(fù)雜分子。本發(fā)明明確地證明了CD26在腫瘤發(fā)病中具有重要作用以及CD26抗體導(dǎo)致表面帶有CD26的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)停滯和生長(zhǎng)抑制。
此外，雖然先前的報(bào)道表明CD26介導(dǎo)活化信號(hào)的能力取決于功能性CD3/TcR復(fù)合體(von Bonin等，1998；Dang等，1990d)，本發(fā)明人顯示CD26可以在缺乏功能性CD3/TcR復(fù)合體的條件下傳遞信號(hào)，導(dǎo)致T細(xì)胞生物反應(yīng)的改變。在正常T細(xì)胞中，CD26的參與導(dǎo)致T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所涉及的蛋白的磷酸化增加，部分是通過(guò)CD26和CD45的物理結(jié)合介導(dǎo)的(Hegen等，1997；Torimoto等，1991)。發(fā)明人目前正研究CD26參與導(dǎo)致細(xì)胞周期所涉及的機(jī)制。盡管在黑素瘤細(xì)胞中觀察到強(qiáng)制CD26表達(dá)之后停滯在G1(Wesley等，1999)，本發(fā)明人證明了CD26-介導(dǎo)的G1/S停滯和p21表達(dá)改變之間的功能聯(lián)系。
B.p21在真核細(xì)胞中，細(xì)胞周期進(jìn)程在Gl/S關(guān)卡受一組公知為依賴于細(xì)胞周期蛋白的激酶(CDK)的相關(guān)酶調(diào)控，該酶通過(guò)其與稱為細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)亞基的物理結(jié)合而被正調(diào)節(jié)(Yang和Kornbluth，1999)。不過(guò)，該CDK-細(xì)胞周期蛋白復(fù)合體的酶活性被一組稱為CDK抑制劑的蛋白負(fù)調(diào)節(jié)。p21為這些CDK抑制劑中的一個(gè)(也稱為WAF1，Cip1，SDI1)，通過(guò)它與這些結(jié)構(gòu)的物理結(jié)合而阻斷多種細(xì)胞周期蛋白-CDK復(fù)合體(El-Deiry等，1993；Xiong等，1993)。此外，通過(guò)它與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)直接的相互作用，p21可抑制DNA復(fù)制(Waga等，1994)。多種不同的刺激物可誘導(dǎo)p21表達(dá)，包括細(xì)胞損傷、血清因子和佛波酯，而且p21誘導(dǎo)被證明既是p53依賴性的又是p53非依賴性的，視刺激而定(El-Diery等；1993；El-Diery等；1994；Datto等，1995)。
作為p53腫瘤抑制基因的下游靶目標(biāo)，p21間接牽涉惡性轉(zhuǎn)化。應(yīng)答DNA損傷的p53誘導(dǎo)導(dǎo)致G1關(guān)卡停滯，在該點(diǎn)先完成DNA修復(fù)，然后才進(jìn)入S期的DNA復(fù)制。與其推測(cè)的作為p53下游效應(yīng)分子的角色一致，已顯示p21抑制增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)依賴性的DNA復(fù)制但不抑制體外的DNA修復(fù)。
美國(guó)專利6,218,372，并入本文作為參考，描述了p21在腫瘤形成中的作用及其在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)惡性表型的能力。p21表達(dá)足以產(chǎn)生腫瘤和再狹窄抑制效應(yīng)，而且p21表達(dá)通過(guò)NF-κB促進(jìn)轉(zhuǎn)錄活化，NF-κB影響基因的表達(dá)，例如與細(xì)胞分化有關(guān)的粘附分子。
本發(fā)明證明給予抗CD26抗體導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制以及p21表達(dá)相應(yīng)增加。
C.在免疫疾病中的作用雖然CD26在免疫調(diào)節(jié)中的功能已得到很好研究，它在臨床情境中的作用尚未明確，盡管現(xiàn)有數(shù)據(jù)暗示它可能參與某些人類疾病的發(fā)病。與CD26為T細(xì)胞活化的標(biāo)志并且在該過(guò)程中起功能性作用的發(fā)現(xiàn)相一致，CD26可能在某些自身免疫病中具有T細(xì)胞活化和淋巴因子合成的調(diào)節(jié)物的作用，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、突眼性甲狀腺腫及多發(fā)性硬化癥(Hafler等，1985；Mizokami等，1996；Eguchi等，1989；Gerli等，1996)。來(lái)自這些自身免疫病患者的循環(huán)T淋巴細(xì)胞表達(dá)高水平的CD26表面表達(dá)，而且在一些情況下，表達(dá)的CD26水平與疾病的活動(dòng)相關(guān)(Hafler等，1985；Mizokami等，1996；Eguchi等，1989；Gerli等，1996)。此外，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中，抗體誘導(dǎo)的CD26表達(dá)調(diào)節(jié)導(dǎo)致外周血T細(xì)胞中IL-2和γ-IFN的合成增加，并且在滑液T細(xì)胞中γ-IFN的產(chǎn)生下降而對(duì)IL-2的產(chǎn)生沒(méi)有影響(Gerli等，1996)。此外，在體內(nèi)抑制CD26/DPPIV酶活性延長(zhǎng)大鼠受體中心臟同種異體移植物的存活，提示CD26在體內(nèi)在同種抗原-介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)和同種異體移植排斥機(jī)制中的作用(Korom等，1997)。
早先的工作證明，以有效劑量的抗CD26單克隆抗體進(jìn)行治療可為患者很好地耐受，不會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性。在先導(dǎo)研究中，Bacigalupo等(1985)用識(shí)別人類CD26的鼠抗CD26單克隆抗體治療患嚴(yán)重難治性移植物抗宿主疾病的8名患者(De Meester等，1993)。隨著循環(huán)CD26+T細(xì)胞數(shù)目的下降，疾病的嚴(yán)重程度有了顯著的改善。有2個(gè)完全響應(yīng)者和2個(gè)部分響應(yīng)者，8個(gè)患者中有5個(gè)在治療后存活至少1年。重要的是，用抗CD26單克隆抗體治療被很好地耐受，即時(shí)的不良反應(yīng)可以接受，暗示著將來(lái)可以給予具有可耐受的副作用的包括抗CD26單克隆抗體的療法。
本發(fā)明人證明可溶性抗CD26單克隆抗體例如1F7的結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞的G1/S停滯，例如CD26轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系以及人類T細(xì)胞克隆。從而，本發(fā)明人預(yù)見(jiàn)抗CD26抗體療法會(huì)在涉及活化的免疫系統(tǒng)紊亂的臨床情境中具有治療應(yīng)用，包括自身免疫病、移植物抗宿主疾病以及器官移植，其中人們可以在超活化的免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。
預(yù)期抗CD26抗體可以與其他治療移植物抗宿主疾病的方式聯(lián)合來(lái)治療該病。此外，可選擇處于移植物抗宿主疾病的不同階段或臨床嚴(yán)重程度的患者用抗CD26療法予以治療。在這樣的療法中，進(jìn)一步預(yù)見(jiàn)在一些實(shí)施方案中，人們可單獨(dú)使用抗CD26抗體，而在其他實(shí)施方案中，人們可使用經(jīng)適當(dāng)修飾的抗CD26抗體，例如偶聯(lián)于靶向引起移植物抗宿主疾病的特定活化T細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞的藥劑，來(lái)治療該病?？膳c抗CD26抗體偶聯(lián)治療該病的藥劑包括但不限于其他特異性抗體、生長(zhǎng)因子、趨化因子、細(xì)胞因子、毒素、或識(shí)別這些效應(yīng)細(xì)胞上的特定靶的藥劑。除了偶聯(lián)，抗CD26單抗可與靶向引起該病的效應(yīng)細(xì)胞的藥劑聯(lián)合使用。在這些疾病中，抗CD26抗體還可以聯(lián)合其他藥劑/臨床藥劑例如經(jīng)挑選的抗生素/抗真菌劑/抗病毒劑以將由該病或由抗CD26治療方案所引起的潛在感染降到最低限度。另外，由抗CD26單克隆抗體識(shí)別的特定表位已證明在CD26-信號(hào)作用和結(jié)合中具有不同的作用。因此，發(fā)明人認(rèn)為識(shí)別不同表位的不同的抗CD26單抗可導(dǎo)致不同的功效和毒性特征。
D.抗體a.抗體產(chǎn)生本發(fā)明提供了抗CD26抗體的治療用途。雖然在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了1F7和5F8單克隆抗體，抗CD26抗原的其他單克隆抗體和多克隆抗體一樣可以有效用于本發(fā)明提供的預(yù)防和治療方法。因而，本發(fā)明不限于任何特定的一種/多種抗CD26抗體，并且認(rèn)為任何對(duì)CD26蛋白、多肽或肽特異性的抗體均可應(yīng)用。本發(fā)明還考慮應(yīng)用抗CD26抗體的生物功能等價(jià)物。術(shù)語(yǔ)″CD26蛋白/肽/多肽″或″CD26抗原″在這里是指CD26蛋白、多肽或肽，而不考慮是否其天然存在，是純化的、部分純化的或是通過(guò)重組DNA法、融合蛋白法、蛋白合成法等制備的，或者是其生物功能等價(jià)物。
生物功能等價(jià)物是一種分子，其中在編碼該分子的多核苷酸和/或蛋白的結(jié)構(gòu)中可以作修飾和/或改變，而得到的分子具有相似或改善的特征。在本發(fā)明的上下文中，這種分子可以是CD26抗原或者CD26抗體。生物功能等價(jià)物可以包括被改造為含有不同的序列而同時(shí)保留編碼“野生型”或標(biāo)準(zhǔn)蛋白的能力的多核苷酸。這可以通過(guò)遺傳密碼的簡(jiǎn)并來(lái)實(shí)現(xiàn)，也就是存在編碼同一個(gè)氨基酸的多個(gè)密碼子。制備這種等價(jià)物的方法是本領(lǐng)域公知的。
制備和表征抗體的方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)例如AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；并入本文作為參考)。
這部分提供對(duì)產(chǎn)生抗體的方法的簡(jiǎn)短討論。
(i)多克隆抗體簡(jiǎn)而言之，多克隆抗體通過(guò)用根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物(在本案中包括CD26抗原)免疫動(dòng)物并從該經(jīng)免疫的動(dòng)物收集抗血清而制備。
廣泛的動(dòng)物種類可用于產(chǎn)生抗血清。通常，用于產(chǎn)生抗-抗血清的動(dòng)物為家兔、小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠或山羊。由于家兔相對(duì)大的血容量，家兔為優(yōu)選的制備多克隆抗體的選擇。
如本領(lǐng)域所公知的，給定組合物的免疫原性可能會(huì)變化。因此常常需要激發(fā)宿主免疫系統(tǒng)，這可通過(guò)將肽或多肽免疫原偶聯(lián)到載體上而實(shí)現(xiàn)。例示性的和優(yōu)選的載體是匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其他蛋白例如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白、家兔血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑也可用作為載體。將多肽偶聯(lián)到載體蛋白上的手段是本領(lǐng)域公知的，包括戊二醛、間馬來(lái)酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亞胺以及bis-biazotized聯(lián)苯胺。其他的雙官能或衍生劑也可用于連接，舉例來(lái)說(shuō)，馬來(lái)酰亞胺基苯甲酰磺基琥珀酰亞胺酯(通過(guò)半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過(guò)賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同的烷基基團(tuán)。
如本領(lǐng)域同樣公知的，特定免疫原組合物的免疫原性可通過(guò)應(yīng)用稱為佐劑的免疫反應(yīng)非特異性刺激物予以增強(qiáng)。例示性的和優(yōu)選的佐劑包括完全弗氏佐劑(免疫反應(yīng)的非特異性刺激物，含有殺死的結(jié)核分枝桿菌)、不完全弗氏佐劑以及氫氧化鋁佐劑。
用于制備多克隆抗體的免疫原組合物的量依據(jù)免疫原的性質(zhì)以及用于免疫的動(dòng)物而變化。很多途徑可用于給予免疫原(皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)以及腹膜內(nèi))。多克隆抗體的產(chǎn)生可通過(guò)在免疫后的各時(shí)間點(diǎn)對(duì)免疫動(dòng)物取血樣而予以監(jiān)測(cè)。
還可給予第二加強(qiáng)注射。重復(fù)強(qiáng)化和滴度測(cè)定的過(guò)程直到獲得合適的滴度。當(dāng)?shù)玫筋A(yù)期的免疫原性水平時(shí)，免疫動(dòng)物可以被放血，并且分離血清并儲(chǔ)存，和/或所述動(dòng)物可用于產(chǎn)生單抗。
為生產(chǎn)家兔多克隆抗體，該動(dòng)物可通過(guò)耳靜脈或者通過(guò)心臟穿刺放血。使這樣取得的血液凝結(jié)，然后離心從全細(xì)胞和血塊中分離出血清成分。血清可以象各種不同應(yīng)用中一樣使用，或者可通過(guò)眾所周知的方法純化需要的抗體成分，例如親和層析，利用另一種抗體或肽結(jié)合于固體基質(zhì)或者蛋白A，繼之以抗原(肽)親和柱予以純化。
(ii)單克隆抗體″單克隆抗體″是指能夠與CD26蛋白特異性結(jié)合的均一免疫球蛋白群。應(yīng)理解CD26蛋白可以具有一個(gè)或多個(gè)抗原決定簇。本發(fā)明的抗體可以針對(duì)這些決定簇中的一個(gè)或多個(gè)。
單克隆抗體(單抗)可利用眾所周知的技術(shù)容易地制備，例如美國(guó)專利4,196,265中所例示的那些技術(shù)，并入本文作為參考。通常，該技術(shù)包括用挑選的免疫原組合物免疫合適的動(dòng)物，例如純化或部分純化的CD26抗原蛋白、多肽或肽。該免疫組合物以能夠有效刺激抗體產(chǎn)生細(xì)胞的方式給予。
產(chǎn)生單抗的方法通常沿著與那些制備多克隆抗體的方法相同的路線開(kāi)始。嚙齒類動(dòng)物例如小鼠和大鼠是優(yōu)選的動(dòng)物，不過(guò)利用家兔、綿羊、山羊、猴細(xì)胞也是可能的。利用大鼠可提供某些優(yōu)勢(shì)(Goding，1986，pp.60-61)，但小鼠是優(yōu)選的，BALB/c小鼠是最優(yōu)選的，因?yàn)樗亲畛Ｒ?guī)應(yīng)用的，并且通常給出更高百分比的穩(wěn)定融合。
一般如上所述向動(dòng)物注射抗原。如果必要，抗原可偶聯(lián)于載體分子例如匙孔血藍(lán)蛋白?？乖ǔ?huì)與佐劑混合，例如弗氏完全或不完全佐劑。用相同抗原加強(qiáng)注射可以以大約兩周的間隔進(jìn)行。
免疫之后，具有產(chǎn)生抗體潛能的體細(xì)胞，特別是B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)，被選擇用于單抗產(chǎn)生方案。這些細(xì)胞可從活檢的脾臟或淋巴結(jié)獲得。優(yōu)選脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞，前者因?yàn)樗鼈兪翘幱诜至褲{母細(xì)胞階段的抗體產(chǎn)生細(xì)胞的豐富來(lái)源。
通常會(huì)免疫一組動(dòng)物，并且取出具有最高抗體滴度的動(dòng)物的脾臟，并用注射器勻漿脾臟而獲得脾淋巴細(xì)胞。通常，來(lái)自免疫小鼠的脾臟含有大約5×107到2×108個(gè)淋巴細(xì)胞。
來(lái)自免疫動(dòng)物的產(chǎn)生抗體的B-淋巴細(xì)胞隨后與無(wú)限增殖的骨髓瘤細(xì)胞融合，通常是與免疫動(dòng)物相同的物種。適合用于產(chǎn)生雜交瘤的融合操作的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選是不產(chǎn)生抗體的，具有高融合效率，和使其不能在某些僅僅支持預(yù)期的融合細(xì)胞(雜交瘤)生長(zhǎng)的選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酶缺陷。
可利用多種骨髓瘤細(xì)胞中的任何一種，正如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的(Goding，pp.65-66，1986；Campbell，pp.75-83，1984；分別并入本文作為參考)。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)免疫動(dòng)物為小鼠時(shí)，人們可利用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0 Bul；至于大鼠，人們可利用R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210；而U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6都可用于人細(xì)胞融合。
一種優(yōu)選的鼠骨髓瘤細(xì)胞是NS-1骨髓瘤細(xì)胞系(也被稱為P3-NS-1-Ag4-1)，通過(guò)請(qǐng)求細(xì)胞系保藏號(hào)GM3573，它可以容易地從NIGMS人類遺傳突變細(xì)胞保藏所獲得。另一種可用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系是8-氮鳥(niǎo)嘌呤-抗性小鼠的鼠骨髓瘤SP2/0不產(chǎn)病毒性(non-producer)細(xì)胞系。
生成抗體-產(chǎn)生性脾或淋巴結(jié)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的雜交體的方法通常包括在促進(jìn)細(xì)胞膜融合的一種或多種因子(化學(xué)的或電的)存在的條件下，將體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞以2∶1的比例混合，盡管該比例可分別從大約20∶1到大約1∶1變化。Kohler和Milstein描述了利用仙臺(tái)病毒的融合方法(1975；1976)，而Gefter等描述了利用聚乙二醇(PEG)，例如37％(v/v)PEG的方法(1977)。利用電誘導(dǎo)融合方法也是適宜的(Goding pp.71-74，1986)。
融合操作通常低頻率地產(chǎn)生存活的雜交體，大約1×10-6至1×10-8。不過(guò)，這不構(gòu)成問(wèn)題，因?yàn)樵摯婊畹娜诤想s交體是由親本未融合細(xì)胞(特別是能夠正常繼續(xù)無(wú)限分裂的未融合骨髓瘤細(xì)胞)通過(guò)在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)分化而來(lái)的。選擇性培養(yǎng)基通常在組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中含有阻斷核苷酸重新合成的試劑。例示性和優(yōu)選的試劑是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮絲氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤阻斷嘌呤和嘧啶兩者的重新合成，而重氮絲氨酸僅阻斷嘌呤的合成。當(dāng)利用氨基蝶呤或氨甲蝶呤時(shí)，培養(yǎng)基補(bǔ)充次黃嘌呤和胸苷作為核苷酸的來(lái)源(次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基)。當(dāng)利用重氮絲氨酸時(shí)，培養(yǎng)基補(bǔ)充次黃嘌呤。
優(yōu)選的選擇性培養(yǎng)基是HAT。只有能夠運(yùn)轉(zhuǎn)核苷酸補(bǔ)救途徑的細(xì)胞能夠在HAT培養(yǎng)基中存活。骨髓瘤細(xì)胞缺乏補(bǔ)救途徑的關(guān)鍵酶，例如次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)，因而它們不能存活。B細(xì)胞可運(yùn)轉(zhuǎn)該途徑，但它們?cè)谂囵B(yǎng)中具有有限的壽命并且通常在約兩周內(nèi)死亡。所以，唯一能夠在選擇性培養(yǎng)基中存活的細(xì)胞是那些由骨髓瘤和B細(xì)胞形成的雜交細(xì)胞。
這種培養(yǎng)提供了雜交瘤種群，從中挑選特定的雜交瘤。有代表性地，雜交瘤的挑選在微量滴定板上通過(guò)單克隆稀釋法培養(yǎng)細(xì)胞，然后對(duì)各個(gè)克隆的上清液(大約兩到三周后)測(cè)試所需的反應(yīng)性來(lái)進(jìn)行。這種分析應(yīng)當(dāng)靈敏、簡(jiǎn)單和迅速，例如放射免疫分析、酶免疫分析、細(xì)胞毒性分析、噬菌斑分析、斑點(diǎn)免疫結(jié)合分析等等。
挑選的雜交瘤隨之進(jìn)行系列稀釋并克隆到單個(gè)的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系中，則該克隆可以無(wú)限增殖提供單抗?？捎脙煞N基本方法使用該細(xì)胞系用于單抗產(chǎn)生。
雜交瘤樣本可被注射到(通常注射到腹膜腔)組織相容的動(dòng)物中，該動(dòng)物類型是用于提供進(jìn)行原始融合的體細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的類型(例如同源小鼠)。任選地，在注射前用碳?xì)浠衔铮貏e是油例如降植烷(四甲基十五烷)使動(dòng)物致敏。注射動(dòng)物形成腫瘤分泌由融合的雜交細(xì)胞產(chǎn)生的特定單抗。然后動(dòng)物的體液，例如血清或腹水，可以被放出以提供高濃度的單抗。
各細(xì)胞系也可以在體外培養(yǎng)，其中單抗自然地分泌到培養(yǎng)基中，從中可容易地獲得高濃度單抗。
如果需要，任何一種方法產(chǎn)生的單抗均可進(jìn)一步純化，利用過(guò)濾、離心和各種層析方法例如HPLC或親和層析。本發(fā)明的單抗的片段可通過(guò)包括用酶例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化的方法，和/或通過(guò)化學(xué)還原裂解二硫鍵的方法從純化的單抗獲得。作為選擇，本發(fā)明包括的單抗片段可利用自動(dòng)肽合成儀合成。
還認(rèn)為分子克隆途徑可用于產(chǎn)生單克隆。為此，從分離自免疫動(dòng)物脾臟的RNA制備組合的免疫球蛋白噬菌粒文庫(kù)，并且利用表達(dá)抗原的細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞例如正常對(duì)腫瘤細(xì)胞(normal-versus-tumor cells)通過(guò)淘選來(lái)選擇表達(dá)合適抗體的噬菌粒。該方法較之于常規(guī)雜交瘤技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是單輪可產(chǎn)生和篩選大約104倍之多的抗體，而且通過(guò)H和L鏈組合可產(chǎn)生新的特異性，這進(jìn)一步增加了找到合適抗體的機(jī)會(huì)。
已經(jīng)用這樣的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生了針對(duì)CD26抗原的抗體。舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)專利5,120,642，并入本文作為參考，描述了1F7單抗的產(chǎn)生和其表征。被開(kāi)發(fā)用于幫助區(qū)分CD4+淋巴細(xì)胞群中的輔助-誘導(dǎo)和抑制-誘導(dǎo)細(xì)胞，單抗1F7是從用來(lái)源于新大陸靈長(zhǎng)類動(dòng)物夜猴(Aotustrivirgatus)的刺激的T細(xì)胞系免疫Balb/cJ小鼠所建立的雜交細(xì)胞系產(chǎn)生的。簡(jiǎn)而言之，利用標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤操作，用來(lái)源于新大陸靈長(zhǎng)類動(dòng)物夜猴(Aotus trivirgatus)的PHA-刺激的T細(xì)胞系的細(xì)胞免疫Balb/cJ小鼠。收集小鼠脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞系NS-1融合。該細(xì)胞群培養(yǎng)于HAT培養(yǎng)基中以獲得待克隆的雜交瘤細(xì)胞。挑選含有與人T細(xì)胞反應(yīng)的抗體的雜交瘤培養(yǎng)物。含有與人T細(xì)胞反應(yīng)的單抗的雜交瘤培養(yǎng)物的克隆和再克隆是在飼養(yǎng)細(xì)胞的存在下通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行的。然后建立惡性腹水并用于分析。通過(guò)用熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG1染色，而不能用熒光素標(biāo)記的針對(duì)小鼠Ig其他亞群的抗體染色，該單抗的同型被確定為小鼠同型IgG1。產(chǎn)生該抗1F7單抗的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物于1989年11月21日保藏在美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(AmericanType Culture Collection)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland20852，并且指名為ATCC No.HB 10297。
已經(jīng)由本發(fā)明人通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的其他抗CD26的單抗包括10F8A、12E3B、14D10、2F9、4G8、11H9、18H3A、9C11和16D4B(Dong等，1998，并入本文作為參考)。還有另一種抗CD26單抗是5F8(Morimoto等，1989；Torimoto等，1992，并入本文作為參考)。
(iii)人源化抗體人源化抗體是動(dòng)物來(lái)源的，運(yùn)用遺傳工程技術(shù)加以修飾，用人類序列替換恒定區(qū)和/或可變區(qū)構(gòu)架序列，而保留原始的抗原特異性的抗體。這樣的抗體還可包括與供體或受體未加修飾的輕鏈或嵌合輕鏈結(jié)合的人源化重鏈，或者反之亦然。這樣的抗體通常來(lái)源于嚙齒類動(dòng)物抗體，舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的鼠源抗體，具有針對(duì)人類抗原的特異性，并且通常可用于體內(nèi)的治療應(yīng)用。該策略減少宿主對(duì)外源抗體的反應(yīng)，并允許對(duì)人類效應(yīng)功能進(jìn)行選擇。
產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的。舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)專利5,693,762公開(kāi)了產(chǎn)生具有一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的人源化免疫球蛋白的方法，以及其組合物?！錍DR″定義為抗體的互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列。CDR包含在免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高變區(qū)內(nèi)。CDR提供了抗體結(jié)合抗原或表位的大多數(shù)接觸殘基。該發(fā)明感興趣的CDR來(lái)源于供體抗體的可變重鏈和輕鏈序列，并且包括天然存在的CDR的功能片段和類似物，所述片段和類似物也享有或保留與其來(lái)源的供體抗體相同的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。當(dāng)組合入完整抗體中時(shí)，人源化免疫球蛋白實(shí)質(zhì)上在人類中是非免疫原性的，并保留與供體免疫球蛋白基本上相同的對(duì)抗原如含有表位的蛋白或其它化合物的親和力。
一般而言，人源化抗體具有非人來(lái)源的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基引入其中。這些非人氨基酸殘基常常被稱為“輸入”殘基，其典型地是從一個(gè)“輸入”可變結(jié)構(gòu)域取出的。人源化抗體中僅僅抗原識(shí)別部位，或者互補(bǔ)決定高變區(qū)(CDR)是非人源的，而可變結(jié)構(gòu)域的所有構(gòu)架區(qū)(FR)都是人類基因的產(chǎn)物。
人源化可基本依據(jù)Winter和同事的方法進(jìn)行(Jones等，1986；Riechmann等，1988；Verhoeyen等，1988)，用嚙齒類動(dòng)物的CDR或CDR序列替換人類抗體的相應(yīng)序列。因此，這種“人源化”抗體是嵌合抗體，其中實(shí)質(zhì)上少于一個(gè)完整的人類可變結(jié)構(gòu)域被非人物種的相應(yīng)序列所替代。在實(shí)踐中，人源化抗體典型地是其中一些CDR殘基和可能一些構(gòu)架區(qū)(FR)殘基被來(lái)自嚙齒動(dòng)物抗體中類似部位的殘基替代的人類抗體。
其他教導(dǎo)了產(chǎn)生可用于本發(fā)明的抗體的美國(guó)專利，分別并入本文作為參考，包括描述了用組合方法生產(chǎn)嵌合抗體的美國(guó)專利5,565,332；描述了重組免疫球蛋白制劑的美國(guó)專利4,816,567以及描述了抗體-治療劑偶聯(lián)物的美國(guó)專利4,867,973。
美國(guó)專利5,565,332描述了生產(chǎn)抗體、或具有與親本抗體相同的結(jié)合特異性但具有增加的人類特征的抗體片段的方法。人源化抗體可通過(guò)鏈改組獲得，或許利用噬菌體展示技術(shù)，鑒于這種方法可用于本發(fā)明，美國(guó)專利No..5,565,332全文并入本文作為參考。人類抗體還可以如Hoon等所述(1993)通過(guò)用EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞并且接著克隆分泌者來(lái)產(chǎn)生。
抗體人源化并保持高的抗原親和力和其他有利的生物特征是很重要的。為實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，根據(jù)優(yōu)選的方法，利用親本和人源化序列的三維模型通過(guò)分析親本序列和各種不同的概念上的人源化產(chǎn)物的過(guò)程來(lái)制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可以得到的，并且其對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的?？衫糜?jì)算機(jī)程序圖解并顯示所挑選的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。檢視這些顯示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，也就是分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。用這種方式，可從共有和輸入序列中選擇FR殘基并組合，以便實(shí)現(xiàn)所需的抗體特征，例如增強(qiáng)的對(duì)靶抗原的親和力。一般來(lái)說(shuō)，CDR殘基直接地并且最為實(shí)質(zhì)性地參與影響抗原結(jié)合。
(iv)人抗體人單抗可通過(guò)雜交瘤方法制備。用于產(chǎn)生人單抗的人骨髓瘤和小鼠-人雜交骨髓瘤細(xì)胞系已有描述，舉例來(lái)說(shuō)，Kozbor(1984)及Brodeur等(1987)。
目前，制備經(jīng)免疫能夠產(chǎn)生人抗體集合(repertoire)而不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)是可能的。舉例來(lái)說(shuō)，已經(jīng)描述了嵌合和生殖系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合缺失導(dǎo)致完全抑制內(nèi)源抗體產(chǎn)生。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移至這樣的生殖系突變小鼠，經(jīng)抗原攻擊就會(huì)導(dǎo)致人抗體的產(chǎn)生(Jakobovits等，1993)。
作為選擇，噬菌體展示技術(shù)(McCafferty等，1990)可用于在體外從來(lái)自未免疫供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因集合產(chǎn)生人抗體和抗體片段。按照該技術(shù)，抗體V結(jié)構(gòu)域基因符合讀框地克隆入絲狀噬菌體例如M13或fd的主要或者次要外殼蛋白基因中，并作為功能性抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面。
由于該絲狀顆粒含有噬菌體基因組的一個(gè)單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)的選擇還導(dǎo)致選擇編碼表現(xiàn)出那些特性的抗體的基因。因而，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進(jìn)行(Johnson等，1993)。幾種來(lái)源的V-基因片段可用于噬菌體展示。Clackson等(1991)從一個(gè)來(lái)源于免疫小鼠的脾臟的V基因的小隨機(jī)組合文庫(kù)中分離了多種不同的抗-噁唑酮抗體。基本上按照Marks等(1991)或者Griffith等(1993)描述的技術(shù)，可以構(gòu)建來(lái)自未免疫的人供體的V基因集合，并可以分離針對(duì)多種不同抗原(包括自身抗原)的抗體。
在天然免疫應(yīng)答中，抗體基因以高速率累積突變(體細(xì)胞高變)。有些引入的變化會(huì)賦予高親和力，并且顯示出高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞在后續(xù)的抗原攻擊期間被優(yōu)先復(fù)制和分化。這種天然過(guò)程可通過(guò)使用公知為“鏈改組”的技術(shù)來(lái)模擬(Marks等，1992)。在這種方法中，通過(guò)用獲自未免疫供體的V結(jié)構(gòu)域基因的天然存在的變體(集合)的集合順序替換重鏈和輕鏈V區(qū)基因，由噬菌體展示獲得的“初級(jí)”人抗體的親和力可得到提高。該技術(shù)使得具有nM級(jí)親和力的抗體和抗體片段得以產(chǎn)生。Waterhouse等(1993)描述了制備非常大的噬菌體抗體集合的策略，而Griffith等(1993)報(bào)道了從這種大的噬菌體文庫(kù)中直接分離高親和力人抗體。基因改組也可用于從嚙齒類動(dòng)物抗體獲得人抗體，其中的人抗體具有與起始的嚙齒類動(dòng)物抗體相似的親和力和特異性。根據(jù)這種也被稱為“表位印記”的方法，由噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒類動(dòng)物抗體的重鏈或輕鏈V結(jié)構(gòu)域基因用人類V結(jié)構(gòu)域基因集合替換，從而創(chuàng)建嚙齒類動(dòng)物-人嵌合體?？乖x擇導(dǎo)致分離能夠恢復(fù)功能性抗原結(jié)合部位的人可變區(qū)，也就是說(shuō)，表位控制(印記)配偶體的選擇。當(dāng)重復(fù)該過(guò)程以便替換其余的嚙齒類動(dòng)物V結(jié)構(gòu)域時(shí)即獲得人抗體(PCT專利申請(qǐng)WO 93/06213)。與傳統(tǒng)的通過(guò)CDR移植法人源化嚙齒類動(dòng)物抗體不同，該技術(shù)提供了完全人的抗體，它沒(méi)有嚙齒類動(dòng)物來(lái)源的構(gòu)架或CDR殘基。
(v)雙特異性抗體雙特異性抗體是單克隆的，優(yōu)選是人或人源化的，具有對(duì)至少兩個(gè)不同抗原的結(jié)合特異性的抗體。在本案中，結(jié)合特異性之一是針對(duì)CD26抗原的，而另一個(gè)則針對(duì)任何其他抗原，并且優(yōu)選是針對(duì)另一個(gè)受體或受體亞單位的。舉例來(lái)說(shuō)，特異性結(jié)合CD26抗原的雙特異性抗體落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域公知的。
傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組制備是基于兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中的兩個(gè)重鏈具有不同的特異性(Millstein和Cuello，1983)。由于免疫球蛋白重鏈和輕鏈的隨機(jī)分配，這些雜交瘤(quadroma)產(chǎn)生10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。該正確分子的純化，通常通過(guò)親和層析步驟完成，相當(dāng)繁瑣，而且產(chǎn)量低。相似的操作在WO 93/08829和Traunecker等(1991)中公開(kāi)。
根據(jù)一種不同的和更優(yōu)選的方法，具有所需的結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合部位)與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。融合優(yōu)選是與免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，包括至少一部分絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選具有包含輕鏈結(jié)合必需部位的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)存在于至少一個(gè)融合體中。編碼免疫球蛋白重鏈融合體的DNA，以及如果需要，編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入到分別的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染至合適的宿主生物體中。在用于構(gòu)建的三個(gè)多肽鏈的不等比例給出最佳產(chǎn)量的實(shí)施方案中，這提供了調(diào)節(jié)這三個(gè)多肽片段的相互比例的極大靈活性。不過(guò)，當(dāng)至少兩個(gè)多肽鏈等比表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)率時(shí)，或者當(dāng)比例沒(méi)有特殊的重要意義時(shí)，有可能將兩個(gè)或所有三個(gè)多肽鏈的編碼序列插入到一個(gè)表達(dá)載體中。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，雙特異性抗體由一個(gè)位于一個(gè)臂上的具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，以及一個(gè)位于另一個(gè)臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)(提供第二結(jié)合特異性)組成。發(fā)現(xiàn)這種不對(duì)稱結(jié)構(gòu)可易化目的雙特異性化合物從不需要的免疫球蛋白鏈組合中的分離，因?yàn)槊庖咔虻鞍纵p鏈僅存在于雙特異性分子的一半提供了容易的分離方法。關(guān)于產(chǎn)生雙特異性抗體的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，參見(jiàn)例如Suresh等(1986)。
(vi)雜綴合抗體雜綴合抗體也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。雜綴合抗體由兩個(gè)共價(jià)連接的抗體組成。這種抗體被提出可以，例如，使免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向于不需要的細(xì)胞(美國(guó)專利4,676,980)，和治療HIV感染(WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089)。雜綴合抗體可由任何便利的交聯(lián)方法制備。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，并且連同許多交聯(lián)技術(shù)公開(kāi)在美國(guó)專利4,676,980中。
b.交叉反應(yīng)性抗體和表位本發(fā)明進(jìn)一步包括其他基于抗CD26抗體的組合物，例如抗體偶聯(lián)物和免疫毒素，其結(jié)合與本文公開(kāi)的抗體相同的抗原和/或表位，即結(jié)合CD26抗原。這種抗體可以是多克隆或單克隆類型，一般優(yōu)選單克隆抗體。
以與本發(fā)明的抗體基本上相同的方式鑒定結(jié)合癌抗原或表位例如CD26抗原或其表位的抗體，是一個(gè)相當(dāng)直接的事情。這可利用免疫學(xué)篩選分析中的任何一種容易地加以確定，在所述分析中可評(píng)估抗體競(jìng)爭(zhēng)。
舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)待檢測(cè)的測(cè)試抗體是從不同來(lái)源的動(dòng)物獲得、或者甚至是不同的同型時(shí)，可使用簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)分析，其中預(yù)先混合對(duì)照和測(cè)試抗體然后用于抗原組合物?！翱乖M合物”是指含有如本文所述的CD26抗原或相關(guān)癌抗原的任何組合物。因此，基于ELISA和蛋白質(zhì)印跡的方案適用于這種簡(jiǎn)單的競(jìng)爭(zhēng)研究。
在這種實(shí)施方案中，人們可以將對(duì)照抗體與不同量的測(cè)試抗體(例如1∶1、1∶10和1∶100)在用于抗原組合物之前預(yù)先混合一段時(shí)間，所述抗原組合物例如ELISA板上抗原包被的孔，或者吸附到膜上的抗原(如在斑點(diǎn)印跡和蛋白質(zhì)印跡中)。利用種或同型二抗，人們只能夠檢測(cè)到結(jié)合的對(duì)照抗體，其結(jié)合會(huì)由于存在識(shí)別相同表位/抗原的測(cè)試抗體而下降。
在進(jìn)行對(duì)照抗體如抗CD26抗體和任何測(cè)試抗體之間的抗體競(jìng)爭(zhēng)研究時(shí)，人們可以首先用可檢測(cè)的標(biāo)記標(biāo)記對(duì)照，例如生物素或酶、放射性或熒光標(biāo)記，以能夠進(jìn)行隨后的鑒定。在這些情況下，人們可以以不同的比例(如1∶1、1∶10和1∶100)溫育標(biāo)記的對(duì)照抗體和待檢測(cè)的測(cè)試抗體，在合適的一段時(shí)間后，人們可以接著分析標(biāo)記的對(duì)照抗體的反應(yīng)性，并將其與溫育中不包括潛在競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試抗體的對(duì)照值進(jìn)行比較。
這種分析同樣可以是任何一種基于抗體雜交的免疫分析，對(duì)照抗體可通過(guò)檢測(cè)其標(biāo)記的方法加以檢測(cè)，例如在生物素化抗體的情況下用鏈霉抗生物素，或者與酶標(biāo)有關(guān)的用顯色底物，或者簡(jiǎn)單地檢測(cè)放射性或熒光標(biāo)記。結(jié)合與對(duì)照抗體基本上相同的表位的抗體能夠有效競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，從而如結(jié)合標(biāo)記的減少所證明的，顯著減少對(duì)照抗體的結(jié)合。
標(biāo)記的對(duì)照抗體在沒(méi)有任何測(cè)試抗體時(shí)的反應(yīng)性應(yīng)該是對(duì)照高值。對(duì)照低值可通過(guò)溫育標(biāo)記抗體和相同類型的未標(biāo)記抗體獲得，此時(shí)可能發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)并減少標(biāo)記抗體的結(jié)合。存在測(cè)試抗體時(shí)標(biāo)記抗體反應(yīng)性的顯著下降意味著識(shí)別相同表位的測(cè)試抗體，也就是說(shuō)，與標(biāo)記抗體“交叉反應(yīng)”的抗體。顯著下降是可重復(fù)的即一致觀察到的結(jié)合減少。
c.抗體偶聯(lián)物抗體偶聯(lián)物包括連接于另一種物質(zhì)的CD26抗體，例如但不限于治療劑、可檢測(cè)的標(biāo)記、細(xì)胞毒性劑、化學(xué)品、毒素、酶抑制劑、藥劑等，構(gòu)成了本發(fā)明更深層的方面。診斷性抗體偶聯(lián)物既可用于體外診斷，如在各種免疫分析中，又可用于體內(nèi)診斷，例如顯象技術(shù)中。
某些抗體偶聯(lián)物包括主要旨在用于體外的那些，其中抗體連接于第二結(jié)合配體或接觸顯色底物能產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶(酶標(biāo))。合適的酶的例子包括脲酶、堿性磷酸酶、(辣根)過(guò)氧化氫酶以及葡萄糖氧化酶。優(yōu)選的第二結(jié)合配體是生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素化合物。這種標(biāo)記的應(yīng)用對(duì)本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，并且描述在例如美國(guó)專利3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中，分別并入本文作為參考。
旨在功能性應(yīng)用的其他抗體偶聯(lián)物包括抗體偶聯(lián)于酶抑制劑如腺苷脫氨酶抑制劑或者二肽基肽酶IV抑制劑的那些。
(i)放射性標(biāo)記的抗體偶聯(lián)物當(dāng)利用基于抗體的分子作為體內(nèi)診斷劑，提供例如腦、甲狀腺、乳房、胃、結(jié)腸、胰、腎、卵巢、肺、前列腺、肝臟以及肺癌或者相應(yīng)轉(zhuǎn)移的圖像時(shí)，可使用磁共振成像、X-射線成像、計(jì)算機(jī)化的發(fā)射斷層攝影術(shù)以及諸如此類的技術(shù)。在本發(fā)明的抗體顯象構(gòu)建體中，所用的抗體部分一般結(jié)合于癌標(biāo)志，例如CD26抗原，而顯象劑是在成像時(shí)可檢測(cè)的物質(zhì)，例如順磁性、放射性或熒光物質(zhì)。
許多合適的顯象劑是本領(lǐng)域公知的，正如將它們連接到抗體的方法一樣(參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,021,236和4,472,509，均并入本文作為參考)。某些連接方法涉及金屬螯合絡(luò)合物的應(yīng)用，使用例如有機(jī)螯合劑如DTPA連接于抗體(美國(guó)專利4,472,509)。單抗也可以與酶在偶聯(lián)劑例如戊二醛或高碘酸鹽的存在下反應(yīng)。帶熒光素標(biāo)記的偶聯(lián)物在這些偶聯(lián)劑存在的條件下或者通過(guò)與異硫氰酸酯反應(yīng)而制備。
在順磁性離子的情況下，作為舉例人們可提到離子例如鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、鈥(III)以及鉺(III)，特別優(yōu)選釓。
在其他背景例如X-射線成像中有用的離子，包括但不限于鑭(III)、金(III)、鉛(II)，特別是鉍(III)。
在放射性同位素用于治療和/或診斷應(yīng)用的情況下，人們可以提到砹211、14碳、51鉻、36氯、57鈷、58鈷、銅67、152Eu、鎵67、3氫、碘123、碘125、碘131、銦111、59鐵、32磷、錸186、錸188、75硒、35硫、锝99m以及釔90。125I常常優(yōu)選用于某些實(shí)施方案中，并且锝99m和銦111因?yàn)樗鼈兊牡湍芰亢瓦m合長(zhǎng)范圍檢測(cè)也常常是優(yōu)選的。
本發(fā)明放射性標(biāo)記的單抗可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的方法制備。例如，單抗的碘化可通過(guò)接觸碘化鈉或碘化鉀以及化學(xué)氧化劑例如次氯酸鈉、或者酶氧化劑例如乳過(guò)氧化物酶。根據(jù)本發(fā)明的單抗可通過(guò)配體交換過(guò)程用锝99m標(biāo)記，舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)用亞錫溶液還原高锝酸鹽、將還原的锝螯合到Sephadex柱上并將抗體施加到該柱上，或者通過(guò)直接的標(biāo)記技術(shù)，例如溫育高锝酸鹽、還原劑例如SNCl2、緩沖溶液例如鄰苯二甲酸鈉-鉀溶液以及抗體。
常用于將作為金屬離子存在的放射性同位素結(jié)合到抗體上的中間官能團(tuán)是二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
熒光標(biāo)記包括若丹明、異硫氰酸熒光素和泛影酸鈉。
(ii)免疫毒素本發(fā)明進(jìn)一步提供了免疫毒素，其中結(jié)合癌標(biāo)志如CD26抗原的抗體連接于細(xì)胞毒性劑。免疫毒素技術(shù)相當(dāng)先進(jìn)，并且是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的。免疫毒素是這樣的制劑，其中抗體成分連接于另一種物質(zhì)，特別是細(xì)胞毒性劑或者以不同方式抗細(xì)胞的物質(zhì)，具有殺傷細(xì)胞或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞分裂的能力。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“毒素”和“毒性部分”用來(lái)指任何具有這樣的殺傷或抑制特性的細(xì)胞毒性劑或者以不同方式抗細(xì)胞的物質(zhì)。毒素因此是能夠與抗體偶聯(lián)，并以活性形式遞送到細(xì)胞的藥劑，在那里它們發(fā)揮顯著的有害效應(yīng)。
免疫毒素的制備一般而言是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,340,535，并入本文作為參考)。還已知雖然基于IgG的免疫毒素通常顯示出比其Fab′對(duì)應(yīng)物更好的結(jié)合能力和更慢的血液清除，基于Fab′片段的免疫毒素一般可顯示出比基于IgG的免疫毒素更好的組織穿透能力。
例示性的抗細(xì)胞劑包括化學(xué)治療劑、放射性同位素和細(xì)胞毒素?；焺┑睦佑屑に乩珙惞檀?；抗代謝藥例如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲蝶呤或氨基蝶呤；蒽環(huán)類抗生素；絲裂霉素C；長(zhǎng)春花生物堿；秋水仙胺；依托泊苷；光輝霉素；或烷化劑例如苯丁酸氮芥或苯丙氨酸氮芥。
優(yōu)選的免疫毒素常常包括植物、真菌或細(xì)菌來(lái)源的毒素，例如A鏈毒素、核糖體失活蛋白、α-八疊球菌素、曲霉菌素、局限曲菌素、核糖核酸酶、白喉毒素或假單胞菌外毒素，不一一而列了。毒素-抗體構(gòu)建物的應(yīng)用，如同它們連接到抗體一樣，是免疫毒素領(lǐng)域眾所周知的。當(dāng)然，各種不同毒素的組合也可以偶聯(lián)到一個(gè)抗體分子，從而適應(yīng)可變化的甚至是增強(qiáng)的細(xì)胞毒性。
一類連接到抗體的毒素是蓖麻毒素，特別優(yōu)選去糖基化的蓖麻毒素A鏈。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“蓖麻毒素”意指從天然來(lái)源和通過(guò)重組手段制備的蓖麻毒素。各種不同的“重組”或“遺傳工程”形式的蓖麻毒素分子對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的，根據(jù)本發(fā)明它們都可以使用。
優(yōu)選去糖基化的蓖麻毒素A鏈(dgA)是因?yàn)樗鼧O強(qiáng)的效力、更長(zhǎng)的半衰期，并且因?yàn)橐耘R床級(jí)別和規(guī)模生產(chǎn)它是經(jīng)濟(jì)上可行的。還可以使用截短的蓖麻毒素A鏈，其中由Nagarase(Sigma)除去了30個(gè)N-末端氨基酸。
將一個(gè)或多個(gè)毒素部分連接或偶聯(lián)到抗體上可通過(guò)許多機(jī)制實(shí)現(xiàn)，舉例來(lái)說(shuō)，共價(jià)結(jié)合、親和結(jié)合、嵌入、協(xié)同結(jié)合以及復(fù)合。優(yōu)選的結(jié)合方法是那些涉及共價(jià)結(jié)合，例如利用化學(xué)交聯(lián)劑、天然肽或二硫鍵的方法。
共價(jià)結(jié)合可通過(guò)現(xiàn)有側(cè)鏈的直接縮合作用或者通過(guò)引入外部架橋分子實(shí)現(xiàn)。許多二價(jià)或多價(jià)試劑可用于將蛋白分子偶聯(lián)到其他蛋白、肽或胺官能團(tuán)上。偶聯(lián)劑的例子有碳二亞胺、二異氰酸酯、戊二醛、重氮苯以及六亞甲基二胺。該列表不意在窮盡本領(lǐng)域公知的各種偶聯(lián)劑，而是例示可以使用的較為常用的偶聯(lián)劑。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，考慮到人們可能希望首先將抗體衍生化，然后將毒素成分連接到該衍生產(chǎn)物上。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“衍生”用于描述用合適的交聯(lián)劑對(duì)抗體底物進(jìn)行化學(xué)修飾。該方法中可用的交聯(lián)劑的例子包括含有二硫鍵的接頭SPDP(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基連硫基)丙酸鹽)和SMPT(4-琥珀酰亞胺基-氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基連硫基)甲苯)。
可生物釋放鍵對(duì)臨床活性免疫毒素的實(shí)現(xiàn)尤為重要，在于它一旦進(jìn)入靶T細(xì)胞后，毒素部分必須能夠從抗體中釋放出來(lái)。已知眾多類型的連接構(gòu)建體，包括簡(jiǎn)單地在氨基酸例如半胱氨酸所含的巰基之間直接形成二硫鍵，或者將其引入各自的蛋白結(jié)構(gòu)中，以及利用現(xiàn)有的或設(shè)計(jì)的接頭部分的二硫鍵合。
已知眾多類型包含二硫鍵的接頭，可成功地使用它將毒素部分偶聯(lián)到抗體上，不過(guò)，某些接頭通常是優(yōu)選的，例如，舉例來(lái)說(shuō)，空間位阻二硫鍵接頭由于其在體內(nèi)更好的穩(wěn)定性而被優(yōu)選，從而防止在結(jié)合于作用部位之前釋放毒素部分。一個(gè)特別優(yōu)選的交聯(lián)試劑是SMPT，盡管也可以使用其他接頭例如SATA、SPDP和2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷。
一旦偶聯(lián)，純化該偶聯(lián)物以除去污染物例如非偶聯(lián)的A鏈或抗體變得很重要。除去非偶聯(lián)的A鏈很重要是因?yàn)槎拘栽黾拥目赡堋４送?，除去非偶?lián)的抗體很重要，以避免偶聯(lián)及非偶聯(lián)種類之間競(jìng)爭(zhēng)抗原的可能。在任何情況下，發(fā)現(xiàn)許多純化技術(shù)提供偶聯(lián)物以足夠的純度，使其在臨床上可用。
一般而言，最優(yōu)選的技術(shù)將引入Blue-Sepharose的應(yīng)用和凝膠過(guò)濾或凝膠滲透步驟。Blue-Sepharose是由Cibacron Blue 3GA和瓊脂糖組成的柱基質(zhì)，它被發(fā)現(xiàn)可用于免疫偶聯(lián)物的純化。Blue-Sepharose的應(yīng)用結(jié)合了離子交換和A鏈結(jié)合的特征，對(duì)于偶聯(lián)的與非偶聯(lián)的結(jié)合提供很好的分離。Blue-Sepharose允許從偶聯(lián)制備物中消除游離(未偶聯(lián))抗體。為消除游離(非偶聯(lián))毒素(例如dgA)，可利用分子排阻層析，利用常規(guī)的凝膠過(guò)濾步驟，或者利用高效液相色譜法。
制備出足夠純的偶聯(lián)物之后，人們通常希望將其制備成為可經(jīng)腸胃外給藥的藥物組合物。這通過(guò)在最后的純化步驟中應(yīng)用含有合適的藥物組合物的介質(zhì)來(lái)完成。這種配方典型地包括藥學(xué)緩沖溶液，連同賦形劑、穩(wěn)定劑以及諸如此類的物質(zhì)。藥學(xué)上可接受的組合物應(yīng)當(dāng)是無(wú)菌、非免疫原性和無(wú)致熱原的。其制備的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域眾所周知的，并在本文進(jìn)一步描述。應(yīng)理解內(nèi)毒素污染應(yīng)當(dāng)被最低限度地控制在安全水平，例如，少于0.5ng/mg蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的合適的藥物組合物一般包括從大約10到大約100mg目的偶聯(lián)物，與可接受的藥學(xué)稀釋劑或賦形劑例如無(wú)菌水溶液混合，使偶聯(lián)物的終濃度為大約0.25到大約2.5mg/ml。
如前所述，本發(fā)明的癌標(biāo)志抗體可連接于一種或多種化學(xué)治療劑，例如抗腫瘤藥物、細(xì)胞因子、抗代謝藥、烷化劑、激素、核酸等等，從而利用該抗體偶聯(lián)物其可以靶向于表達(dá)CD26抗原的癌細(xì)胞?？贵w偶聯(lián)的藥劑與其非抗體偶聯(lián)的對(duì)應(yīng)物相比，優(yōu)勢(shì)在于增加了由抗體所賦予的選擇性。
在分析可用于偶聯(lián)到抗體的化學(xué)治療劑和藥劑的種類時(shí)，人們可能希望特別考慮那些先前證明可成功偶聯(lián)到抗體上并發(fā)揮藥理學(xué)功能的藥劑。已經(jīng)被用過(guò)的例示性的抗腫瘤劑包括阿霉素、柔紅霉素、氨甲蝶呤、長(zhǎng)春堿。此外，其他藥劑如新制癌菌素、大分子霉素、三亞胺醌以及α-鵝膏蕈堿的連接也已有描述。這里所提供的適合藥劑的列表當(dāng)然僅僅是例示性的，將藥劑連接到抗體上用于特異性遞送到組織的技術(shù)已經(jīng)很好地建立了。
因而，通常認(rèn)為將具有可用于結(jié)合或交聯(lián)到抗體的氨基酸或碳水化合物基團(tuán)上的伯胺或仲胺基、酰肼或肼基、羧基醇、磷酸或烷化基團(tuán)的任何藥劑偶聯(lián)到抗體上是可能的。至于蛋白結(jié)構(gòu)，這可通過(guò)如上文關(guān)于免疫毒素所述的交聯(lián)劑的方式很容易地實(shí)現(xiàn)。連接也可以通過(guò)藥物和抗體之間的酸不穩(wěn)定?；昊蛘唔槥躅^酰(cis aconityl)連接，或者利用藥物γ-羧基和抗體氨基酸之間的肽間隔臂例如L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala實(shí)現(xiàn)。
E.免疫檢測(cè)a.免疫分析治療性抗CD26抗體還可用于與癌癥檢測(cè)和分析有關(guān)的各種診斷和預(yù)后應(yīng)用。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明因此考慮了對(duì)于結(jié)合、純化、鑒定、去除、定量或其他通常用于檢測(cè)生物組分的免疫檢測(cè)方法。從而，人們可以，舉例來(lái)說(shuō)，將本發(fā)明的抗CD26抗體療法結(jié)合或繼之以一輪免疫檢測(cè)，以獲得由表達(dá)CD26的癌細(xì)胞數(shù)目的下降所反映出來(lái)的療效的預(yù)后或診斷。
各種有用的免疫檢測(cè)方法的步驟在科技文獻(xiàn)中已有描述，例如參見(jiàn)Nakamura等(1987)，并入本文作為參考。免疫分析，就其最簡(jiǎn)單和最直接的意義而言，是結(jié)合分析。某些優(yōu)選的免疫分析是各種類型的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISAs)、放射免疫測(cè)定(RIA)以及免疫珠捕獲分析。利用組織切片的免疫組化檢測(cè)也尤為有用。不過(guò)，很容易理解檢測(cè)不局限于這些技術(shù)，蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)印跡、FACS分析等等同樣可用于本發(fā)明。
一般而言，免疫結(jié)合方法包括獲得懷疑含有某一蛋白、肽或抗體的樣品，并在有效促成免疫復(fù)合體形成的條件下，使該樣品與根據(jù)本發(fā)明的抗體或蛋白或肽接觸，視情形而定。
本發(fā)明的免疫結(jié)合方法包括檢測(cè)或定量樣品中反應(yīng)性組份的量的方法，該方法需要檢測(cè)或定量在結(jié)合過(guò)程中形成的任何免疫復(fù)合體。這里，人們可以獲得懷疑含有CD26抗原或相關(guān)癌標(biāo)志蛋白、肽或相應(yīng)抗體的樣品，并使該樣品與抗體或編碼蛋白或肽接觸，視情形而定，然后檢測(cè)或定量在特定條件下形成的免疫復(fù)合體的量。
有關(guān)抗原檢測(cè)，待分析的生物樣品可以是懷疑含有癌特異性抗原如CD26抗原的任何樣品，例如T細(xì)胞癌、黑素瘤、成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤以及乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、腎癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、淋巴結(jié)或骨髓組織切片或標(biāo)本、勻漿的組織提取物、分離的細(xì)胞、細(xì)胞膜制備物、含有分離或純化形式的任何上述蛋白的組合物、或者甚至是任何接觸癌組織的生物液體，包括血液、淋巴液、精液和尿。
使選擇的生物樣品與蛋白、肽或抗體在有效條件下接觸足以形成免疫復(fù)合體(第一免疫復(fù)合體)的一段時(shí)間，通常是簡(jiǎn)單地將組合物加到樣品中并將混合物溫育足夠長(zhǎng)的一段時(shí)間，以使抗體與存在的任何抗原，例如CD26抗原形成免疫復(fù)合體，即結(jié)合。這段時(shí)間后，樣品-抗體組合物，例如組織切片、ELISA板、斑點(diǎn)印跡或蛋白質(zhì)印跡，通常進(jìn)行沖洗以除去任何非特異性結(jié)合的抗體物質(zhì)，僅允許檢測(cè)那些特異性結(jié)合在第一免疫復(fù)合體之內(nèi)的抗體。
一般而言，免疫復(fù)合體形成的檢測(cè)是本領(lǐng)域公知的，并且可通過(guò)應(yīng)用眾多方法實(shí)現(xiàn)。這些方法通常建立在檢測(cè)標(biāo)記或標(biāo)志的基礎(chǔ)上，例如本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)使用的任何放射性、熒光、生物學(xué)或酶標(biāo)簽或標(biāo)記。有關(guān)這種標(biāo)記的使用的參考文獻(xiàn)包括美國(guó)專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149以及4,366,241，分別并入本文作為參考。當(dāng)然，人們通過(guò)利用第二結(jié)合配體，例如二抗或生物素/抗生物素蛋白配體結(jié)合排列，可以發(fā)現(xiàn)其他的優(yōu)勢(shì)，正如本領(lǐng)域所公知的。
該檢測(cè)中所使用的編碼蛋白、肽或相應(yīng)的抗體可以本身連接于一種可檢測(cè)的標(biāo)記，其中人們于是可以簡(jiǎn)單地檢測(cè)該標(biāo)記，從而使該組合物中第一免疫復(fù)合體的量得以確定。
作為選擇，首先加入的結(jié)合在第一免疫復(fù)合體中的組份可通過(guò)對(duì)編碼蛋白、肽或相應(yīng)的抗體具有結(jié)合親和力的第二結(jié)合配體的方式加以檢測(cè)。在這些情況下，第二結(jié)合配體可以連接于一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記。第二結(jié)合配體本身常常是抗體，它因此可被稱之為“第二”抗體。第一免疫復(fù)合體與標(biāo)記的第二結(jié)合配體或抗體在有效條件下接觸足以形成第二免疫復(fù)合體的一段時(shí)間。然后第二免疫復(fù)合體通常進(jìn)行洗滌以除去任何非特異性結(jié)合的標(biāo)記的第二抗體或配體，然后檢測(cè)第二免疫復(fù)合體中剩余的標(biāo)記。
其它的方法包括兩步法檢測(cè)第一免疫復(fù)合體。第二結(jié)合配體，例如抗體，其對(duì)編碼蛋白、肽或相應(yīng)的抗體具有結(jié)合親和力，被用于形成第二免疫復(fù)合體，如前所述。洗滌后，第二免疫復(fù)合體與對(duì)第二抗體具有結(jié)合親和力的第三結(jié)合配體或抗體再次在有效條件下接觸足以使免疫復(fù)合體(第三免疫復(fù)合體)形成的一段時(shí)間。第三配體或抗體連接于一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記，允許對(duì)這樣形成的第三免疫復(fù)合體加以檢測(cè)。如果需要該系統(tǒng)可提供信號(hào)放大。
本發(fā)明的免疫檢測(cè)方法在癌癥診斷中具有明顯的實(shí)用性。這里，利用的是懷疑含有編碼蛋白或肽或者是相應(yīng)抗體的生物或臨床樣品。不過(guò)，這些實(shí)施方案也適用于非臨床樣品，例如在抗原或抗體樣品的滴度測(cè)定中，在雜交瘤的選擇中，等等。
(i)ELISAs正如所指出的，我們認(rèn)為免疫檢測(cè)技術(shù)例如ELISA可用于檢測(cè)臨床樣品中CD26的存在，以確定是否需要進(jìn)行抗CD26抗體治療。作為選擇，人們可在癌細(xì)胞被誘導(dǎo)表達(dá)CD26以使本文提供的療法可行的實(shí)施方案中利用這種技術(shù)。
在一個(gè)例示性的ELISA中，結(jié)合于本發(fā)明的編碼蛋白的抗體被固定到挑選的表現(xiàn)出蛋白親和性的表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板的孔中。然后，懷疑含有癌癥標(biāo)志抗原，例如CD26抗原的測(cè)試組合物，例如臨床樣品，被加到孔中。在結(jié)合并沖洗除去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合體后，可檢測(cè)結(jié)合抗原。
檢測(cè)通常通過(guò)加入對(duì)靶蛋白特異性的二抗來(lái)實(shí)現(xiàn)，其連接于一可檢測(cè)的標(biāo)記。這類ELISA是一種簡(jiǎn)單的“夾心ELISA”。檢測(cè)還可通過(guò)加入二抗、接著加入對(duì)二抗具有結(jié)合親和力的三抗來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中三抗連接于一可檢測(cè)的標(biāo)記。
在另一個(gè)例示性ELISA中，懷疑含有CD26抗原的樣品被固定到孔表面，然后與本發(fā)明的抗體接觸。在結(jié)合并沖洗除去非特異性結(jié)合的免疫復(fù)合體后，檢測(cè)結(jié)合抗體。當(dāng)最初的抗體連接于一可檢測(cè)的標(biāo)記對(duì)，該免疫復(fù)合體可直接檢測(cè)。同樣，該免疫復(fù)合體可利用對(duì)第一抗體具有結(jié)合親和力的二抗進(jìn)行檢測(cè)，其中二抗連接于一可檢測(cè)的標(biāo)記。
在另一類的ELISA中，蛋白或肽例如CD26抗原被固定化，檢測(cè)中涉及應(yīng)用抗體競(jìng)爭(zhēng)。在這種ELISA中，向孔中加入標(biāo)記抗體，使其結(jié)合CD26抗原，通過(guò)檢測(cè)其標(biāo)記的方式加以檢測(cè)。未知樣品中標(biāo)志抗原的量則可以通過(guò)將樣品與標(biāo)記抗體在與包被孔溫育之前或期間混合來(lái)確定。樣品中存在的標(biāo)志抗原起的作用是減少可結(jié)合孔的抗體量，從而降低最終的信號(hào)。這適于檢測(cè)未知樣品中的抗體，其中未標(biāo)記的抗體結(jié)合抗原包被的孔，并且還降低了可結(jié)合標(biāo)記抗體的抗原量。
與所使用的形式無(wú)關(guān)，ELISA具有某些共同特征，例如包被、溫育或結(jié)合，洗滌除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)，并檢測(cè)結(jié)合的免疫復(fù)合體。這些特征描述如下用抗原或抗體包被板時(shí)，人們通?？梢杂每乖蚩贵w的溶液溫育板孔，或者過(guò)夜或者指定的數(shù)小時(shí)時(shí)間。然后可以洗滌板孔以去除不完全吸附的材料。接著用非特異性蛋白“包被”孔中任何余下的可用表面，該蛋白對(duì)于測(cè)試抗血清是抗原中性的。這些蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白以及奶粉溶液。這種包被可以封閉固定表面上的非特異性吸附部位，從而降低由于抗血清非特異性結(jié)合到表面上所造成的背景本底。
在ELISA中，可能更慣常使用第二或第三檢測(cè)手段而不是一個(gè)直接的步驟。因此，在蛋白或抗體與孔結(jié)合，用非反應(yīng)性材料包被以降低背景，并洗滌除去非結(jié)合材料后，固定表面與對(duì)照人癌和/或待測(cè)試的臨床或生物學(xué)樣品在有效使免疫復(fù)合體(抗原/抗體)形成的條件下相接觸。然后免疫復(fù)合體的檢測(cè)需要標(biāo)記的第二結(jié)合配體或抗體，或者第二結(jié)合配體或抗體連同標(biāo)記的第三抗體或第三結(jié)合配體。“在有效使免疫復(fù)合體(抗原/抗體)形成的條件下”是指這種條件優(yōu)選包括用溶液稀釋抗原和抗體，所述溶液如BSA、牛丙種球蛋白(BGG)以及磷酸緩沖鹽水(PBS)/吐溫。這些加入的試劑也趨向有助于降低非特異性背景。
“合適”的條件還意味著溫育是在一定溫度下持續(xù)一段時(shí)間，所述溫度和時(shí)間足以允許有效結(jié)合。溫育步驟典型地是從大約1到2到4小時(shí)，優(yōu)選是在25到27℃數(shù)量級(jí)的溫度下，或者可以在大約4℃左右溫育過(guò)夜。
在ELISA所有的溫育步驟之后，洗滌接觸表面以便除去未復(fù)合的材料。優(yōu)選的洗滌過(guò)程包括用溶液例如PBS/吐溫、或者硼酸鹽緩沖液洗滌。在測(cè)試樣品和原始結(jié)合材料之間形成特異性的免疫復(fù)合體，以及隨后洗滌后，即使是微量的免疫復(fù)合體也可以被測(cè)定。
為提供檢測(cè)手段，第二或第三抗體可帶有結(jié)合的標(biāo)記以允許檢測(cè)。優(yōu)選地，這可以是與合適的顯色底物溫育后就會(huì)產(chǎn)生顏色變化的酶。因此，舉例來(lái)說(shuō)，人們可以預(yù)期將第一或第二免疫復(fù)合體與脲酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶或過(guò)氧化氫酶偶聯(lián)的抗體接觸并溫育一段時(shí)間，并且是在有利于發(fā)生進(jìn)一步的免疫復(fù)合體形成的條件下(例如在室溫下在含PBS的溶液例如PBS-吐溫中溫育2小時(shí))。
在與標(biāo)記抗體溫育、并且隨后洗滌除去未結(jié)合的材料后，對(duì)標(biāo)記的量進(jìn)行定量，例如通過(guò)與顯色底物如尿素和溴甲酚紫或者2，2′-疊氮基-二-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)[ABTS]溫育，和在過(guò)氧化物酶作為酶標(biāo)記時(shí)與H2O2溫育。然后通過(guò)測(cè)量顏色產(chǎn)生的程度實(shí)現(xiàn)定量，例如用可見(jiàn)光分光光度計(jì)。
在其他實(shí)施方案中，還考慮了溶液相競(jìng)爭(zhēng)ELISA，溶液相ELISA涉及將CD26抗原附到珠子上，例如磁珠。這種珠子接著與來(lái)自人或動(dòng)物來(lái)源的血清溫育。在合適的允許特異性相互作用發(fā)生的溫育期后，洗滌珠子。用抗體指示劑偶聯(lián)物檢測(cè)特定類型的抗體。洗滌并分選珠子。這種復(fù)合體是合適儀器上的讀數(shù)(熒光、電發(fā)光、分光光度計(jì)，取決于偶聯(lián)部分)。由此抗體結(jié)合的水平可被定量，并且直接地與呈現(xiàn)的信號(hào)量相關(guān)。
(ii)免疫組織化學(xué)抗CD26抗體可用于新鮮冷凍的和福爾馬林固定的由免疫組織化學(xué)(IHC)研究制備的石蠟包埋的組織塊。舉例來(lái)說(shuō)，每個(gè)組織塊包括50 mg殘留的“粉碎”腫瘤。從這些顆粒標(biāo)本制備組織塊的方法已經(jīng)成功地用于先前的各種預(yù)后因素的IHC研究中，例如在乳腺中，并且是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的(Brown等，1990；Abbondanzo等，1990；Allred等，1990)。
簡(jiǎn)而言之，冷凍切片可如下制備在小塑料囊中于室溫下用磷酸緩沖鹽水(PBS)再水化50ng冷凍“粉碎”腫瘤；離心沉淀這些顆粒；將其重懸于粘性的包埋介質(zhì)(OCT)中；顛倒該囊并再次離心沉淀；在-70℃異戊烷中迅速冷凍；切割塑料囊并取出冷凍的組織柱；將組織柱固定于冷凍切片機(jī)的夾頭上；并切出25-50片含有平均大約500個(gè)明顯完整的腫瘤細(xì)胞的連續(xù)切片。
永久切片可通過(guò)相似的方法制備，包括在塑料微離心管中再水化50mg樣品；沉淀；重懸于10％福爾馬林固定4小時(shí)；洗滌/沉淀；重懸于溫?zé)岬?.5％瓊脂中；沉淀；在冰水中冷卻以使瓊脂變硬；從管中取出組織/瓊脂塊；將該塊浸潤(rùn)并包埋于石蠟中；并且切出多至50片連續(xù)永久切片。
(iii)FACS分析熒光激活細(xì)胞分選、流式細(xì)胞儀或流動(dòng)顯微熒光測(cè)定法提供了掃描單個(gè)細(xì)胞是否存在抗原例如CD26抗原的手段。該方法使用了能夠激活并檢測(cè)液體介質(zhì)中標(biāo)記細(xì)胞的激發(fā)發(fā)射的儀器。
FACS的獨(dú)特之處在于它能提供對(duì)活細(xì)胞或者固定細(xì)胞的迅速、可信、定量和多參數(shù)分析。細(xì)胞通?？赏ㄟ^(guò)活檢、血液或培養(yǎng)物中的單細(xì)胞懸液獲得。當(dāng)需要在給定的時(shí)間分析多個(gè)癌抗原，例如追蹤在疾病進(jìn)展過(guò)程中的抗原分布特征時(shí)，F(xiàn)ACS分析可能是最為有用的。
(iv)體內(nèi)成像本發(fā)明還提供了在體內(nèi)利用抗體偶聯(lián)物使腫瘤顯像的方法。術(shù)語(yǔ)“體內(nèi)成像”是指任何可允許檢測(cè)與位于動(dòng)物或人患者體內(nèi)的癌細(xì)胞特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體或其片段的非侵入性方法。
成像方法通常包括向動(dòng)物或患者給予成像有效量的可檢測(cè)標(biāo)記的癌特異性抗體或其片段(位于藥學(xué)有效載體中)，例如抗CD26抗體，然后檢測(cè)該標(biāo)記抗體與癌性組織的結(jié)合?？蓹z測(cè)的標(biāo)記優(yōu)選是非侵入性方法可檢測(cè)的自旋標(biāo)記分子或放射性同位素。
“成像有效量”是可檢測(cè)標(biāo)記的抗體或其片段的量，當(dāng)給藥時(shí)足以實(shí)施隨后對(duì)抗體或片段與癌組織結(jié)合的檢測(cè)。有效量的抗體-標(biāo)志偶聯(lián)物被允許充分的時(shí)間與存在于患者組織中的反應(yīng)性抗原接觸，然后患者暴露于檢測(cè)裝置以鑒定可檢測(cè)的標(biāo)志。
用于成像的抗體偶聯(lián)物或構(gòu)建體因此具有提供腫瘤圖像的能力，舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)磁共振成像、x-射線成像、計(jì)算機(jī)化的發(fā)射斷層攝影術(shù)等等。磁共振成像(″MRI″)中特別有用的元素包括核磁自旋共振同位素157Gd、55Mn、162Dy、52Cr、以及56Fe，其中常優(yōu)選釓?？衫忙瞄W爍相機(jī)或檢測(cè)器檢測(cè)的放射性物質(zhì)，例如锝99m或銦111，也可以應(yīng)用。適用于本發(fā)明的金屬離子的其它例子有123I、131I、131I、97Ru、67Cu、67Ga、125I、68Ga、72As、89Zr以及201Tl。
在選擇放射性核素用于體內(nèi)診斷時(shí)要考慮的一個(gè)因素是該核素的半衰期足夠長(zhǎng)以致于在靶達(dá)到最大攝取時(shí)其仍可以檢測(cè)，但又足夠短從而施加到宿主的有害輻射以及背景被最小化。理想的是，用于體內(nèi)成像的放射性核素缺乏微粒發(fā)射，但在140-2000keV的范圍內(nèi)產(chǎn)生大量的光子，這可以通過(guò)常規(guī)的γ相機(jī)容易地檢測(cè)。
放射性核素可以直接地結(jié)合于抗體或者通過(guò)利用中間官能團(tuán)間接地結(jié)合。常常用來(lái)將作為金屬離子存在的放射同位素結(jié)合到抗體的中間官能團(tuán)是二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)。
標(biāo)記抗體的給藥可以是局部的或全身的，并且通過(guò)靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、經(jīng)由脊髓液或者類似的方式完成。給藥也可以是皮內(nèi)或者腔內(nèi)，取決于待檢查的身體部位。在經(jīng)過(guò)足夠的時(shí)間令標(biāo)記抗體或片段與患病組織(在本案中是癌組織)結(jié)合后，例如30分鐘到48小時(shí)，然后通過(guò)成像技術(shù)檢查待研究的患者部位。MRI、SPECT、平面閃爍成像以及其它新興的成像技術(shù)都可以使用。
監(jiān)測(cè)并記錄結(jié)合的放射性同位素的分布以及它隨著時(shí)間的增減。通過(guò)將該結(jié)果與從臨床正常個(gè)體的研究中所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，可以確定患病組織的存在和程度。
確切的成像方案會(huì)必要地發(fā)生變化，取決于患者特有的因素，并取決于待檢查的身體部位、給藥方法、所用標(biāo)記類型等等。不過(guò)，具體步驟的確定是熟練技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)。盡管用于成像方案的劑量取決于患者的年齡和體重，大約0.1到大約20mg的單次劑量，更優(yōu)選每個(gè)患者大約1.0到大約2.0mg抗體偶聯(lián)物被認(rèn)為是有用的。
F.聯(lián)合癌癥療法為進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明所提供的抗CD26抗體治療的功效，考慮聯(lián)合療法。因此，除了基于抗CD26抗體的療法之外，可利用第二治療劑。第二治療劑可以是化學(xué)治療劑、放射治療劑、基因治療劑、蛋白/肽/多肽治療劑、另一種免疫治療劑等。這些治療劑是本領(lǐng)域公知的。
可用本發(fā)明治療的癌癥包括但不限于，血液系統(tǒng)惡性腫瘤包括B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、或B細(xì)胞淋巴瘤、成淋巴細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞CD30+退行性大細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性T細(xì)胞淋巴瘤、HTLV-相關(guān)T細(xì)胞白血病或成人T細(xì)胞白血病、血癌、髓細(xì)胞性白血病、單核細(xì)胞白血病、髓細(xì)胞白血病、前髓細(xì)胞白血病、原始粒細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、成淋巴細(xì)胞白血病、毛細(xì)胞白血病。能夠治療的實(shí)體細(xì)胞腫瘤和癌癥包括例如腦(成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤)、肺、肝、脾、腎、淋巴結(jié)、小腸、胰腺、結(jié)腸、胃、乳房、骨、內(nèi)分泌腺、子宮內(nèi)膜、前列腺、睪丸、甲狀腺、卵巢、皮膚、頭頸、食道的腫瘤。此外，癌可以是前期癌、轉(zhuǎn)移和/或非轉(zhuǎn)移癌。
“有效量”定義為降低、減少、抑制或以其它方式消除癌細(xì)胞生長(zhǎng)、使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡、抑制轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)腫瘤壞死、殺死細(xì)胞、或者在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的藥劑的量。
第二治療劑可以在利用抗CD26抗體的治療之前或之后，以從數(shù)分鐘到數(shù)天到數(shù)周的時(shí)間間隔給藥。在第二治療劑和抗CD26抗體一起給藥的實(shí)施方案中，人們通常確保在每次遞送時(shí)間之間的重要時(shí)間段不失效。在這種情況下，認(rèn)為可以在彼此大約12-24小時(shí)內(nèi)向患者給予兩種形式的治療，更優(yōu)選在彼此大約6-12小時(shí)內(nèi)，最優(yōu)選只有大約12小時(shí)的延遲期。不過(guò)，在有些情形下，可能需要顯著延長(zhǎng)治療的時(shí)間周期，在分別給藥之間要隔數(shù)天(2、3、4、5、6或7)到數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
還可想到需要多于一次給予第二治療劑和抗CD26抗體以實(shí)現(xiàn)徹底的癌癥治愈?？梢允褂酶鞣N組合，第二治療劑表示為″A″而抗CD26抗體表示為″B″，例示如下A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/A/A A/B/B B/B/B/A B/B/A/BA/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B B/B/B/AA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/AA/B/B/BB/A/B/BB/B/A/B還可以考慮其他組合。每種藥劑確切的劑量和方案可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)加以改變。
下文提供的是關(guān)于一些其它在癌癥治療中有效的藥劑的描述。
a)放射治療劑放射治療劑和因子包括誘導(dǎo)DNA損傷的照射和波，例如γ-輻射、X-射線、UV-輻射、微波、電子發(fā)射、放射性同位素等等。用上述形式的輻射照射局部的腫瘤部位可實(shí)現(xiàn)治療。很可能所有這些因子可對(duì)DNA前體、DNA復(fù)制和修復(fù)、以及染色體的裝配和維持產(chǎn)生寬范圍的損傷DNA。
X-射線的劑量范圍從長(zhǎng)期(3到4周)的50到200倫琴的每天劑量到2000到6000倫琴的單次劑量。放射性同位素的劑量范圍變化廣泛，并取決于同位素的半衰期、發(fā)射的輻射的強(qiáng)度和類型以及腫瘤細(xì)胞的攝取。
b)外科手術(shù)大約60％癌癥患者會(huì)經(jīng)受某一類型的外科手術(shù)，包括預(yù)防性、診斷性或分階段性、治療性及姑息性手術(shù)。治療性外科手術(shù)是一種可與其它治療方法聯(lián)合應(yīng)用的癌癥療法，例如本發(fā)明的治療方法、化學(xué)療法、放射療法、激素治療、基因治療、免疫治療和/或其它可供選擇的療法。
治療性外科手術(shù)包括切除術(shù)，其中全部或部分癌組織被物理摘除、切除和/或破壞。腫瘤切除術(shù)是指物理去除至少部分腫瘤。除了腫瘤切除術(shù)，外科手術(shù)治療還包括激光外科手術(shù)、冷凍手術(shù)、電外科手術(shù)、以及顯微鏡控制的(miscopically controlled)外科手術(shù)(莫氏外科手術(shù))。還進(jìn)一步考慮了本發(fā)明可與去除表淺癌、前期癌、或附帶量的正常組織聯(lián)合應(yīng)用。
在切除部分或所有的癌細(xì)胞、組織或腫瘤后，可能在體內(nèi)形成一個(gè)空腔。可通過(guò)灌注、直接注射或在該區(qū)局部應(yīng)用額外的抗癌療法實(shí)現(xiàn)治療。這種治療可以重復(fù)，例如，每1、2、3、4、5、6或7天、或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個(gè)月。這些治療同樣可以變化劑量。
c)化學(xué)治療劑損傷DNA的藥劑是化療劑。這些可以是，例如，直接交聯(lián)DNA的藥劑、嵌入到DNA中的藥劑、以及通過(guò)影響核酸合成導(dǎo)致染色體和有絲分裂畸變的藥劑。直接交聯(lián)核酸特別是DNA的藥劑被予以考慮，并例示為順鉑以及其他DNA烷化劑。損傷DNA的藥劑還包括干擾DNA復(fù)制、有絲分裂以及染色體分離的化合物。
化學(xué)治療劑的一些例子包括抗生素類化療劑例如阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素(也公知為突變霉素和/或絲裂霉素-C)、放線菌素D(更生霉素)、博來(lái)霉素、plicomycin；植物生物堿例如紫杉醇(Taxol)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿；混雜藥劑例如順鉑、VP16、腫瘤壞死因子；烷化劑例如卡莫司汀、馬法蘭(也公知為左旋溶肉瘤素、L-苯丙氨酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、L-PAM、或L-溶肉瘤素，是氮芥的苯丙氨酸衍生物)、環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安(也公知為馬利蘭)、洛莫司??；以及其它藥劑例如順鉑(CDDP)、卡鉑、甲基芐肼、氮芥、喜樹(shù)堿、異環(huán)磷酰胺、硝基脲、依托泊苷(VP16)、他莫昔芬、雷洛昔芬、雌激素受體結(jié)合劑、吉西他濱、Navelbine、法尼基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、Transplatinum、5-氟尿嘧啶、以及氨甲蝶呤、Temazolomide(DTIC的一種含水形式)或者前述物質(zhì)的任何類似物或衍生物變體。
d)其他免疫療法其他免疫治療劑可以與抗CD26抗體聯(lián)合應(yīng)用。通常，免疫治療劑依賴于利用免疫效應(yīng)細(xì)胞和分子以靶向并破壞癌細(xì)胞。另外的免疫效應(yīng)物可以是，例如，另一種對(duì)腫瘤細(xì)胞表面上的某些其他標(biāo)志特異性的抗體。該第二種抗體本身可能作為治療的效應(yīng)物或者它可以募集其它細(xì)胞以真正引起T細(xì)胞殺傷。該第二種抗體也可以偶聯(lián)于藥物或毒素(化療劑、放射性核素、蓖麻毒素A鏈、霍亂毒素、百日咳毒素等)并僅僅作為靶向劑。作為選擇，效應(yīng)物可以是攜帶直接或間接地與腫瘤細(xì)胞靶相互作用的表面分子的淋巴細(xì)胞。各種效應(yīng)細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞。免疫療法可用作為聯(lián)合療法的一部分，與基于抗CD26抗體的療法聯(lián)合應(yīng)用。
聯(lián)合療法的一般程序討論如下。在一方面，免疫療法可用于靶向腫瘤細(xì)胞。存在許多腫瘤標(biāo)志，并且其中任何一種均可能適于本發(fā)明上下文中的靶向。常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志包括癌胚抗原、前列腺特異性抗原、泌尿系腫瘤相關(guān)抗原、胎兒抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酰路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受體、層粘連蛋白受體、erb B和p155。還存在備選的免疫刺激分子，包括細(xì)胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趨化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8以及生長(zhǎng)因子例如FLT3配體。將免疫刺激分子，或者作為蛋白，或者利用基因遞送，與本發(fā)明基于抗CD26抗體的療法相聯(lián)合，可增強(qiáng)抗腫瘤效果。
(i)被動(dòng)免疫療法存在多種不同的癌癥被動(dòng)免疫療法途徑。它們可以被廣泛地分類如下單獨(dú)注射抗體；注射偶聯(lián)于毒素或化學(xué)治療劑的抗體；注射偶聯(lián)于放射性同位素的抗體；注射抗-獨(dú)特型抗體；以及最后，清除骨髓中的腫瘤細(xì)胞。
(ii)主動(dòng)免疫療法在主動(dòng)免疫療法中，給予抗原肽、多肽或蛋白，或者自體或同種異體腫瘤細(xì)胞組合物或者“疫苗”，通常和獨(dú)特的細(xì)菌佐劑一起(Ravindranath和Morton，1991；Morton等，1993)。
(iii)過(guò)繼免疫療法在過(guò)繼免疫療法中，體外分離患者的循環(huán)淋巴細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞，用淋巴因子例如IL-2激活，或者用腫瘤壞死基因轉(zhuǎn)異，并重新給予(Rosenberg等，1988；1989)。為實(shí)現(xiàn)此療法，人們可以向動(dòng)物或人類患者給予免疫有效量的活化的淋巴細(xì)胞，聯(lián)合本文所述的摻入佐劑的抗原肽組合物。活化的淋巴細(xì)胞最優(yōu)選是早先從血液或腫瘤樣品中分離并且在體外活化(或“擴(kuò)增”)的患者自身的細(xì)胞。
e)基因治療在另一個(gè)實(shí)施方案中，想到將基因治療與本發(fā)明所述的抗CD26抗體療法聯(lián)合。多種核酸及核酸編碼的蛋白包含在本發(fā)明中，其中一些在下面描述。表1列舉了可被靶向的多種基因，用于某種形式的基因治療與本發(fā)明相聯(lián)合。
表1
f)其他藥劑認(rèn)為其他藥劑可以與本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用以提高治療的治療功效。與化學(xué)療法聯(lián)合應(yīng)用的一種治療形式包括高熱療法，這是一個(gè)患者組織被暴露于高溫(高達(dá)106°F)的過(guò)程。外部或內(nèi)部加熱器可包括在局部、區(qū)域、或全身的高熱療法應(yīng)用中。局部高熱療法包括向小區(qū)域例如腫瘤施熱?？衫脕?lái)自身體外部裝置的靶向腫瘤的高頻波從外部產(chǎn)熱。內(nèi)熱可包括無(wú)菌探針，包括細(xì)加熱電線或充滿熱水的中空管，植入的微波天線或射頻電極。
患者的器官或肢體被加熱用于區(qū)域治療，利用產(chǎn)生高能的裝置，例如磁鐵來(lái)實(shí)現(xiàn)。作為選擇，患者的部分血液可被取出并加熱，之后再灌注到將要內(nèi)部加熱的區(qū)域。全身加熱可在腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散遍布全身的情況下實(shí)施。溫水毯、熱蠟、感應(yīng)線圈、以及溫箱可用于此目的。
激素療法也可以與本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用。激素的應(yīng)用可在某些癌癥例如乳腺、前列腺、卵巢、或?qū)m頸癌的治療中使用，以減低某些激素例如睪酮或雌激素的水平或阻斷其效應(yīng)，并且這通常降低轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。
G.藥物藥學(xué)組合物包括有效量的抗CD26抗體或抗體偶聯(lián)物，可溶解或分散于藥學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)中，以形成治療性和/或診斷性制劑，然后可以根據(jù)本發(fā)明的方法給藥。
本發(fā)明的治療性抗體可以用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)載體配制以便向需要的患者給藥。這包括鹽水、磷酸緩沖鹽水、和其他含水載體、以及脂質(zhì)體、聚合物微球體以及其他控釋遞送裝置，如本領(lǐng)域所熟知的。
短語(yǔ)“藥學(xué)或藥理學(xué)上可接受的”是指當(dāng)適宜地向動(dòng)物或人給藥時(shí)，不產(chǎn)生不良的、過(guò)敏的或其他不適當(dāng)反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。如本文所用的，“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何及所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等等。這種介質(zhì)和制劑應(yīng)用于藥學(xué)活性物質(zhì)是本領(lǐng)域熟知的。除了與活性成分不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或制劑外，其在治療組合物中的應(yīng)用都可以考慮。補(bǔ)充性活性成分也可以加入到該組合物中。
活性化合物通常配制成供腸胃外給藥，例如，配制成經(jīng)靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、病損內(nèi)或甚至腹膜內(nèi)途徑注射。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的啟示下，將會(huì)知曉含有癌標(biāo)志抗體、偶聯(lián)物、抑制劑或其他藥劑作為活性組分或成分的含水組合物的制備。有代表性的，這種組合物可以制備成可注射的液體溶液或者懸液；也可以制備成固體形式，適用于在注射前加入液體而制成溶液或懸液；并且制備物還可以被乳化。
適于注射用的藥劑形式包括無(wú)菌水溶液或者分散體；配方包括芝麻油、花生油或含水丙二醇；以及用于臨時(shí)制備無(wú)菌注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末。在所有的情況下，所述形式必須是無(wú)菌的并且流動(dòng)程度必須達(dá)到容易注射。其在制造和貯存條件下必須是穩(wěn)定的，并且必須防止微生物例如細(xì)菌和真菌的污染作用。
活性化合物作為游離堿或者藥學(xué)上可接受的鹽的溶液可在水中與表面活性劑例如羥丙基纖維素適當(dāng)?shù)鼗旌隙苽洹７稚Ⅲw還可以在甘油、液體聚乙二醇和它們的混合物以及油中制備。在普通貯存和使用條件下，這些制備物含有防腐劑以阻止微生物的生長(zhǎng)。
還提供了中性或鹽形式的配方。藥學(xué)上可接受的鹽，包括酸加成鹽(與蛋白的游離氨基形成)以及與無(wú)機(jī)酸如鹽酸或磷酸，或者諸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有機(jī)酸形成的鹽。與游離羧基形成的鹽還可以得自于無(wú)機(jī)堿，例如鈉、鉀、銨、鈣、或鐵氫氧化物，以及諸如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等有機(jī)堿。
載體還可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、以及液體丙二醇等)、其合適的混合物以及植物油的溶劑或者分散介質(zhì)。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以通過(guò)，例如，利用包衣例如卵磷脂維持，至于分散體可通過(guò)維持所需的粒徑大小，以及通過(guò)利用表面活性物質(zhì)。預(yù)防微生物作用可通過(guò)各種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等實(shí)現(xiàn)。在許多情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉?？赏ㄟ^(guò)在組合物中利用吸收延遲劑，例如單硬脂酸鋁和明膠實(shí)現(xiàn)可注射組合物的延長(zhǎng)吸收。
無(wú)菌可注射溶液通過(guò)在合適的溶劑中將需要量的活性化合物與多種其他上文列舉的成分按照需要合并，進(jìn)而過(guò)濾滅菌予以制備。一般而言，分散體通過(guò)將多種滅菌活性成分引入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和需要的來(lái)自那些上文所列舉的其他成分的無(wú)菌介質(zhì)中予以制備。至于用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，從預(yù)先無(wú)菌過(guò)濾的溶液中，產(chǎn)生活性成分加上任何附加的所需成分的粉末。
還設(shè)計(jì)了用于局部注射的更為濃縮或高度濃縮的溶液。在這方面，優(yōu)選利用DMSO作為溶劑，因?yàn)檫@會(huì)產(chǎn)生極為迅速的滲透，將高濃度活性劑遞送到小區(qū)域內(nèi)。
一旦配制，溶液可以與劑型匹配的方式并以診斷或治療有效量給藥。對(duì)于水溶液腸胃外給藥，舉例來(lái)說(shuō)，如果以要，溶液應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)丶右跃彌_，并且液體稀釋劑首先用足夠的鹽水或葡萄糖使其等滲。這些特定的水溶液尤其適于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥。在其他實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)直接的腫瘤內(nèi)注射。作為選擇的，可以采用任何合適的遞送介質(zhì)用治療化合物輸注或灌注腫瘤。還設(shè)計(jì)了關(guān)于腫瘤的局部或區(qū)域性給藥。最后，可以進(jìn)行全身給藥。適當(dāng)?shù)臅r(shí)候還可以應(yīng)用持續(xù)給藥，舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)腫瘤被切除并且處理瘤床以消除殘留的顯微可見(jiàn)的疾病時(shí)。還設(shè)計(jì)經(jīng)由注射器或?qū)Ч懿迦脒f送。
就這點(diǎn)而言，在本文公開(kāi)內(nèi)容的啟示下，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會(huì)知曉可以使用的無(wú)菌含水介質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，一劑量可以溶于1mL等滲NaCl溶液中，或者加到1000mL皮下輸液中，或注射到打算輸注的部位(參見(jiàn)如″Remington′s Pharmaceutical Sciences″第15版，第1035-1038頁(yè)和第1570-1580頁(yè))。根據(jù)被治療或診斷的患者的情況，必然會(huì)發(fā)生劑量的某些變化。負(fù)責(zé)給藥的人將在任何情況下確定對(duì)于個(gè)體患者的合適劑量。
H.給藥路徑給藥路徑自然會(huì)隨病損的位置和性質(zhì)而變化，包括例如皮內(nèi)、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、經(jīng)皮、腸胃外、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)、灌注、灌洗、直接注射、局部應(yīng)用、以及口服給藥和配方。特別設(shè)計(jì)腫瘤內(nèi)注射、或者注射到腫瘤的血管系統(tǒng)內(nèi)，用于分離的、實(shí)體的、可接近的腫瘤。局部、區(qū)域或全身給藥也可能是合適的。關(guān)于外科手術(shù)干預(yù)，本發(fā)明可在術(shù)前、術(shù)中、和/或術(shù)后應(yīng)用，以治療殘留或轉(zhuǎn)移的疾病。舉例來(lái)說(shuō)，切除的腫瘤床可用含有抗CD26抗體的制劑注射或灌注。灌注可在切除后繼續(xù)，例如，通過(guò)將導(dǎo)管留置植入手術(shù)部位。還考慮定期的術(shù)后治療。
適當(dāng)?shù)臅r(shí)候還可以應(yīng)用持續(xù)給藥，舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)腫瘤被切除并且處理瘤床以消除殘留的顯微可見(jiàn)的疾病時(shí)。可以經(jīng)由注射器或?qū)Ч懿迦脒f送。這種持續(xù)灌注可在治療開(kāi)始之后進(jìn)行大約1-2小時(shí)、到大約2-6小時(shí)、到大約6-12小時(shí)、到大約12-24小時(shí)、到大約1-2天、到大約1-2周或更長(zhǎng)的一段時(shí)期。一般而言，經(jīng)由持續(xù)灌注的治療組合物的劑量等同于通過(guò)單次或多次注射給予的劑量，在灌注時(shí)間內(nèi)予以調(diào)整。進(jìn)一步認(rèn)為可通過(guò)肢體灌注給予本發(fā)明的治療組合物，特別是在黑素瘤和肉瘤的治療中。
治療方案同樣可以變化，并且通常取決于腫瘤類型、腫瘤位置、疾病進(jìn)展、以及患者的健康和年齡。顯然，某些類型的腫瘤會(huì)需要更具攻擊性的治療，但是同時(shí)，某些患者不能耐受更繁重的方案。臨床醫(yī)生最適合于根據(jù)治療劑已知的功效和毒性(如果有的話)作出這樣的決定。
在一些實(shí)施方案中，考慮包含抗CD26抗體的脂質(zhì)體配方。藥學(xué)制劑的脂質(zhì)體包囊與常規(guī)的藥物遞送系統(tǒng)相比延長(zhǎng)其半衰期。因?yàn)檩^大量可以被保護(hù)性包裝起來(lái)，這給予了如此遞送到細(xì)胞的藥劑劑量強(qiáng)化的機(jī)會(huì)。
“脂質(zhì)體”是一個(gè)通稱，包含許多種類的由圍繞起來(lái)的脂雙層形成的單層或多層脂質(zhì)載體。利用磷脂來(lái)制備根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體，其可攜帶凈正電荷、凈負(fù)電荷或者是中性的。聯(lián)十六烷基磷酸鹽可用來(lái)賦予脂質(zhì)體負(fù)電荷，而硬脂胺可用于賦予脂質(zhì)體正電荷。脂質(zhì)體特征在于磷脂雙層膜和內(nèi)部的含水介質(zhì)。多層脂質(zhì)體具有被含水介質(zhì)分隔開(kāi)的多個(gè)脂質(zhì)層。當(dāng)磷脂懸浮于過(guò)量的水溶液中時(shí)它們自發(fā)形成。脂質(zhì)成分經(jīng)歷自身重排，之后形成封閉的結(jié)構(gòu)，并在脂雙層之間包入水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，1991)。還可以考慮陽(yáng)離子脂質(zhì)-核酸復(fù)合體，例如脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺-核酸復(fù)合體。
I.實(shí)施例下列實(shí)施例用于顯示本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會(huì)理解以下實(shí)施例中公開(kāi)的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的實(shí)施中可很好發(fā)揮作用的技術(shù)，從而可以被認(rèn)為構(gòu)成其實(shí)施的優(yōu)選實(shí)施方案。不過(guò)，在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的啟示下，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，對(duì)所公開(kāi)的具體實(shí)施方案可以作出許多變化，而依然能取得類似或相似的結(jié)果。
實(shí)施例1抗CD26單克隆抗體的體外和體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)材料和方法動(dòng)物.3-4周齡雌性C.B-17 SCID小鼠得自Taconic Farms，Inc.并圈養(yǎng)在小分離籠中，所有的食物、水和草墊在用前高壓滅菌。
細(xì)胞.人CD30+退行性大細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Karpas 299是從診斷為CD30+退行性大細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤的25歲白種男性的外周血未成熟T細(xì)胞(blast T-cell)建立起來(lái)的，攜帶表面標(biāo)志CD4、CD5、HLA-DR和CD30，具有t(2；5)易位和重排的T細(xì)胞受體β-鏈基因(Fischer等，1988；Tian等，1995)。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10％FCS、青霉素(100單位/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的RPMI 1640(GIBCO BRL，Rockville，MD)組成。
抗體.所用的抗CD26單克隆抗體(單抗)為1F7和5F8，兩者都是識(shí)別人CD26的鼠源抗體，并且先前已有描述(Morimoto等，1989；Dang等，1990b；Torimoto等，1992)。所用的對(duì)照單抗是識(shí)別不在Karpas 299細(xì)胞系上表達(dá)的CD45 RA表位的同型對(duì)照小鼠IgG1，并如先前的描述建立(Morimotoet等，1989)?？?CD3和抗-CD2單抗購(gòu)自Coulter。關(guān)于蛋白質(zhì)印跡研究，抗-p21和抗-p27獲自TransductionLaboratories；抗-p53獲自Calbiochem；抗-cdk2、抗-cdk4、抗-細(xì)胞周期蛋白D獲自Upstate Biotechnology；抗-細(xì)胞周期蛋白E和抗-PCNA獲自Santa Cruz Biotechnology；而抗-肌動(dòng)蛋白獲自Sigma。
試劑.四氮唑鹽MTT(3，(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基四氮唑溴)(Sigma)在室溫下以5mg/ml的濃度溶于無(wú)菌PBS中，該溶液進(jìn)一步過(guò)濾滅菌并在4℃貯存于暗處。抽提緩沖液制備如下20％w/v的SDS在37℃溶解于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)(Sigma)和蒸餾水各50％的溶液中。pH通過(guò)加入1M HCl調(diào)節(jié)至4.7。環(huán)己酰亞胺CHX(Sigma)以20μg/ml的濃度應(yīng)用。
體內(nèi)研究在腫瘤移植前1天，所有的小鼠用0.2ml的抗-asilo GM1多克隆抗血清25％(v/v)(Wako，Richmond，VA)腹膜內(nèi)注射進(jìn)行預(yù)處理，以消除宿主自然殺傷細(xì)胞的活性并且促進(jìn)腫瘤移植(Tian等，1995)。為進(jìn)行存活研究，通過(guò)腹膜內(nèi)注射方式接種腫瘤細(xì)胞，接種腫瘤細(xì)胞后1天，SCID小鼠如所示的劑量和程序表以0.1ml無(wú)菌鹽水的形式接受鹽水、同型對(duì)照抗體或抗CD26單抗1F7的腹膜內(nèi)注射。監(jiān)測(cè)荷瘤小鼠腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展，并且對(duì)垂死小鼠實(shí)施安樂(lè)死并作尸檢尋找腫瘤證據(jù)。另外，對(duì)于具有最大維度測(cè)量為2cm的可見(jiàn)或可觸及腫瘤的小鼠也實(shí)施安樂(lè)死并作尸檢以降低動(dòng)物的痛苦。對(duì)于一些動(dòng)物，還收集其器官用于組織病理學(xué)分析。在一些研究中，SCID小鼠通過(guò)皮下注射方式注射腫瘤細(xì)胞，并且在腫瘤最大維度達(dá)到0.5cm大小后，隔天腫瘤內(nèi)注射鹽水或1F7(5μg每次注射)共7次注射。然后對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，并收集注射部位的腫瘤塊進(jìn)行組織病理學(xué)分析。
在其他研究中，通過(guò)皮下注射方式用溫育于單獨(dú)鹽水、100μg 1F7或同型對(duì)照抗體中的1×106的Karpas 299腫瘤細(xì)胞對(duì)SCID小鼠進(jìn)行注射。隨后，自腫瘤細(xì)胞接種后1天起，對(duì)SCID小鼠以0.1ml無(wú)菌鹽水的形式隔天給予鹽水、同型對(duì)照抗體(20μg/注射)或1F7(20μg/注射)皮下注射共10次注射，位于皮下腫瘤注射的原始部位。記錄最初出現(xiàn)可見(jiàn)腫瘤的日期以評(píng)價(jià)治療效果。
體外研究MTT分析.如前所述進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)分析(Hansen等，1989)。細(xì)胞置于微量反應(yīng)板中，在總體積為100μl的單獨(dú)培養(yǎng)基或加入所述抗體的培養(yǎng)基中溫育(50,000細(xì)胞/孔)。在37℃溫育48小時(shí)后，向孔中加入25μl MTT至終濃度為1mg/ml。微量反應(yīng)板接著在37℃溫育2小時(shí)，然后加入100μl抽提緩沖液。在37℃過(guò)夜溫育后，在570nm進(jìn)行OD測(cè)量。報(bào)告的數(shù)值代表一式三份孔的平均值，并且平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差小于15％。
免疫熒光.所有過(guò)程在4℃進(jìn)行，并如以前所述(Dang等，1990d)進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析(FACScan，Becton Dickinson)。細(xì)胞用合適的抗體著色，用PBS沖洗2次，然后用山羊抗-小鼠IgG FITC著色。細(xì)胞在流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析前用PBS沖洗2次。陰性對(duì)照僅用二抗著色。在一些研究中，如上所述向SCID小鼠腹膜內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞(1×106細(xì)胞/小鼠)。當(dāng)腫瘤可觸及時(shí)，對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死并收集腫瘤塊。從腫瘤塊中分離單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。
細(xì)胞周期分析.細(xì)胞或者在單獨(dú)培養(yǎng)基中、或者在5μg/ml抗體存在的條件下在37℃溫育。在合適的時(shí)間間隔收集細(xì)胞，用PBS沖洗兩次，并重懸于含有10μg/ml碘化丙錠、0.5％吐溫-20和0.1％RNA酶的PBS，室溫放置30分鐘。然后分析樣品的DNA含量(FACScan，Becton Dickinson)。細(xì)胞碎片和固定物被門控在外(gated out)，并利用CellQuest和ModFit LT程序定量Go/Gl、S和G2/M群。
SDS-PA GE和免疫印跡.在37℃溫育后，從孔中收集細(xì)胞，用PBS沖洗，并在由1％Brij 97、5 mM EDTA、0.02M HEPES pH 7.3、0.15M NaCl、1mM PMSF、0.5mM NaF、10μg/ml抑酶肽、以及0.2mM原釩酸鈉組成的裂解緩沖液裂解。在冰上溫育15分鐘后，離心去除核并收集上清液。將由20％甘油、4.6％SDS、0.125M Tris、pH6.8和0.1％溴酚藍(lán)組成的2×樣品緩沖液加入適當(dāng)小份的上清液中。蛋白樣品在標(biāo)準(zhǔn)條件下置于20％的凝膠上用mini-Protean II system(Bio-RadHercules，CA)進(jìn)行SDS-PAGE分析。為進(jìn)行免疫印跡，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上(Immobilon-P，Millipore)。在由0.1％吐溫20和5％牛血清白蛋白在TBS中組成的封閉液中于4℃過(guò)夜封閉后，膜在室溫下用以封閉液稀釋的合適一抗印跡1小時(shí)。然后用封閉液沖洗膜，并接著在室溫下施加以封閉液稀釋的合適的二抗1小時(shí)。二抗是山羊抗小鼠或山羊抗兔HRP偶聯(lián)物(Dako)。然后用封閉液沖洗膜，而且隨后通過(guò)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白(Amersham Pharmacia Biotech)。
結(jié)果CD26在Karpas 299淋巴瘤細(xì)胞系上的表達(dá).在腫瘤移植到SCID小鼠之前，用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)CD26在CD30+退行性大細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Karpas 299上的表達(dá)。如圖1A所示，Karpas 299細(xì)胞具有高的CD26表面表達(dá)，而CD3和CD2表面表達(dá)不可檢測(cè)。另外，與1F7溫育過(guò)夜導(dǎo)致CD26表面表達(dá)的下降(圖1B)，與以前報(bào)導(dǎo)的抗CD26介導(dǎo)調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞上CD26表面表達(dá)的發(fā)現(xiàn)相一致(Dang等，1990d)。
CD26-介導(dǎo)的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)在G1/S關(guān)卡.在體外研究中檢測(cè)了可溶性抗CD26抗體的結(jié)合對(duì)Karpas 299細(xì)胞和H9細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。如圖2A和圖2B所示，1F7的加入導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的下降，如MTT的減少所檢測(cè)到的。5F8單克隆抗體也對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)施加顯著的抑制效應(yīng)，不過(guò)，與1F7相比，使用了更高濃度的5F8?？笴D26單抗在測(cè)試濃度下對(duì)CD26-陰性細(xì)胞系不施加任何生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。1F7對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的額外證據(jù)通過(guò)細(xì)胞周期分析獲得。如表2所示，1F7的結(jié)合造成細(xì)胞周期進(jìn)程在Gl/S關(guān)卡的阻斷增強(qiáng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)的下降，如MTT攝取的減少所檢測(cè)到的。
表2抗CD26-介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯在Gl/S
Karpas 299細(xì)胞在37℃與培養(yǎng)基或抗體(2μg/ml)溫育。在所示的時(shí)間間隔，收集細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞周期分析。數(shù)據(jù)代表三次獨(dú)立的研究。
在CD26-介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯后p21表達(dá)的增強(qiáng).鑒于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑在Gl/S關(guān)卡所扮演的整體角色，檢測(cè)了在抗CD26抗體結(jié)合后p21、p27和p16的表達(dá)。Karpas 299細(xì)胞中表現(xiàn)出抗CD26處理后p21表達(dá)的增強(qiáng)，細(xì)胞與單獨(dú)培養(yǎng)基、含有同型對(duì)照單抗或1F7(2μg/ml)的培養(yǎng)基在37℃過(guò)夜溫育，然后收集細(xì)胞，并進(jìn)行SDS-PAGE和免疫印跡研究。在其他實(shí)驗(yàn)中，Karpas 299細(xì)胞用1F7(2μg/ml)或單獨(dú)培養(yǎng)基以多種不同的時(shí)間間隔處理，并檢測(cè)p21的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)p27的表達(dá)不受抗CD26單抗結(jié)合的影響，而p16的表達(dá)在與單獨(dú)培養(yǎng)基或者在對(duì)照抗體和抗CD26單抗存在下溫育的細(xì)胞中不可檢測(cè)。另一方面，p21的表達(dá)在CD26結(jié)合后增強(qiáng)。與對(duì)照條件下的溫育相比，用抗-1F7處理導(dǎo)致p21的表達(dá)增加。用抗-p21單抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡顯示了出現(xiàn)預(yù)期的遷移在21kd位置的條帶。已知在某些條件下，p21表達(dá)的誘導(dǎo)依賴于p53(El-Deiry等，1993；El-Deiry等，1994)。在Karpas 299細(xì)胞系中，與對(duì)照相比，在抗CD26處理過(guò)的細(xì)胞中沒(méi)有觀察到p53表達(dá)的變化。然而，p53的功能狀態(tài)尚未確定。
已知p21與細(xì)胞周期蛋白和CDK形成復(fù)合物而抑制T細(xì)胞周期進(jìn)程在G1/S。盡管抗CD26抗體結(jié)合增強(qiáng)了p21的表達(dá)，細(xì)胞周期蛋白D、細(xì)胞周期蛋白E、cdk2和cdk4的蛋白水平保持不變，所述蛋白全部都存在于細(xì)胞周期蛋白/CDK/p21復(fù)合物中。另外，PCNA蛋白水平不受抗CD26處理影響。在抗CD26結(jié)合到CD26+H9細(xì)胞系后得到相似的數(shù)據(jù)。還顯示了p21表達(dá)增強(qiáng)在用1F7處理3小時(shí)之內(nèi)可檢測(cè)到，其水平在持續(xù)的抗體處理期間升高。
p21表達(dá)增強(qiáng)依賴于重新蛋白合成.為了測(cè)定在抗CD26結(jié)合之后p21表達(dá)的增強(qiáng)是否依賴于增加的蛋白合成，在存在和缺乏蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)的條件下檢測(cè)p21的表達(dá)。在用1F7處理的細(xì)胞中觀察到p21的表達(dá)，而由1F7和CHX處理的細(xì)胞中沒(méi)有。因此，CD26結(jié)合后p21的表達(dá)依賴于重新蛋白合成。
1F7在攜帶Karpas 299的SCID小鼠體內(nèi)腫瘤模型中的抗瘤效果.抗CD26單抗1F7對(duì)于Karpas 299生長(zhǎng)的影響也在SCID小鼠腫瘤模型中加以檢測(cè)。為此，將1×106Karpas 299細(xì)胞通過(guò)腹膜內(nèi)注射植入SCID小鼠，并使腫瘤形成。隨后，取出腫瘤塊并建立單細(xì)胞懸液。在體內(nèi)模型中腫瘤形成過(guò)程不影響CD26表面表達(dá)。例如，如圖3A和圖3B中所示，在腫瘤植入SCID小鼠后的CD26表達(dá)與腫瘤移植前其水平相似。死后對(duì)腹膜內(nèi)腫塊的組織切片的組織病理分析也顯示了CD26的存在。
SCID小鼠通過(guò)腹膜內(nèi)注射接種Karpas 299細(xì)胞(1×106細(xì)胞/小鼠)，并且自腫瘤接種后第一天起，隔天用鹽水、同型對(duì)照抗體或1F7按照所示的劑量開(kāi)始處理，總共10次腹膜內(nèi)注射。如圖4A所示，用5μg/注射1F7處理的小鼠比那些用鹽水(p＜0.0001)或5μg/注射同型對(duì)照抗體(p＜0.001)處理的小鼠有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的存活優(yōu)勢(shì)。類似的，用10μg/注射1F7處理的小鼠與用生理鹽水處理的小鼠(p＜0.0001)或用10μg/注射同型對(duì)照抗體處理的小鼠(p＜0.001)相比的存活優(yōu)勢(shì)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)還顯示5μg/注射和10μg/注射的1F7劑量之間在存活方面沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異(p＝0.7)。
對(duì)小鼠用更高劑量腫瘤細(xì)胞(3×106細(xì)胞/小鼠)腹膜內(nèi)注射，并且隨后通過(guò)腹膜內(nèi)注射單獨(dú)鹽水、同型對(duì)照抗體(20μg/注射)、或者1F7以5μg/注射(p＜0.05)、10μg/注射(p＜0.05)或20μg/注射(p＜0.01)的劑量進(jìn)行處理，隔天給予，共計(jì)10次注射，與最初用較低劑量的腫瘤細(xì)胞注射處理的小鼠相比，再次地表現(xiàn)出沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的存活優(yōu)勢(shì)。用20μg/注射劑量的1F7處理的小鼠與那些用20μg/注射劑量的同型對(duì)照抗體處理的小鼠(p＜0.01)相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的存活優(yōu)勢(shì)。
比較用不同1F7劑量處理的小鼠，那些用20μg/注射處理的比那些用5μg/注射1F7劑量處理的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義的存活優(yōu)勢(shì)(p＜0.01)。用20μg/注射劑量的1F7處理的小鼠與那些用10μg/注射劑量處理的相比，也傾向于具有更大的生存活優(yōu)勢(shì)(p＝0.2)。同樣的，用10μg/注射的1F7劑量處理的那些與5μg/注射相比，傾向于具有更大的存活優(yōu)勢(shì)的趨勢(shì)(p＝0.09)(圖4B)。這些數(shù)據(jù)表明抗體治療的功效取決于存在的腫瘤的相對(duì)量。
死后組織切片的組織病理分析顯示對(duì)照條件下處理的荷瘤小鼠在局部部位和遠(yuǎn)處器官發(fā)生腫瘤浸潤(rùn)。在另一方面，1F7處理的小鼠在這些部位沒(méi)有腫瘤涉及的跡象。因此，抗CD26抗體還防止轉(zhuǎn)移腫瘤生長(zhǎng)。
還證明了1F7在SCID小鼠模型中的抗瘤效果。為此，對(duì)SCID小鼠通過(guò)皮下給藥接種1×106Kalpas 299細(xì)胞。在形成可見(jiàn)的腫塊后，對(duì)小鼠接著腫瘤內(nèi)注射單獨(dú)的鹽水或1F7(5μg/注射)進(jìn)行處理，隔天給予共7次注射。組織病理學(xué)分析顯示1F7處理導(dǎo)致腫瘤壞死，大部分腫瘤經(jīng)歷凝固性壞死。相比之下，鹽水處理導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞在腫塊的絕大部分中存活。用同型對(duì)照抗體以5μg/注射處理產(chǎn)生與鹽水處理相似的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞在腫塊中存活。
還測(cè)定了在皮下注射腫瘤細(xì)胞以及用鹽水、1F7或同型對(duì)照抗體皮下處理之后最初出現(xiàn)Karpas 299腫瘤所需的時(shí)間。為進(jìn)行這些研究，對(duì)SCID小鼠皮下注射在單獨(dú)鹽水、100μg 1F7或100μg同型對(duì)照抗體中溫育的1×106Kalpas 299細(xì)胞。隨后，在腫瘤細(xì)胞接種后1天起，SCID小鼠接著以0.1ml無(wú)菌鹽水的形式隔天接受鹽水、同型對(duì)照抗體(20μg/注射)或1F7(20μg/注射)的皮下注射，共計(jì)10次注射，位于皮下腫瘤注射的原始部位。記錄最初出現(xiàn)可見(jiàn)腫瘤的日期以評(píng)價(jià)治療效果。
如圖5所示，在用不同條件處理的小鼠之間，在可見(jiàn)腫瘤形成的速率方面存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的差異。與那些用同型對(duì)照抗體或僅用鹽水處理的組(分別是p＜0.001和p＜0.001)相比，1F7處理組具有較低的腫瘤形成速率，大多數(shù)1F7處理的小鼠在研究期間保持無(wú)瘤。
實(shí)施例2抗CD26單抗1F7抑制T淋巴細(xì)胞增殖并使細(xì)胞周期停滯在G1/S，伴有增強(qiáng)的p21Cip1表達(dá)方法細(xì)胞制備和培養(yǎng).根據(jù)以前描述的方法(Sugita等，1992)通過(guò)在體外刺激人外周血淋巴細(xì)胞建立人T細(xì)胞克隆。人Jurkat T細(xì)胞系獲自ATCC。Jurkat細(xì)胞系包括1)野生型CD26轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系(J.C26/DP+)，2)由在630位推定的催化絲氨酸殘基處含有丙氨酸的突變CD26轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞系，產(chǎn)生突變的CD26陽(yáng)性/DPPIV陰性Jurkat轉(zhuǎn)染體(J.C26/DP-)，以及3)未轉(zhuǎn)染的親本Jurkat細(xì)胞(Jwt)(Tanaka等，1992；Tanaka等，1993)。Jurkat轉(zhuǎn)染體以1×106/ml的濃度在37℃培養(yǎng)于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10％FCS、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(100μg/ml)(Life Technologies Inc.)和G418(500μg/ml)(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的RPMI 1640(Life Technologies Inc.，Grand Island，NY)組成。未轉(zhuǎn)染的親本Jurkat細(xì)胞維持在不含G418的相同培養(yǎng)基中。人外周血單核的細(xì)胞(PBMC)從健康成年志愿者中收集，用Ficoll/Paque(Amersham Pharmacia Biotech.，Piscataway，NJ)離心分離。為獲得高度純化的T細(xì)胞群，PBMC被分成E花結(jié)陽(yáng)性群并用作為靜息T細(xì)胞，正如利用FITC-標(biāo)記的抗-CD3單抗(BDPharMingen，San Diego，CA)通過(guò)流式細(xì)胞儀分析(FACScaliburTM，Nippon Becton Dickinson Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)所測(cè)定的，純度＞95％。T細(xì)胞克隆在含IL-2(10ng/ml；PeproTech EC Ltd.，London，U.K.)的培養(yǎng)基中維持，并每2-3周用照射的(30Gy)異源PBMC(1.0*105/ml)再刺激(Sugita等，1992)。細(xì)胞生存力用錐蟲(chóng)藍(lán)(Sigma-Aldrich)染料排斥法檢測(cè)。
抗體和試劑.抗CD26單抗1F7和5F8，以及同型對(duì)照單抗4B4(CD29單抗)是以前所描述的(Morimoto等，1989；Torimoto等，1992；Morimoto等，1985，并入本文作為參考)?？?CD3單抗(OKT3)也在別處有描述(Kung等，1979，并入本文作為參考)。下列抗體和試劑購(gòu)自于BD PharMingenFITC標(biāo)記的抗-溴脫氧尿苷(BrdU)、抗-p21Cip1、抗-p27kip1、抗-p53、抗-細(xì)胞周期蛋白D1、抗-CDK4、抗-CDK-6、抗-ERK以及7-氨基放線菌素D(7-AAD)。小鼠單克隆抗-磷酸酪氨酸4G10和抗-β-肌動(dòng)蛋白購(gòu)自于Sigma-Aldrich，，而抗-磷酸化ERK來(lái)自Santa Cruz(Delaware Avenue，CA)。用于刺激細(xì)胞和抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑的來(lái)源和工作濃度如下OKT3(0.05μg/ml)、PMA(10ng/ml；Sigma-Aldrich)、諾考達(dá)唑(500ng/ml來(lái)自1mg/ml的DMSO貯液；Sigma-Aldrich)、PD98059(10μM來(lái)自10mM的DMSO貯液；BIOMOL，Plymouth Meeting，PA)、以及U0126(10μM來(lái)自10mM的DMSO貯液；Cell Signaling Technology Inc.，Beverly，MA)。在開(kāi)始與單抗培養(yǎng)之前細(xì)胞用每種抑制劑處理30分鐘。
流式細(xì)胞儀分析.所有步驟在4℃進(jìn)行，并且用FACSCaliburTM(Nippon Becton-Dickinson)利用標(biāo)準(zhǔn)CELLQuestTM獲取/分析軟件(Becton-Dickinson)進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FCM)分析。細(xì)胞用合適的抗體著色，并在FCM分析前用冰冷的PBS沖洗兩次。
細(xì)胞周期分析.細(xì)胞(1×106/孔)在37℃下于單獨(dú)培養(yǎng)基中或者在所示濃度的1F7、5F8或同型對(duì)照單抗(4B4)存在下培養(yǎng)，有或無(wú)諾考達(dá)唑。在應(yīng)用抑制劑的實(shí)驗(yàn)中，在與抗CD26單抗溫育之前，1×106細(xì)胞與所示濃度的各種抑制劑于37℃溫育30分鐘。在合適的時(shí)間間隔，細(xì)胞用10μM的BrdU在37℃脈沖最后1小時(shí)。然后收集細(xì)胞，并用冰冷的PBS沖洗兩次。固定、透化、以及用FITC標(biāo)記的抗-BrdU和7-AAD對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫著色根據(jù)BrdU流式細(xì)胞儀試劑盒的BDPharMingen指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行。然后樣品用FACSCaliburTM在制備后1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分析。在將細(xì)胞碎片和固定物分選出去后，通過(guò)施加于BrdU相對(duì)7-AAD散點(diǎn)圖的區(qū)域門控，F(xiàn)CM分析使得能夠?qū)νＡ粼诩?xì)胞周期的G0/G1、G2/M以及S期的細(xì)胞亞群進(jìn)行區(qū)分。G0/G1、S和G2/M群用CELLQuestTM程序(Becton-Dickinson)定量。
溶胞產(chǎn)物的制備和蛋白質(zhì)印跡分析.在37℃溫育后，從孔中收集細(xì)胞，用PBS沖洗，并在RIPA裂解緩沖液中進(jìn)行裂解，該緩沖液由1％NP-40、0.5％脫氧膽酸納、0.1％SDS、5mM EDTA、10mMTris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl、1mM PMSF、0.5mM NaF、10μg/ml抑酶肽以及0.02mM Na3VO4組成。為檢測(cè)磷酸酪氨酸蛋白，溫育后的細(xì)胞用冰冷的含有5mM EDTA、10mM NaF、10mM焦磷酸鈉和0.4mMNa3VO4的PBS沖洗。離心細(xì)胞，然后溶解于裂解緩沖液中(1％NP-40、0.5％脫氧膽酸納、5mM EDTA、50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.15MNaCl、1mM PMSF、10mM碘乙酰胺、10mM NaF、10μg/ml抑酶肽以及0.4 mM Na3VO4)。通過(guò)超速離心除去沉淀后，溶胞產(chǎn)物在還原條件下，在合適濃度的凝膠上利用mini-Protean II system(Bio-RadLaboratories Hercules，CA)進(jìn)行SDS-PAGE分析。關(guān)于免疫印跡，蛋白被轉(zhuǎn)移到處于25mM Tris、192mM甘氨酸以及20％甲醇中的聚偏二氟乙烯膜上(Immobilon-P；Milipore，Bedford，MA)，并且膜在有含5％脫脂奶的0.05％吐溫20的PBS中于室溫封閉1小時(shí)。特定抗原通過(guò)相應(yīng)的單抗繼之以HRP-偶聯(lián)的抗-小鼠Ig(Amersham Pharmacia)探測(cè)。蛋白質(zhì)印跡通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光技術(shù)(NEN，Boston，MA)觀察。
體外細(xì)胞增殖分析.細(xì)胞增殖通過(guò)[3H]-胸苷摻入測(cè)定(ICNRadiochemicals，Irvine，CA)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的所有增殖分析都進(jìn)行一式三份。每個(gè)微量培養(yǎng)板孔中0.2×106細(xì)胞在僅有培養(yǎng)基或存在1F7(1μg/ml)時(shí)在有或沒(méi)有OKT3和PMA刺激的條件下于37℃溫育。溫育72小時(shí)后，細(xì)胞用[3H]-胸苷(1μCi/孔)脈沖培養(yǎng)最后的8小時(shí)。然后將細(xì)胞收集到玻璃濾器(Wallac，Turk，F(xiàn)inland)上，并用液體閃爍計(jì)數(shù)器(Wallac)計(jì)數(shù)放射性。[3H]-胸苷攝取表示為一式三份樣品的平均cpm。
統(tǒng)計(jì)學(xué)。用Student’s t檢驗(yàn)來(lái)確定對(duì)照和樣品之間的差異是否顯著(p＜0.05為顯著)。
結(jié)果抗CD26-單抗處理抑制細(xì)胞周期進(jìn)展在G1/S關(guān)卡.檢測(cè)了可溶性抗CD26抗體結(jié)合對(duì)用具有DPPIV活性結(jié)構(gòu)域(J.C26/DP+)以及沒(méi)有DPPIV活性結(jié)構(gòu)域(J.C26/DP-)的CD26的cDNA轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響(21，22)。為分析細(xì)胞周期狀態(tài)，應(yīng)用了在細(xì)胞用BrdU脈沖后FITC標(biāo)記的抗-BrdU和7-AAD雙色著色的FCM。為更好地觀察細(xì)胞周期效應(yīng)，細(xì)胞用諾考達(dá)唑處理，其使細(xì)胞停滯在M期，除非細(xì)胞停滯在G0/G1期。用錐蟲(chóng)藍(lán)染料排斥法證實(shí)的細(xì)胞生存力在有或無(wú)諾考達(dá)唑的情況下仍然＞95％。如圖6A所示，抗CD26單抗1F7加入到J.C26/DP+導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程阻斷在G1/S關(guān)卡。值得注意的是，在J.C26/DP-或親本Jurkat(Jwt)中未觀察到細(xì)周胞周期停滯在G1/S關(guān)卡(圖6A)。在圖6B中，由諾考達(dá)唑引起的G2/M積聚在1F7未處理的J.C26/DP+中觀察到，但在1F7處理的J.C26/DP+中沒(méi)有。這種由諾考達(dá)唑所致的G2/M積聚效應(yīng)還在有或無(wú)1F7的情況下在J.C26/DP-和Jwt中觀察到(圖6B)。在另一方面，S期不受1F7處理的影響(圖6C)。這些發(fā)現(xiàn)提示細(xì)胞周期進(jìn)程在G1/S關(guān)卡的效應(yīng)取決于CD26分子本身固有的DPPIV酶活性。
抗CD26單抗處理后與細(xì)胞周期停滯在G1/S關(guān)卡相關(guān)的p21表達(dá)的增強(qiáng).通過(guò)FCM分析密切檢測(cè)Jurkat細(xì)胞對(duì)1F7的細(xì)胞應(yīng)答，揭示J.C26/DP+在開(kāi)始與1F7培養(yǎng)后6小時(shí)表現(xiàn)出G1停滯增加大約25％(圖7)。在1F7處理后12和24小時(shí)，J.C26/DP+逐漸喪失其最初的G0/G1停滯。值得注意的是，在J.C26/DP-中，沒(méi)有觀察到細(xì)胞周期停滯。這些發(fā)現(xiàn)再次提示對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程在G1/S關(guān)卡的效應(yīng)取決于DPPIV的酶活性。1F7在0.1-10.0μg/ml濃度的效應(yīng)是劑量依賴性的。應(yīng)當(dāng)注意另一種識(shí)別與1F7不同的CD26表位的抗CD26單抗5F8沒(méi)有如對(duì)1F7所觀察到的效應(yīng)(Torimoto等，1992)。
因?yàn)榧?xì)胞周期停滯可伴隨著CDKI的增加和/或細(xì)胞周期蛋白或CDK的減少，檢測(cè)了1F7結(jié)合后各種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。與對(duì)照條件下溫育(僅有培養(yǎng)基或4B4作為同型匹配的對(duì)照單抗處理)相比，用1F7處理J.C26/DP+導(dǎo)致p21Cip1表達(dá)增加，如對(duì)蛋白相對(duì)水平的蛋白質(zhì)印跡分析所顯示的。
關(guān)于蛋白質(zhì)印跡，J.C26/DP+和J.C26/DP-與1F7溫育。然后在所示的培養(yǎng)時(shí)期收集細(xì)胞，并用合適的單抗通過(guò)蛋白質(zhì)印跡評(píng)價(jià)p21Cip1的表達(dá)。細(xì)胞提取物的等量上樣利用抗-β-肌動(dòng)蛋白單抗證實(shí)。僅有培養(yǎng)基或4B4未觀察不到對(duì)p21Cip1表達(dá)的影響。用1F7處理J.C26/DP-不導(dǎo)致p21Cip1表達(dá)的增加。在用1F7處理6小時(shí)之內(nèi)檢測(cè)到p21Cip1表達(dá)的增加，然后逐漸下降，與圖6A中所示的細(xì)胞周期分析一致。
進(jìn)一步的，J.C26/DP+和J.C26/DP-與單獨(dú)培養(yǎng)基、同型對(duì)照單抗4B4(Iso)或1F7溫育6小時(shí)。然后收集細(xì)胞，并用合適的單抗通過(guò)蛋白質(zhì)印跡評(píng)價(jià)p21Cip1、p27Kip1、p53、細(xì)胞周期蛋白D1、CDK4以及CDK6的表達(dá)。細(xì)胞提取物的等量上樣利用抗-β-肌動(dòng)蛋白單抗證實(shí)。與p21Cip1相比，細(xì)胞周期蛋白D1、CDK4、CDK6、p27Kip1以及p53(與G1-調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物有關(guān))的表達(dá)在用1F7處理后6小時(shí)不變。
應(yīng)指出這些蛋白的表達(dá)在開(kāi)始與1F7培養(yǎng)后的0-24小時(shí)之間不變。這些結(jié)果表明1F7刺激導(dǎo)致p21Cip1的增量調(diào)節(jié)，并且通過(guò)CD26的DPPIV酶活性使細(xì)胞周期停滯在G1/S關(guān)卡。
MEK-ERK途徑在1F7介導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯在G1/S關(guān)卡中扮演重要角色.CD26分子還顯示存在于膜脂筏(raft)中，而1F7與CD26的連接顯示出可增加CD26分子募集到筏(Ishii等，2001)。脂筏中的T細(xì)胞受體(TCR)還與其他信號(hào)分子相互作用(Janes等，1999；Cheukuri等，2001)，從而誘導(dǎo)信號(hào)分子的酪氨酸磷酸化增加。CD26通過(guò)其與關(guān)鍵細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物理和功能關(guān)聯(lián)而參與必要的T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)事件(Morimoto和Schlossman，1998；von Bonin等，1998；De Meester等，1999)。其他研究證明T細(xì)胞和其他細(xì)胞譜系中Raf-MEK-ERK途徑的超活化導(dǎo)致關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物表達(dá)的改變和細(xì)胞周期停滯在G1/S關(guān)卡(Boussiotis等，1997；Sewing等，1997；Chen等，1999)。因此，關(guān)于p21Cip1表達(dá)，檢測(cè)T細(xì)胞中與CD26相關(guān)的信號(hào)分子的酪氨酸磷酸化。J.C26/DP+、J.C26/DP-和Jwt與1F7溫育多種時(shí)間段，即0、5和10分鐘。然后收集細(xì)胞，用5-20％梯度SDS-PAGE分離，并用抗-磷酸酪氨酸單抗4G10(pY)通過(guò)蛋白質(zhì)印跡評(píng)價(jià)酪氨酸磷酸化的狀態(tài)。細(xì)胞提取物的等量上樣利用識(shí)別β-肌動(dòng)蛋白的抗體證實(shí)。1F7處理J.C26/DP+在起始培養(yǎng)后5到10分鐘誘導(dǎo)分子量大約為40kDa的蛋白酪氨酸磷酸化。然而，在用1F7處理J.C26/DP-和Jwt后，沒(méi)有觀察到誘導(dǎo)酪氨酸磷酸化。這些變化在利用同型匹配對(duì)照單抗4B4的實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有觀察到。
為表征40kDa的磷酸化蛋白，檢測(cè)了ERK的磷酸化狀態(tài)，因?yàn)橄惹暗墓ぷ鞅砻鱎af-MEK-ERK途徑介導(dǎo)抗-CD3單抗誘導(dǎo)G1停滯(Chen等，1999)。ERK蛋白顯示出在用1F7處理J.C26/DP+后被磷酸化。關(guān)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，J.C26/DP+與單獨(dú)培養(yǎng)基、同型對(duì)照單抗4B4(Iso)或1F7溫育多種時(shí)間段，即0、5和10分鐘。溶胞產(chǎn)物用抗-磷酸-ERK印跡，并用抗-ERK單抗重新探測(cè)。對(duì)用J.C26-或Jwt的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有觀察到差別。
為證實(shí)這些結(jié)果，檢測(cè)了抑制MEK-ERK途徑對(duì)p21Cip1表達(dá)的作用。細(xì)胞在缺乏或存在MEK-特異性抑制劑PD98059的情況下用1F7處理6小時(shí)。與ERK磷酸化相關(guān)的p21Cip1的表達(dá)增強(qiáng)明顯地因MEK抑制劑的存在而受到抑制。應(yīng)指出凝膠泳道的等量上樣利用識(shí)別ERK的抗體通過(guò)探測(cè)蛋白質(zhì)印跡證實(shí)。這些結(jié)果表明1F7處理后p21Cip1的誘導(dǎo)是通過(guò)MEK-ERK途徑介導(dǎo)的。
為進(jìn)一步確定在用1F7處理后，MEK-ERK途徑在T細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控中的作用，在存在或不存在MEK-特異性抑制劑PD98059和U0126的情況下，通過(guò)FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分析。與關(guān)于p21Cip1表達(dá)的結(jié)果一致，1F7處理的J.C26/DP+的G0/G1停滯因MEK特異性抑制劑的存在而被中斷(圖8)，這在J.C26/DP-和Jwt中沒(méi)有觀察到。這些發(fā)現(xiàn)表明抗CD26處理通過(guò)激活MEK-ERK途徑，在T細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1/S關(guān)卡，導(dǎo)致CDKI p21Cip1表達(dá)的增強(qiáng)。
抗CD26單抗1F7處理抑制T細(xì)胞克隆的增殖。已經(jīng)描述了在T細(xì)胞增殖期間以及在自身免疫傾向性BXSB的CD4+記憶T細(xì)胞中p21Cipl的增量調(diào)節(jié)(Nourse等，1994；Sabzevari等，1997)。此外，p21Cip1一缺陷小鼠積聚異常量的CD4+記憶T細(xì)胞，并發(fā)生對(duì)核抗原的耐受喪失(Sabzevari等，1997)。考慮到這些發(fā)現(xiàn)，為定義1F7介導(dǎo)的p21Cip增強(qiáng)對(duì)人外周T細(xì)胞增殖的生物學(xué)效應(yīng)，檢測(cè)了可溶性抗CD26抗體結(jié)合對(duì)來(lái)源于PBMC的人T細(xì)胞克隆增殖的影響。如圖9所示，1F7加入人T細(xì)胞克隆導(dǎo)致細(xì)胞增殖的下降，如[3H]-胸苷攝取所測(cè)定的。值得注意的是用抗CD26單抗5F8(Morimoto等，1992；Dong等，1998)或同型對(duì)照抗體4B4處理后沒(méi)有抑制效應(yīng)的事實(shí)。與上述用Jurkat轉(zhuǎn)染體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，用1F7處理后，T細(xì)胞克隆中的p21Cipl表達(dá)也增強(qiáng)(圖4B)。在PHA blast T細(xì)胞中也觀察到1F7增強(qiáng)p21Cip1表達(dá)的效應(yīng)，雖然是較小的程度，但不在靜息T細(xì)胞中。關(guān)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)，T細(xì)胞克隆、10天PHA blast T細(xì)胞、以及新鮮分離的T細(xì)胞與單獨(dú)培養(yǎng)基或1F7溫育72小時(shí)。然后制備溶胞產(chǎn)物，用識(shí)別p21Cip1的單抗進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。細(xì)胞提取物的等量上樣利用識(shí)別β-肌動(dòng)蛋白的單抗證實(shí)。這些結(jié)果顯示在活化的T細(xì)胞例如T細(xì)胞克隆和PHAblast T細(xì)胞中，T細(xì)胞增殖由1F7處理通過(guò)誘導(dǎo)p21Cip1而被抑制。
本發(fā)明人證明抗CD26單抗1F7結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1/S關(guān)卡，并且CD26的參與通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21Cip1的表達(dá)，誘導(dǎo)CD26 Jurkat轉(zhuǎn)染體的G1停滯。這種效應(yīng)是通過(guò)激活MEK-ERK途徑介導(dǎo)的。除了CD26 Jurkat轉(zhuǎn)染體外，在來(lái)源于人PBMC的T細(xì)胞克隆和PHA blast T細(xì)胞中也觀察到增殖的抑制和p21Cip1表達(dá)的增強(qiáng)。
II類MHC-限制性人CD4+T細(xì)胞克隆的抗原敏感性被證明在刺激后隨著時(shí)間逐漸增加。這由以下事實(shí)證實(shí)培養(yǎng)物中需要更少的抗原，以及用于T細(xì)胞活化的每個(gè)抗原呈遞細(xì)胞(APC)的肽-MHC復(fù)合體數(shù)目下降，和對(duì)II類MHC阻斷的抑制作用的抗性增加(Lehaman等，1989)。以前證明抗原敏感性的增加伴隨著CD26、LFA-1和VLA-1的細(xì)胞表面表達(dá)增加，而TCR和一系列其他T細(xì)胞表面分子的表達(dá)保持不變(Falcioni等，1996)。本發(fā)明還證明晚期記憶T細(xì)胞表型發(fā)生在體內(nèi)活化的T細(xì)胞中。此外，利用合適的單抗，用CD26單抗處理及MHC阻斷被證明有助于抑制活化的記憶T細(xì)胞增殖(Falcioni等，1996)。此外，抗CD26單抗對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制作用的分子機(jī)制已經(jīng)證明是通過(guò)細(xì)胞周期停滯在G1/S關(guān)卡以及通過(guò)激活MEK-ERK途徑誘導(dǎo)p21Cip1。
另外，T細(xì)胞中的CD26分子存在于膜脂筏中，因此，CD26與抗CD26單抗的交聯(lián)誘導(dǎo)CD26分子聚集進(jìn)入脂筏。該過(guò)程通過(guò)信號(hào)分子，例如Cbl、ZAP-70、ERK、p56Lck和CD3-ζ的酪氨酸磷酸化最終導(dǎo)致T細(xì)胞活化(Ishii等，2001)。TCR還通過(guò)募集各種表面和胞質(zhì)銜接蛋白到脂筏中面發(fā)揮其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(Janes等，1999；Cheukuri等，2001)。作為TCR信號(hào)作用的負(fù)調(diào)節(jié)物，Rap1、Raf和Cbl-b已經(jīng)顯示在脂筏中聚集(Boussiotis等，1997；Sewing等，1997；Leo和Schraven，2001)。關(guān)于這一點(diǎn)，已經(jīng)證明Raf-MEK-ERK信號(hào)傳導(dǎo)強(qiáng)度增加可引發(fā)T細(xì)胞周期在G1/S關(guān)卡停滯，伴隨著p21Cip1表達(dá)的增加。同時(shí)，高劑量抗-CD3單抗通過(guò)激活Raf-MEK-ERK途徑誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，導(dǎo)致p21Cip1在T細(xì)胞中表達(dá)，并且不能下調(diào)p27Kip1的表達(dá)(Sewing等，1997；Chen等，1999)。
越來(lái)越多的證據(jù)表明DPPIV酶活性在CD26介導(dǎo)的T細(xì)胞共刺激以及T細(xì)胞免疫應(yīng)答中具有重要的作用(Morimoto和Schlossman，1998；von Bonin等，1998；De Meester等，1999)。本發(fā)明證明在用抗CD26單抗1F7處理T細(xì)胞后，DPPIV酶活性在p21Cip1的誘導(dǎo)中起作用。據(jù)報(bào)導(dǎo)CD26/DPPIV通過(guò)在N-末端切割選擇的趨化因子以修飾其生物功能，來(lái)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能(De Meester等，1999；Oravecz等，1997；Proost等，1998)。鑒于其作為絲氨酸蛋白酶切割某些生物因子的能力，可以想到CD26的DPPIV酶活性似乎在T細(xì)胞中通過(guò)切割相關(guān)的生物因子調(diào)節(jié)ERK的磷酸化并誘導(dǎo)p21Cipl。設(shè)計(jì)了旨在鑒定負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)p21Cip1表達(dá)的CD26/DPPIV-相關(guān)因子的實(shí)驗(yàn)。
1F7具有比5F8更強(qiáng)的效力這一發(fā)現(xiàn)證明選擇的CD26表位的參與是在單抗處理后介導(dǎo)細(xì)胞周期停滯、抑制細(xì)胞增殖、以及誘導(dǎo)p21Cip1表達(dá)中的重要因子。還應(yīng)該注意，1F7具有很強(qiáng)的輔助促有絲分裂(co-mitogenic)能力，而5F8沒(méi)有這種活性(Dong等，1998)。因而，1F7和5F8所識(shí)別的CD26分子上的表位具有截然不同的功能效果。
活化的記憶T細(xì)胞表達(dá)高水平的CD26，并且這種表型的晚期記憶T細(xì)胞與體內(nèi)和體外抗原敏感性增加相關(guān)(Falcioni等，1996)。體內(nèi)研究揭示很多CD26+T細(xì)胞發(fā)現(xiàn)于多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的炎癥組織中(Mizokami等，1996；Eguchi等，1989；Hafler等，1985)，指示CD26+T細(xì)胞作為效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)揮功能。因此，CD26可作為免疫治療劑應(yīng)用。事實(shí)上，抗CD26治療據(jù)報(bào)導(dǎo)在同種異體骨髓移植術(shù)后可有效地降低對(duì)甾體耐藥的急性GVHD的發(fā)生率(Bacigalupo等，1985；De Meester等，1993)，雖然這些臨床結(jié)果涉及的確切機(jī)制尚未闡明。本數(shù)據(jù)顯示通過(guò)CD26對(duì)活化T細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期調(diào)節(jié)可用于通過(guò)抑制細(xì)胞增殖控制急性GVHD。結(jié)合觀察到p21基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)環(huán)孢菌素A-介導(dǎo)的抑制淋巴細(xì)胞增殖(Ashwani等，2000)，抗CD26單抗療法提供了誘導(dǎo)免疫抑制的可供選擇的一種策略，其可能比目前對(duì)常規(guī)藥劑所見(jiàn)到的副作用毒性更小。
實(shí)施例3臨床試驗(yàn)這一部分涉及發(fā)展單獨(dú)應(yīng)用抗CD26抗體或聯(lián)合其他治療劑的抗癌療法的人類治療方案。盡管這里只描述了癌癥相關(guān)的治療，這個(gè)實(shí)施例還可應(yīng)用于治療免疫疾病如自身免疫、GVHD以及預(yù)防器官移植排斥反應(yīng)。
在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的啟示下，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員會(huì)知曉進(jìn)行臨床試驗(yàn)的各種要素，包括患者治療和監(jiān)測(cè)。下列信息是作為一般性指導(dǎo)給出的，用于在臨床試驗(yàn)中建立本文所述的以抗CD26抗體為基礎(chǔ)的療法，單獨(dú)或者與其他癌癥療法中常規(guī)使用的輔助治療聯(lián)合。
一期臨床試驗(yàn)的候選者是所有常規(guī)療法失敗的患者。最初大約有100個(gè)患者得到治療。他們的年齡范圍從16到90(中值65)歲?；颊邔⒌靡灾委?，獲得樣本，無(wú)性別、種族、人種偏性。對(duì)于此患者群體，大約41％為婦女，6％為黑人，13％為西班牙人，3％為其他少數(shù)民族。這些估計(jì)基于過(guò)去5年中在MD Anderson Cancer Center所觀察到的連續(xù)病例。
最理想的是患者表現(xiàn)出充足的骨髓功能(定義為外周絕對(duì)粒細(xì)胞計(jì)數(shù)＞1,000/mm3，而且血小板計(jì)數(shù)為100,000/mm3(除非由于骨髓中涉及腫瘤而減少))、充足的肝功能(膽紅素≤1.5mg/dl，SGOT/SGPT＜4×正常上限)以及充足的腎功能(肌酐≤1.5mg/dl)。
研究樣本根據(jù)現(xiàn)有得到許可的項(xiàng)目和方案從外周血或骨髓獲得。有些研究材料從作為患者護(hù)理的一部分所取的標(biāo)本中得到。
上述抗CD26抗體治療將在試驗(yàn)性的一周基礎(chǔ)上向患者局部或全身給藥。典型的治療過(guò)程可包括在7到21天的時(shí)間周期內(nèi)遞送大約6劑。經(jīng)臨床醫(yī)生的選擇，治療方案可以每三周或在更低頻率的(每月，每雙月，每季度等)基礎(chǔ)上繼續(xù)6劑。當(dāng)然，這些只是治療的例示性時(shí)間，熟練的從業(yè)者將容易地認(rèn)識(shí)到許多其他時(shí)間過(guò)程也是可能的。
給藥方式可以是局部給藥，包括，通過(guò)腫瘤內(nèi)注射和/或者通過(guò)注射入腫瘤血管系統(tǒng)、氣管內(nèi)、鞘內(nèi)、內(nèi)窺鏡的、皮下、和/或經(jīng)皮。給藥方式可以是全身的，包括，靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和/或口服給藥。
抗CD26抗體靜脈內(nèi)的給藥劑量范圍是從1μg/kg到1g/kg，盡管精確的劑量將依賴于以后的測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，抗體作為脂質(zhì)體制劑或潛在地通過(guò)其他人工載體給藥?？贵w還可以作為無(wú)活性的部分給藥，遇到表達(dá)CD26的腫瘤細(xì)胞才被激活。例如，抗體脂質(zhì)體制劑的靜脈內(nèi)給藥范圍由0.01到100mg/m2/天。當(dāng)然，熟練技術(shù)人員會(huì)理解盡管這些劑量范圍提供有用的指導(dǎo)，取決于個(gè)體患者的需要，疾病、性別、身體狀態(tài)、年齡和其他一般健康狀況方面的因素，有經(jīng)驗(yàn)的內(nèi)科醫(yī)師在向患者給藥時(shí)，會(huì)對(duì)劑量做出適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。對(duì)于給藥方法、給藥路徑也是同樣的。
為監(jiān)控疾病的過(guò)程和評(píng)估癌細(xì)胞殺傷，認(rèn)為每月患者應(yīng)接受合適的測(cè)試予以檢查。為評(píng)估藥效，內(nèi)科醫(yī)師根據(jù)癌/腫瘤的類型確定監(jiān)控參數(shù)，并涉及監(jiān)控腫塊減小的方法，例如通過(guò)計(jì)算機(jī)體層攝影(CT)掃描、PET掃描、鎵掃描，檢測(cè)細(xì)胞表面上和血清中CD26抗原的存在，以及在一些情況下額外檢測(cè)其他腫瘤標(biāo)志如在前列腺癌中的PSA(前列腺特異性抗原)、生殖腫瘤中的HCG、結(jié)腸癌中的CEA、卵巢瘤中的CA125、淋巴瘤中的LDH和B2微球蛋白等等。用于監(jiān)控患者的進(jìn)展和治療效果的測(cè)試包括體檢、X射線、驗(yàn)血、骨髓檢查和其他臨床實(shí)驗(yàn)室方法。在1期研究中給予的劑量是逐步升高的，如在標(biāo)準(zhǔn)1期臨床期試驗(yàn)中所做的那樣，也就是說(shuō)，劑量將逐漸升高，直到達(dá)到最大可耐忍的范圍。
臨床反應(yīng)可由可接受的測(cè)量來(lái)定義。例如，完全反應(yīng)可定義為癌細(xì)胞的完全消失，而部分反應(yīng)可定義為的癌細(xì)胞或腫塊減少50％。
典型的治療過(guò)程將取決于個(gè)體患者和治療的疾病，以本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的方式變化。例如，T細(xì)胞淋巴瘤患者可能以4周的周期治療。治療持續(xù)時(shí)間也類似地變化，盡管在對(duì)患者沒(méi)有觀察到不良作用時(shí)可能應(yīng)用較長(zhǎng)的持續(xù)時(shí)間，而如果患者沒(méi)有反應(yīng)或遭遇不能耐受的毒性則治療時(shí)間較短。
按照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容，所有本文公開(kāi)和要求保護(hù)的組合物和/或方法無(wú)需過(guò)度的試驗(yàn)都可以制備和執(zhí)行。盡管本發(fā)明的組合物和方法是以優(yōu)選的實(shí)施方案的形式描述的，對(duì)于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員顯然的是，在不偏離本發(fā)明的觀念、精神和范圍的情況下，對(duì)本文描述的組合物和/或方法以及該方法的步驟、步驟的順序可施以改變。更具體地，顯然某些化學(xué)和生理學(xué)相關(guān)的物質(zhì)可替代本文描述的物質(zhì)，而仍然達(dá)到相同或相似的結(jié)果。所有這些對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯然的相似替代和修飾均被視為是落在了本發(fā)明的精神、范圍和觀念之中，如所附的權(quán)力要求中所限定的。
參考文獻(xiàn)下列參考文獻(xiàn)，就其提供例示性操作細(xì)節(jié)或補(bǔ)充本文所闡述的那些內(nèi)容的其他細(xì)節(jié)而言，被特別引入本文作為參考。
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權(quán)利要求
1.治療患有表達(dá)CD26的癌癥患者的方法，包括向所述患者給予包含抗CD26抗體的藥物制劑，藉此該抗CD26抗體結(jié)合CD26并停滯細(xì)胞周期。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)細(xì)胞周期停滯。
3.權(quán)利要求1的方法，其中的抗CD26抗體為多克隆抗體。
4.權(quán)利要求1的方法，其中的抗體是針對(duì)重組制備的CD26蛋白、CD26融合蛋白、純化的CD26蛋白、部分純化的CD26蛋白或者天然存在的CD26蛋白制備的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中的抗CD26抗體為單克隆抗體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中的抗CD26單克隆抗體是1F7、5F8、10F8A、12E3B、14D10、2F9、4G8、11H9、18H3A、9C11或16D4B。
7.權(quán)利要求5的方法，其中的抗CD26單克隆抗體為1F7。
8.權(quán)利要求5的方法，其中的抗CD26單克隆抗體為5F8。
9.權(quán)利要求5的方法，其中的抗CD26單克隆抗體是由保藏在美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)的雜交瘤HB 10297分泌的。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中的單克隆抗體是人源化的。
11.權(quán)利要求1的方法，其中的抗CD26抗體是非偶聯(lián)抗體。
12.權(quán)利要求1的方法，其中的抗CD26抗體偶聯(lián)于化學(xué)治療劑、放射性核素、顯象劑、毒素、生物活性劑、酶抑制劑或者二抗。
13.權(quán)利要求12的方法，其中的酶抑制劑是腺苷脫氨酶抑制劑或者二肽基肽酶IV抑制劑。
14.權(quán)利要求1的方法，其中的癌癥是T細(xì)胞癌、B細(xì)胞癌、血液系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、T細(xì)胞淋巴瘤、肺腺癌、甲狀腺癌、黑素瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肺癌、肝癌、胃癌、睪丸癌、子宮癌、腦癌、淋巴癌、皮膚癌、骨癌、直腸癌或肉瘤。
15.權(quán)利要求14的方法，其中的T細(xì)胞癌是T細(xì)胞淋巴瘤、成淋巴細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞CD30+退行性大細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性T細(xì)胞淋巴瘤、HTLV-相關(guān)T細(xì)胞白血病或成人T細(xì)胞白血病。
16.權(quán)利要求14的方法，其中的B細(xì)胞癌是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病或B細(xì)胞淋巴瘤。
17.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括用第二藥劑治療該患者，其中的第二藥劑是治療性多肽、編碼治療性多肽的核酸、化學(xué)治療劑、免疫治療劑、放射治療劑、細(xì)胞因子、趨化因子、活化劑、或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中的第二藥劑與抗CD26抗體同時(shí)給藥。
19.權(quán)利要求17的方法，其中的第二藥劑在不同于抗CD26抗體的時(shí)間給藥。
20.權(quán)利要求1的方法，其中的癌癥以在所述患者中形成腫瘤為特征。
21.權(quán)利要求1的方法，其中的給藥是靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、真皮內(nèi)、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、真皮、鼻、口含、直腸或陰道給藥。
22.治療癌癥患者的方法，包括誘導(dǎo)CD26在所述癌細(xì)胞中表達(dá)，并向所述患者給予包含抗CD26抗體的藥物制劑，藉此該抗CD26抗體結(jié)合CD26并停滯細(xì)胞周期。
23.權(quán)利要求22的方法，其中是通過(guò)令細(xì)胞與生物因子接觸而誘導(dǎo)CD26在所述癌細(xì)胞中表達(dá)。
24.權(quán)利要求23的方法，其中的生物因子是細(xì)胞因子、趨化因子、類視黃醇、干擾素、化學(xué)治療劑、抗體或抗原。
25.權(quán)利要求22的方法，其中是通過(guò)使細(xì)胞與化學(xué)劑接觸而誘導(dǎo)CD26在所述癌細(xì)胞中表達(dá)。
26.治療患有表達(dá)CD26的癌癥患者的方法，包括向所述患者給予包含抗CD26抗體的藥物制劑，藉此該抗CD26抗體結(jié)合CD26并抑制構(gòu)成所述癌癥的細(xì)胞的生長(zhǎng)。
27.權(quán)利要求26的方法，進(jìn)一步包括檢測(cè)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。
28.誘導(dǎo)腫瘤消退的方法，包括向需要的患者給予包含抗CD26抗體的組合物。
29.誘導(dǎo)腫瘤壞死的方法，包括向需要的患者給予包含抗CD26抗體的組合物。
30.增加CD26+細(xì)胞中p21表達(dá)的方法，包括使細(xì)胞與抗CD26抗體接觸。
31.權(quán)利要求30的方法，其中的CD26+細(xì)胞是癌細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中的癌細(xì)胞是血液系統(tǒng)癌細(xì)胞、T細(xì)胞癌細(xì)胞、B細(xì)胞癌細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、睪丸癌細(xì)胞、子宮癌細(xì)胞、腦癌細(xì)胞、淋巴癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、骨癌細(xì)胞、直腸癌細(xì)胞或肉瘤細(xì)胞。
33.權(quán)利要求31的方法，其中的癌細(xì)胞是T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞、甲狀腺癌細(xì)胞、黑素瘤細(xì)胞、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、或B細(xì)胞淋巴瘤。
34.權(quán)利要求33的方法，其中T細(xì)胞淋巴瘤是成淋巴細(xì)胞淋巴瘤、急性成淋巴細(xì)胞白血病、T細(xì)胞CD30+退行性大細(xì)胞淋巴瘤、外周T細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性T細(xì)胞淋巴瘤、HTLV-相關(guān)T細(xì)胞白血病或成人T細(xì)胞白血病。
35.權(quán)利要求30的方法，其中的抗CD26抗體是多克隆抗體。
36.權(quán)利要求30的方法，其中的抗CD26抗體是單克隆抗體。
37.權(quán)利要求36的方法，其中的抗CD26單克隆抗體是由保藏在美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)的雜交瘤HB 10297分泌的。
38.權(quán)利要求36的方法，其中的抗CD26單克隆抗體是1F7、5F8、10F8A、12E3B、14D10、2F9、4G8、11H9、18H3A、9C11或16D4B。
39.權(quán)利要求36的方法，其中的抗CD26單克隆抗體是1F7。
40.權(quán)利要求36的方法，其中的抗CD26單克隆抗體是5F8。
41.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中的單克隆抗體是人源化的。
42.權(quán)利要求30的方法，其中的抗CD26抗體是非偶聯(lián)抗體。
43.權(quán)利要求30的方法，其中的抗CD26抗體進(jìn)一步連接于化學(xué)治療劑、放射性核素、顯象劑、毒素、生物活性劑、酶抑制劑或者二抗。
44.權(quán)利要求43的方法，其中的酶抑制劑是腺苷脫氨酶抑制劑或者二肽基肽酶IV抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了包括給予抗CD26抗體的治療方法，用于預(yù)防和治療與表達(dá)CD26相關(guān)的癌癥和免疫疾病。本發(fā)明描述了多種不同類型的抗CD26抗體和給藥方式。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1671415SQ02811707
公開(kāi)日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2002年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月11日
發(fā)明者N·H·黨, C·莫里莫托, S·施羅斯曼 申請(qǐng)人:得克薩斯州立大學(xué)董事會(huì), 達(dá)娜-法勃腫瘤研究所