專(zhuān)利名稱(chēng)：源自粘膜炎莫拉氏菌的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多核苷酸，(此處指“BASB020多核苷酸”)，它們所編碼的多肽(此處指“BASB020”多肽)，重組物質(zhì)以及它們的生產(chǎn)方法。在另一方面，本發(fā)明涉及使用這樣的多肽和多核苷酸，包括疫苗，來(lái)抵抗微生物的感染。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)某些病原體感染的診斷分析。
背景技術(shù)：
粘膜炎莫拉氏菌(粘膜炎莫拉氏菌)(也名為Branhamellacatarrhalis)是經(jīng)常從人類(lèi)上呼吸道分離得到的革蘭氏陰性細(xì)菌。它導(dǎo)致幾種疾病，主要的是嬰兒以及兒童的中耳炎以及老年人的肺炎。它還導(dǎo)致竇炎，醫(yī)院感染以及不太經(jīng)常的入侵性疾病。
不論在病例的數(shù)目上還是在潛在的后遺癥上中耳炎都是一種重要的兒童疾病。在美國(guó)每年記錄的疾病有350萬(wàn)。估計(jì)約有80％的兒童在3歲以前都經(jīng)歷過(guò)至少一次中耳炎(Klein，J0(1994)Clin.Inf.Dis 19823)。如果不進(jìn)行治療或轉(zhuǎn)成慢性的話這種疾病可能導(dǎo)致暫時(shí)(在中耳積水的情況下)或永遠(yuǎn)(如果聽(tīng)神經(jīng)受到損傷)喪失聽(tīng)力。在嬰兒中，這樣的喪失聽(tīng)力可能導(dǎo)致學(xué)說(shuō)話的推遲。
在中耳炎兒童的中耳中主要分離得到三種細(xì)菌肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，未分型的流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)(NTHi)粘膜炎莫拉氏菌。它們?cè)?0到90％的病例中存在。最近研究的一篇綜述表明肺炎鏈球菌和NTHi在約30％的病例中存在，而粘膜炎莫拉氏菌在約15％的中耳炎病例中存在(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。從中耳中還能分離得到其它細(xì)菌，但幾率要小得多(病例的2％或更小)。
流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，，在中耳發(fā)現(xiàn)的病原體在上呼吸道的集群對(duì)于耳炎的發(fā)生而言是絕對(duì)的先決條件；但是導(dǎo)致該疾病還需要其它條件(Dickinson，DP et al.(1988)J.Infect.Dis.158205，F(xiàn)aden，HL et al.(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100612)。這些對(duì)于引起細(xì)菌通過(guò)咽鼓管向中耳遷移然后開(kāi)始炎癥過(guò)程是很重要的。這些因素目前還是未知的。有人猜測(cè)，例如，病毒感染后暫時(shí)的免疫系統(tǒng)異?？赡軐?dǎo)致對(duì)呼吸道集群的失控(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.1691312)。一種替代的解釋是暴露于環(huán)境因素使得一些兒童發(fā)展出更嚴(yán)重的集群，然后由于中耳病原體的持續(xù)存在這些兒童易得中耳炎(Murphy，TF(1996)Microbio.Rev.60267)。
對(duì)粘膜炎莫拉氏菌的免疫應(yīng)答的特征還很不清楚。對(duì)從0到2周歲嬰兒的鼻咽先后分離得到的菌株的分析表明他們經(jīng)常獲得和消滅新的菌株。這表明被集群化的兒童產(chǎn)生了抵抗這些細(xì)菌的有效免疫應(yīng)答(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.1691312)。
在大多數(shù)被檢測(cè)的成年人中鑒定到了殺菌抗體(Chapman，AJ etal.(1985)J.Infect.Dis.151878)。粘膜炎莫拉氏菌的不同菌株呈現(xiàn)出的抵抗殺菌活性的能力存在差異總的來(lái)說(shuō)從生病個(gè)體分離得到的菌株的抵抗力比從僅僅集群化的個(gè)體分離得到的菌株的抵抗力更強(qiáng)(Hol，C et al.(1993)Lancet 3411281，Jordan，KL etal.(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A)28S)。因此血清抗性可以被認(rèn)為是該細(xì)菌的毒性因素。在從中耳炎恢復(fù)的兒童的血清中觀察到了調(diào)理活性。
除了OMPB1(Sethi，S，et al(1995)Infect.Immun，631516)和UspA1以及UspA2(Chen D.et al.(1999)，Infect.Immun.67L1310)外這些不同的免疫應(yīng)答所針對(duì)的免疫原還未被鑒定；OMPB1是一種84kDa的蛋白，其表達(dá)受到鐵的調(diào)控，它能為肺炎病人的血清所識(shí)別。
通過(guò)生化方法描述了存在粘膜炎莫拉氏菌表面的一些其它膜蛋白的特征，或者描述了它們誘導(dǎo)保護(hù)性免疫力的潛在可能。(綜述參見(jiàn)Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60267)。在小鼠肺炎模型中，抵抗其中一些蛋白(UspA，CopB)的抗體的存在有利于更快地清除肺部感染。另一種多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中是高度保守的，并且呈現(xiàn)出與綠色假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的孔道蛋白具有同源性，這種多肽已經(jīng)被證明能在動(dòng)物模型中有效地抵抗這種細(xì)菌。
在過(guò)去的幾十年中粘膜炎莫拉氏菌感染的頻率升高了很多。這歸結(jié)于多抗生素抗性菌株的出現(xiàn)以及免疫系統(tǒng)減弱的人口的增加。分離出能抵抗一些或所有常見(jiàn)抗生素的粘膜炎莫拉氏菌菌株不再是不同尋常的事了。這種現(xiàn)象產(chǎn)生了一種未滿足的醫(yī)藥需求，并且需要新的抗微生物制劑、疫苗、藥物篩選方法和檢測(cè)這種生物體的診斷檢測(cè)方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及BASB020，尤其是BASB020多肽和BASB020多核苷酸、重組物質(zhì)以及它們的生產(chǎn)方法。在另一方面，本發(fā)明涉及這樣的多肽和多核苷酸的使用方法，包括防止和治療微生物疾病，及其他。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)和微生物感染相關(guān)的疾病以及與這些感染相關(guān)的病癥的診斷測(cè)試，例如檢測(cè)BASB020多核苷酸或多肽的表達(dá)或活性的測(cè)試方法。
通過(guò)閱讀隨后的描述以及通過(guò)閱讀本公布的其他部分，在公布的本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的各種變化和修正對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員將是顯而易見(jiàn)的。
發(fā)明詳述如下文詳細(xì)描述，本發(fā)明涉及BASB020多肽和多核苷酸。尤其是，本發(fā)明涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB020的多肽和多核苷酸，它在氨基酸序列上和豬痢疾小蛇菌(Serpulina hyodysenteriae)的TlyC溶血球素(hemolysin)蛋白具有同源性。本發(fā)明尤其涉及核苷酸序列和氨基酸序列分別在SEQ ID NO1，3，5或7和SEQ ID NO2，4，6或8列出的BASB020。應(yīng)當(dāng)理解在以下的序列表中列為“DNA”的序列代表本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的例子，因?yàn)榫哂衅胀夹g(shù)的人員將認(rèn)識(shí)到這些序列總體上可用于多核苷酸，包括多聚核糖核酸。
多肽在本發(fā)明的一個(gè)方面提供了此處稱(chēng)為“BASB020”和“BASB020多肽”的粘膜炎莫拉氏菌多肽，以及它們具有生物學(xué)用途、診斷用途、臨床應(yīng)用以及治療用途的變體，以及含有上述多肽或其變體的組合物。
本發(fā)明進(jìn)而提供了(a)一種分離的多肽，該多肽含有的氨基酸序列和SEQ ID NO2，4，6，或8至少85％相同，優(yōu)選地至少90％相同，更優(yōu)選地至少95％相同，最為優(yōu)選地至少97-99％相同或完全相同。(b)由一種分離的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸含有的多核苷酸序列和SEQ ID NO1，3，5，或7在SEQ ID NO1，3，5，或7的全長(zhǎng)至少85％相同，優(yōu)選地至少90％相同，更優(yōu)選地至少95％相同，最為優(yōu)選地至少97-99％相同或完全相同。(c)由一種分離的多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸含有的多核苷酸序列編碼的多肽和SEQ ID NO2，4，6，或8至少85％相同，優(yōu)選地至少90％相同，更優(yōu)選地至少95％相同，最為優(yōu)選地至少97-99％相同或完全相同。
在SEQ ID NO2，4，6，或8中提供的BASB020多肽是源自粘膜炎莫拉氏菌菌株MC2931(ATCC43617)，MC2912，MC2913和MC2969的BASB020多肽。
本發(fā)明還提供了BASB020多肽的免疫原性片段，即，BASB020多肽的一個(gè)連續(xù)部分，該部分和含有SEQ ID NO2，4，6，或8中氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原活性；這就是說(shuō)，該片段(如果需要的話交聯(lián)到載體上)能產(chǎn)生識(shí)別BASB020多肽的免疫應(yīng)答。這樣的免疫源性可以包括，例如，缺少BASB020N末端引導(dǎo)序列和/或缺少一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域/或缺少C末端錨定結(jié)構(gòu)域的多肽。在一個(gè)優(yōu)選的方面根據(jù)本發(fā)明的BASB020免疫原性片段含有基本上所有的多肽膜外結(jié)構(gòu)域，上述多肽和SEQ ID NO2，4，6，或8在SEQ ID NO2，4，6，或8的全長(zhǎng)上至少85％相同，優(yōu)選地至少90％相同，更優(yōu)選地至少95％相同，最為優(yōu)選地至少97-99％相同或完全相同。
片段是指氨基酸序列和本發(fā)明的任何多肽的任何氨基酸序列部分而不是全部完全相同的多肽。對(duì)于BASB020多肽，片段可以是“自由存在”的或包含在較大的多肽中，它們形成較大多肽的一部分或一個(gè)區(qū)域，最為優(yōu)選地，它們?cè)趩我坏妮^大多肽中是作為單一連續(xù)的區(qū)域。
優(yōu)選的片段包括，例如，具有SEQ ID NO2，4，6，或8或其變體的一部分氨基酸序列的截短多肽，如包括了氨基端或羧基端氨基酸序列的一個(gè)連續(xù)系列的殘基。由宿主細(xì)胞產(chǎn)生或在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的降解多肽也是優(yōu)選的。進(jìn)而優(yōu)選的是具有結(jié)構(gòu)或功能特征的片段，例如含有α螺旋和α螺旋形成區(qū)域、β片層和β片層形成區(qū)域、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)域、卷曲和卷曲形成區(qū)域、親水區(qū)域、疏水區(qū)域、α兩親性區(qū)域、β兩親性區(qū)域、柔性區(qū)域、表面形成區(qū)域、底物結(jié)合區(qū)域和高抗原性指數(shù)區(qū)。
進(jìn)而優(yōu)選的片段包括一種分離的多肽，該多肽含有源自SEQ IDNO2，4，6，或8的氨基酸序列中至少15，20，30，40，50或100個(gè)連續(xù)的氨基酸，或者包括包含一種多肽，該多肽包含一段氨基酸序列，該序列從SEQ ID NO2，4，6，或8的氨基酸序列中截短或刪去至少15，20，30，40，50或100個(gè)連續(xù)的氨基酸。
通過(guò)多肽合成，本發(fā)明的多肽片段可被用于生產(chǎn)相應(yīng)的全長(zhǎng)多肽；因此這些片段可被用作生產(chǎn)本發(fā)明的多肽的中間物。
特別優(yōu)選的是一些變體，在這些變體中5-10，1-5，1-3，1-2或1個(gè)氨基酸被以任何組合方式取代、刪除或添加。
本發(fā)明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟蛋白”的形式，或可以是較大的蛋白如前體蛋白或融合蛋白的一部分。將含有分泌或引導(dǎo)序列、前序列、幫助純化的序列如多組氨酸殘基、或增加重組生產(chǎn)過(guò)程中的穩(wěn)定性的序列的另加序列包括在內(nèi)經(jīng)常是有利的。進(jìn)而，還考慮了添加外源多肽或脂類(lèi)尾巴或多核苷酸序列以提高最終分子的潛在免疫原性。
在一個(gè)方面本發(fā)明涉及經(jīng)遺傳工程改造的可溶性融合蛋白，該融合蛋白含有本發(fā)明的多肽或其片段以及各種亞型(IgG，IgM，IgA，IgE)的免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的恒定區(qū)的各個(gè)部分。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG，尤其是IgG1，重鏈的恒定部分，其中融合在鉸鏈區(qū)進(jìn)行。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，通過(guò)整合入可以被凝血因子X(jué)a切除的序列可以簡(jiǎn)單地將Fc部分除去。
進(jìn)而，本發(fā)明涉及通過(guò)基因工程制備這些融合蛋白的方法，以及它們?cè)谒幬锖Y選、診斷及治療中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步的方面還包括編碼這樣的融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白激素的例子可以在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)Nos.WO94/29458和WO94/22914中找到。
蛋白可以是化學(xué)交聯(lián)的，或是以重組融合蛋白的形式表達(dá)，以便和非融合蛋白相比提高在表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平。融合伙伴可以幫助提供T輔助細(xì)胞表位(免疫融合伙伴)，優(yōu)選地提供為人所識(shí)別的T輔助細(xì)胞表位；或和天然的重組蛋白相比幫助提高該蛋白的表達(dá)產(chǎn)量(表達(dá)增強(qiáng)伙伴)。優(yōu)選地，上述融合伙伴同時(shí)是免疫融合伙伴和表達(dá)增強(qiáng)伙伴。
融合伙伴包括源自流感嗜血桿菌的蛋白D以及源自感冒病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，NS1(紅血球凝集素)。另一種融合伙伴是被稱(chēng)為L(zhǎng)ytA的蛋白。優(yōu)選地，使用的是該分子的C末端部分。Lyta源自Streptococcus pneumoniae(肺炎鏈球菌)，它合成一種N-乙?；?L丙氨酸酰胺酶LytA(由lytA基因編碼{Gene，43(1986)265-272頁(yè)})，一種特異性地降解肽多糖骨架的某些鍵的自溶素。LytA蛋白的C末端部分負(fù)責(zé)對(duì)膽堿或某些膽堿類(lèi)似物如DEAE的親和性。這種特性已經(jīng)被用于發(fā)展用來(lái)表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌(E.coli)C-LytA表達(dá)質(zhì)粒。在N末端含有C-LytA片段的雜交蛋白的純化已有描述{Biotechnology10，(1992)page 795-798}。也可以使用在LytA分子C末端的從178開(kāi)始的重復(fù)部分，例如殘基188-305。
本發(fā)明還包括了上述多肽的變體，即參考多肽通過(guò)保守氨基酸替換得到的多肽，在保守氨基酸替換中一個(gè)殘基被具有類(lèi)似特性的另一個(gè)殘基替換。這種替換的典型例子如Ala，leu和Ile之間的替換；Ser和Thr之間的替換；酸性殘基Asp和Glu之間的替換；Asn和Gln之間的替換；堿性殘基Lys和Arg之間的替換；或芳香殘基Phe和Tyr之間的替換。
最為優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是源自粘膜炎莫拉氏菌，但是它也可以優(yōu)選地選自同一分類(lèi)屬的其它微生物。例如，本發(fā)明的多肽可以從同一科或同一目的微生物體中得到。
多核苷酸本發(fā)明的一個(gè)目的是提供編碼BASB020多肽的多核苷酸，特別是編碼此處被命名為BASB020的多肽的多核苷酸。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施例中上述多核苷酸含有一個(gè)編碼BASB020多肽的區(qū)域，上述BASB020多肽包括SEQ ID NO1，3，5或7中列出的包括全長(zhǎng)基因的序列，或它們的變體。
SEQ ID NO1，3，5或7中提供的BASB020多核苷酸是源自粘膜炎莫拉氏菌菌株MC2931(ATCC43617)，MC2912，MC2913和MC2969的BASB020多核苷酸。
本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面還提供了分離的核酸分子，該核酸分子編碼和/或表達(dá)BASB020多肽和多核苷酸，尤其是粘膜炎莫拉氏菌BASB020多肽和多核苷酸，包括，例如，未加工的RNA，mRNA，cDNA，基因組DNA，B和Z-DNA。本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案包括具有生物學(xué)、診斷、預(yù)防、臨床或治療用途的多核苷酸和多肽以及它們的變體，以及含有它們的組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及分離的多核苷酸，包括至少一種編碼BASB多肽的全長(zhǎng)基因，它們編碼的多肽推測(cè)具有SEQ ID NO2，4，6，或8中的氨基酸序列，或上述多核苷酸的緊密相關(guān)的多核苷酸或它們的變體。
在本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中有一源自粘膜炎莫拉氏菌的BASB020多肽，該多肽含有SEQ ID NO2，4，6，或8中的氨基酸序列或它們的變體，或由上述氨基酸序列或變體組成。
根據(jù)此處提供的信息，例如SEQ ID NO1，3，5或7中提供的多核苷酸序列，可以通過(guò)常規(guī)的克隆和篩選方法，例如用粘膜炎莫拉氏菌細(xì)胞作為起始材料從細(xì)菌中克隆和測(cè)序染色體DNA片段，然后得到全長(zhǎng)克隆，獲得本發(fā)明的編碼BASB020多肽的多核苷酸。例如，為了得到本發(fā)明的多核苷酸序列，如SEQ ID NO1，3，5或7中給出的多核苷酸序列，通常用源自部分序列的放射性標(biāo)記的寡聚核苷酸探針，長(zhǎng)度優(yōu)選地為17堿基或更長(zhǎng)，探測(cè)E.coli中或其他合適的宿主中的粘膜炎莫拉氏菌染色體DNA克隆文庫(kù)。然后用嚴(yán)緊雜交條件區(qū)別含有的DNA和探針完全相同的克隆。利用根據(jù)初始的多肽或多核苷酸序列設(shè)計(jì)得到的測(cè)序探針對(duì)通過(guò)雜交鑒定的克隆進(jìn)行測(cè)序，從而能夠在兩個(gè)方向延伸多核苷酸序列以確定基因的全長(zhǎng)序列。這樣的測(cè)序可以方便地利用，例如，從質(zhì)?？寺≈苽涞玫降碾p鏈變性質(zhì)粒DNA進(jìn)行。合適的技術(shù)在Maniatis，T.，F(xiàn)ritsch，E.F.and Sambrook etal MOLECULAR CLONNING，A LABORATORY MANUAL，2ndEd.；ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1989)中有所描述(具體見(jiàn)Screening By Hybridization1.90(雜交篩選)和Sequencing Denatured Double-Stranded DNATemplates 13.70(變性雙鏈DNA模板的測(cè)序))。也可進(jìn)行基因組DNA的直接測(cè)序以得到基因的全長(zhǎng)序列。例如在本發(fā)明中SEQ ID NO1，3，5或7的每個(gè)序列都設(shè)在源自粘膜炎莫拉氏菌的DNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。
進(jìn)而，SEQ ID NO1，3，5或7列出的每個(gè)DNA序列都含有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼的蛋白大約具有SEQ ID NO2，4，6，或8中給出的氨基酸殘基數(shù)，可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員眾所周知的氨基酸殘基分子量推測(cè)出蛋白的分子量。
SEQ ID NO1中的多核苷酸在核苷酸1開(kāi)始的起始密碼子和核苷酸841開(kāi)始的終止密碼子之間編碼SEQ ID NO2中的多肽。
SEQ ID NO3中的多核苷酸在核苷酸1開(kāi)始的起始密碼子和核苷酸841開(kāi)始的終止密碼子之間編碼SEQ ID NO4中的多肽。
SEQ ID NO5中的多核苷酸在核苷酸1開(kāi)始的起始密碼子和核苷酸841開(kāi)始的終止密碼子之間編碼SEQ ID NO6中的多肽。
SEQ ID NO7中的多核苷酸在核苷酸1開(kāi)始的起始密碼子和核苷酸841開(kāi)始的終止密碼子之間編碼SEQ ID NO8中的多肽。
在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面提供了一種分離的多核苷酸，它包括以下核苷酸序列或由它們組成(a)，一種多核苷酸，其的多核苷酸序列分別和SEQ ID NO1，3，5，或7在SEQ ID NO1，3，5，或7的全長(zhǎng)至少85％相同，優(yōu)選地至少90％相同，更優(yōu)選地至少95％相同，最為優(yōu)選地至少97-99％相同或完全相同。
(b)一種多核苷酸，它編碼的多肽含有的氨基酸序列分別和SEQID NO2，4，6，或8在SEQ ID NO2，4，6，或8的全長(zhǎng)上至少85％相同，優(yōu)選地至少90％相同，更優(yōu)選地至少95％相同，最為優(yōu)選地至少97-99％相同或完全相同。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸，包括源自粘膜炎莫拉氏菌以外種屬的同源物和直線同源物(ortholog)，他們可由包括以下步驟的方法得到在嚴(yán)緊的雜交條件(例如用使用45-65℃之間的溫度和0.1-1％的SDS濃度)下用標(biāo)記的或可探測(cè)的探針篩選合適的文庫(kù)，然后分離含有上述多核苷酸序列的全長(zhǎng)基因和/或基因組克隆；上述探針含有SEQ ID NO1，3，5，或7的序列或它們的片段，或由SEQ ID NO1，3，5，或7的序列或它們的片段組成。
本發(fā)明提供了在全長(zhǎng)上和SEQ ID NO1，3，5，或7的編碼序列(開(kāi)放閱讀框)相同的多核苷酸序列。本發(fā)明還提供了獨(dú)立存在的成熟多肽或其片段的編碼序列，以及存在于其它編碼序列，例如編碼前導(dǎo)序列或分泌序列，前蛋白，或前體蛋白，或前前體蛋白序列的序列，的閱讀框中的成熟多肽或其片段。本發(fā)明的多肽還含有至少一種非編碼序列，包括，例如但不限于，至少一個(gè)非編碼的5’和3’序列，如轉(zhuǎn)錄但不翻譯的序列，終止信號(hào)(如rho依賴(lài)的和rho不依賴(lài)的終止信號(hào))，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Kozak序列，穩(wěn)定mRNA的序列，內(nèi)含子和多聚腺苷酸信號(hào)。多核苷酸還可以含有編碼另加氨基酸的另加編碼序列。例如，可以編碼便于融合蛋白純化的標(biāo)記序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中該標(biāo)記序列是由pQE載體提供(Qiagen.Inc.)并在Gentz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 86821-824(1989)中有所描述的六組氨酸肽，或者是HA肽標(biāo)記(Wilson et al.，Cell37757(1984))，兩種標(biāo)記都可用于純化和它們?nèi)诤系男蛄?。本發(fā)明的多核苷酸還包括，但不限于，含有結(jié)構(gòu)基因的多核苷酸及其天然相連的控制基因表達(dá)的序列。
編碼SEQ ID NO2，4，6，或8中的BASB020多肽的核苷酸序列可以分別等同于SEQ ID NO1，3，5，或7中核苷酸1到840之間的多肽編碼序列。替代地，它也可以是編碼SEQ ID NO2，4，6，或8中多肽的，由于遺傳密碼的重復(fù)性(簡(jiǎn)并性)造成的序列。
此處所使用的術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”包括含有本發(fā)明多肽編碼序列的多核苷酸，本發(fā)明的多肽尤其是細(xì)菌多肽，更具體地說(shuō)是具有SEQ ID NO2，4，6，或8中列出的氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括了含有編碼多肽的單一連續(xù)區(qū)域或不連續(xù)區(qū)域(例如，多核苷酸被整合噬菌體、整合插入序列、整合載體序列、整合轉(zhuǎn)座子序列中斷或由于RNA編輯或基因組DNA重排而被中斷)以及其他可能含有編碼和/或非編碼序列的另加區(qū)域的多核苷酸。
本發(fā)明還進(jìn)而涉及此處描述的多核苷酸，該多核苷酸編碼一種多肽的變體，上述多肽具有SEQ ID NO2，4，6，或8中列出的氨基酸序列?？梢允褂?，例如，本發(fā)明多核苷酸的片段合成本發(fā)明的全長(zhǎng)多核苷酸。
進(jìn)而特別優(yōu)選的實(shí)施方案為編碼BASB020變體的多核苷酸，上述變體具有SEQ ID NO2，4，6，或8中列出的BASB020多肽的氨基酸序列，但其中幾個(gè)或一些，或5到10個(gè)，或1到5個(gè)，或1到3個(gè)，或2個(gè)或1個(gè)或沒(méi)有氨基酸殘基被以任何組合方式替換，修飾，缺失和/或添加。其中特別優(yōu)選的是靜息替換、添加和缺失，即并不改變BASB020多肽的特性和活性。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案為和編碼BASB020多肽的多核苷酸在全部長(zhǎng)度上至少85％相同的多核苷酸，以及與這樣的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，其中上述BASB020多肽具有SEQ ID NO2，4，6，或8中列出的氨基酸序列。替代地，最為優(yōu)選的是和編碼BASB020多肽的多核苷酸在全部長(zhǎng)度上至少90％相同的多核苷酸，以及與這樣的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。從這方面考慮，和上述編碼BASB020多肽的多核苷酸在全部長(zhǎng)度上至少90％相同的多核苷酸是特別優(yōu)選的。進(jìn)而，在這些至少95％的多核苷酸中至少97％的是高度優(yōu)選的，這些至少97％的多核苷酸中至少98％和至少99％的是特別高度優(yōu)選的，而99％的是更為優(yōu)選的。
優(yōu)選的實(shí)施方案為編碼的多肽基本上保留了SEQ ID NO1，3，5或7中的DNA所編碼的成熟多肽的相同生物學(xué)功能或活性的多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案提供了，尤其是在嚴(yán)緊的條件下，與BASB020多核苷酸序列，例如SEQ ID NO1，3，5或7中的多核苷酸序列，雜交的多核苷酸。
本發(fā)明進(jìn)而涉及能和此處提供的多核苷酸序列雜交的多核苷酸。在這一點(diǎn)上本發(fā)明尤其是涉及在嚴(yán)緊條件下與此處描述的多核苷酸雜交的多核苷酸。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊條件”和“嚴(yán)緊雜交條件”的意思為僅僅當(dāng)序列之間的同一性至少為95％，優(yōu)選地至少為97％時(shí)才發(fā)生雜交。嚴(yán)緊雜交條件的一個(gè)具體例子為在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhard’s溶液，10％硫酸右旋糖苷和20微克/ml變性剪切的鮭魚(yú)精DNA的溶液中42℃溫育過(guò)夜，然后在約65℃在0.1×SSC中洗滌雜交支持物。雜交和洗滌條件是眾所周知的，例子見(jiàn)Sambrook，et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.Second Edition，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1989)，特別是該書(shū)中的第11章。本發(fā)明提供的多核苷酸還可以用溶液雜交。
本發(fā)明還提供了一種多核苷酸，該多核苷酸含有一種多核苷酸序列或有該序列組成，上述多核苷酸序列是通過(guò)在嚴(yán)緊條件下篩選適當(dāng)文庫(kù)并分離多核苷酸序列得到的，上述文庫(kù)含有SEQ ID NO1，3，5或7中列出的序列的完全基因；上述篩選用的探針具有SEQ ID NO1，3，5或7中列出的多核苷酸序列或其片段?？捎糜讷@得這樣的多核苷酸的片段包括，例如，本文其他地方所詳細(xì)描述的探針和引物。
如本文其它地方關(guān)于本發(fā)明的多核苷酸檢測(cè)的描述，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以被用作RNA，cDNA和基因組DNA的探針來(lái)分離編碼BASB020的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆以及分離具有高度同源性，尤其是高序列同源性，的其它基因的基因組克隆和cDNA。這樣的探針通常含有至少15個(gè)核苷酸或者堿基對(duì)。優(yōu)選地，這樣的探針至少具有30個(gè)核苷酸殘基或者堿基對(duì)，并可以具有50個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)。特別優(yōu)選的探針將具有至少20個(gè)核苷酸殘基或堿基對(duì)并將少于30個(gè)核苷酸殘基或者堿基對(duì)。
可通過(guò)用SEQ ID NO1，3，5或7中提供的DNA序列合成探針進(jìn)行篩選，從而分離BASB020基因的編碼區(qū)。然后用標(biāo)記的，具有和本發(fā)明的基因互補(bǔ)的序列的寡聚核苷酸探針篩選cDNA文庫(kù)、基因組DNA或mRNA以確定該探針和文庫(kù)中的哪個(gè)成員雜交。
已知有幾種方法可以用來(lái)獲得全長(zhǎng)DNA或延伸短DNA，這些方法對(duì)于本領(lǐng)域中的技術(shù)熟練人員是眾所周知的，例如基于cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplication of cDNA ends，RACE)的方法(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)rohman，et al.，PNAS USA 858998-9002，1988)。最近技術(shù)上的改進(jìn)，例如MarathonTM技術(shù)(Clontech LaboratoriesInc.)，大大地簡(jiǎn)化了對(duì)較長(zhǎng)cDNA的搜索。在MarathonTM技術(shù)中從選定的組織中提取mRNA并制備cDNA，然后在每個(gè)末端連接上“轉(zhuǎn)接”序列。然后聯(lián)合使用用基因特異的和轉(zhuǎn)接序列特異的寡聚核苷酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增(PCR)以擴(kuò)增DNA“丟失的”5’端。然后用“嵌套”引物重復(fù)進(jìn)行PCR反應(yīng)，嵌套引物即是設(shè)計(jì)用來(lái)與擴(kuò)增的產(chǎn)物退火的引物(通常為進(jìn)而與轉(zhuǎn)接序列3’端退火的轉(zhuǎn)接序列特異引物以及與選定基因序列5’端退火的基因特異引物)。此反應(yīng)的產(chǎn)物可以通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行分析，并且通過(guò)將該產(chǎn)物直接和存在的DNA連接以給出全長(zhǎng)序列，或用新的序列信息設(shè)計(jì)5’引物另外進(jìn)行全長(zhǎng)PCR可以構(gòu)建全長(zhǎng)DNA。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可以用作，例如，發(fā)現(xiàn)疾病，尤其是人類(lèi)疾病的治療和診斷方法的研究試劑和材料，如本文所進(jìn)一步討論，上述治療和診斷涉及多核苷酸檢測(cè)。
作為源自SEQ ID NO1-8的序列的寡聚核苷酸的本發(fā)明的多核苷酸可被用于此處所描述的方法，但優(yōu)選地是PCR方法，以確定此處所鑒定的多核苷酸是否全部或部分地在感染組織的細(xì)菌中表達(dá)。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到這樣的序列還可以用于診斷病原體所達(dá)到的感染階段和感染的類(lèi)型。
本發(fā)明還提供了編碼一種多肽的多核苷酸，上述多肽是成熟蛋白加上另加的氨基酸或羧基末端氨基酸，或位于成熟多肽內(nèi)部的氨基酸(例如當(dāng)成熟多肽具有一條以上肽鏈時(shí))。這樣的序列可能在將蛋白從前體向成熟形式加工時(shí)起作用，可能允許蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，可能延長(zhǎng)或縮短蛋白的半衰期或者便于蛋白分析或生產(chǎn)時(shí)的操作，等等。通常在體內(nèi)另加的氨基酸可能被細(xì)胞的酶從成熟蛋白加工除去。
對(duì)于每個(gè)和每一個(gè)本發(fā)明的多核苷酸提供了與它互補(bǔ)的多核苷酸。優(yōu)選地這些互補(bǔ)的多核苷酸和它們各自互補(bǔ)的多核苷酸完全互補(bǔ)。
一種前體蛋白，含有和一種或多種前體序列融合的成熟多肽，可能是該多肽的無(wú)活性形式。當(dāng)前體序列被除去時(shí)這樣的無(wú)活性前體通常被激活?？梢栽诩せ钋俺ヒ恍┗蛩械那绑w序列。通常這樣的前體被稱(chēng)為前體蛋白。
除了用常規(guī)的A，G，T/U來(lái)表示核苷酸，術(shù)語(yǔ)“N”也可以用來(lái)描述本發(fā)明的一些多核苷酸。“N”的意思為四種DNA或RNA核苷酸中的任何一種都可以出現(xiàn)在DNA或RNA中的這樣一個(gè)既定位置，但是當(dāng)和鄰近的核苷酸位置一起考慮時(shí)，當(dāng)在正確的閱讀框中閱讀時(shí)將在這樣的閱讀框中產(chǎn)生提前終止密碼子的核酸除外。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面提供了將本發(fā)明的多核苷酸用于治療或預(yù)防的用途，特別適用于基因免疫。
將本發(fā)明的多核苷酸用于基因免疫將由選地使用適當(dāng)?shù)倪\(yùn)送方法，如直接將質(zhì)粒DNA注射到肌肉中(Wolff et al.，Hum Mol Genet(1992)1363，Manthorpe et al.，Hum Gene Ther.(1983)4419)，用特殊的蛋白載體運(yùn)送DNA復(fù)合物(Wu et al.，J Biol Chem.(1989)26416985)，DNA和磷酸鈣共沉淀(Benvenisty & Reshef.PNAS USA.(1986)839551)，將DNA包在各種形式的脂質(zhì)體中(Kaneda et al.，Science(1989)243375)，顆粒轟炸(Tang et al.，Nature(1992)356152，Eisenbraun et al.，DNA Cell Biol(1993)12791)和用克隆的反轉(zhuǎn)錄載體體內(nèi)感染(Seeger et al.，PNAS USA(1984)815849)。
載體，宿主細(xì)胞，表達(dá)系統(tǒng)本發(fā)明還涉及含有一種或幾種本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體進(jìn)行基因工程改造的宿主細(xì)胞以及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。用源自本發(fā)明的DNA構(gòu)建物的RNA也可以通過(guò)無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)生產(chǎn)這樣的蛋白。
可以用本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員眾所周知的方法從含有表達(dá)系統(tǒng)的基因工程改造的宿主細(xì)胞制備本發(fā)明的重組多肽。因此，在進(jìn)一步的方面中本發(fā)明涉及含有一種或幾種本發(fā)明的多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，涉及用這樣的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了基因工程改造的宿主細(xì)胞，并涉及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
對(duì)于本發(fā)明多肽的重組生產(chǎn)，宿主細(xì)胞可以被進(jìn)行基因工程改造以整合入表達(dá)系統(tǒng)或表達(dá)系統(tǒng)的一部分，或整合入本發(fā)明的多核苷酸。向宿主細(xì)胞引入多核苷酸的方法可通過(guò)許多常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中描述的方法進(jìn)行，例如Dayis，et al BASIC METHODS IN MOLECULARBIOLOGY，(1986)和Sambrook，et al.，MOLECULAR CLONINGALABORATORY MANUAL，2ndEd.，Cold Spring Harbor Lboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-dextran介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)載體(transvection)，微量注射，陽(yáng)離子磷脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔，轉(zhuǎn)導(dǎo)，刮傷載入(scrape loading)，彈射引入(ballistic introduction)和感染。
適當(dāng)宿主的代表例子包括細(xì)菌細(xì)胞，例如鏈球菌(streptococci)，葡萄球菌(staphylococci)，腸球菌(enterococci)，大腸桿菌(E.coli)，鏈霉菌(streptomyces)，藍(lán)細(xì)菌(cyanobacteria)，枯草桿菌(Bacillus subtilis)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)和粘膜炎莫拉氏菌的細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，克魯紙氏酵母(Kluveromyces)，糖酵母(Saccharomyces)，擔(dān)子菌(basidiomycete)，白色假絲酵母(Cadida albicans)，曲霉(Aspergillus)；昆蟲(chóng)細(xì)胞例如Drosophila S2(果蠅細(xì)胞S2)和Spodoptera Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞如CHO，COS，Hela，C127，C127，3T3，BHK，293，CV-1和Bowes黑色素瘤細(xì)胞；植物細(xì)胞，如裸子植物細(xì)胞或被子植物細(xì)胞。
許多表達(dá)系統(tǒng)可被用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。如載體，包括染色體載體，游離基因載體和源自病毒的載體，例如，源自細(xì)菌質(zhì)粒、源自噬菌體、源自轉(zhuǎn)位子、源自酵母附加體，源自插入元件，源自病毒如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40病毒，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病病毒，小核糖核酸病毒和α病毒的載體，以及源自質(zhì)粒和噬菌體基因元件的載體，如粘粒載體和噬菌體載體。表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建物可以含有調(diào)節(jié)以及產(chǎn)生表達(dá)的控制區(qū)域。在這一點(diǎn)上通常任何適合用于維持、增殖或表達(dá)多核苷酸和/或在宿主中表達(dá)多肽的系統(tǒng)或載體都可以用于表達(dá)。可以通過(guò)許多眾所周知的常規(guī)技術(shù)中的任何一種將適當(dāng)?shù)腄NA序列插入到表達(dá)系統(tǒng)中，例如，通過(guò)Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，(supra)中列出的技術(shù)。
在真核重組表達(dá)系統(tǒng)中，為了將翻譯的蛋白分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，到質(zhì)周空間或分泌到細(xì)胞外環(huán)境，可以在表達(dá)的多肽中整合入適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)。這些信號(hào)多肽的內(nèi)源信號(hào)或外源信號(hào)。
可以通過(guò)眾所周知的方法從重組細(xì)胞的培養(yǎng)基中回收和純化本發(fā)明的多肽，包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最為優(yōu)選地，金屬離子親和層析(IMAC)被用于純化。當(dāng)多肽在細(xì)胞內(nèi)合成，分離和純化中被變性時(shí)眾所周知的蛋白質(zhì)重新折疊技術(shù)可被用于再生活性構(gòu)象。
表達(dá)系統(tǒng)也可以是活的重組微生物，如病毒或細(xì)菌。感興趣的基因被插入到活的重組病毒或細(xì)菌的基因組中。這種活載體的接種和體內(nèi)表達(dá)將導(dǎo)致該抗原的體內(nèi)表達(dá)并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。用于此目的的病毒和細(xì)菌的例子如乳多空病毒(例如牛痘病毒，禽痘病毒，金黃痘病毒)α病毒(如Sindbis病毒，Semliki Forest病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒)，腺病毒，腺相關(guān)病毒，小核糖核酸病毒(脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒)，皰疹病毒(帶狀水痘病毒等等)，Listeria(里斯特氏菌)，Salmonella(沙門(mén)氏菌)，Shigella，Neisseria，BCG(卡介苗)。這些病毒和細(xì)菌可能是有毒性的，或通過(guò)各種途徑弱化以得到活疫苗。這樣的或疫苗也構(gòu)成本發(fā)明的一部分。
診斷檢測(cè)，預(yù)防監(jiān)測(cè)，血清型檢測(cè)和突變檢測(cè)本發(fā)明還涉及本發(fā)明的BASB020多核苷酸和多肽作為診斷試劑的應(yīng)用。在真核生物，尤其是在哺乳動(dòng)物中，對(duì)BASB020多核苷酸和/或多肽檢測(cè)將提供對(duì)疾病診斷，疾病階段診斷以及感染生物體對(duì)藥物的反應(yīng)的診斷的方法?？梢酝ㄟ^(guò)許多眾所周知的技術(shù)以及此處所提供的方法在核酸或氨基酸水平上對(duì)真核生物，尤其是哺乳動(dòng)物，特別是人類(lèi)，特別是感染了或懷疑感染了含有BASB020基因或蛋白的生物體的人類(lèi)，進(jìn)行檢測(cè)。
可以從可能被感染的或已經(jīng)被感染的個(gè)體的身體物質(zhì)里得到用于預(yù)測(cè)，診斷或其它分析用的多肽或多核苷酸。來(lái)自任何這些來(lái)源的多核苷酸，尤其是DNA或RNA，可以被直接用于檢測(cè)，或者可以在分析之前用PCR或任何其他擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行酶促擴(kuò)增。RNA，尤其是mRNA，cDNA和基因組DNA也可以以相同的方式使用。利用擴(kuò)增可以通過(guò)對(duì)生物體的選定多核苷酸基因型的分析而對(duì)個(gè)體中存在的感染或常駐種屬和菌株進(jìn)行描述。通過(guò)比較擴(kuò)增產(chǎn)物和選自相關(guān)生物體，的參考序列可以根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物大小的改變而檢測(cè)到缺失或插入；上述參考生物體優(yōu)選地為相同屬的不同種或相同種的不同菌株。通過(guò)將擴(kuò)增的DNA和標(biāo)記的BASB020多核苷酸序列雜交而鑒定點(diǎn)突變。通過(guò)DNA酶或RNA酶消化，或通過(guò)檢測(cè)熔解溫度或復(fù)性動(dòng)力學(xué)可以分別將完全或明顯配對(duì)的DNA或RNA序列和不完全或不明顯配對(duì)的二體區(qū)分開(kāi)。多核苷酸序列之間的差別還可以通過(guò)多核苷酸片段在凝膠中的電泳遷移率相對(duì)于參考序列的改變來(lái)檢測(cè)。中可用在含有或不含有變性試劑的條件下進(jìn)行。多核苷酸之間的差別還可以通過(guò)直接的DNA或RNA測(cè)序來(lái)檢測(cè)。參見(jiàn)，例如，Myers et al.，Science，2301242(1985)。特定部位的序列改變還可以通過(guò)核酸酶保護(hù)試驗(yàn)，例如RNA酶，V1和S1保護(hù)試驗(yàn)或化學(xué)裂解方法來(lái)揭示。參見(jiàn)，例如，Cotton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，854397-4401(1985)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中可以構(gòu)建含有BASB020核苷酸序列或其片段的寡聚核苷酸陣列(array)以進(jìn)行對(duì)，例如，基因突變、血清型、分類(lèi)學(xué)分類(lèi)或鑒定，的高效篩選。陣列技術(shù)是眾所周知的并且具有廣泛的用途，并且可以用來(lái)研究許多分子遺傳學(xué)問(wèn)題，包括基因表達(dá)、遺傳相關(guān)(geneti clinkage)和以及遺傳可變性(geneticvariability)(參見(jiàn)，。例如，Chee et al.，Science 274610(1996))。
因此在另一方面本發(fā)明涉及一種診斷試劑盒，該試劑盒含有(a)本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選地為SEQ ID NO1，3，5或7中的核苷酸序列，或其片段；(b)和(a)中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列(c)本發(fā)明的一種多肽，優(yōu)選地為SEQ ID NO2，4，6或8中的多肽，或其片段；或(d)針對(duì)本發(fā)明的多肽的抗體，上述多肽優(yōu)選地為SEQ ID NO2，4，6或8中的多肽。
應(yīng)當(dāng)理解在在這樣的任何一個(gè)試劑盒中(a)，(b)，(c)或(d)可能包含一種實(shí)質(zhì)性的組分。這樣的試劑盒可能在診斷疾病或診斷對(duì)疾病易感性等等中有用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多核苷酸作為診斷試劑的應(yīng)用。本發(fā)明的多核苷酸，優(yōu)選地，SEQ ID NO1，3，5或7中的多核苷酸，的與疾病或病原性相關(guān)的突變形式的檢測(cè)可能提供一種診斷工具，其可能增加了，或定義了對(duì)疾病的診斷方法，或?qū)膊∵M(jìn)程的預(yù)測(cè)方法，或確定疾病階段的方法，或確定對(duì)疾病的易感性的方法，上述疾病可能是由于該多核苷酸的表達(dá)不足或過(guò)量表達(dá)或表達(dá)發(fā)生改變而造成的?？梢酝ㄟ^(guò)許多技術(shù)，例如本文其他地方所描述的技術(shù)，在多核苷酸的水平上檢測(cè)在這樣的多核苷酸上帶有突變的生物體，尤其是感染性生物體。
也可以通過(guò)許多技術(shù)在多核苷酸和/或多肽的水平上檢測(cè)在本發(fā)明的多核苷酸和/或多肽上帶有突變或多形性(等位變化)的細(xì)胞，以進(jìn)行，例如，血清型分析。例如，RT-PCR可以被用于檢測(cè)RNA上的突變。有其優(yōu)選的是；聯(lián)合使用RT-PCR和自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)，例如，GeneScan。RNA，cDNA或基因組DNA可以被用于同樣的目的，PCR。例如，和編碼BASB020多肽的多核苷酸互補(bǔ)的PCR引物可以被用于鑒定和分析突變。
本發(fā)明進(jìn)而提供了從5’和/或3’除去1，2，3或4個(gè)核苷酸的引物。這些引物可以被用于擴(kuò)增BASB020DNA和/或RNA，上述BASB020DNA和/或RNA是從源自一個(gè)個(gè)體的，例如身體物質(zhì)，的樣品分離得到的。上述引物可以被用于擴(kuò)增從一個(gè)感染個(gè)體分離得到的多核苷酸，以便該多核苷酸可以被用于多種技術(shù)以便闡明該核苷酸的序列。通過(guò)這種方法多核苷酸序列中的突變可以被檢測(cè)到并被用于診斷和/或預(yù)測(cè)感染或感染的階段或進(jìn)程，或用于進(jìn)行血清型分析和/或感染源的分類(lèi)。
本發(fā)明進(jìn)而提供了一種診斷疾病的方法，上述疾病優(yōu)選地為細(xì)菌感染，更為優(yōu)選地為由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染，該方法包括確定源自個(gè)體的樣品，例如身體物質(zhì)，中具有SEQ ID NO1，3，5或7序列的多核苷酸水平的不斷升高。BASB020多肽表達(dá)的升高或降低可以用本領(lǐng)域中眾所周知的任何多核苷酸定量方法進(jìn)行，例如擴(kuò)增、PCR、RT-PCR、RNA酶保護(hù)、Northern印跡法、分光光度法和其它雜交方法。
此外通過(guò)和正常的對(duì)照組織樣品相比較檢測(cè)BASB020多肽的過(guò)量表達(dá)的根據(jù)本發(fā)明的診斷檢測(cè)可以被用來(lái)檢測(cè)，例如，感染的存在?？梢员挥脕?lái)確定源自宿主的樣品，例如身體樣品中BASB020多肽水平的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員是眾所周知的。這樣的檢測(cè)技術(shù)包括放射性免疫檢測(cè)，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)，Western印跡分析，抗體夾心法檢測(cè)，抗體檢測(cè)和ELISA檢測(cè)。
本發(fā)明的多核苷酸可以被用作多核苷酸陣列，優(yōu)選地高密度陣列或格子(grid)的組分。這些陣列在診斷或預(yù)測(cè)目的中尤其有用。例如，一套點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)含有不同的基因并進(jìn)而包括本發(fā)明的本發(fā)明的一種或多種多核苷酸，可以被用于探測(cè)，例如通過(guò)雜交或核酸擴(kuò)增，通過(guò)源自身體樣品或從身體樣品得到的探針來(lái)確定一個(gè)個(gè)體中特定核苷酸序列或相關(guān)序列的存在。這樣的存在可能意味著病原體的存在，尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在，并且可以用于檢測(cè)或預(yù)測(cè)疾病和/或疾病的進(jìn)程。含有許多SEQ ID NO1，3，5或7中多核苷酸序列的變體的格子是優(yōu)選的。含有許多SEQ ID NO2，4，6或8中多肽序列的變體的格子也優(yōu)選的。
抗體本發(fā)明的多肽和多核苷酸或其變體或表達(dá)它們的細(xì)胞可以被用作免疫原來(lái)分別產(chǎn)生對(duì)這樣的多肽或多核苷酸具有免疫特異性的抗體。
在本發(fā)明的某些優(yōu)秀的實(shí)施方案中提供了抗BASB020多肽或多核苷酸的抗體。
抗本發(fā)明的多肽或多核苷酸的抗體可以這樣得到對(duì)動(dòng)物，優(yōu)選地非人類(lèi)動(dòng)物，通過(guò)常規(guī)方法施用本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸，或它們之一或兩者的帶有表位的片段，它們之一或兩者的類(lèi)似物，或表達(dá)它們之一或兩者的細(xì)胞。單克隆抗體的制備可以用本領(lǐng)域中已知的由連續(xù)細(xì)胞系提供抗體任何技術(shù)。例子包括各種技術(shù)，例如Kohler，G.and Milstein，C.Nature 256495-497(1975)；Kozbor et al.，Immunology Today 472(1983)；Cole et al.，pg.77-96 inMONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的技術(shù)。
用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)可以被改造來(lái)生產(chǎn)針對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸的單鏈抗體。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠，或其他生物體或動(dòng)物，如其他哺乳動(dòng)物，可以被用來(lái)表達(dá)對(duì)本發(fā)明的多肽或多核苷酸具有免疫特異性的人化抗體。
替代地，根據(jù)對(duì)本發(fā)明多肽的結(jié)合活性，噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)(phagedisplay technology)可以被用來(lái)從淋巴細(xì)胞PCR擴(kuò)增V-基因庫(kù)中或從天然文庫(kù)中選擇抗體基因；上述淋巴細(xì)胞來(lái)自用來(lái)篩選抗BASB020的人群(McCafferty，et al.，(1990)，Nature 348，552-554；Marks，et al.，(1992)Biotechnology 10，779-783)。通過(guò)，例如，chain shuffling(Clackson et al.，(1991)Nature 352628)可以提高這些抗體的親和性。
以上描述的抗體可以被用來(lái)分離或鑒定表達(dá)本發(fā)明的的多肽或多核苷酸的顆粒，用來(lái)通過(guò)，例如親和層析，純化該多肽或多核苷酸。
因此，抗BASB020多肽或BASB020多核苷酸的抗體可以被用來(lái)治療感染尤其是細(xì)菌感染，等等。
多肽的變體，包括抗原性上，表位上或免疫學(xué)上對(duì)等的變體構(gòu)成了本發(fā)明的一個(gè)特殊的方面。
優(yōu)選地，可以修飾上述抗體或其變體使其對(duì)個(gè)體的免疫原性降低。例如，如果上述個(gè)體是人那么該抗體可以被最為優(yōu)選地“人化”，在人化抗體中雜交瘤抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)或其它區(qū)域被移植到人單克隆抗體，例如Jones et al.(1986).Nature 321，522-525中所描述或Tempest et al.，(1991)Biotechnology 9，266-273中所描述。
拮抗劑和激動(dòng)劑-檢測(cè)與分子本發(fā)明的多核苷酸和多肽也可以用于在細(xì)胞，無(wú)細(xì)胞制備物，化學(xué)文庫(kù)和天然產(chǎn)物混合物中評(píng)估小分子底物和配基的結(jié)合。這些底物和配基可以是天然底物和配基或者是結(jié)構(gòu)或功能上的模擬物。參見(jiàn)，例如，Coligan et al.，Current Protocols in Immunology 1(2)Chapter 5(1991)。
篩選方法可能僅僅是通過(guò)直接或間接與候選化合物相關(guān)的標(biāo)記測(cè)量候選化合物和上述多肽或多核苷酸的結(jié)合，和或帶有該多肽或多核苷酸的細(xì)胞或膜，或和該多肽的融合蛋白的結(jié)合。替代地，篩選方法可能涉及和標(biāo)記競(jìng)爭(zhēng)劑的的競(jìng)爭(zhēng)。進(jìn)而，利用針對(duì)含有該多肽或多核苷酸的細(xì)胞的適當(dāng)檢測(cè)系統(tǒng)，這些篩選方法可能測(cè)量候選化合物是否能導(dǎo)致一種由于激活或抑制上述多肽或多核苷酸而產(chǎn)生的信號(hào)。激活的抑制劑通常是在已知激動(dòng)劑存在的情況下檢測(cè)，并且觀察候選化合物的存在對(duì)激動(dòng)劑所導(dǎo)致的激活的影響。組成型激活的多肽和/或組成型表達(dá)的多肽或多核苷酸可以被應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)激動(dòng)劑或抑制劑的篩選方法，這可以通過(guò)在沒(méi)有激動(dòng)劑或抑制劑存在的情況下，根據(jù)具體情況，檢測(cè)候選化合物是否導(dǎo)致對(duì)該多肽或多核苷酸引起的激活的抑制。進(jìn)而，該篩選方法可能僅僅包括以下步驟將候選化合物與含有本發(fā)明的一種多肽或多核苷酸的溶液混合以形成混合物，測(cè)量混合物中BASB020多肽和/或多核苷酸的活性并將混合物中BASB020多肽和/或多核苷酸的活性與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。融合蛋白，例如由BASB020多肽和Fc部分形成的融合蛋白，如此前所描述，也可以被用于高通量篩選檢測(cè)以鑒定本發(fā)明的多肽的拮抗劑以及系統(tǒng)發(fā)生和/或功能上相關(guān)的多肽(參見(jiàn)D.Bennett et al.，J Mol Recognition，852-58(1995)；和K.Johanson et al.，J Biol Chem，270(16)9459-9471(1995))。
與本發(fā)明的多肽結(jié)合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗體可以被用來(lái)設(shè)置一些篩選方法，上述篩選方法是用來(lái)探測(cè)加入的化合物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生mRNA和/或多肽的影響。例如可以構(gòu)建一種ELISA測(cè)試以測(cè)量分泌水平的或細(xì)胞相連的多肽水平，這種方法是利用單克隆和多克隆抗體通過(guò)本領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法進(jìn)行的。這可以被用來(lái)尋找可能抑制或增強(qiáng)多肽在適當(dāng)?shù)慕?jīng)過(guò)操作的細(xì)胞或組織中的表達(dá)的制劑(也分別稱(chēng)為拮抗劑或激動(dòng)劑)。
本發(fā)明還提供了篩選化合物以鑒定增強(qiáng)(激動(dòng)劑)或阻止(拮抗劑)BASB020多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤其是這些抑菌和/或殺菌的化合物，的方法。篩選方法可能需要高通量技術(shù)。例如，為了篩選激動(dòng)劑或拮抗劑，在存在或不存在可能是激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物的情況下將合成的反應(yīng)混合物、含有BASB020多肽的細(xì)胞分隔(cell compartment)，如膜，細(xì)胞包膜或細(xì)胞壁、或其任何制備物以及這樣多肽的標(biāo)記底物或配基一起溫育。候選分子激活或拮抗BASB020多肽的能力反映在標(biāo)記配基結(jié)合的下降或標(biāo)記底物的產(chǎn)物的產(chǎn)生減少。無(wú)效結(jié)合的分子，即，結(jié)合而不誘導(dǎo)BASB020多肽的效果的分子非常可能是很好的拮抗劑。結(jié)合得很好，并且，根據(jù)具體情況，增加從底物產(chǎn)生產(chǎn)物的速率、增加信號(hào)傳導(dǎo)或或增加化學(xué)通道活性的分子是激動(dòng)劑?？梢酝ㄟ^(guò)報(bào)告系統(tǒng)探測(cè)可能被增強(qiáng)的從底物產(chǎn)生產(chǎn)物，信號(hào)傳導(dǎo)或化學(xué)通道活性的速率或水平，根據(jù)具體情況。在這一點(diǎn)上有用的報(bào)告系統(tǒng)包括但不限于本領(lǐng)域中已知的比色系統(tǒng)，被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的標(biāo)記底物，能反映BASB020多核苷酸或多肽活性的改變的報(bào)告基因以及結(jié)合測(cè)試。
另一個(gè)檢測(cè)BASB020多肽激動(dòng)劑的例子為競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試，在上述競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)試中在適于進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)試的條件下將BASB020和潛在的激動(dòng)劑與BASB020結(jié)合分子，重組BASB020結(jié)合分子，天然底物或配基，或底物或配基模擬物混合在一起。BASB020可以被標(biāo)記，例如用放射性和比色化合物標(biāo)記，使得與結(jié)合分子結(jié)合的BASB020分子數(shù)或被轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物可以被精確地測(cè)定以評(píng)估潛在拮抗劑的效力。
潛在拮抗劑包括有機(jī)小分子，肽，多肽以及能夠結(jié)合本發(fā)明的的多核苷酸和/或多肽從而抑制其活性或表達(dá)的抗體，等等。潛在的拮抗劑也可以是有機(jī)小分子，肽，多肽，如結(jié)合位點(diǎn)與結(jié)合分子相同的緊密相關(guān)的蛋白或抗體，如結(jié)合后不會(huì)誘導(dǎo)BASB020誘導(dǎo)的活性從而通過(guò)防止BASB020多肽和/或多核苷酸的結(jié)合而阻止了BASB020多肽/或多核苷酸的表達(dá)或作用的結(jié)合分子。
潛在的拮抗劑包括結(jié)合并占據(jù)上述多肽的結(jié)合位點(diǎn)從而阻止其和細(xì)胞結(jié)合分子的結(jié)合以至于阻止了其正常生物學(xué)活性的小分子。這一小分子的例子包括但不限于有機(jī)小分子、肽或類(lèi)肽分子。其他潛在的拮抗劑包括反義分子(參見(jiàn)Okano，J.Neurochem.56560(1991)；OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENEEXPRESSION，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988)中對(duì)這些分子的描述)。優(yōu)選的潛在拮抗劑包括BASB020的變體以及與之相關(guān)的化合物。
在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明涉及遺傳工程改造的融合蛋白，上述融合蛋白含有本發(fā)明多肽或其片段以及各種亞型的免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA，IgE)重鏈或輕鏈的恒定區(qū)。優(yōu)選的免疫球蛋白是人IgG，特別是IgG1的重鏈恒定區(qū)，其中融合位點(diǎn)位于鉸鏈區(qū)。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中Fc部分可以通過(guò)引入切除序列而被簡(jiǎn)單地除去，上述切除序列可以被凝血因子X(jué)a切開(kāi)。進(jìn)而，本發(fā)明通過(guò)基因工程制備這些融合蛋白的方法，以及涉及這些融合蛋白在藥物篩選、診斷以及治療中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步的方面還涉及編碼這樣的融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技術(shù)的例子可以在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)NoWO94/29459和WO94/22914中找到。
此處提供的每個(gè)多核苷酸序列都可以被用于尋找和開(kāi)發(fā)抗菌化合物。這些多核苷酸編碼的蛋白表達(dá)后可以被用作篩選抗菌藥物的靶。進(jìn)而，在各自的mRNA上編碼上述蛋白的氨基末端或Shine-Delgarno或其它翻譯促進(jìn)序列的多核苷酸序列可以被用來(lái)構(gòu)建反義序列以控制感興趣的編碼序列的表達(dá)。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的多肽、多核苷酸、激動(dòng)劑或拮抗劑在干擾病原體和真核宿主，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物宿主，之間的最初相互作用上的應(yīng)用，上述病原體和和宿主之間的最初相互作用導(dǎo)致了感染。特別是，本發(fā)明的分子可以用于防止細(xì)菌，特別是革蘭氏陽(yáng)性和/或革蘭氏陰性細(xì)菌粘附在真核生物的，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物的，留置裝置上的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，或粘附在傷口的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上；阻止真核生物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)菌BASB020蛋白之間細(xì)菌粘附，上述細(xì)菌粘附導(dǎo)致組織損傷；和/或阻止感染中疾病發(fā)生的進(jìn)程，上述感染是由于植入留置裝置或其他外科技術(shù)以外的原因引起的。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了BASB020激動(dòng)劑以及拮抗劑優(yōu)選地為抑菌或殺菌的激動(dòng)劑和拮抗劑。
本發(fā)明的激動(dòng)劑和拮抗劑可以被用于，例如，防止抑制和/或治療疾病。
在進(jìn)一步的方面中本發(fā)明涉及本發(fā)明多肽的擬表位。擬表位是和天然肽足夠相似的肽序列(序列上或結(jié)構(gòu)上)，它能夠被識(shí)別天然肽的抗體所識(shí)別；當(dāng)它和適當(dāng)?shù)妮d體偶聯(lián)時(shí)能夠產(chǎn)生識(shí)別天然肽的抗體。
可以通過(guò)添加、缺失或替代選出的氨基酸為特定的目的設(shè)計(jì)擬表位。因此，上述肽可以進(jìn)行修飾以便于和蛋白載體交聯(lián)。例如，對(duì)于一些交聯(lián)方法而言含有末端半胱氨酸是有利的。此外對(duì)于和蛋白載體交聯(lián)的多肽在遠(yuǎn)離交聯(lián)端的一端含有疏水末端時(shí)合乎需要的，這樣多肽未交聯(lián)的一端可以保持和載體蛋白的表面相聯(lián)。這樣肽呈現(xiàn)出的構(gòu)象非常近似于該肽在天然完全分子中的構(gòu)象。例如，可以改造肽使之具有N末端的半胱氨酸和C末端的疏水酰胺化的尾巴。替代地，可以替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸的D-立體異構(gòu)體以產(chǎn)生有利的衍生物，例如，以增強(qiáng)肽的穩(wěn)定性。
替代地，可以通過(guò)，如，噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)(EP 0 552 267 B1)用抗體鑒定肽擬表位，上述抗體自身能結(jié)合本發(fā)明的多肽。這種技術(shù)產(chǎn)生大量的模擬天然肽結(jié)構(gòu)的肽序列，因此上述肽序列能夠結(jié)合抗天然肽的抗體，但是它們自身和天然多肽不一定有顯著的序列同源性。
疫苗本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在一個(gè)個(gè)體，尤其是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地是人，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括為上述個(gè)體接種BASB020多核苷酸和/或多肽，或它們的片段或變體，上述接種足以產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答以保護(hù)上述個(gè)體不受感染，特別是不受細(xì)菌感染，尤其特別是不受粘膜炎莫拉氏菌感染。還提供了通過(guò)免疫應(yīng)答減緩細(xì)菌復(fù)制的方法。本發(fā)明的另一個(gè)方面還涉及在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括對(duì)這樣的個(gè)體體內(nèi)輸送核酸載體，序列或核酶以直接表達(dá)BASB020多核苷酸和/或多肽，或它們的片段或變體，以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，如，產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫應(yīng)答包括，例如，產(chǎn)生細(xì)胞因子的T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞，以保護(hù)個(gè)體，優(yōu)選地為人類(lèi)，免得疾病，不管該疾病是否已經(jīng)在個(gè)體內(nèi)產(chǎn)生。施用基因的一個(gè)例子為將基因涂覆在顆粒或其它東西的表面以加速它進(jìn)入所需要的細(xì)胞。這樣的核酸載體可以含有DNA、RNA、核酶和修飾的核酸，DNA/RNA雜交體、DNA蛋白復(fù)合物或RNA蛋白復(fù)合物。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)方面涉及一種免疫組合物，當(dāng)它被引入到個(gè)體，優(yōu)選地人類(lèi)中時(shí)能在上述個(gè)體中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，在這樣的個(gè)體中誘導(dǎo)針對(duì)BASB020多核苷酸和/或其編碼的多肽的免疫應(yīng)答，其中上述組合物含有重組BASB020多核苷酸和或其編碼的多肽，并且/或者含有DNA和/或RNA，上述DNA和/或RNA編碼本發(fā)明的BASB020多核苷酸、該多核苷酸編碼的多肽或其它多肽。免疫應(yīng)答可以被用作治療或預(yù)防的目的，并且可以是抗體免疫或細(xì)胞免疫的形式，如由于CTL或CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的免疫。
BASB020多肽或其片段可以與輔蛋白或化學(xué)組成部份融合，輔蛋白和化學(xué)組成部份自身可以產(chǎn)生或不產(chǎn)生抗體，但它們能穩(wěn)定第一個(gè)蛋白并產(chǎn)生具有抗原性和/或免疫原性，以及優(yōu)選地保護(hù)特性，的融合或修飾蛋白。因此融合重組蛋白優(yōu)選地進(jìn)而含有一種抗原性輔蛋白，如源自流感嗜血桿菌的脂蛋白D、谷胱氨肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或β-糖苷酶，或任何其它穩(wěn)定該蛋白并有利于其生產(chǎn)和純化的較大的輔蛋白。進(jìn)而，該輔蛋白可能在接受上述蛋白的生物體中提供對(duì)其免疫系統(tǒng)的一般刺激，在這個(gè)意義上該輔蛋白可能作為一種佐劑。上述輔蛋白可以連接到上述第一蛋白的氨基端或羧基端。
本發(fā)明還提供了組合物，尤其是疫苗組合物，以及含有本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及免疫刺激DNA序列的方法，如Sato，Y.et al.Science 273352(1996)中所描述。
本發(fā)明還提供了在多核苷酸構(gòu)建體中利用以上描述的多核苷酸或其特定片段的方法，上述片段編碼細(xì)菌細(xì)胞表面蛋白的不變區(qū)，上述構(gòu)建體被用于感染了粘膜炎莫拉氏菌的動(dòng)物模型的基因免疫試驗(yàn)中。這樣的試驗(yàn)在鑒定能夠引起預(yù)防性或治療性免疫應(yīng)答的蛋白表位上尤其有用。有人相信通過(guò)這種方法將能夠隨后制備具有特別價(jià)值的單克隆抗體，上述單克隆抗體源自成功地抵抗了或清除了感染的動(dòng)物的器官，上述單克隆抗體可以被用于開(kāi)發(fā)哺乳動(dòng)物中，有其事人類(lèi)中，細(xì)菌感染，尤其是粘膜炎莫拉氏菌感染的預(yù)防性制劑或治療方法。
本發(fā)明還提供了一種疫苗配方，該配方含有免疫原性的本發(fā)明的重組多肽和/或多核苷酸以及適當(dāng)?shù)妮d體，如制藥上可接受的載體。由于多肽和多核苷酸中胃中可能被分解，因此優(yōu)選地是通過(guò)腸道外途徑施用，包括，例如，皮下、肌肉內(nèi)、靜脈或皮內(nèi)施用。適用于腸道外施用的配方包括水溶解的或非水溶解的無(wú)菌注射溶液，可能含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌化合物以及使配方與個(gè)體的體液，優(yōu)選地為血液，等滲的溶質(zhì)；還包括含有懸浮劑或增稠劑的無(wú)菌水懸液或非水懸液。上述配方可以存在于單一劑量或多劑量容器中，例如密閉的安瓿和瓶子中并儲(chǔ)存于凍干條件下，只需要在使用前加入無(wú)菌液體載體。
本發(fā)明的疫苗配方還可以包括佐劑系統(tǒng)以增強(qiáng)該配方的免疫原性。優(yōu)選的佐劑系統(tǒng)優(yōu)選地產(chǎn)生TH1類(lèi)型的應(yīng)答。
一種免疫應(yīng)答可以被廣泛地區(qū)分成為兩種極端的類(lèi)型，即體液或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(通常它們的保護(hù)機(jī)制的特征分別為抗體或細(xì)胞效應(yīng)器)。應(yīng)答的這些分類(lèi)被命名為T(mén)H1型應(yīng)答(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答)和TH2型免疫應(yīng)答(體液應(yīng)答)。
極端TH1型免疫應(yīng)答的特征在于產(chǎn)生抗原特異性的，單元型限制(haplotype restricted)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞應(yīng)答。在小鼠的TH1型應(yīng)答中的特征經(jīng)常為產(chǎn)生IgG2a亞型的抗體，而在人類(lèi)中這相應(yīng)于IgG1型抗體。TH2型免疫應(yīng)答的特征為產(chǎn)生廣泛的免疫球蛋白亞型包括小鼠IgG1，IgA，和IgM。
可以認(rèn)為這兩種亞型的應(yīng)答的發(fā)展背后的驅(qū)動(dòng)力是細(xì)胞因子。高水平的TH1型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)針對(duì)既定抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而高水平的TH2型細(xì)胞因子傾向于誘導(dǎo)針對(duì)既定抗原的體液免疫應(yīng)答。
TH1型和TH2型免疫應(yīng)答的區(qū)分并不是絕對(duì)的。事實(shí)上一個(gè)個(gè)體將支持的免疫應(yīng)答被描述為主要TH1或主要TH2。然而，根據(jù)Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T細(xì)胞克隆中的描述來(lái)考慮細(xì)胞因子家族經(jīng)常是方便的(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2細(xì)胞不同的淋巴因子類(lèi)型分泌導(dǎo)致不同的功能特征，AnnualReview of Immunology，7，p145-173)。通常，TH1類(lèi)型的應(yīng)答是與T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生INFγ和IL2細(xì)胞因子相關(guān)的。其它經(jīng)常與TH1類(lèi)型免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)直接相關(guān)的細(xì)胞因子，如IL-12，不是由T細(xì)胞產(chǎn)生的。相反，TH2類(lèi)型的應(yīng)答經(jīng)常與IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌相關(guān)。
已知某些疫苗佐劑特別適合誘導(dǎo)TH1或TH2型細(xì)胞因子應(yīng)答。通常接種或感染后免疫應(yīng)答的TH1∶TH2平衡的最好指示包括用抗原重新刺激后直接測(cè)量T淋巴細(xì)胞體外產(chǎn)生的TH1或TH2細(xì)胞因子，和/或測(cè)量抗原特異性抗體應(yīng)答的IgG1∶IgG2比率。
因此TH1型佐劑是指用抗原體外刺激時(shí)優(yōu)先刺激分離的T細(xì)胞群產(chǎn)生高水平TH1型細(xì)胞因子，并促進(jìn)CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及與TH1型亞型相關(guān)的抗原特異性免疫球蛋白應(yīng)答的發(fā)展的佐劑。
能優(yōu)先刺激TH1型應(yīng)答的在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.WO94/00153和WO95/17209中有所描述。
3 De-O-脂酰化單磷?；珹(3 De-O-acylatedmonophosphoryl lipid A，3D-MPL)是一種這樣的佐劑。這是從GB2220211(Ribi)中得知的。在化學(xué)上它是帶有4，5或6脂酰鏈的3De-O-脂?；瘑瘟柞；珹，由Ribi Immunochem，Montana生產(chǎn)。一種優(yōu)選形式的3 De-O-脂?；瘑瘟柞；珹公布于歐洲專(zhuān)利0689 454中(Smith Kline Beecham Biologicals SA)。
優(yōu)選地，3D-MPL的顆粒足夠小，以便可以過(guò)濾通過(guò)0.22微米的膜除菌(歐洲專(zhuān)利號(hào)0 689 454)。
每劑量中存在的3D-MPL的量可以在10μg-100μg的范圍內(nèi)，優(yōu)選地在25μg-50μg內(nèi)，其中存在的上述抗原的量通常在2-50μg每劑量的范圍內(nèi)。
另一種優(yōu)選的佐劑包括QS21，一種源自Quilaja SaponariaMolia樹(shù)皮的，經(jīng)過(guò)HPLC純化的無(wú)毒組分。供選地，這種佐劑可以被混合到3 De-O-脂?；瘑瘟柞；珹中，供選地與載體一起混合。
生產(chǎn)QS21的方法在美國(guó)專(zhuān)利No.5,057,540中公布。
含有QS21的非反應(yīng)原性佐劑的配方先前已有描述(WO96/33739)。這樣的含有QS21和膽固醇的配方和一種抗原配制在一起時(shí)已經(jīng)被證明是成功的TH1刺激佐劑。
作為T(mén)H1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激劑的佐劑進(jìn)而包括免疫調(diào)節(jié)寡聚核苷酸，例如未甲基化的CpG序列，如WO 96/02555中所公布。
不同TH1刺激佐劑，如先前所描述，的組合也被認(rèn)為是提供了TH1細(xì)胞應(yīng)答的優(yōu)先刺激劑的佐劑。例如，QS21可以和3D-MPL配制在一起。QS21∶3D-MPL的比例通常為1∶10到10∶1這個(gè)級(jí)別；優(yōu)選地為1∶5到5∶1，并且經(jīng)常是1∶1。最佳協(xié)同作用的優(yōu)選范圍是2.5∶1到1∶2 3D-MPL∶QS21。
優(yōu)選地，載體也存在與根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物中。該載體可以是水包油乳劑或銨鹽，如磷酸銨或氫氧化銨。
優(yōu)選的水包油乳劑含有可代謝的油，如鯊烯、α生育酚和土溫80。在一個(gè)特別優(yōu)選的方面根據(jù)本發(fā)明的疫苗組合物的抗原和QS21以及3D-MPL共同存在于這樣的乳劑中。此外，水包油乳劑可以含有span85和/或卵磷脂和/或三辛酸(tricaprylin)。
通常對(duì)于人類(lèi)施用而言QS21和3D-MPL在疫苗中存在的范圍為1μg-200μg，如10-100μg，優(yōu)選地10μg-50μg每劑量。通常水包油將含有2到10％的鯊烯；2到10％的α生育酚以及0.3到3％的土溫80。優(yōu)選地鯊烯α生育酚的比例等于或小于1以提供更穩(wěn)定的乳劑。Span85可以以1％的水平存在。在一些情況下本發(fā)明的疫苗進(jìn)而含有穩(wěn)定劑可能是有利的。
無(wú)毒水包油乳劑進(jìn)而在水載體中。含有無(wú)毒的油，例如鯊?fù)榛蝓徬榛瘎缤翜?0。上述水載體可以是，例如，磷酸鹽緩沖液。
在WO95/17210中描述了在水包油中含有QS21、3D-MPL和生育酚的特別強(qiáng)勁的佐劑配方。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的疫苗配方以及其他抗原，特別是可以用于治療癌癥、自體免疫疾病和相關(guān)病情的抗原，的多價(jià)疫苗組合物。這樣的多價(jià)疫苗組合物可以含有TH1誘導(dǎo)佐劑，如此前所描述。
盡管本發(fā)明是關(guān)于某些BASB020多肽和多核苷酸的，但是應(yīng)當(dāng)理解它覆蓋了天然存在的多肽和多核苷酸的片段，還覆蓋了類(lèi)似的多肽和多核苷酸，在上述的類(lèi)似多肽和多核苷酸中進(jìn)行了添加、缺失或替代而不會(huì)實(shí)質(zhì)性的影響重組多肽或多核苷酸的免疫原性特性。
組合物，試劑盒和施用在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的方面中提供了含有BASB020多核苷酸和/或BASB020多肽的組合物以施用到細(xì)胞或多細(xì)胞生物體中。
本發(fā)明還涉及含有此處所討論的多核苷酸和/或多肽或它們的激動(dòng)劑或拮抗劑的組合物。本發(fā)明的多肽和多核苷酸還可以和無(wú)菌的或非無(wú)菌的載體，例如適用于對(duì)一個(gè)個(gè)體施用的制藥載體，聯(lián)合使用于細(xì)胞、組織或生物體。這樣的組合物含有，例如，介質(zhì)添加劑(mediaadditive)或藥用上有效劑量的本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸以及制藥上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體可以包括，但是不限于，鹽溶液，緩沖的鹽溶液，右旋糖，水，甘油，乙醇和它們的組合。上述配方應(yīng)當(dāng)適合于施用方式。本發(fā)明進(jìn)而涉及診斷和制藥包和試劑盒，它們含有一個(gè)或多個(gè)充滿了上述本發(fā)明組合物的成分的容器。本發(fā)明的多肽，多核苷酸和其它化合物可以單獨(dú)使用或和其它化合物一起使用，如治療用的化合物。
上述藥用組合物可以以任何有效的方便的方式施用，例如，通過(guò)局部、口服、陰道、靜脈、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、鼻腔內(nèi)或皮內(nèi)途徑等等途徑施用。
在治療或預(yù)防時(shí)活性制劑可以作為可注射的組合物對(duì)個(gè)體施用，例如作為無(wú)菌液體分散物，優(yōu)選地是等滲的。
在進(jìn)一步的方面中本發(fā)明提供了藥用組合物，該組合物中含有治療上有效劑量的多肽和/或多核苷酸，如可溶形式的本發(fā)明的多肽和/或多核苷酸激動(dòng)劑或拮抗劑肽或小分子化合物，以及藥用上可接受的載體或賦形劑。這樣的載體可以包括，但是不限于，鹽溶液，緩沖的鹽溶液，右旋糖，水，甘油，乙醇和它們的組合。上述配方應(yīng)當(dāng)適合于施用方式。本發(fā)明進(jìn)而涉及診斷和制藥包和試劑盒，它們含有一個(gè)或多個(gè)充滿了上述本發(fā)明組合物的成分的容器。本發(fā)明的多肽，多核苷酸和其它化合物可以單獨(dú)使用或和其它化合物一起使用，如治療用的化合物。
組合物將被改造得適用于施用途徑，例如全身途徑或口服途徑。優(yōu)選的全身施用形式包括注射，通常為通過(guò)靜脈注射。也可以使用其它注射途徑，如皮下注射、肌肉內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射。替代的全身施用方法包括透過(guò)黏膜和透過(guò)皮膚的施用，以膽酸鹽或梭鏈孢酸或其它去污劑作為滲透劑。此外，本發(fā)明的多肽或其它化合物可以被配制成腸道配方或膠囊形式，口服施用也是可能的。通過(guò)藥膏、軟膏、凝膠、溶液、粉末等等形式，這些化合物的施用也可以是局部的和/或定位的。
對(duì)于哺乳動(dòng)物，特別是人類(lèi)，的施用而言，預(yù)期活性制劑每天的劑量水平為0.01mg/kg到10mg/kg，通常大約為1mg/kg。醫(yī)生在任何情況下都將確定最適合于一個(gè)個(gè)體的真正劑量，上述劑量將根據(jù)年齡、體重和特定個(gè)體的反應(yīng)而定。以上劑量是普通情況的示范。當(dāng)較高或較低的范圍是有利時(shí)當(dāng)然可能存在個(gè)別情況，這樣的情況處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
所需要的劑量范圍依賴(lài)于所選擇的肽，施用的途徑，配方的性質(zhì)，對(duì)象病情的性質(zhì)，以及參與的實(shí)踐者的判斷。但是適當(dāng)?shù)膭┝吭?.1-100μg/kg對(duì)象的體重的范圍內(nèi)。
可注射形式疫苗組合物時(shí)很方便的、可以用傳統(tǒng)的佐劑來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。適當(dāng)?shù)膯挝唤臃N劑量為0.5-5微克抗原/kg，優(yōu)選地以這樣的劑量施用1-3次，間隔為1-3星期。在所注明的劑量范圍內(nèi)沒(méi)有觀察到本發(fā)明化合物的不利的毒性效應(yīng)，如果存在上述毒性效應(yīng)那么它們對(duì)適當(dāng)個(gè)體的施用將被禁止。
考慮到可得到的化合物的多樣性以及各種施用途徑的不同效率，可以預(yù)期所需要的劑量有很大的變化。例如，與靜脈注射相比預(yù)期口服施用將需要更高的劑量?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)的優(yōu)化經(jīng)驗(yàn)規(guī)律調(diào)節(jié)這些劑量水平上的變化，這在本領(lǐng)域中是眾所周知的。
序列數(shù)據(jù)庫(kù)，有形介質(zhì)中的序列和運(yùn)算法則多核苷酸和多肽的序列形成了一個(gè)寶貴的資源，用它們可以確定它們的2-和3-維結(jié)構(gòu)以及鑒定具有相似同源性的進(jìn)一步的序列。通過(guò)將這些序列處存在計(jì)算機(jī)的可讀介質(zhì)中然后在已知的大分子結(jié)構(gòu)程序中應(yīng)用上述儲(chǔ)存的數(shù)據(jù)，或用廣為人知的搜索工具，如GCG程序包搜索序列數(shù)據(jù)庫(kù)很容易使以上方法變得簡(jiǎn)便。
本發(fā)明還提供了特征序列(character sequence)或特征鏈，特別是基因序列或編碼蛋白的序列，的序列分析方法。優(yōu)選的序列分析方法包括，例如，序列同源性分析的方法，如同一性和相似性分析、DNA、RNA和蛋白結(jié)構(gòu)分析、序列裝配、進(jìn)化樹(shù)分析、序列域(sequencemotif)分析、開(kāi)放閱讀框的確定、核酸堿基召集(nucleic acid basecalling)、密碼子使用分析、核酸堿基整理和序列色譜峰分析。
提供了基于計(jì)算機(jī)的同源性鑒定方法。這種方法包括以下步驟在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中提供含有本發(fā)明的多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；并將上述第一多核苷酸序列和至少一種第二多核苷酸序列或多肽序列進(jìn)行比較以確定同源性。
還提供了基于計(jì)算機(jī)的同源性鑒定方法。這種方法包括以下步驟在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中提供含有本發(fā)明的多肽序列的第一多肽序列；并將上述第一多肽序列和至少一種第二多核苷酸序列或多肽序列進(jìn)行比較以確定同源性。
所有在本說(shuō)明書(shū)中引用的發(fā)表物和參考文獻(xiàn)，包括但不限于專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，都在此全文引入作為參考，就象每個(gè)單獨(dú)的發(fā)表物或參考文獻(xiàn)都被特地和單獨(dú)標(biāo)明在此全文引入作為參考。按照上文描述的發(fā)表物和參考文獻(xiàn)的引用方式，本申請(qǐng)要求具有優(yōu)先性的任何專(zhuān)利申請(qǐng)也在此全文引入作為參考。
定義“同一性”，如本領(lǐng)域中所眾所周知，是指，根據(jù)具體情況，通過(guò)序列對(duì)比所確定的兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間關(guān)系。在本領(lǐng)域中“同一性”還表示，根據(jù)具體情況，兩個(gè)多肽序列或多核苷酸序列之間的相關(guān)性，如這兩個(gè)序列的鏈之間的匹配性所決定。通過(guò)已知的方法很容易計(jì)算“同一性”，這些方法包括但不限于(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing；Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，AcademicPress，New York，1993；Computer Analysis，New Jersey，1994；Sequence Analysi s Primer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；and Carillo，H.，andLipman，.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988).)中所描述的方法。確定同一性的方法被設(shè)計(jì)得使被測(cè)試的序列之間的匹配最大。進(jìn)而，確定同一性的方法被編成了共享的計(jì)算機(jī)程序。確定兩個(gè)序列之間的同一性的計(jì)算機(jī)程序方法包括，但不限于，GCG程序包中的GAP程序(Altschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.215403-410(1990))和FASTA(Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448(1988))。BLAST家族的程序在NCBI和其它來(lái)源上是共享的(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBINLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215403-410(1990))。眾所周知的Smith Waerman運(yùn)算法則也可以被用來(lái)確定同一性。
多肽序列比較的參數(shù)如下運(yùn)算法則Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比較基質(zhì)(comparison matrix)BLOSSUM62，來(lái)自Henikoff andHenikoffProc.Natll.Acad.Sci.USA.8910915-10919(1992)間隙補(bǔ)償(gap penalty)8間隙長(zhǎng)度補(bǔ)償(gap length penalty)2可以用這些參數(shù)的是Genetics Computer Group，Madison WI的名為″gap″的共享程序。前述的參數(shù)是肽段比較的默認(rèn)參數(shù)(以及對(duì)末端間隙沒(méi)有懲罰)。
多核苷酸比較的參數(shù)如下運(yùn)算法則Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48443-453(1970)比較基質(zhì)匹配＝+10，不匹配＝0間隙補(bǔ)償(gap penalty)50間隙長(zhǎng)度補(bǔ)償(gap length penalty)3可以從Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序得到。這些是核酸比較的默認(rèn)參數(shù)。
多核苷酸和多肽，根據(jù)具體情況，的“同一性”的優(yōu)選的含義由以下的(1)和(2)提供。
(1)多核苷酸實(shí)施方案進(jìn)而包括一種分離的多核苷酸，該多核苷酸含有的序列和SEQ ID NO1中的參考序列的同一性至少為50、60、70、80、90、95、97或100％，其中所述的多核苷酸序列可能和SEQ ID NO1中參考序列完全相同或可能和參考序列相比至少有某個(gè)整數(shù)的核苷酸發(fā)生改變，其中所述的改變選自一組由至少一個(gè)核苷酸缺失、替換包括轉(zhuǎn)換和顛換、或插入組成的一組改變，并且其中所述的改變可能在參考序列的5’或3’端或這兩端之間的任何位置發(fā)生，上述改變或者獨(dú)立地分布在參考序列的核苷酸中，或者在參考序列中以一個(gè)或多個(gè)相鄰的組的形式分布，其中所述的核苷酸改變的數(shù)目是這樣得到的將SEQ ID NO1中的核苷酸總數(shù)乘以表示百分之同一性的整數(shù)再除以100，然后從上述SEQ ID NO1中的核苷酸總數(shù)中減去上述計(jì)算的得數(shù)，或者nn≤xn-(xn·y)，其中nn是變化的核苷酸數(shù)，xn是SEQ ID NO1中的總核苷酸數(shù)，y對(duì)于50％是0.50，60％是0.60，70％是0.70，80％是0.80，85％是0.85，90％是0.90，95％是0.95，97％是0.97或?qū)τ?00％是1.0，·是乘號(hào)的標(biāo)志，其中任何xn和y的任何非整數(shù)得數(shù)都先取整為最相近的整數(shù)然后再?gòu)膞n中減去。編碼SEQ ID NO2中多肽的多核苷酸序列的改變可能在編碼序列中產(chǎn)生無(wú)義、錯(cuò)義或框架偏移突變，從而在這樣的改變之后變化該多核苷酸所編碼的多肽序列。
舉個(gè)例子，本發(fā)明的多核苷酸序列可以和SEQ ID NO1中的參考序列相同，即可能是100％相同，或者和參考序列相比可能有整數(shù)個(gè)核酸發(fā)生改變，即同一性百分比小于100％。其中所述的改變選自一組由至少一個(gè)核苷酸缺失、替換包括轉(zhuǎn)換和顛換、或插入組成的一組改變，并且其中所述的改變可能在參考序列的5’或3’端或這兩端之間的任何位置發(fā)生，上述改變或者獨(dú)立地分布在參考序列的核苷酸中，或者在參考序列中以一個(gè)或多個(gè)相鄰的組的形式分布。其中所述的核苷酸改變的數(shù)目是這樣得到的將SEQ ID NO1中的核苷酸總數(shù)乘以表示百分之同一性的整數(shù)再除以100，然后從上述SEQ IDNO1中的核苷酸總數(shù)中減去上述計(jì)算的得數(shù)，或者nn≤xn-(xn·y)，其中nn是變化的核苷酸數(shù)，xn是SEQ ID NO1中的總核苷酸數(shù)，y對(duì)于50％是0.50，60％是0.60，70％是0.70，80％是0.80，85％是0.85，等等，·是乘號(hào)的標(biāo)志，其中任何xn和y的任何非整數(shù)得數(shù)都先取整為最相近的整數(shù)然后再?gòu)膞n中減去。
(2)多肽實(shí)施方案進(jìn)而包括一種分離的多肽，該多肽含有的序列和SEQ ID NO2中的參考序列的同一性至少為50、60、70、80、90、95、97或100％，其中所述的多肽序列可能和SEQ ID NO1中參考序列完全相同或可能和參考序列相比至少有某個(gè)整數(shù)的氨基酸發(fā)生改變，其中所述的改變選自一組由至少一個(gè)氨基酸缺失、替換包括保守和非保守的替換、或插入組成的一組改變，并且其中所述的改變可能在參考序列的氨基端或羧基端或這兩端之間的任何位置發(fā)生，上述改變或者獨(dú)立地分布在參考序列的氨基酸中，或者在參考序列中以一個(gè)或多個(gè)相鄰的組的形式分布，其中所述的氨基酸改變的數(shù)目是這樣得到的將SEQ ID NO2中的氨基酸總數(shù)乘以表示百分之同一性的整數(shù)再除以100，然后從上述SEQ ID NO2中的氨基酸總數(shù)中減去上述計(jì)算的得數(shù)，或者na≤xa-(xa·y)，其中na是變化的氨基酸數(shù)，xa是SEQ ID NO2中的總氨基酸數(shù)，y對(duì)于50％是0.50，60％是0.60，70％是0.70，80％是0.80，85％是0.85，90％是0.90，95％是0.95，97％是0.97或?qū)τ?00％是1.0，·是乘號(hào)的標(biāo)志，其中任何xa和y的任何非整數(shù)得數(shù)都先取整為最相近的整數(shù)然后再?gòu)膞a中減去。
舉個(gè)例子，本發(fā)明的多肽序列可以和SEQ ID NO2中的參考序列相同，即可能是100％相同，或者和參考序列相比可能有整數(shù)個(gè)氨基酸發(fā)生改變，即同一性百分比小于100％。其中所述的改變選自一組由至少一個(gè)氨基酸缺失、替換包括保守或非保守替換、或插入組成的一組改變，并且其中所述的改變可能在參考序列的氨基端或羧基端或這兩端之間的任何位置發(fā)生，上述改變或者獨(dú)立地分布在參考序列的氨基酸中，或者在參考序列中以一個(gè)或多個(gè)相鄰的組的形式分布。其中所述的氨基酸改變的數(shù)目是這樣得到的將SEQ ID NO2中的氨基酸總數(shù)乘以表示百分之同一性的整數(shù)再除以100，然后從上述SEQID NO2中的氨基酸總數(shù)中減去上述計(jì)算的得數(shù)，或者na≤xa-(xa·y)，其中na是變化的氨基酸數(shù)，xa是SEQ ID NO2中的總氨基酸數(shù)，y對(duì)于50％是0.50，60％是0.60，70％是0.70，80％是0.80，85％是0.85，等等，·是乘號(hào)的標(biāo)志，其中任何xa和y的任何非整數(shù)得數(shù)都先取整為最相近的整數(shù)然后再?gòu)膞a中減去。
此處所用的“個(gè)體”是關(guān)于一種生物體的，意思為多細(xì)胞真核生物，包括但不限于，多細(xì)胞生物(metazonan)，ovid，牛科動(dòng)物，猿，靈長(zhǎng)類(lèi)和人。
“分離”的意思為“通過(guò)人的手”將其從其天然狀態(tài)改變，即，如果它是天然存在的，那么它被從其初始環(huán)境改變或移開(kāi)，或兩者。例如，天然存在于活生物體中的多核苷酸或多肽不是“分離”的，但是從其天然狀態(tài)共存的物質(zhì)中分開(kāi)的多核苷酸和多肽就是“分離”的，如此術(shù)語(yǔ)在此所使用進(jìn)而，通過(guò)轉(zhuǎn)化、基因操作或通過(guò)任何其它重組方法被引入到一個(gè)生物體中的多核苷酸或多肽就是分離的，盡管它仍然存在于上述生物體中，上述生物體可以是活的或死的。
“多核苷酸”通常指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，可以是未修飾的RNA或DNA，或修飾的RNA或DNA，包括單鏈和多鏈區(qū)域。
“變體”指和參考多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。一個(gè)多核苷酸典型的變體和另一個(gè)參考的多核苷酸在核苷酸序列上有所不同。上述變體核苷酸序列的改變可能也可能不改變上述參考序列所編碼的多肽的氨基酸序列。核苷酸的改變可能導(dǎo)致參考序列所編碼的多肽的氨基酸替換、添加、缺失、融合和截短，如下文所討論。一個(gè)多肽典型的變體和另一個(gè)參考的多肽在氨基酸序列上有所不同。通常，這些不同是有限的，以便參考多肽和變體的序列整體上足夠相似，并且在許多區(qū)域是相同的。變體和參考多肽在在氨基酸序列上的差別可能為一個(gè)或多個(gè)替換、添加、缺失或它們的任何組合。插入或替換的氨基酸殘基可能是也可能不是由遺傳密碼編碼的。多核苷酸的變體可能是天然存在的，例如等位變體，或可能是天然中未發(fā)現(xiàn)的變體。多核苷酸和多肽的非天然存在的變體可以通過(guò)突變技術(shù)或通過(guò)直接合成制備。
“疾病”的意思為由細(xì)菌感染引起的或涉及細(xì)菌感染的疾病，包括，例如，嬰兒和兒童的中耳炎，老人的肺炎，竇炎，醫(yī)院感染和侵入性疾病，喪失聽(tīng)力的慢性中耳炎，液體在中耳中聚集，聽(tīng)神經(jīng)損傷，學(xué)語(yǔ)遲緩，上呼吸道感染和中耳炎癥。
實(shí)施例1源自粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617的BASB020基因的發(fā)現(xiàn)和DNA測(cè)序確認(rèn)SEQ ID NO1中的BASB020基因首先發(fā)現(xiàn)于含有粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617(也成為菌株Mc2931)未完成基因組DNA序列的Incyte PathoSeq數(shù)據(jù)庫(kù)。BASB020多核苷酸序列的翻譯產(chǎn)物，如SEQID NO2所示，和豬痢疾小蛇菌的TlyC溶血素蛋白表現(xiàn)出顯著的同一性(227個(gè)氨基酸重疊中具有36％的同一性)。
進(jìn)而通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段確認(rèn)了BASB020基因的序列。為了這個(gè)目的利用QIAGEN的基因組DNA提取試劑盒(Qiagen Gmbn)從1010個(gè)粘膜炎莫拉氏菌(ATCC43617菌株)細(xì)胞中提取了基因組DNA，用引物E475781a(5’-ACT TGA ATA AAA CCG G-3’)(SEQ ID NO9)和E475782a(5’-GAC ATT GGC CGC AAC ATG C-3’)(SEQ ID NO10)將1μg的這種物質(zhì)進(jìn)行了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。利用Biorobot9600(Qiagen Gmbh)儀器純化了該P(yáng)CR產(chǎn)物并用Big Dye CycleSequenching kit(Perkin-Elmer)和ABI377/PRISM DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。在兩條鏈上進(jìn)行測(cè)序，冗余度(redundancy)為2，并用SequencherTM(Applied Biosystem)軟件組裝了全序列。得到的序列表明和SEQ ID NO1的同一性為100％。
實(shí)施例2幾個(gè)粘膜炎莫拉氏菌菌株的BASB020基因之間的可變性分析2A限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)如下文所描述，從16個(gè)粘膜炎莫拉氏菌菌株(在表1中列出)中提取了基因組DNA。將粘膜炎莫拉氏菌在BHI瓊脂平板上劃線并在37℃培養(yǎng)過(guò)夜以得到單菌落。挑取3到4個(gè)單菌落用來(lái)接種～1.5mlBHI(Brain-heart infusion，腦-心灌輸液)種子肉湯培養(yǎng)基并在搖床中培養(yǎng)過(guò)夜，～300rpm，37℃。用種子培養(yǎng)基接種錐形瓶中的～150mlBHI肉湯培養(yǎng)基并在搖床中37℃培養(yǎng)～12-16小時(shí)，175rpm以得到大量的細(xì)胞進(jìn)行DNA分離。在Sorval GSA轉(zhuǎn)頭上～2000×g室溫離心15分鐘以收集細(xì)胞。倒去上清并用～5.0ml無(wú)菌水懸浮細(xì)胞沉淀。加入等體積的裂解緩沖液(200mM NaCl，20mM EDTA，40mMTris-HCl，pH8.0，0.5％(w/v)SDS，0.5％(v/v)2-巰基乙醇，和250μg/ml蛋白酶K)并溫和地?cái)噭?dòng)和研磨以懸浮細(xì)胞。然后將懸浮液在50℃溫育～12小時(shí)以裂解細(xì)胞和釋放染色體DNA。加入5.0m1飽和NaCl(～6.0M，溶于無(wú)菌水中)并在Sorval SS34轉(zhuǎn)頭室溫5,500×g離心以沉淀蛋白物質(zhì)。通過(guò)加入兩倍體積的100％乙醇以從上清中沉淀染色體DNA。搜集聚集的DNA并用小體積的70％乙醇溶液溫柔地?cái)噭?dòng)以進(jìn)行洗滌。用無(wú)菌水懸浮純化的DNA并在4℃穩(wěn)和搖動(dòng)過(guò)夜以溶解/分配DNA。根據(jù)1.00.D.單位～50μg/ml的消光系數(shù)通過(guò)分光光度法在260nm處測(cè)量溶解的DNA的濃度。
然后利用MC-Hly3-BamF(5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGATCC ATG CGT GGT AGG CGT TGG TTA TCC ACC G-3’)(SEQ ID NO11)和MC-Hly3-SalRC(5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTATTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG-3’)(SEQ ID NO12)寡聚核苷酸將上述物質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用限制性內(nèi)切酶(AciI，AluI，HphI，MseI，NlaIII，Tsp509I)將BASB020基因相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物獨(dú)立進(jìn)行水解，限制性產(chǎn)物用常規(guī)的分子生物學(xué)方法，如“MolecularCloning，a Laboratory Manual，Second Edition，EdsSambrook，F(xiàn)ritch&Maniatis，Cold Spring Harbor press 1989”中所描述，通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離。得到的電泳凝膠的照片在

圖1中出示。對(duì)每個(gè)菌株相應(yīng)于6個(gè)限制性內(nèi)切酶的RFLP樣式進(jìn)行評(píng)分和綜合。然后定義具有共有相同的綜合RFLP樣式的菌株組。通過(guò)這種方法，在本研究中測(cè)試的菌株被分成6個(gè)基因組類(lèi)型(組1Mc2904，Mc2905，Mc2906，Mc2969；組2Mc2907，Mc2913；組3Mc2908，Mc2909，Mc 2931，Mc2975；組4Mc2910，Mc2912，Mc2956，組5Mc2911；組6Mc2926)。這些數(shù)據(jù)支持了在本研究中使用的粘膜炎莫拉氏菌群在BASB020基因上表現(xiàn)出一些核苷酸序列多樣性這一現(xiàn)象。
2B其它菌株中的DNA測(cè)序用來(lái)確定BASB020序列的ATCC43617菌株(Mc2931)通過(guò)RFLP被歸類(lèi)到組3。通過(guò)實(shí)施例1中所描述的實(shí)驗(yàn)方法還確定了其它3個(gè)RFLP基因組類(lèi)型的粘膜炎莫拉氏菌代表菌株(組1(Mc2969)，組2(Mc2913)組4(Mc2912))。菌株Mc2912，Mc2913，Mc2969的BASB020基因的多核苷酸序列分別示明于SEQ ID NO3，5和7。這些多核苷酸序列被翻譯成的氨基酸序列分別示明于SEQ ID NO4，6和8。用DNASTAR Lasergene程序包的MegAlign程序?qū)EQ ID NO1，3，5和7中的多核苷酸序列進(jìn)行了多序列對(duì)比，結(jié)果示明于圖2。成對(duì)序列的同一性比較總結(jié)于表2，表明4個(gè)BASB020核苷酸基因序列的同一性都類(lèi)似地為99％或更高。用同一程序?qū)EQ ID NO2，4，6和8中的多肽序列進(jìn)行了序列對(duì)比，結(jié)果示明于圖3。成對(duì)序列的同一性比較總結(jié)于表3，表明4個(gè)BASB020蛋白序列的同一性都類(lèi)似地為99％或更高。
表1用于本研究的粘膜炎莫拉氏菌菌株的特征
表2BASB020多核苷酸序列的成對(duì)序列同一性(％)
表3BASB020多肽序列的成對(duì)序列同一性(％)
實(shí)施例3表達(dá)重組BASB020的質(zhì)粒的構(gòu)建ABASB020的克隆分別在正向(SEQ ID NO11)和反向(SEQ ID NO12)擴(kuò)增引物上設(shè)計(jì)了BamHI和SalI限制性位點(diǎn)，以允許將504bp的PCR產(chǎn)物定向連接到可由商業(yè)途徑獲得的E.coli表達(dá)質(zhì)粒pQE30(QiaGen，氨芐抗性)，以便成熟BASB020蛋白可以作為在N末端含有(His)6親和層析標(biāo)記的融合蛋白表達(dá)。BASB020PCR產(chǎn)物是根據(jù)制造商的說(shuō)明利用基于硅膠的離心柱(QiaGen)從PCR反應(yīng)體系中純化得到的。為了產(chǎn)生克隆所需要的BamHI和SalI末端，按照制造商的說(shuō)明(LifeTechnologies)隨后將純化的PCR產(chǎn)物用限制性酶BamHI和SalI消化完全。第一次限制性消化后將PCR產(chǎn)物用上述的離心柱純化以除去鹽，并在進(jìn)行第二次酶消化之前用無(wú)菌水洗脫。和pQE30質(zhì)粒連接之前將消化的DNA片段再一次用基于硅膠的離心柱純化。
B表達(dá)載體的產(chǎn)生為了制備連接所用的pQE30，類(lèi)似地用BamHI和SalI進(jìn)行了完全消化，然后按照制造商的指導(dǎo)用小牛腸磷酸酶(CI[P，～0.02單位/pmole 5’端，Life Technologies)消化以防止自連接。加入與制備的載體相比大約5倍摩爾過(guò)量的消化片段進(jìn)行連接反應(yīng)。在常規(guī)的～20μl的連接反應(yīng)體系(～16℃，～16小時(shí))中用本領(lǐng)域中眾所周知的方法通過(guò)T4DNA連接酶(～2.0單位/反應(yīng)，LifeTechnologies)進(jìn)行連接。根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法用一小份連接體系(～5μl)轉(zhuǎn)化M15(pREP4)電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。在～1.0ml LV肉湯培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)～2-3小時(shí)后涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)和氨芐青霉素(100μg/ml)的LB平板上。在選擇培養(yǎng)基中同時(shí)含兩種抗生素是為了保證所有的轉(zhuǎn)化細(xì)胞同時(shí)帶有pREP4質(zhì)粒(KnR)和pQE30-BASB020(ApR)質(zhì)粒，在pREP4質(zhì)粒中帶有l(wèi)acIq基因，該基因?qū)τ谠趐QE30上抑制可由IPTG誘導(dǎo)的蛋白的表達(dá)是必需的。平板在37℃過(guò)夜培養(yǎng)～16小時(shí)。用無(wú)菌牙簽挑取單個(gè)的KnR/ApR菌落并用于對(duì)新鮮的KnR/ApR平板以及～1.0ml LB KnR/ApR肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行“斑點(diǎn)”接種。在常規(guī)的培養(yǎng)箱(平板)或水浴搖床中37℃過(guò)夜培養(yǎng)斑點(diǎn)平板和肉湯培養(yǎng)基。
用全細(xì)胞PCR分析確認(rèn)轉(zhuǎn)化子含有BASB020 DNA插入序列。將1.0ml LB Kn/Ap肉湯過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到1.5ml聚丙烯管中，用Beckmann微量離心機(jī)(～3min，室溫，～1,2000×g)收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀用～200μl無(wú)菌水懸浮，然后將10μl的一小份用于進(jìn)行總體積～50μl的PCR反應(yīng)體系，在該反應(yīng)體系中含有BASB020正向和反向擴(kuò)增引物。PCR反應(yīng)組分的終濃度基本上和實(shí)施例2中所說(shuō)明的一樣，但使用了～5.0單位的Taq聚合酶。最初的95℃變性步驟增加到3分鐘以確保對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的熱破壞并釋放質(zhì)粒DNA。用的是ABI Model9700熱循環(huán)儀，32個(gè)循環(huán)，3步熱擴(kuò)增方式，即，95℃，45秒；55-58℃，45秒；72℃，1分鐘，來(lái)擴(kuò)增裂解的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的MC-P6PCR片段。熱擴(kuò)增后將～20μl的反應(yīng)體系進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析(0.8％瓊脂糖熔于Tris-乙酸-EDTA(TAE)緩沖液)。凝膠電泳后DNA片段用溴乙錠染色和紫外線照射來(lái)顯示。和測(cè)試樣品平行電泳DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(1kb階梯，Life Technologies)以便估計(jì)PCR產(chǎn)物的大小。產(chǎn)生預(yù)期的504bpPCR產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子被鑒定為含有BASB020表達(dá)構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化子。對(duì)含有表達(dá)質(zhì)粒的菌株進(jìn)行重組BASB020可誘導(dǎo)表達(dá)的分析。
CPCR-陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的表達(dá)分析對(duì)于以上鑒定的每個(gè)PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子從斑點(diǎn)平板上接種到含有卡那霉素(50μg/ml)和氨芐青霉素(50μg/ml)～5.0ml LB肉湯中并在搖床中(～250rpm)37℃培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜種子培養(yǎng)物的一個(gè)小份(～1.0ml)被接種到含有25ml LB Kn/Ap肉湯培養(yǎng)基125ml錐形瓶中并在37℃搖晃培養(yǎng)(～250rpm)直至培養(yǎng)基的混濁度達(dá)到0.D.600～0.5，即，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(通常為約1.5-2.0小時(shí))。在這一時(shí)間大約一半的培養(yǎng)基(約12.5ml)被轉(zhuǎn)移到第二個(gè)125ml的燒瓶中并將IPTG(1.0M用無(wú)菌水制備的儲(chǔ)存液，Sigma)加到終濃度1.0mM以誘導(dǎo)重組BASB020蛋白的表達(dá)。將IPTG誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物在37℃繼續(xù)搖晃培養(yǎng)～4小時(shí)。誘導(dǎo)后取出誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物的樣品并且在室溫微量離心以收集菌體。然后每份沉淀用～50μl無(wú)菌水懸浮，然后和等體積的含有2-巰基乙醇2×Laemelli SDS-PAGE上樣緩沖液混合并沸水浴～3分鐘以變性蛋白。將等體積(～15μl)的IPTG誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的粗細(xì)胞裂解液上樣到兩塊12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠(1mm厚的微型凝膠，Novex)。將誘導(dǎo)的和未誘導(dǎo)的樣品以及預(yù)染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)(SeeBlue，Novex)在傳統(tǒng)的條件下用常規(guī)的SDS/Tris/甘氨酸電泳緩沖液(BioRad)一起電泳。電泳后一塊凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250(BioRad)染色，然后脫色以觀察IPTG誘導(dǎo)的新BASB020蛋白。第二塊凝膠用BioRad Mini-Protein II印跡裝置和Towbin’s甲醇(20％)轉(zhuǎn)移緩沖液電轉(zhuǎn)移到PVDF膜(0.45微米孔徑，Novex)上。膜的封閉和抗體的溫育按照本領(lǐng)域中眾所周知的方法進(jìn)行。首先用單克隆抗-RGS(His)3抗體，然后用交聯(lián)了HRP的兔抗鼠二抗(QiaGen)來(lái)確認(rèn)BASB020重組蛋白的表達(dá)和身份。用ABT不溶底物或Hyperfilm以及Amersham ECL的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)來(lái)顯示抗His抗體的反應(yīng)樣式。
D序列的確認(rèn)為了進(jìn)一步確認(rèn)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組BASB020是正確的開(kāi)放閱讀框并且不是克隆假象(例如閱讀框移動(dòng))造成的假分子，確認(rèn)了克隆插入物的DNA序列。用傳統(tǒng)的不對(duì)稱(chēng)PCR循環(huán)測(cè)序方法(ABI PrismDye-Terminator Cycle Sequencing，Perkin-Elmer)從一條鏈得到了粘膜炎莫拉氏菌BASB020基因的DNA序列。用未消化的表達(dá)質(zhì)粒DNA(～0.5μg/rxn)作為模板和適當(dāng)?shù)膒QE30載體特異性的ORF特異測(cè)序引物(～3.5pmol/rxn)設(shè)計(jì)了測(cè)序反應(yīng)。除了莫飽和測(cè)序引物外每個(gè)測(cè)序反應(yīng)體系(～20μl)還含有4種不同的dNTP(即，A，G，C，T)和4種相應(yīng)的ddNTP(即，ddA，ddG，ddC，ddT)終止核苷酸；每個(gè)終止核苷酸和四種熒光染料，Joe，Tam，Rox，或Fam中的一種交聯(lián)。由于染料標(biāo)記的ddNTP終止核苷酸的摻入單鏈測(cè)序延伸產(chǎn)物沿著模板在隨機(jī)位置終止。用微量離心分子排阻層析柱(PrincetonGenetics)純化了熒光管染料標(biāo)記的終止產(chǎn)物，真空干燥，按照制造商的說(shuō)明用模板懸浮緩沖液懸浮(Perkin-Elmer)以進(jìn)行毛細(xì)管電泳，或用去離子甲酰胺懸浮以進(jìn)行PAGE(ABI 377 Automated DNAsequenator)。收集每個(gè)反應(yīng)得到的DNA測(cè)序數(shù)據(jù)并用ABI SequenceAnalysis Software(Perkin-Elmer)在PowerMAC計(jì)算機(jī)上自動(dòng)分析熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度。在用AutoAssembler軟件(Perkin-Elmer)合并成單鏈序列“串”之前單獨(dú)地將自動(dòng)分析的DNA序列進(jìn)行手工編輯以保證準(zhǔn)確性。測(cè)序表明表達(dá)質(zhì)粒含有正確的開(kāi)放閱讀框的正確序列。
實(shí)施例4重組BASB020的生產(chǎn)細(xì)菌菌株含有編碼源自粘膜炎莫拉氏菌的BASB020的質(zhì)粒(pQE30)的E.coli M15(pREP4)重組表達(dá)菌株被用來(lái)產(chǎn)生用于純化重組蛋白的大量細(xì)胞。在含有50μg/ml卡那霉素(“Kn”)和100μg/ml氨芐青霉素(“Ap”)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)表達(dá)菌株以保證同時(shí)維持pREP4 lacIq調(diào)控質(zhì)粒和pQE30-BASB020表達(dá)構(gòu)建物。為了在-80℃凍存，將菌株在含有同樣濃度的LB肉湯中擴(kuò)增，然后與含有30％(w/v)甘油的LB肉湯等體積混合。
培養(yǎng)基用于生產(chǎn)重組蛋白的發(fā)酵培養(yǎng)基由含有50μg/ml Kn和100μg/ml氨芐青霉素Ap的2×YT肉湯(Difco)組成。在發(fā)酵罐中加入0.25ml/L抗泡沫劑Antifoam(Antifoam 204，Sigma)。為了誘導(dǎo)BASB020重組蛋白的表達(dá)，在發(fā)酵罐中加入IPTG(異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)(終濃度1mM)。
發(fā)酵用0.3ml快速溶解的冷凍培養(yǎng)物，或者選擇性平板上的幾個(gè)菌落，接種含有50ml工作體積的500ml的種子錐形瓶，并在搖晃平臺(tái)(Innova 2100，New Brunswick Scientific)上150rpm，376℃培養(yǎng)大約12小時(shí)。然后用此種子培養(yǎng)物接種工作體積為5L的，含有2×YT肉湯以及Kn和Ap抗生素發(fā)酵罐。該發(fā)酵罐()在3761℃，空氣噴射0.2-0.4VVM，Rushton葉輪250rpm的條件下工作。在掃頻種子培養(yǎng)物中和發(fā)酵罐中都不控制pH值。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐中的pH值在6.5到7.3之間。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(～0.70.D.600單位)時(shí)往發(fā)酵罐中加入IPTG(1.0M儲(chǔ)存液，用無(wú)菌水制備)。細(xì)胞誘導(dǎo)2-4小時(shí)然后用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速離心機(jī)(Sorvall Instruments)離心收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀儲(chǔ)存于-20℃直至進(jìn)一步處理。
純化化學(xué)試劑和材料生物技術(shù)級(jí)或更高的咪唑、鹽酸胍、Tris(羥甲基)和EDTA(乙二胺四乙酸)，購(gòu)自Ameresco Chemical，Solon，Ohio。TritonX-100(t-辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇)磷酸鈉、單價(jià)堿和脲為試劑級(jí)或更高級(jí)，購(gòu)自Sigma Chemical Company，St.Louis，Missori。冰醋酸和鹽酸購(gòu)自Mallincrodt Baker Inc.，Phillipsburg，NewJersey。甲醇購(gòu)自Fisher Scientific，F(xiàn)airlawn，New Jersey。PefablocSC(4-(2-氨基乙烷基)-苯磺酰氟)，全蛋白酶抑制劑混合物藥片和PMSF(苯甲磺酰氟)購(gòu)自Roche Diagnostics Corporation，Indianapols，Indiana。Bestatin，Pepstatin A，和E-64蛋白酶抑制劑購(gòu)自Calbiochem，LaJolla，Califonia。Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(1×PBS)購(gòu)自Quality Biological，Inc.，Gaithersburg，Maryland。Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液(10×PBS)購(gòu)自BioWhittaker，Walkersville，Maryland。無(wú)BSA Penta-His Antibody，購(gòu)自QiaGen，Valencia，California。過(guò)氧化物酶標(biāo)記的AffiniPure羊抗鼠IgG購(gòu)自Jackson Immuno Research，West Grove，Penn。AECsingle solution購(gòu)自Zymed，South San Francisco，California。所有的其它化學(xué)試劑都是試劑級(jí)或更高級(jí)的。
Ni-NTA Superflow凝膠購(gòu)自QiaGen，Inc.，Valencia，California。預(yù)灌注的Tris-甘氨酸4-20％和10-20％聚丙烯酰胺凝膠、所有的電泳緩沖液和溶液、SeeBlue染色分子量標(biāo)準(zhǔn)、MultiMarkMulti-Colored Standards和PVDF轉(zhuǎn)移膜購(gòu)自Novex，SanDiego，Clifornia。SDS-PAGE銀染試劑盒購(gòu)自Daiichi Pure ChemicalsCompany Limited，Tokoyo，Japan。考馬斯亮藍(lán)染色液購(gòu)自BioRadLaboratories，Hercules，California。AcrodiscPF 0.2μm注射濾器購(gòu)自Pall Gelman Sciences，Ann Arbor，Michigan。GD/X 25mm拋棄型注射濾器購(gòu)自Whatman Inc.Od New York，Carmal New York，BCA定蛋白試劑和Snake Skin透析管，3,500MWCO購(gòu)自PierceChemaical Co..Rockford，Illinois。
提取方法細(xì)胞沉淀在室溫融化30到60分鐘。將5到6克的物質(zhì)稱(chēng)到50ml拋棄型離心管中。加入5ml/克鹽酸胍(GuHCl)緩沖液(6M鹽酸胍，100mM磷酸鈉，單價(jià)堿，10mM Tris和0.05％Triton X-100，pH8.0)。細(xì)胞沉淀用PRO300D proscientific勻漿器懸浮，3/4功率(3/4power)勻漿1分鐘。然后將提取混合物置于室溫溫和地?cái)嚢?0-90分鐘。60到90分鐘后提取緩沖液在15,800×g離心15分鐘(SorvallRC5C離心機(jī)，11,500rpm)。倒出上清(S1)以進(jìn)一步純化。保留沉淀進(jìn)行分析。
BASB020和鎳NTA凝膠的結(jié)合往S1中加入3到4毫升的Ni-NTA凝膠。在室溫溫和攪拌一小時(shí)。一小時(shí)后S1/Ni-NTA被裝到XK16 Pharmacia層析柱中。然后用1MGu-HCl緩沖液(1M鹽酸胍，100mM磷酸鈉，單價(jià)堿，10mM Tris和0.05％Triton-X100，pH8.0)洗滌上述層析柱。然后用磷酸緩沖液洗滌(100mM磷酸鈉，單價(jià)堿，10mM Tris和0.05％Triton-X100，pH6.3)。然后用250mM咪唑緩沖液(250mM咪唑、100mM磷酸鈉，單價(jià)堿，10mM Tris和0.05％Triton-X100，pH5.9)從層析柱上洗脫蛋白。
最終配方最后將BASB020對(duì)0.1％Triton X100，1×PBS，pH7.4進(jìn)行透析，透析中換3次緩沖液，以除去Gu-HCl和咪唑。純化的蛋白進(jìn)行特性研究并用于產(chǎn)生以下描述的抗體。
生化特性研究SDS-PAGE和Western印跡分析純化的重組蛋白在4-20％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分辨并如先前所描述100V，1小時(shí)電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Thebaine et al.1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354)。然后PVDF膜用含有5％脫脂奶粉的25ml Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液預(yù)處理。所有隨后的操作都用此預(yù)處理緩沖液進(jìn)行。
PVDF膜和25ml稀釋的預(yù)免疫血清或兔抗-His免疫血清室溫溫育1小時(shí)。然后用洗滌緩沖液(20mM Tris緩沖液，pH7.5，含有150mM氯化鈉和0.05％吐溫-20)洗滌PVDF膜兩次。然后PVDF膜用25ml 15000稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)抗體室溫溫育30分鐘，然后PVDF膜用洗滌緩沖液洗滌4次，然后用Zymed(San Francisco)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和過(guò)氧化脲分別顯色10分鐘。
SDS-PAGE(圖4)的結(jié)果表明32-35KDa的蛋白被純化到大于90％的純度，并且SDS-PAGE的Western印跡表明它和抗RGS(His)抗體能夠反應(yīng)(圖5)。
蛋白測(cè)序用已經(jīng)很好地確立的方法在Hewlett-Pakard model G1000A測(cè)序儀的模型1090LC Hewlett-Pakard model241測(cè)序儀的模型1100LC上進(jìn)行純化蛋白的氨基末端氨基酸測(cè)序以確認(rèn)重組蛋白是正確的。
實(shí)施例5重組BASB020抗血清的生產(chǎn)抗BASB020蛋白的多價(jià)抗血清是通過(guò)用純化的重組BASB020蛋白免疫兩只兔子得到的。每只動(dòng)物總共肌肉注射三次(開(kāi)始時(shí)用完全Ffeud佐劑，然后用不完全Freud佐劑)，每次約20μgBASB020蛋白，時(shí)間間隔為約21天。在首次免疫之前(“預(yù)放血”)和第35和57天將動(dòng)物放血。
抗BASB020蛋白的滴定用純化的重組BASB020蛋白通過(guò)ELISA進(jìn)行(0.5μg/孔)。滴定度定義為按照如下公式計(jì)算時(shí)得數(shù)等于或大于0.1時(shí)的最高稀釋倍數(shù)兩個(gè)抗血清測(cè)試樣品的平均OD-兩個(gè)緩沖液測(cè)試樣品的平均OD。3次免疫后的滴定度在3000和8000之間。
按照以上實(shí)施例4描述的Western印跡法鑒定該蛋白時(shí)上述抗血清被用作第一抗體。Western印跡表明在免疫的動(dòng)物的血清中存在抗BASB020抗體。
實(shí)施例6.免疫學(xué)特性Western印跡分析將幾種粘膜炎莫拉氏菌菌株，包括ATCC49143和ATCC43617，以及臨床上從不同的地區(qū)分離的菌株在巧克力瓊脂平板上在35℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)48小時(shí)。幾個(gè)菌落被用于接種250ml燒瓶中的25mlMuller Hinton肉湯培養(yǎng)基。培養(yǎng)過(guò)夜并離心收集。在150μlPAGE上樣緩沖液(360mM Tris緩沖液、pH8.8，含有4％SDS和20％甘油)中懸浮30μg細(xì)胞然后將懸浮液在100℃溫育5分鐘以便裂解細(xì)胞。裂解的細(xì)胞用4-20％聚丙烯酰胺凝膠分開(kāi)并將分開(kāi)的蛋白100V電轉(zhuǎn)移1小時(shí)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，如先前所描述(Thebaine et al.1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354)。然后PVDF膜用含有5％脫脂奶粉的25ml Dulbecco’s磷酸鹽緩沖液預(yù)處理。所有隨后的操作都用此預(yù)處理緩沖液進(jìn)行。
PVDF膜和25ml稀釋的預(yù)免疫血清或兔免疫血清室溫溫育1小時(shí)。然后用洗滌緩沖液(20mM Tris緩沖液，pH7.5，含有150mM氯化鈉和0.05％吐溫-20)洗滌PVDF膜兩次。然后PVDF膜用25ml 1∶5000稀釋的過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，West Grove，PA)抗體室溫溫育30分鐘，然后PVDF膜用洗滌緩沖液洗滌4次，然后用Zymed(San Francisco)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和過(guò)氧化脲分別顯色10分鐘。
在所有的Moraxella菌株中都探測(cè)到了和上述抗血清反應(yīng)的大約32-35KDa的蛋白(相應(yīng)于BASB020預(yù)期的分子量)。
實(shí)施例7.在逐漸康復(fù)的人類(lèi)的血清中存在BASB020抗體純化的重組BASB020的Western印跡分析按照以上的實(shí)施例4和6所描述的進(jìn)行，但是來(lái)自感染粘膜炎莫拉氏菌的兒童的人類(lèi)血清被用作第一抗體。結(jié)果表明源自天然感染個(gè)體的抗血清和純化的重組蛋白反應(yīng)，如圖6所示。
實(shí)施例8.BASB020疫苗的效力在小鼠中增強(qiáng)了肺部粘膜炎莫拉氏菌的清除.
在小鼠模型中測(cè)試了重組BASB020蛋白的保護(hù)能力。這種小鼠模型基于受免疫小鼠的常規(guī)鼻內(nèi)對(duì)于婦女和或男子不育攻擊(challenge)后對(duì)小鼠的粘膜炎莫拉氏菌肺部侵入分析的之上。用相應(yīng)于10μg劑量的100μl疫苗皮下免疫6BALB/c小鼠(雌性，6星期大)實(shí)驗(yàn)組，并在兩星期后強(qiáng)化(boost)。強(qiáng)化后1個(gè)星期在麻醉的條件下(小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉劑麻醉，0.24mg甲苯噻嗪(Rompun)和0.8mg氯胺酮(Imalgene)/100μl)往小鼠的左鼻孔內(nèi)灌輸50μl細(xì)菌懸浮液(+/-CFU/50μl)進(jìn)行攻擊。攻擊后4小時(shí)殺死小鼠并在無(wú)菌條件下取出肺部并單獨(dú)勻漿。將20μl 5次順序稀釋的勻漿涂布于Mueller-Hinton瓊脂平板上并計(jì)算菌落數(shù)，確定每個(gè)肺的平均CFU的Log10對(duì)數(shù)。計(jì)算每個(gè)肺的平均CFU的Log10對(duì)數(shù)的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
假設(shè)變異(variance)(通過(guò)Brown and Forsythe’s test進(jìn)行檢驗(yàn))和常態(tài)(normality)(用Shapiro-Wilk test檢驗(yàn))相等后用單向ANOVA對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用Dunnet test、Tukey’sstudentised range test(HSD)和Student-Newman-Keuls test對(duì)各組之間的差異進(jìn)行分析。在本實(shí)驗(yàn)中小鼠試驗(yàn)組用吸附到AlPO4(10μg BASB020吸附到100μg AlPO4)上的BASB020或吸附到AlPO4(5×108細(xì)胞吸附到100μg AlPO4上)上的粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617的殺死的全細(xì)胞(kwc)或無(wú)抗原的100μg AlPO4進(jìn)行免疫。小鼠用106CFU的活粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617細(xì)菌攻擊。
計(jì)算攻擊4小時(shí)后每組的平均CFU/肺的Log10對(duì)數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。攻擊后4小時(shí)假免疫的小鼠有5.5(+/-0.023)log10CFU/肺。
和對(duì)照組相比kwc制備物能誘導(dǎo)顯著的肺部清除(1.74log的差異)。和對(duì)照組相比BASB020疫苗誘導(dǎo)出0.62log的肺部清除，和對(duì)照有顯著的區(qū)別。
用純化的重組BASB020蛋白和攻擊前從用BASB020蛋白免疫的小鼠中收集的血清進(jìn)行的Western印跡表明存在抗BASB020蛋白的抗體(圖7)。
實(shí)施例9BASB020多肽、抗血清的生產(chǎn)和它們的活性在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)眾所周知的方法生產(chǎn)了序列為CNEEAWSQNRRAELSY(SEQ ID NO13)和YTGVAPLVDNDETV(SEQ ID NO14)的兩個(gè)短氨基酸序列的特異性BASB020肽。這些多肽和KLH偶聯(lián)并用于在12個(gè)星期大的無(wú)病源體新西蘭雌性兔子中生產(chǎn)抗體。兔子接受4次注射，間隔大約3星期，每次注射在完全(第一次)或不完全(第二，三，四次)Freund’s佐劑中的200μg肽-KLH。動(dòng)物在第一次免疫后以及第四次注射后一個(gè)月放血。
用自由多肽通過(guò)ELISA測(cè)量了抗多肽的中點(diǎn)滴定度。第四次免疫后一個(gè)月的抗多肽中點(diǎn)滴定度大于41000。按照實(shí)施例4和6中的描述準(zhǔn)備了純化重組BASB020的Western印跡，用抗多肽抗體作為第一抗體。結(jié)果見(jiàn)圖8。
保藏的材料1997年6月21含有粘膜炎莫拉氏菌菌株的保藏物被保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(本文中“ATCC”)，保藏號(hào)為43617。該保藏物被描述為Branhamela catarrhalis(Frosch and Kolle)并被凍干。從患慢性支氣管炎的煤礦工的氣管呼吸道得到的粘膜炎莫拉氏菌分離物構(gòu)建了1.5-2.9kb插入序列的文庫(kù)。該保藏物在Antimicrob.Agents Chemother.21506-598(1982)中有所描述。
上述粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物在此稱(chēng)為“保藏的菌株”或“保藏菌株的DNA”。
該保藏菌株含有全長(zhǎng)的BASB020基因。
由含有粘膜炎莫拉氏菌DNA插入序列的pQE30組成的pMC-Hly3載體的保藏物1999年2月12日被保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心(ATCC)，保藏號(hào)為207106。
在保藏的菌株/克隆中含有的多核苷酸序列以及它們編碼的任何氨基酸序列如果和此處所描述的序列有任何沖突的話都是受控制的。
保藏菌株的保藏是根據(jù)用于專(zhuān)利程序目的的微生物保藏的國(guó)際條約-布達(dá)佩斯條約進(jìn)行的。在專(zhuān)利授權(quán)時(shí)保藏的菌株將不可取消地，并且不受限制地和無(wú)條件地向公眾發(fā)放。儲(chǔ)存的菌株僅僅是為了本領(lǐng)域中的技術(shù)熟練人員的方便而提供的，并不等于承認(rèn)保藏物是實(shí)施(enablement)所必需的，如35 U.SC§112所要求的那樣。
序列表<110>SmithKline Beecham Biologicalc S.A.
<120>新化合物<130>BM45320<160>14<170>在Windows環(huán)境中的FastSEQ第三版<210>1<211>843<212>DNA<213>細(xì)菌<400>1atgcgtggtc ttaggcgttg gttatccacc gcacctgaaa ctcgagatga tttattaaag 60ctggttcaag actctcgcca gtttttagag cctgatacgg ttgatatgct tgaaggggtg120cttgatctgc cagcaaccca agtgcgtgag attatgacac cacgcccgca ggtgcatgcg180attgccagcg atgatgattt atctgatatt ttatcggtgg tgcttgaaac agagcattct240cgctatcctg tttttgaeag tttagatgat gatgctgtgg ttgggatttt gctgattaag300gacttaatac catacctaaa agccaaagct gacggtaaag agcagccgct caaattggct360gatattgtac gaaagccgtt gtatattagc gagacggcac gctcagatac actgctacgc420tcacttoaaa aagcccaagt gcatatggcg attgtggttg atgaatttgg ctcggtctct480ggtgtggtga caatggagga tttgcttgag gagattgtcg gtgatattgt tgatgaacat540gacgatattg acgaggacag cgacattaat aacatcattc cacaccctga taaatcaggc600gtttggttgg tgcaagcttc cacactcatc agtgattgca atgagatttt aggcagtcat660tttgatgata cagatgttga tacaatgggc ggtttggtca tgcaagcatt gggctttgtt720agccatcttc aaggtgcggt tgttcaaatc gatgaatggc aaattaccgt ggttgatgtt780gaggcacgat ttattcatct gttggagctc gtgctgatac cacagcttga gaatgctgaa840taa 843<210>2<211>280
<212>蛋白質(zhì)<213>細(xì)菌<400>2Met Arg Gly Leu Arg Arg Trp Leu Ser Thr Ala Pro Glu Thr Arg Asp1 5 10 15Asp Leu Lau Lys Leu Val Gln Asp Ser Arg Gln Phe Leu Glu Pro Asp20 25 30Thr Val Asp Met Leu Glu Gly Val Leu Asp Leu Pro Ala Thr Gln Val35 40 45Arg Glu Ile Met Thr Pro Arg Pro Gln Val His Ala Ile Ala Ser Asp50 55 60Asp Asp Leu Ser Asp Ile Leu Ser Val Val Leu Glu Thr Glu His Ser65 70 75 80Arg Tyr Pro Val Phe Asp Ser Leu Asp Asp Asp Ala Val Val Gly Ile85 90 95Leu Leu Ile Lys Asp Leu Ile Pro Tyr Leu Lye Ala Lys Ala Asp Gly100 105 110Lys Glu Gln Pro Leu Lys Leu Ala Asp Ile Val Arg Lys Pro Leu Tyr115 120 125Ile Ser Glu Thr Ala Arg Ser Asp Thr Leu Leu Arg Ser Leu Gln Lys130 135 140Ala Gln Val His Met Ala Ile Val Val Asp Glu Phs Gly Ser Val Ser145 150 155 160Gly Val Val Thr Met Glu Asp Leu Leu Glu Glu Ile Val Gly Asp Ile165 170 175Val Asp Glu His Asp Asp Ile Asp Glu Asp Ser Asp Ile Asn Asn Ile180 185 190Ile Pro His Pro Asp Lys Ser Gly Val Trp Lsu Val Gln Ala Ser Thr195 200 205Leu Ile Ser Asp Cys Asn Glu Ile Leu Gly Ser His Phe Asp Asp Thr210 215 220Asp Val Aap Thr Met Gly Gly Leu Val Met Gln Ala Leu Gly Phe Val225 230 235 240Ser His Leu Gln Gly Ala Val Val Gln Ile Asp Glu Trp Gln Ile Thr245 250 255Val Val Asp Val Glu Ala Arg Phe Ile His Leu Leu Glu Leu Val Leu260 265 270Ile Pro Gln Leu Glu Asn Ala Glu
275 280<210>3<211>843<212>DNA<213>細(xì)菌<400>3atgcgtggtc ttaggcgttg gttatccacc gcacctgaaa ctcgagatga ttcatcaaag 60ctggtccaag actctcgcca gtttttagag cctgatacgg ttgatatgct tgaaggggtg120cttgatctge eagcaaeeca agtgegtgag attatgacac cacgcccgca ggtgcatgcg180attgccagcg atgatgattt atctgatatt ttatcggtgg tgcttgaaac agagcattct240cgctatcctg tttttgagag tttggatgat gatgctgtgg ttgggatttt gctgattaag300gacttaatac catacctaaa agccaaagct gacggtaaag agcagccgct caaattggct360gatattgtac gaaagccgtt gtatattagc gagacggcac gctcagatac actgctacgc420tcacttcaaa aagcccaagt acatacggcg attgttgttg atgaacttgg ctcggtctct480ggtgtggcga caatggagga tttgcttgag gagattgtcg gtgatattgt tgatgaacat540gatgatattg acgaggacag cgscattaat aacatcattc cacaccctga taaatcaggc600gtttggttgg tgcaagcttc cacactcatc agtgattgca atgagatttt aggcagtcat660tttgatgata cagatgttga tacaatgggc ggtttggtca tgcaagcatt gggctttgtt720agccatcttc aaggtgcggt tgttcaaatc gatgaatggc aaattaccgt ggttgatgtt780gaggcacgat ttattcatct gttggagctt gtgctgatac cacagcttga gaatgctgaa840taa 843<210>4<211>280<212>蛋白質(zhì)<213>細(xì)菌<400>4Met Arg Gly Leu Arg Arg Trp Leu Ser Thr Ala Pro Glu Thr Arg Asp1 5 10 15Asp Leu Leu Lys Leu Val Gln Asp Ser Arg Gln Phe Leu Glu Pro Asp20 25 30Thr Val Asp Met Leu Glu Gly Val Leu Asp Leu Pro Ala Thr Gln Val35 40 45Arg Glu Ile Met Thr Pro Arg Pro Gln Val His Ala Ile Ala Ser Asp50 55 60Asp Asp Leu Ser Asp Ile Leu Ser Va1 Val Leu Glu Thr Glu His Ser
65 70 75 80Arg Tyr Pro Val Phe Asp Ser Leu Asp Asp Asp Ala Val Val Gly Ile85 90 95Leu Leu Ile Lys Asp Leu Ile Pro Tyr Leu Lys Ala Lys Ala Asp Gly100 105 110Lys Glu Gln Pro Leu Lys Leu Ala Asp Ile Val Arg Lys Pro Leu Tyr115 120 125Ile Ser Glu Thr Ala Arg Ser Asp Thr Leu Leu Arg Ser Leu Gln Lys130 135 140Ala Gln Val His Met Ala Ile Val Val Asp Glu Phe Gly Ser Val Ser145 150 155 160Gly Val Ala Thr Met Glu Asp Leu Leu Glu Glu Ile Val Gly Asp Ile165 170 175Val Asp Glu His Asp Asp Ile Asp Glu Asp Ser Asp Ile Asn Asn Ile180 185 190Ile Pro His Pro Asp Lys Ser Gly Val Trp Leu Val Gln Ala Ser Thr195 200 205Leu Ile Ser Asp Cys Asn Glu Ile Leu Gly Ser His Phe Asp Asp Thr210 215 220Asp Val Asp Thr Met Gly Gly Leu Val Met Gln Ala Leu Gly Phe Val225 230 235 240Ser His Leu Gln Gly Ala Val Val Gln Ile Asp Glu Trp Gln Ile Thr245 250 255Val Val Asp Val Glu Ala Arg Phe Ile His Leu Leu Glu Leu Val Leu260 265 270Ile Pro Gln Leu Glu Aan Ala Glu275 280<210>5<211>843<212>DNA<213>細(xì)菌<400>5atgcgtggtc ttaggcgttg gttatccacc gcacocgaaa ctcgagatga tttattaaag 60ctggttcaag actctcgcca gtttttagag cctgatacgg ttgatatgct tgaaggggtg120cttgatctgc cagcaaccca agtgcgtgag attatgacac cacgcccaca ggtgcacgcg180attgccagcg atgatgattt atctgatatt tcatcggtgg tgcttgaaac agagcattct240cgctatcccg tttttgacag cctggatgat gatgctgtgg ttgggatttt gctgactaag300
gacttaatac catacctaaa agccaaagct gacggtaaag agcagccgct caaattggct360gatattgtac gaaagccgtt gtatattagc gagacggcac gctcagatac actgctacgc420tcacttcaaa aagcccaagt acatatggcg attgttgttg atgaatttgg ctcggtctct480ggtgtggcga caatggagga tttgcttgag gagattgtcg gcgatattgt tgatgaacat540gatgatattg acgaggacag cgacattaat aacatcattc cacatcctga taaatcaggc600gtttggttgg tgcaagcttc cacactcatc agtgattgca atgagatttt aggcagtcat660tttgatgata cagatgttga tacaatggge ggttcggcca tgcaagcatt gggctttgct720agccatcctc aaggtgcggt tgttcaaatc gatgaatggc aaattaccgt ggttgacgtt780gaggcacgat ttattcatct gttggagcct gtgctgatac cacagcttga gaatgctgaa840taa 843<210>6<211>280<212>蛋白質(zhì)<213>細(xì)菌<400>6Met Arg Gly Leu Arg Arg Trp Leu Ser Thr Ala Pro Glu Thr Arg Asp1 5 10 15Asp Leu Leu Lys Leu Val Gln Asp Ser Arg Gln Phe Leu Glu Pro Asp20 25 30Thr Val Asp Met Leu Glu Gly Val Leu Asp Leu Pro Ala Thr Gln Val35 40 45Arg Glu Ile Met Thr Pro Arg Pro Gln Val His Ala Ile Ala Ser Asp50 55 60Asp Asp Leu Ser Asp Ile Leu Ser Val Val Leu Glu Thr Glu His Ser65 70 75 80Arg Tyr Pro Val Phe Asp Ser Leu Asp Asp Asp Ala Val Val Gly Ile85 90 95Leu Leu Ile Lys Asp Leu Ile Pro Tyr Leu Lys Ala Lys Ala Asp Gly100 105 110Lys Glu Gln Pro Leu Lys Leu Ala Asp Ile Val Arg Lys Pro Leu Tyr115 120 125Ile Ser Glu Thr Ala Arg Ser Asp Thr Leu Leu Arg Ser Leu Gln Lys130 135 140Ala Gln Val His Met Ala Ile Val Val Asp Glu Phe Gly Ser Val Ser145 150 155 160Gly Val Ala TAr Met Glu Asp Leu Leu Glu Glu Ile Val Gly Asp Ile165 170 175
Val Asp Glu His Asp Asp Ile Asp Glu Asp Ser Asp Ile Asn Asn Ile180 185 190Ile Pro His Pro Asp Lys Ser Gly Val Trp Leu Val Gln Ala Ser Thr195 200 205Leu Ile Ser Asp Cys Asn Glu Ile Leu Gly Ser His Phe Asp Asp Thr210 215 220Asp Val Asp Thr Met Gly Gly Leu Val Mst Gln Ala Leu Gly Phe Val225 230 235 240Ser His Leu Gln Gly Ala Val Val Gln Ile Asp Glu Trp Gln Ile Thr245 250 255Val Val Asp Val Glu Ala Arg Phe Ile His Leu Leu Glu Leu Val Leu260 265 270Ile Pro Gln Leu Glu Asn Ala Glu275 280<210>7<2l1>843<212>DNA<213>細(xì)菌<400>7atgcgtggtc ttaggcgttg gttatccacc gcacctgaaa ctcgagatga tttattaaag 60ctggttcaag actctcgcca gtttttagag cctgatacgg ttgatatgct tgaaggggtg120cttgatctgc cagcaaccca agtgcgtgag attatgacac cacgcccaca ggtgcatgcg100attgccagcg atgatgattt gtctgatatt ttatcggtgg tgcttgaaac agagcattct240cgctatcctg tttttgacag tttggatgat gatgctgtgg ttgggacttt gctgattaag300gacttaatac catacctaaa agccaaagct gacggtaaag agcagccgct caaattggct360gatattgtac gaaagccgtt gtatattagc gagacggcac gctcagacac actgctacgc420tcacttcaaa aagcccaagt gcatatggcg attgttgttg atgaatttgg ctcggtctct480ggtgtggtga caatggagga tttgcttgag gagattgtcg gcgatattgt tgatgaacat540gatgatattg acgaggacag cgacattaat aacatcattc cacaccctga taaatcaggc600gtttggttgg tgcaagcttc cacactcatc agtgattgca atgagatttt aggcagtcat660tttgatgata cagatgttga tacaatgggc ggtttggtca tgeaagcatt aggctttgct720agccatcttc aaggtgcggt tgttcaaatc gatgaatggc aaattaccgt ggttgatgtt780gaggcacgat ttattcatct grtggagctt gtgctgatac cacagcttga gaatgctgaa840taa 843<210>8<211>280
<212蛋白質(zhì)<213>細(xì)菌<400>8Met Arg Gly Lau Arg Arg Trp Lau Sar Thr Ala Pro Glu Thr Arg Asp1 5 10 15Asp Leu Leu Lys Leu Val Gln Asp Ser Arg Gln Phe Lau Glu Pro Asp20 25 30Thr Val Asp Met Lau Glu Gly Val Leu Asp Leu Pro Ala Thr Gln Val35 40 45Arg Glu Ile Met Thr Pro Arg Pro Gln Val His Ala Ile Ala Ser Asp50 55 60Asp Asp Leu Ser Asp Ile Lsu Ser Val Val Leu Glu Thr Glu His Ser65 70 75 80Arg Tyr Pro Val Phe Asp Ser Leu Asp Asp Asp Ala Val Val Gly Ile85 90 95Lsu Leu Ile Lys Asp Leu Ile Pro Tyr Leu Lys Ala Lys Ala Asp Gly100 105 110Lys Glu Gln Pro Leu Lys Leu Ala Asp Ile Val Arg Lys Pro Leu Tyr115 120 125Ile Sar Glu Thr Ala Arg Ser Asp Thr Leu Leu Arg Ser Leu Gln Lys130 135 140Ala Gln Val His Met Ala Ile Val Val Asp Glu Phe Gly Ser Val Ser145 150 155 160Gly Val Val Thr Met Glu Aap Leu Leu Glu Glu Ile Val Gly Asp Ile165 170 175Val Asp Glu His Asp Asp Ile Asp Glu Asp Ser Asp Ile Asn Asn Ile180 185 190Ile Pro His Pro Asp Lys Ser Gly Val Trp Leu Val Gln Ala Ser Thr195 200 205Leu Ile Ser Asp Cys Asn Glu Ile Leu Gly Ser His Phe Asp Asp Thr210 215 220Asp Val Asp Thr Met Gly Gly Leu Val Met Gln Ala Leu Gly Phe Val225 230 235 240Ser His Leu Gln Gly Ala Val Val Gln Ile Asp Glu Trp Gln Ile Thr245 250 255Val Val Asp Val Glu Ala Arg Phe Ile His Leu Leu Glu Leu Val Leu260 265 270Ile Pro Gln Leu Glu Asn Ala Glu
275 280<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>寡聚核苷酸<400>10gacattggcc gcaacatgc 19<210>11<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<213>寡聚核苷酸<400>11aagggcccaa ttacgcagag gggatccatg cgtggtctta ggcgttggtt atccaccg 58<210>12<211>60<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>寡聚核苷酸<400>12aagggcccaa ttacgcagag ggtcgactta ttattcegca ttctcaagct gtggtatcag60<210>13<211>16<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220>
<223>肽<400>13Cys Asn Glu Glu Ala Trp Ser Gln Asn Arg Arg Ala Glu Leu Ser Tyr1 5 10 15<210>14<211>14<212>蛋白質(zhì)<213>人工序列<220>
<223>肽<400>14Tyr Thr Gly Val Ala Pro Leu Val Asp Asn Asp Glu Thr Val1 5 10
SEQUENCE INFORMATIONBASB020多聚核苷酸和多肽序列SEQ ID NO1菌株MC2931的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多核苷酸序列ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAGACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTGCTTGATCTGCCAGCAACCCAAGTGCGTGAGATTATGACACCACGCCCGCAGGTGCATGCGATTGCCAGCGATGATGATTTATCTGATATTTTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCTCGCTATCCTGTTTTTGACAGTTTAGATGATGATGCTGTGGTTGGGATTTTTGCTGATAAGGACTTAATACCATACCTAAAAGCCAAAGCTGACGGTAAAGAGCAGCCGCTCAAATTGGCTGATATTGTACGAAAGCCGTTGTATATTAGCGAGACGGCACGCTCAGATACACTGCTACGCTCACTTCAAAAAGCCCAAGTGCATATGGCGATTGTGGTTGATGAATTTGGCTCGGTCTCTGGTGTGGTGACAATGGAGGATTTGCTTGAGGAGATTGTCGGTGATATTGTTGATGAACATGATGATATTGACGAGGACAGCGACATTAATAACATCATTCCACACCCTGATAAATCAGGCGTTTGGTTGGTGCAAGCTTCCACACTCATCAGTGATTGCAATGAGATTTTAGGCAGTCATTTTGATGATACAGATGTTGATACAATGGGCGGTTTGGTCATGCAAGCATTGGGCTTTGTTAGCCATCTTCAAGGTGCGGTTGTTCAAATCGATGAATGGCAAATTACCGTGGTTGATGTTGAGGCACGATTTATTCATCTGTTGGAGCTTGTGCTGATACCACAGCTTGAGAATGCTGAATAASEQ ID NO2菌株MC2931的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多肽序列MRGLRRWLSTAPETRDDLLKLVQDSRQFLEPDTVDMLEGVLDLPATQVREIMTPRPQVHAIASDDDLSDILSVVLETEHSRYPVFDSLDDDAVVGILLIKDLIPYLKAKADGKEQPLKLADIVRKPLYISETARSDTLLRSLQKAQVHMAIVVDEFGSVSGVVTMEDLLEEIVGDIVDEHDDIDEDSDINNIIPHPDKSGVWLVQASTLISDCNEILGSHFDDTDVDTMGGLVMQALGFVSHLQGAVVQIDEWQITVVDVEARFIHLLELVLIPQLENAESEQ ID NO3菌株Mcat 2912的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多聚核苷酸序列ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAGACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTGCTTGATCTGCCAGCAACCCAAGTGCGTGAGATTATGACACCACGCCCGCAGGTGCATGCGATTGCCAGCGATGATGATTTATCTGATATTTTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCTCGCTATCCTGTTTTTGACAGTTTGGATGATGATGCTGTGGTTGGGATTTTGCTGATTAAGGACTTAATACCATACCTAAAAGCCAAAGCTGACGGTAAAGAGCAGCCGCTCAAATTGGCTGATATTGTACGAAAGCCGTTGTATATTAGCGAGACGGCACGCTCAGATACACTGCTACGC
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LADIVRKPLYISETARSDTLLRSLQKAQVHMAIVVDEFGSVSGVATMEDLLEEIVGDIVDEHDDIDEDSDINNIIPHPDKSGVWLVQASTLISDCNEILGSHFDDTDVDTMGGLVMOALGFVSHLQGAVVQIDEWQITVVDVEARFIHLLELVLIPQLENAESEQ ID NO7菌株Mcat 2969的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多聚核苷酸序列ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAGACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTGCTTGATCTGCCAGCAACCCAAGTGCGTGAGATTATGACACCACGCCCACAGGTGCATGCGATTGCCAGCGATGATGATTTGTCTGATATTTTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCTCGCTATCCTGTTTTTGACAGTTTGGATGATGATGCTGTGGTTGGGATTTTGCTGATTAAGGACTTAATACCATACCTAAAAGCCAAAGCTGACGGTAAAGAGCAGCCGCTCAAATTGGCTGATATTGTACGAAAGCCGTTGTATATTAGCGAGACGGCACGCTCAGATACACTGCTACGCTCACTTCAAAAAGCCCAAGTGCATATGGCGATTGTTGTTGATGAATTTGGCTCGGTCTCTGGTGTGGTGACAATGGAGGATTTGCTTGAGGAGATTGTCGGCGATATTGTTGATGAACATGATGATATTGACGAGGACAGCGACATTAATAACATCATTCCACACCCTGATAAATCAGGCGTTTGGTTGGTGCAAGCTTCCACACTCATCAGTGATTGCAATGAGATTTTAGGCAGTCATTTTGATGATACAGATGTTGATACAATGGGCGGTTTGGTCATGCAAGCATTAGGCTTTGTTAGCCATCTTCAAGGTGCGGTTGTTCAAATCGATGAATGGCAAATTACCGTGGTTGATGTTGAGGCACGATTTATTCATCTGTTGGAGCTTGTGCTGATACCACAGCTTGAGAATGCTGAATAASEQ ID NO8菌株Mcat 2969的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多肽序列MRGLRRWLSTAPETRDDLLKLVQDSRQFLEPDTVDMLEGVLDLPATQVREIMTPRPQVHAIASDDDLSDILSVVLETEHSRYPVFDSLDDDAVVGILLIKDLIPYLKAKADGKEQPLKLADIVRKPLYISETARSDTLLRSLQKAQVHMAIVVDEFGSVSGVVTMEDLLEEIVGDIVDEHDDIDEDSDINNIIPHPDKSGVWLVQASTLISDCNEILGSHFDDTDVDTMGGLVMQALGFVSHLQGAVVQIDEWQITVVDVEARFIHLLELVLIPQLENAESEQ ID NO9ACT TGA ATA AAA CCG AGT GSEQID NO10GAC ATT GGC CGC AAC ATG CSEQ ID NO11
AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT AGG CGT TGG TTA TCCACC GSEQ ID NO12AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGGTAT CAGSEQ ID NO13CNEEAWSQNRRAELSYSEQ ID NO14YTGVAPLVDNDETV
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽的免疫原性片段，該片段可以用于抗粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗中，其中所述多肽包含就SEQ ID NO4或SEQ IDNO6的全長(zhǎng)來(lái)說(shuō)分別與選自SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的氨基酸序列至少有85％的同一性的氨基酸序列，其中所述免疫原性片段能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))。
2.一種分離的多肽的免疫原性片段，該片段可以用于抗粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗中，其中所述多肽包含就SEQ ID NO4或SEQ IDNO6的全長(zhǎng)來(lái)說(shuō)分別與選自SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的氨基酸序列至少有95％的同一性的氨基酸序列，其中所述免疫原性片段能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))。
3.一種分離的多肽的免疫原性片段，該片段可以用于抗粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗中，其中所述多肽包含選自SEQ ID NO4或SEQ IDNO6的氨基酸序列，其中所述免疫原性片段能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))。
4.一種分離的多肽的免疫原性片段，該片段可以用于抗粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗中，其中所述多肽具有選自SEQ ID NO4或SEQ IDNO6的氨基酸序列，其中所述免疫原性片段能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))。
5.權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段是較大的融合蛋白的一部分。
6.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的免疫原性片段。
7.一種分離的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸包含就SEQ IDNO3或SEQ ID NO5的全長(zhǎng)來(lái)說(shuō)分別與選自SEQ ID NO3或SEQ IDNO5的核苷酸序列至少有85％的同一性的核苷酸序列，其中所述片段編碼可以用于抗粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗中的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))。
8.一種分離的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸包含就SEQ IDNO3或SEQ ID NO5的全長(zhǎng)來(lái)說(shuō)分別與選自SEQ ID NO3或SEQNO5的核苷酸序列至少有95％的同一性的核苷酸序列，其中所述片段編碼可以用于抗粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗中的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))。
9.一種分離的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列，其中所述片段編碼可以用于抗粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗中的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))。
10.一種分離的多核苷酸片段，其中所述多核苷酸由SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的核苷酸序列組成，其中所述片段編碼可以用于抗粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗中的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))。
11.一種表達(dá)載體或活的微生物，其包含權(quán)利要求6-10中任何一項(xiàng)的分離的重組多核苷酸。
12.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求11的表達(dá)載體，其表達(dá)能夠產(chǎn)生識(shí)別SEQ ID NO4或SEQ ID NO6的多肽的免疫應(yīng)答(如果需要的話和載體偶聯(lián))的免疫原性片段，或者含有表達(dá)的免疫原性片段的宿主細(xì)胞的膜。
13.一種制備權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的免疫原性片段的方法，其包括在足以產(chǎn)生所述免疫原性片段的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，并從培養(yǎng)基中回收免疫原性片段。
14.一種表達(dá)權(quán)利要求6-10中任何一項(xiàng)的免疫原性片段的方法，其包括用包含至少一種所述多核苷酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在足以表達(dá)任何一種所述多核苷酸的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。
15.一種疫苗組合物，該組合物含有有效劑量的權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的免疫原性片段以及藥學(xué)上可接受的載體。
16.一種疫苗組合物，該組合物含有有效劑量的權(quán)利要求6-10中任何一項(xiàng)的多核苷酸以及藥學(xué)上可接受的載體。
17.權(quán)利要求15或16中的疫苗組合物，其中所述的組合物含有至少一種其它粘膜炎莫拉氏菌抗原。
18.對(duì)權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的免疫原性片段具有免疫特異性的抗體。
19.一種診斷粘膜炎莫拉氏菌感染的方法，其包括鑒定懷疑受到感染的動(dòng)物的生物樣品中存在的權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)的免疫原性片段，或?qū)λ雒庖咴云尉哂忻庖咛禺愋缘目贵w。
20.含有免疫有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的免疫原性片段的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
21.含有免疫有效量的權(quán)利要求6-10任一項(xiàng)的免疫原性片段的組合物在制備用于在動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的藥物中的應(yīng)用。
22.可用于治療人粘膜炎莫拉氏菌病的治療組合物，包括至少一種抗權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)的免疫原性片段的抗體和合適的藥物載體。
全文摘要
本發(fā)明提供了BASB020多肽以及編碼BASB020多肽的多核苷酸以及通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)這樣的多肽的方法。還提供了診斷，預(yù)防以及治療的用途。
文檔編號(hào)C07K14/21GK1727359SQ200510074658
公開(kāi)日2006年2月1日 申請(qǐng)日期1999年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月13日
發(fā)明者J·通納德 申請(qǐng)人:史密絲克萊恩比徹姆生物有限公司