新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備及應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備及應用，所述制備方法包括：抗原制備步驟：將病毒NDRV?TH11株接種永生化的鴨胚成纖維細胞，收獲細胞病變達80％的細胞毒，?20℃凍存；疫苗制備步驟：將收獲的細胞毒滅活后與自制納米佐劑混合，攪拌均勻，即得新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗。本發(fā)明制備的新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗免疫鴨后能有效抵抗新型鴨呼腸孤病毒強毒株的攻擊。
【專利說明】
新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備及應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備及應用，具體涉及一種新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗及其在預防新發(fā)鴨呼腸孤病毒病上的應用，屬于預防獸醫(yī)學領域。
【背景技術】
[0002]禽呼腸孤病毒感染水禽的報道最初僅見于番鴨，稱為番鴨呼腸孤病毒病，其致病因子稱為番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)。研究表明MDRV對我國的北京鴨以及其它地方品種鴨不具有感染性。隨著養(yǎng)鴨業(yè)的不斷發(fā)展，呼腸孤病毒病感染多品種鴨也見報道，但是由于流行區(qū)域、發(fā)病種群和發(fā)病時間的不同，呼腸孤病毒感染鴨表現(xiàn)出不同程度的差異。程安春等報道了 1998年四川、云南等地的“鴨病毒性腫頭出血癥”疫情，后續(xù)研究表明是由鴨呼腸孤病毒所致。2008年，劉紅等對廣東省某鴨場一種以腫頭、軟腳、流淚，拉黃綠色稀便，肝出血和壞死及食道泄殖腔潰瘍和結(jié)痂為主要特征的疫情進行病因調(diào)查時，分離到多株病毒，其中包括I株鴨呼腸孤病毒(Duck reovirus，DRV-GZ株)。2009年，陳少鶯等報道了福建省一種以肝臟出血和壞死為主要病變特征的半番鴨和麻鴨呼腸孤病毒病，之后通過對該毒株的感染性和免疫原特性研究，發(fā)現(xiàn)這是一株與番鴨呼腸孤病毒存在明顯差異的新型呼腸孤病毒。
[0003]2011年，Liu等從北京鴨體內(nèi)也分離到了一株呼腸孤病毒(HC株)，其動物回歸實驗表明，DRV-HC株在15d內(nèi)引起未能引起鴨的死亡，但能引起SPF雞的死亡，說明該毒株的致病力并不太強。
[0004]同年，我國華東地區(qū)的一些養(yǎng)鴨場陸續(xù)發(fā)生了一種以軟腳和肝臟、脾臟壞死為主要特征的傳染病，發(fā)病率約20%?50%，病死率在80%以上，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了較為嚴重的經(jīng)濟損失。中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所從病原生物學、動物回歸試驗、基因組特性及分子水平上首次證實該病原是一種有別于以往分離的鴨呼腸孤病毒、番鴨呼腸孤病毒、禽呼腸孤病毒，試驗證明此次疫情是由呼腸孤病毒引起，所分離到的病原稱為DRV-THll株。值得指出的是，與以往報道的鴨呼腸孤病毒如NDRV-JM85株、番鴨呼腸孤病毒、禽呼腸孤病毒相比，新發(fā)鴨呼腸孤病毒的宿主譜更廣，致病性更強，它可感染包括麻鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨等在內(nèi)的多個品種的鴨，而且感染鴨的病死率為50-80%，提示THll株是一株致病力發(fā)生變異了的新發(fā)鴨呼腸孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)。至今為止，該病尚無有效的防治方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備及應用，為防治新發(fā)鴨呼腸孤病毒病提供了一種安全有效的方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
[0007]第一方面，本發(fā)明提供了一種新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟:
[0008]抗原制備步驟:將病毒NDRV-THlI株接種永生化的鴨胚成纖維細胞，收獲細胞病變達80 %的細胞毒，-20 0C凍存；
[0009]疫苗制備步驟:將收獲的細胞毒滅活后與自制納米佐劑混合，攪拌均勻，即得新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗。
[0010]優(yōu)選地，所述的鴨呼腸孤病毒NDRV-TH11株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microb1logical Culture Collect1n Center，簡稱CGMCC)，保藏單位CGMCC。地址在中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日2013年11月28 日，保藏編號:CGMCC NO:8554 ο
[0011]優(yōu)選地，所述永生化的鴨胚成纖維細胞為本實驗室制備，(其制備參見YuzhiFu,Zongyan Chen,Chuanfeng Li,Guangqing Liu.Establishment of a duck cell linesusceptible to duck hepatitis virus type 1.J Virol Methods.2012Sep；184(1-2):41-5.do1: 10.1016/j.jviromet.2012.05.004.Epub 2012May 23.)與以往原代細胞不能連續(xù)傳代或SPF鴨胚成本高導致病毒培養(yǎng)困難相比較，本高效細胞滅活疫苗研制所用的細胞是本實驗室永生化的細胞，細胞可連續(xù)傳代，也可懸浮培養(yǎng)，生長狀態(tài)好，且病毒適應該DEF細胞，并能引起細胞病變，利于病毒的繁殖及疫苗生產(chǎn)。
[0012]優(yōu)選地，所述自制納米佐劑包括以下質(zhì)量百分含量的各組分:納米殼聚糖25%、乳化劑25%、礦物油50%。與現(xiàn)有的白油佐劑相比，副反應更小。
[0013]優(yōu)選地，抗原制備步驟中，所述病毒NDRV-TH11株接種鴨胚成纖維細胞單層。
[0014]優(yōu)選地，疫苗制備步驟中，所述滅活具體采用以下步驟:將收獲的細胞毒，按總體積的0.001%加入β-丙內(nèi)酯(BPL)，37°C滅活24h。本發(fā)明采用BPL滅活，可高效滅活病毒。與以往滅活疫苗的滅活方式相比較，滅活更徹底，且安全高效。且避免了因加入甲醛滅活病毒時，甲醛量過多而導致免疫副反應。
[0015]優(yōu)選地，疫苗制備步驟中，所述滅活后的細胞毒與自制納米佐劑的體積比為I: I。
[0016]第二方面，本發(fā)明提供了一種基于所述方法制備的新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的應用，所述應用包括用于預防新型鴨呼腸孤病毒病。
[0017]優(yōu)選地，所述預防新發(fā)鴨呼腸孤病毒病的方法具體包括:取滅活疫苗免疫種鴨一次，Iml/羽;4周后加強免疫一次，Iml/羽。
[0018]現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0019]1.本發(fā)明通過免疫種鴨提高子代母源抗體水平，使雛鴨在易感日齡能抵抗新型鴨呼腸孤病毒感染。
[0020]2.用上述高效細胞滅活疫苗免疫產(chǎn)蛋前的種鴨，Iml/羽，間隔28天加強免疫，使免疫種鴨的子代含有較高的母源抗體，免疫種鴨所產(chǎn)的子代雛鴨在15日齡內(nèi)能夠抵抗新型鴨呼腸孤病毒的感染。
[0021]3.本發(fā)明簡便可行、實用性強，為防治新發(fā)鴨呼腸孤病毒病提供了一種安全有效的方法。
【具體實施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0023]實施例1
[0024]本實施例應用鴨呼腸孤病毒NDRV-TH11株接種本實驗室永生化的鴨胚成纖維細胞單層，當細胞病變達80%時收獲細胞毒;將上述病毒適當濃縮并經(jīng)β-丙內(nèi)酯(BPL)滅活后，按適當比例與自制納米佐劑混勻，制成新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗，然后將上述滅活疫苗應用于預防新型鴨呼腸孤病毒病;種鴨免疫及中和抗體:取滅活疫苗免疫種鴨一次，1ml/羽;4周后加強免疫一次，1ml/羽。所述的鴨呼腸孤病毒NDRV-TH11株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microb1logicalCulture Collect1n Center，簡稱CGMCC)，保藏單位CGMCC。地址在中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日2013年11月28日，保藏編號:CGMCC NO:85540
[0025]所述的疫苗制備方法具體步驟如下:
[0026](丨)抗原制備:將病毒NDRV-THlI株接種本實驗室永生化的鴨胚成纖維細胞，收獲細胞病變達80%的細胞毒，-20 °C凍存。當細胞毒對鴨胚成纖維細胞的TCID5q^ 10—67.5/
0.1ml時，可用于病毒滅活。將收獲的細胞毒，按總體積的0.001%加入β-丙內(nèi)酯(BPL)，4°C滅活4h。取滅活后的病毒液接種9日齡SPF雞胚或11日齡鴨胚，雞胚及鴨胚應全部存活。
[0027](2)疫苗制備:按1:1的比例加入自制納米佐劑和滅活的病毒液，攪拌均勻制成油包水型乳劑疫苗。該疫苗無菌檢驗結(jié)果為無菌生長。
[0028]實驗證明:3日齡健康易感鴨，每羽頸部皮下注射1.0ml的疫苗后，接種鴨應全部存活，采食、飲水、生長發(fā)育等均正常;隨機剖殺鴨，心、肝、脾等內(nèi)臟未見異常。
[0029]于二免后不同時間(S卩PI 7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天、70天、77天、84天、91天)連同對照鴨采血，測定中和抗體效價。結(jié)果表明，種鴨在第二次免疫后7天就有一定的抗體，二免后14天抗體效價上升明顯，于二免后28-49天時達到2'直到91天時抗體水平為2425。
[0030]雛鴨(免疫種鴨子代)被動保護:取二免后種鴨在60天內(nèi)所產(chǎn)的種蛋，挑選同一時間孵化出殼的一日齡含NDRV母源抗體的鴨20羽為母源抗體組(A組)；同時設非免疫種鴨子代(無NDRV母源抗體)的I日齡鴨20羽為非母源抗體組(B組)；將A組和B組雛鴨經(jīng)腿肌注射NDRV強毒05ml/羽，觀察21天。并在攻毒后第7天，隨機剖殺5羽，觀察各器官病變情況。結(jié)果:A組雛鴨注射強毒后全部存活，采食、飲水、精神等方面正常，隨機剖殺5羽鴨的肝、脾等臟器均正常，未見出血壞死等變化。而B組雛鴨注射強毒后，采食、飲水減少，精神沉郁，整個觀察期對照鴨體重比母源抗體組輕且差異明顯，隨機剖殺5羽鴨肝、脾均觀察到嚴重的出血壞死斑。結(jié)果表明種鴨經(jīng)兩次免疫NDRV高效細胞滅活苗后，其子代雛鴨能有效抵抗NDRV強毒感染。
[0031]雛鴨(免疫種鴨的子代)母源抗體消長規(guī)律:取種鴨二免后60天內(nèi)所產(chǎn)種蛋，孵化出殼后采血測定雛鴨NDRV母源抗體消長情況。I日齡雛鴨NDRV母源抗體較高，中和抗體效價達23;之后逐漸下降，在15日齡時還有一定的母源抗體，中和抗體效價為215，在21日齡時母源抗體基本消失。
[0032]臨床應用效果評價:在NDRV流行疫區(qū)挑選3個種鴨養(yǎng)殖場進行該方法的防制試驗。種鴨在開產(chǎn)前兩次免疫NDRV滅活苗，所孵化的小鴨跟蹤觀察30天，試驗種鴨及雛鴨都沒有出現(xiàn)NDRV感染。而周邊未采取以上措施養(yǎng)鴨場不同程度出現(xiàn)雛鴨因發(fā)生該病而死亡。進一步證明該方法安全、有效，可用于臨床上預防新發(fā)鴨呼腸孤病毒病。
[0033]疫苗安全試驗:以最小免疫劑量的100倍，肌肉或頸部皮下接種10只I日齡試驗雛鴨，觀察接種雛鴨的反應，觀察期15d。結(jié)果I日齡番鴨免疫疫苗后無發(fā)病和死亡，剖檢未見肉眼可見的大體病變。
[0034]保存期試驗:取保存于2-8 °C條件下6、12、15、18、24、28、30個月的滅活疫苗，按確定的最佳免疫劑量免疫I日齡雛鴨，同時設定非免疫對照組，14日齡攻毒。結(jié)果顯示2-8°C保存6、12、15個月后的疫苗均能完全保護雛鴨抵抗同源強毒的攻擊;保存24個月后的疫苗保護率僅為80 %，保存28、30個月的疫苗保護率分別為25 %、20 %。該疫苗最長有效保存期為24個月。
[0035]本發(fā)明具體應用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。應當指出，以上實施例僅用于說明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護范圍。對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 抗原制備步驟:將病毒NDRV-TH11株接種永生化的鴨胚成纖維細胞或11日齡的鴨胚，收獲細胞病變達80 %的細胞毒，-20 0C凍存； 疫苗制備步驟:將收獲的細胞毒滅活后與自制納米佐劑混合，攪拌均勻，即得新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗。2.如權利要求1所述的新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述自制納米佐劑包括以下質(zhì)量百分含量的各組分:納米殼聚糖25%、乳化劑25%、礦物油50 %。3.如權利要求1所述的新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備方法，其特征在于，疫苗制備步驟中，所述滅活具體采用以下步驟:將收獲的細胞毒，按總體積的0.001%加入丙內(nèi)酯，37°C滅活24h。4.如權利要求1所述的新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的制備方法，其特征在于，疫苗制備步驟中，所述滅活后的細胞毒與自制納米佐劑的體積比為I: I。5.—種基于權利要求1所述方法制備的新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的應用，其特征在于，所述應用包括用于預防新發(fā)鴨呼腸孤病毒病。6.如權利要求5所述的新發(fā)鴨呼腸孤病毒病高效細胞滅活疫苗的應用，其特征在于，所述預防新發(fā)鴨呼腸孤病毒病的方法具體包括:取滅活疫苗免疫種鴨一次，Iml/羽;4周后加強免疫一次，Iml/羽。
【文檔編號】A61K39/15GK105854011SQ201610265577
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】陳宗艷, 劉光清, 李傳峰
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所