一種藥用glp-1r抗體融合蛋白的穩(wěn)定溶液制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種藥用GLP-1R抗體融合蛋白的穩(wěn)定溶液制劑，包括治療有效劑量的GLP-1R抗體融合蛋白、氨基酸、表面活性劑及緩沖體系，所述氨基酸的終濃度為1-500mM，表面活性劑的終濃度為0.01％-0.5％，所述穩(wěn)定溶液制劑的pH值為5.0至8.0。本發(fā)明性能穩(wěn)定，在體內半衰期較長，治療效果好，可以用于糖尿病、肥胖癥及其相關病癥的治療。
【專利說明】
一種藥用GLP-1R抗體融合蛋白的穩(wěn)定溶液制劑
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術領域，特別涉及一種藥用GLP-1R抗體融合蛋白的穩(wěn)定溶 液制劑。
【背景技術】
[0002] GLP-1類似物在臨床試驗中用于治療II型糖尿病和肥胖癥(Gallwitz B，European Endocrinol，2015; 11:21-5) ALP-1誘導多種生物學效應，例如刺激胰島素分泌、抑制胰高 血糖素分泌、抑制胃排空、抑制胃運動或腸運動，并且誘導體重減輕(Lund A et al，Eur J Intern Med 2014; 25:407-14) ALP-1的顯著特征是其刺激胰島素分泌而不伴有低血糖相 關危險的能力，所述低血糖相關危險見于應用胰島素治療或通過促進胰島素分泌起作用的 某些類型的口服治療時。天然存在的GLP-1在體內會被迅速清除，具有極短的體內半衰期這 一事實限制了涉及GLP-1的多肽治療的有效性。
[0003] 目前已經有多種途徑可以在保持生物學活性的同時延長GLP-1及其類似物在體內 的半衰期(Verspohl EJ，Pharmacol Rev，2012; 64:A-AX)，包括將GLP-1及其類似物與免疫 球蛋白Fc部分或者人血清白蛋白（HSA)融合。我們選擇的全新途徑涉及將GLP-1與完整的 GLP-1R抗體分子（IgG)進行融合。IgG具有延長融合分子體內循環(huán)半衰期的作用，其本身在 人體內的半衰期是21天。在保留GLP-1分子生物學活性的同時，GLP-1R抗體融合蛋白具有由 抗體分子提供的穩(wěn)定性方面的優(yōu)勢。同時，GLP-1和GLP-1R的抗體形成的融合蛋白質具有由 抗體分子提供的分子靶向性進而增加GLP-1與GLP-1 R結合的幾率。另外，抗體分子的免疫原 性也低于其他的蛋白融合伙伴，對于一個需要長期甚至終身服用的藥物，低免疫原性是一 個必備的屬性。
[0004] 這些融合蛋白質一般在哺乳動物細胞、例如CH0、SP2/0或NS0中生產。但是發(fā)明人 觀察到在CH0細胞中產生的GLP-1R抗體融合蛋白易于被內源蛋白酶或者在特定的細胞培養(yǎng) 理化條件下降解，且其趨勢在低pH的環(huán)境下更加顯著和快速，同時發(fā)現(xiàn)在pH值7以上時， GLP-1R抗體融合蛋白更加易于聚合。另外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)GLP-1R抗體融合蛋白在冷藏條件 (2-8°C)下、在單一的緩沖溶液(例如檸檬酸鹽緩沖液）中的溶解度低，無法滿足藥用的劑量 要求。這些問題在本發(fā)明中通過對pH的控制、使用特定的制劑添加物的組合、以及使用特定 的GLP-1R抗體融合蛋白濃度來予以克服。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種藥用GLP-1R融合蛋白的穩(wěn)定溶液制劑，性能穩(wěn)定，在 體內半衰期較長，治療效果佳，可以被用于糖尿病、肥胖癥及其相關病癥的治療。
[0006] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0007] 一種藥用GLP-1R抗體融合蛋白的穩(wěn)定溶液制劑，包括治療有效劑量的GLP-1R抗體 融合蛋白、氨基酸、表面活性劑及緩沖體系，所述氨基酸的終濃度為l_500mM，表面活性劑的 終濃度為〇. 01 %-〇. 5%，所述穩(wěn)定溶液制劑的pH值為5.0至8.0。
[0008] 為了克服GLP-1R抗體融合蛋白的溶液制劑在低pH值下不穩(wěn)定，高pH值下易聚合以 及GLP-1R抗體融合蛋白在單一的緩沖溶液中溶解度不夠高的一些問題，本發(fā)明研發(fā)了包含 GLP-1R抗體融合蛋白的在物理和化學上穩(wěn)定的溶液制劑，其進一步包含了緩沖體系、作為 穩(wěn)定劑和滲透壓調節(jié)劑的氨基酸和表面活性劑。該穩(wěn)定溶液制劑在25°C下的穩(wěn)定保存為至 少6個月。本發(fā)明進一步優(yōu)選的穩(wěn)定溶液制劑包含終濃度約0.1-100mg/mL的GLP-1R抗體融 合蛋白、濃度為5_30mM的檸檬酸鹽緩沖液、終濃度0.01 %-0.2%的吐溫-80和終濃度80-200mM的L-精氨酸，并且pH為5至8。該穩(wěn)定溶液制劑提高了 GLP-1R抗體融合蛋白的溶解度以 及其在特殊環(huán)境下，尤其是高溫下的穩(wěn)定性。本發(fā)明還包括治療糖尿病、肥胖癥和相關病癥 的方法，該方法包括施用本發(fā)明所述的GLP-1R抗體融合蛋白制劑。
[0009] 作為優(yōu)選，所述氨基酸的終濃度為80-200mM，表面活性劑的終濃度為0.01%_ 〇. 2 %，所述緩沖體系為檸檬酸鹽緩沖液，所述穩(wěn)定溶液制劑的pH值為5.5至7.0。
[0010] 作為優(yōu)選，所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為5-30mM。
[0011]作為優(yōu)選，所述氨基酸為L-精氨酸，L-精氨酸的終濃度為100-180mM，所述表面活 性為吐溫-80，吐溫-80的終濃度為0.05%-0.15%。
[0012]作為優(yōu)選，所述治療有效劑量的GLP-1R抗體融合蛋白的終濃度為0.1mg/mL-100mg/mL 〇
[0013]作為優(yōu)選，所述治療有效劑量的GLP-1R抗體融合蛋白的終濃度為5mg/mL-40mg/ mL〇
[0014]作為優(yōu)選，所述GLP-1R抗體融合蛋白的輕鏈可變結構域的氨基酸序列選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6其中之一，重鏈 可變結構域的氨基酸序列選自SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9其中之一。
[0015]作為優(yōu)選，所述GLP-1R抗體融合蛋白的輕鏈恒定結構域的氨基酸序列為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11，重鏈恒定結構域的氨基酸序列為SEQ ID NO: 12。
[0016] 本發(fā)明所述的GLP-1R抗體融合蛋白包含GLP-1或其類似物，在其C端通過肽接頭與 GLP-1R抗體輕鏈的N端進行了融合。該抗體融合蛋白在生物學上相比GLP-1及其類似物具有 類似或者更好的生物學活性和延長的半衰期。優(yōu)選的GLP-1R抗體融合蛋白的輕鏈可變結構 域序列包含全部或部分的SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6,其輕鏈恒定結構域序列包含全部或部 分的3￡〇10^):10或11，其重鏈可變結構域序列包含全部或者部分的3￡〇10勵:7、8或9， 其重鏈恒定結構域序列包含全部或者部分的SEQ ID N0:12。更優(yōu)選的GLP-1R抗體融合蛋白 的輕鏈可變結構域序列基本是SEQ ID N0:l、2、3、4、5或6,其輕鏈恒定結構域序列基本是 3￡〇10勵：10或11，其重鏈可變結構域序列基本是3￡〇10^) :7、8或9，其重鏈恒定結構域 序列基本是SEQ ID N0:12。最優(yōu)選的GLP-1R抗體融合蛋白的輕鏈可變結構域序列完全是 3￡〇10如：1、2、3、4、5或6，其輕鏈恒定結構域序列完全是3￡〇10勵 ：10或11，其重鏈可變 結構域序列完全是SEQ ID N0:7、8或9,其重鏈恒定結構域序列完全是SEQ ID N0:12。
[0017] 本發(fā)明的穩(wěn)定溶液制劑應用于治療糖尿病或肥胖癥。
[0018] 本發(fā)明的穩(wěn)定溶液制劑應用于治療腸易激綜合征以及通過降低血漿葡萄糖、抑制 胃和/或腸運動、抑制胃和/或腸排空、或抑制食物攝入而受益的其它疾病。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是:性能穩(wěn)定，在體內半衰期較長，治療效果佳，可以被用于糖 尿病、肥胖癥、腸易激綜合征及其相關病癥的治療。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進一步的具體說明。
[0021] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。
[0022] 本發(fā)明GLP-1R抗體融合蛋白的制備參見
【申請人】在先申請的專利：CN104371019A， W0 2015/021871〇
[0023]生物學活性指的是GLP-1R抗體融合蛋白在體內與GLP-1R結合并活化GLP-1R而引 發(fā)響應的能力。響應包括不限于促進胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制食欲、減輕體 重、誘導飽腹感、抑制胰腺0細胞凋亡和誘導胰腺0細胞增殖。
[0024]藥用GLP-1R抗體融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑包含了在緩沖液中的GLP-1R抗體融 合蛋白，該緩沖液進一步含有作為穩(wěn)定劑、滲透壓調節(jié)劑的氨基酸和表面活性劑。該穩(wěn)定溶 液制劑在25°C下的穩(wěn)定性能至少維持6個月，其更為精確的25°C下穩(wěn)定性保持周期為6個月 至8個月、6個月至12個月、6個月至18個月、6個月至24個月、8個月至12個月、8個月至18個 月、8個月至24個月、12個月至18個月、12個月至24個月、18個月至24個月。
[0025] 本發(fā)明所用到的緩沖液體系由包括但不限于以下的一種或者數(shù)種有機或無機化 合物組成:梓檬酸(citric acid)，梓檬酸鹽(salts of citric acid)，抗壞血酸(ascorbic acid)，抗壞血酸鹽(salts of ascorbic acid)，葡萄糖酸(gluconic acid)，葡萄糖酸鹽 (salts of gluconic acid)，碳酉愛（carbonic acid)，碳酉愛鹽（salts of carbonic acid)， 酒石酸（tartaric acid)，酒石酸鹽（salts of tartaric acid)，瑰I白酸(succinic acid)， 琥I白酸鹽（salts of succinic acid)，醋酸（acetic acid)，醋酸鹽（salts of acetic acid)，肽酸(phtalic acid)，肽酸鹽(salt of phtalic acid)，磷酸(phosphorc acid)，磷 酸鹽（phosphate)，鹽酸（hydrochloric acid)，三輕甲基氨基甲燒（Tris)，氨丁三醇 (Thomethamine)以及氨基酸(amino acid)，包括但不局限于組氨酸(Histidine)，精氨酸 (Arginine)，甘氨酸（Glycine) 〇
[0026] 滲透壓調節(jié)劑在本發(fā)明中定義為在被添加后能夠增加制劑滲透壓的一種物質。本 發(fā)明所涉及的滲透壓調節(jié)劑為自由氨基酸，包括但不僅限于以下:精氨酸(arginine)、組氨 酸(histidine )、蛋氨酸(methionine )、賴氨酸（lysine )、鳥氨酸（ornithine )、亮氨酸 (leucine)、異亮氨酸（iso leucine )、丙氨酸（alanine)、甘氨酸（glycine)、谷氨酸 (glutamic acid)和天冬氨酸(aspartic acid)。堿性氨基酸優(yōu)選精氨酸，組氨酸，賴氨酸或 者其組合。氨基酸可以以氨基酸鹽的形式添加，同時被添加的氨基酸可以是D構象氨基酸， 比如D-精氨酸，或者L構象氨基酸，比如L-精氨酸。
[0027] 在本發(fā)明所述范圍內，氨基酸的添加不僅限于作為滲透壓調節(jié)劑，同時也作為穩(wěn) 定劑，其包括但不僅限于精氨酸(arginine)、組氨酸(histidine)、蛋氨酸(methionine)、賴 氨酸（lysine )、鳥氨酸(ornithine )、亮氨酸（leucine )、異亮氨酸（iso leucine )、丙氨酸 (alanine)、甘氨酸(glycine)、谷氨酰胺(glutamine)、谷氨酸(glutamic acid)、天冬酰胺 (asparagine)、天冬氨酸（aspartic acid)、苯丙氨酸（phenylalanine)、酪氨酸 (tyrosine)、絲氨酸（serine)、脯氨酸(proline)和色氨酸(tryptophan)。氨基酸作為穩(wěn)定 劑和滲透壓調節(jié)劑在本發(fā)明中優(yōu)選的濃度為1至500mM。
[0028]表面活性劑在本發(fā)明里定義為具有兩性結構的有機化合物，即他們含有具有不同 可溶性質的基團，典型的情況是這種化合物同時含有可溶于油的碳氫基團和易溶于水的離 子基團。本發(fā)明涉及的表面活性劑包括但不限于以下的一些：山梨醇酐脂肪酸酯（sorbitan fatty acid esters;比如，山梨糖單辛酸酯（sorbitan monocaprylate)、失水山梨醇單月 桂酸酯（sorbitan monolaurate)、失水山梨醇棕櫚酸酯（sorbitan monopalmitate));失水 山梨醇三油酸酯（sorbitan trioleate);甘油脂肪酸酯（glycerine fatty acid esters; 比如：單辛酸甘油酸酯（glycerine monocaprylate))、單十四燒酸甘油酸酯（glycerine monomyristate)、單硬脂酸甘油酯（glycerine monostearate);聚甘油脂肪酸酯 (polyglycerine fatty acid esters;比如：十甘油單硬脂酸酯（decaglycerine monostearate))、十甘油二硬脂酸酯（decaglyeery 1 distearate)、十甘油單亞油酸酯 (decaglyceryl monolinoleate));聚氧乙稀山梨醇酐脂肪酸酯（polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters;比如：聚氧乙稀失水山梨醇單月桂酸酯（polyoxyethylene sorbitan monolaurate))，其中聚氧乙?。?0)失水山梨醇單月桂酸酯(polyoxyethylene (20)8〇1'13；^311111〇11〇131^3七6)即為吐溫-20(1￥6611-20)、聚氧乙稀失水山梨醇單棕櫚酸酯 (polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)，即吐溫-40(Tween_40)、聚氧乙稀失水山梨 醇單油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate)，其中聚氧乙?。?0)失水山梨醇單 單油酸酯（polyoxyethylene(80)sorbitan mono。leate)即為吐溫-80(Tween-80)、聚氧乙 稀失水山梨醇單硬脂酸酯（polyoxyethylene sorbitan monostearate)，其中聚氧乙稀 (60)失水山梨醇單硬脂酸酯（polyoxyethylene(60)sorbitan monostearate)即為吐溫-60;聚氧乙稀失水山梨醇三油酸酯（polyoxyethylene sorbitan trioleate)，即吐溫-85 (Tween-85)，聚氧乙稀失水山梨醇三硬酯酸酯（polyoxyethylene sorbitan tristearate)，即吐溫_65(Tween-65);聚氧乙稀山梨糖醇脂肪酸酯（polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters，比如：聚氧乙稀山梨糖醇四硬脂酸酯（polyoxyethylene sorbitol tetrastearate)，聚氧乙稀山梨糖醇單油脂酸酯 polyoxy ethylene sorbitol tetraoleate));聚氧乙稀甘酸脂肪酸酯（polyoxyethylene glycerine fatty acid esters，比如：聚氧乙稀甘油單硬脂酸酯(polyoxyethylene glyceryl monostearate))，聚 氧乙稀聚乙二醇脂肪酸酯(polyethylene glycol fatty acid esters;比如：聚氧乙稀聚 乙二醇二硬脂酸酯（polyethylene glycol distearate));聚氧乙稀烷基醚 (polyoxyethylene alkyl ethers，比如：聚氧乙稀月桂酉迷 polyoxy ethylene laury 1 ether));聚氧乙稀聚氧丙稀烷基醚（polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ethers， 比如：聚氧乙稀聚氧丙稀二醇(polyoxyethylene polyoxypropylene glycol)，聚氧乙稀聚 氧丙醇胺醚（polyoxyethylene polyoxypropylene propyl ether)，聚氧乙稀聚氧丙稀十 六烷基醚(polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether));聚氧乙稀烷基苯基醚 (polyoxyethylene alkylphenyl ethers，比如：壬基酷聚氧乙稀謎（polyoxyethylene nonylphenyl ether));聚氧乙稀氫化蓖麻油油（polyoxyethylene hydrogenated castor oils，比如polyoxyethylene castor oil聚氧乙稀蓖麻油油））；聚氧乙稀蜂錯衍生物 (polyoxyethylene beeswax derivatives，比如：聚氧乙稀山梨醇蜂錯衍生物 (polyoxyethylene sorbitol beeswax));聚氧乙稀羊毛脂衍生物（polyoxyethylene lanolin derivatives)和聚氧乙稀脂肪酸酰胺（polyoxyethylene fatty acid amides，比 如：聚氧乙稀硬脂酸酰胺(polyoxyethylene stearic acid amide));十碳-十八碳烷基硫 酸鹽(C10_C18alkyl sulfates，比如:十六烷基硫酸鈉(sodium cetyl sulfate)，硫酸月桂 酸鈉（sodium lauryl sulfate)，硫酸油稀醇鈉（sodium oleyl sulfate));添加有2到4個 環(huán)氧乙烷基團的十碳-十六碳脂肪醇聚氧乙稀醚硫酸銨(polyoxyethylene C10-C16alkyl ether sulfate with an average of 2to 4moles of ethylene oxide units added，比 如：聚環(huán)氧乙燒月桂基醚硫酸鈉（sodium polyoxyethylene lauryl sulfate)); -碳-十八 碳烷基磺酸酯(Cl_C18alkyl sulfosuccinate ester salts，比如：月桂酯磺酸鈉(sodium lauryl sulfosuccinate ester));以及天然的表面活性劑，比如卵磷脂（lecithin)、甘油 磷脂（815^61~(^1108。11〇11。1(1)、磷酸鞘酯類（8。11；[1^(^110 8。11011。1(18，比如神經鞘磷脂 (sphingomyelin))、十二碳-十八碳鹿糖脂肪酸酯（sucrose esters of C12_C18fatty acids)。本發(fā)明使用的表面活性劑配方可能含有一個或者多個以上所述的表面活性劑成 分。比較合適的表面活性劑是聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯類化合物，比如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60和吐溫-80。
[0029] 藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑包含終濃度約0.1至約100mg/mL GLP-1R 抗體融合蛋白。優(yōu)選的61^-11?抗體融合蛋白的濃度(11^/1]1〇范圍為約0.1至1、1至5、5至10、5 至20、10至20、20至30、20至40、30至40、40至50、50至60、60至70、70至80、80至90、90至 100mg/mL。特別優(yōu)選的GLP-1R抗體融合蛋白的濃度(mg/mL)為約0.1、約0.25、約0.5、約1、約 2、約3、約4、約 5、約6.5、約8、約10、約12.5、約15、約17.5、約 20、約22.5、約 25、約27.5、約30、 約32.5、約35、約37.5、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約80、約85、約90、約 95、約100mg/mL。
[0030]優(yōu)選的穩(wěn)定溶液制劑的緩沖體系為檸檬酸鹽，其濃度范圍為約5至30mM。進一步優(yōu) 選的檸檬酸鹽濃度(mM)范圍為約5至25、5至20、5至15、5至12.5、5至10、7.5至30、7.5至25、 7.5至20、7.5至15、7.5至12.5、7.5至10、8至30、8至25、8至20、8至15、8至12.5、8至11、8至 10、9至30、9至25、9至20、9至15、9至12.5、10至30、10至25、10至20、10至17.5、10至15、10至 12.5、12.5至30、12.5至25、12.5至20、12.5至15、15至30、15至25、15至20、17.5至30、17.5至 25、17.5至22.5、17.5至20、20至30、20至27.5、20至25、20至22.5、22.5至30、22.5至27.5、 22.5至25、25至30、25至27.5、27.5至30。更進一步優(yōu)選的檸檬酸鹽的濃度為約5至2011^。特 別優(yōu)選的檸檬酸鹽的濃度為約10、10.0、20或20.0 mM。
[0031]本發(fā)明所述的藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑的pH調節(jié)范圍為約5至8。該 pH范圍為制劑提供可接受的穩(wěn)定性，以保持GLP-1R抗體融合蛋白的溶解度和促進胰島素分 泌的活性，并且是非腸道施用可以接受的?？梢酝ㄟ^加入酸、例如HC1，或加入堿，例如NaOH， 將pH調節(jié)至預期的pH或者可以加入檸檬酸鹽緩沖液和檸檬酸的組合以獲得預期的緩沖濃 度和預期的pH。優(yōu)選pH值的范圍為5至7.75、5至7.5、5至7.25、5至7.0、5至6.75、5至6.5、5至 6.25、5至6.0、5至5.75、5至5.5、5至5.25、5.25至8.0、5.25至7.75、5.25至7.5、5.25至7.25、 5.25至7.0、5.25至6.75、5.25至6.5、5.25至6.25、5.25至6.0、5.25至5.75、5.25至5.5、5.5 至 8.0、5.5至7.75、5.5至7.5、5.5至7.25、5.5至7.0、5.5至6.75、5.5至6.5、5.5至6.25、5.5 至 6.0、5.5至5.75、5.75至8.0、5.75至7.75、5.75至7.5、5.75至7.25、5.75至7.0、5.75至 6.75、5.75至6.5、5.75至6.25、5.75至6.0、6.0至8.0、6.0至7.75、6.0至7.5、6.0至7.25、6.0 至 7.0、6.0至6.75、6.0至6.5、6.0至6.25、6.25至8.0、6.25至7.75、6.25至7.5、6.25至7.25、 6.25至7、6.25至6.75、6.25至6.5、6.5至8.0、6.5至7.75、6.5至7.5、6.5至7.25、6.5至7、6.5 至7、6.5至6.75、6.75至8、6.75至7.75、6.75至7.5、6.75至7.25、6.75至7.0、7至8.0、7至 7.75、7至7.5、7至7.25、7.25至8.0、7.25至7.75、7.25至7.5、7.5至8.0、7.5至7.75、7.75至 8.0。進一步優(yōu)選的pH范圍為6至7，特別優(yōu)選的pH值為約6.5或6.50。
[0032]本發(fā)明優(yōu)選了 L-精氨酸作為藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑的滲透壓調 節(jié)劑和穩(wěn)定劑，其濃度范圍為1至500mM，起到穩(wěn)定GLP-1R抗體融合蛋白、增加其溶解度，并 調整制劑的滲透壓使其適用于非腸道施用等作用。優(yōu)選的L-精氨酸的濃度范圍為80至 200mM。進一步優(yōu)選濃度范圍為80至190、80至180、80至170、80至160、80至150、80至140、80 至130、80至120、80至110、80至100、80至90、90至200、90至190、90至180、90至170、90至160、 90至150、90至140、90至130、90至120、90至110、90至100、100至200、100至190、100至180、 100至170、100至160、100至150、100至140、100至130、100至120、100至110、110至200、110至 190、110至180、110至170、110至160、110至150、110至140、110至130、110至120、120至200、 120至190、120至180、120至170、120至160、120至150、120至140、120至130、130至200、130至 190、130至180、130至170、130至160、130至150、130至140、140至200、140至190、140至180、 140至170、140至160、140至150、150至200、150至190、150至180、150至170、150至160、160至 200、160至190、160至180、160至170、170至200、170至190、170至180、180至190、190至200。 更進一步優(yōu)選的L-精氨酸濃度為100至180mM。特別優(yōu)選為約138mM或約138.0mM。
[0033]本發(fā)明優(yōu)選了吐溫-80作為藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑的表面活性 劑，其濃度范圍為〇. 〇 1 %至〇. 5 %。優(yōu)選的吐溫-80的濃度范圍為約0.01 %至0.2 %，優(yōu)選的 濃度范圍是與GLP-1R抗體融合蛋白和精氨酸組合確定的，以便可溶聚集物和不可溶顆粒的 形成最小化。進一步優(yōu)選的吐溫-80的濃度范圍為約0.01 %至0.2 %、0.01 %至0.15%、 0.01%至0.1%、0.01%至0.05%、0.01%至0.025%、0.025%至0.2%、0.025%至0.15%、 0.025%至0.1%、0.025%至0.075%、0.025%至0.05%、0.05%至0.2%、0.05%至0.15%、 0.05%至0.1%、0.05%至0.075%、0.075%至0.2%、0.075%至0.15%、0.075%至0.1%、 0.1 %至0.2 %、0.1 %至0.15 %、0.15 %至0.2 %。更進一步優(yōu)選的吐溫-80濃度范圍為約 0.05%至約0.15%。特別優(yōu)選的吐溫-80濃度為約0.1 %。
[0034]特別優(yōu)選的藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑包含GLP-1R抗體融合蛋白，濃 度范圍為約5至約20mg/mL、檸檬酸鹽緩沖液:濃度為約20mM、吐溫-80:濃度為約0.1%、L-精 氨酸:濃度為約138mM，并且pH為約6.5。另一個特別優(yōu)選的藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶 液制劑包含GLP-1R抗體融合蛋白，濃度范圍為約20至約40mg/mL、檸檬酸鹽緩沖液:濃度為 約20mM、吐溫-80:濃度為約0.1 %、L-精氨酸:濃度為約138mM，并且pH為約6.5。另一個特別 優(yōu)選的穩(wěn)定溶液制劑包含GLP-1R抗體融合蛋白，濃度范圍為約5至約20mg/mL、檸檬酸鹽緩 沖液:濃度范圍為約5至20mM，吐溫-80:濃度范圍為約0.05%至0.15%、L-精氨酸:濃度范圍 為約100至180mM，并且pH范圍為約6.0至7。另一個特別優(yōu)選的穩(wěn)定溶液制劑包含GLP-1R抗 體融合蛋白，濃度范圍為約20至約40mg/mL、檸檬酸鹽緩沖液:濃度范圍為約5至20mM，吐溫-80:濃度范圍為約0.05%至0.15%、L-精氨酸:濃度范圍為約100至180mM，并且pH范圍為約 6.0 至 7〇
[0035]穩(wěn)定溶液制劑的施用可以通過具備了通常技術的醫(yī)師所知的任何有效途徑。外用 非腸道施用是其中一種方法。非腸道施用在醫(yī)學文獻中通常被理解為通過滅菌注射器或某 些其它機械設備例如輸注栗將劑型注射至體內。外用非腸道途徑可以包括靜脈內、肌內、皮 下和腹膜內途徑施用。皮下施用是優(yōu)選的途徑。
[0036] 本發(fā)明所述的穩(wěn)定溶液制劑可以被用于治療患有非胰島素依賴性糖尿病或者處 于發(fā)展成非胰島素依賴性糖尿病危險中的個體、胰島素依賴性糖尿病或肥胖癥的個體。在 上下文描述的穩(wěn)定溶液制劑中GLP-1R抗體融合蛋白的有效量是當施用于需要GLP-1R刺激 的個體時引起預期的治療和/或預防效果而不引起不希望的副作用的量。
[0037] 優(yōu)選的GLP-1R抗體融合蛋白每兩周施用一次或者每周施用一次。取決于治療的疾 病，其可能需要更頻繁施用GLP-1R抗體融合蛋白，例如每周施用二至三次。
[0038] 本發(fā)明將通過參考以下實施例以非限制性實施例的方式進行描述。
[0039]檢測方法的描述
[0040]報告基因實驗檢測GLP-1R抗體融合蛋白在體外激活GLP-1R的功能。
[0041 ] 以每孔20000個接種共表達hGLP-lR-CRE-Luciferase的CH0-DHFR-細胞至96孔細 胞培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)過夜。第二天除去培養(yǎng)基上清，用無血清培養(yǎng)基清洗細胞表面兩次，吸 去殘液，再加入l〇〇yl用無血清培養(yǎng)基稀釋GLP-1R抗體融合蛋白樣品和對照，37°C孵育4小 時。孵育結束后，加入l〇〇yl Promega的Bright Glo化學發(fā)光底物，最后將細胞裂解物轉移 至白色96孔板，在Molecular Devices的SpectraMax L酶標儀上讀取相對焚光強度。用 GraphPad處理數(shù)據(jù)得到對數(shù)濃度與應答強度的劑量-響應曲線和EC50值。
[0042]體積排阻高效液相色譜法(SEC-HPLC)檢測GLP-1R抗體融合蛋白的純度。
[0043] SEC-HPLC用于檢測GLP-1R抗體融合蛋白的聚合物（可溶聚集物）的形成和相應的 單體損失。使用安捷倫1100系列HPLC，在25 °C的柱溫下，用含有200mM磷酸鹽，pH6.8的流動 相沖洗TSK-G3000SWxl高效液相體積排阻層析柱，直至UV吸收曲線維持在基線。進樣50ul濃 度為1至3mg/mL的藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑的稀釋液（用流動相對原樣進行 稀釋）。上樣完成后，繼續(xù)在流動相流速〇.5mL/min下運行，記錄UV280nm的吸收曲線。完成方 法后對主峰(單體）、二聚和多聚體在UV280nm下的吸收峰進行積分，計算出主峰所占總面積 的比例，此即為樣品的純度。
[0044]實例一 :pH對GLP-1R抗體融合蛋白穩(wěn)定性的作用：
[0045] pH可以影響GLP-1R抗體融合蛋白的溶解度和穩(wěn)定性，是制劑處方中最為關鍵的一 個參數(shù)。我們通過實例一評估了pH值對GLP-1R抗體融合蛋白穩(wěn)定性的影響，通過可溶聚合 物(二聚體和多聚體)形成的多寡作為標準，選擇了測定在45°C的高溫下1周和3周后各樣品 中可溶聚合物生成的比例(聚合物％)來比較各pH值下GLP-1R抗體融合蛋白的穩(wěn)定性。
[0046] 根據(jù)表1制備藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑：
[0047] 表1不同pH條件的GLP-1R抗體融合蛋白制劑
[0049] 藥用GLP-1R融合蛋白質的穩(wěn)定溶液制劑是通過0.22mi聚偏1，1二氟乙烯(PVDF)膜 滅菌過濾的。將溶液在45°C下儲存在2mL硼硅玻璃材質的西林瓶中直至分析或者最多3周。 各樣品中的可溶聚合物比例由SEC-HPLC來測定，表2結果顯示特別優(yōu)選的pH值6.5條件下， 制劑的可溶性聚合體形成的比例為最低、制劑的穩(wěn)定性最佳，且顯示了隨著pH的降低，穩(wěn)定 性有增加的趨勢。
[0050]表2不同pH條件下GLP-1R抗體融合蛋白制劑的可溶性聚合體形成的比例
[0052]實例二:優(yōu)選制劑處方的穩(wěn)健性研究
[0053 ]我們對優(yōu)選制劑處方在GLP-1R抗體融合蛋白為1 Omg/mL的濃度下進行了穩(wěn)健性研 究，以考察處方中三個最重要的制劑成分或者因素(L-精氨酸，pH值和吐溫-80)在實際生產 過程中的偏差（± 15% )是否會對藥物質量和穩(wěn)定性產生顯著影響，并基于處方研究的一般 規(guī)律及GLP-1R抗體融合蛋白的特性，選擇了單體純度（即主峰所占百分比）的變化作為評判 標準。
[0054]根據(jù)表3制備GLP-1R抗體融合蛋白制劑用于DOE實驗：
[0055]表3 D0E實驗GLP-1R抗體融合蛋白制劑樣品
[0058]制備制劑處方并且通過0.22wii聚偏1，1二氟乙烯(PVDF)膜滅菌過濾。將制劑在40 °(：下貯存在2mL玻璃小瓶中直至分析或至多1個月。各處方的純度值由SEC-HPLC來測定，表4 結果顯示：在PH6至7，L-精氨酸110至166mM和吐溫-80濃度0.05%至0.15%的范圍內，各制 劑處方在純度上的表現(xiàn)相當，沒有出現(xiàn)顯著性差異，表明本優(yōu)選處方的穩(wěn)健性良好，生產中 若出現(xiàn)偏差對實際制劑的穩(wěn)定性造成的影響不具有顯著性。
[0059]表4 D0E實驗各GLP-1R抗體融合蛋白制劑樣品的純度檢測結果
[0061 ]實例三:GLP_1R抗體融合蛋白濃度對制劑處方穩(wěn)定性的影響
[0062] 我們比較了優(yōu)選的制劑處方在兩個不同的GLP-1R抗體融合蛋白濃度下的表現(xiàn)，考 察優(yōu)選制劑處方是否可以對更高濃度的GLP-1R抗體融合蛋白提供可接受的穩(wěn)定性，以利于 更高劑量GLP-1R抗體融合蛋白在實際中的施用。我們選擇了 10和20mg/mL的GLP-1R抗體融 合蛋白進行了對比。
[0063] 根據(jù)表5制備GLP-1R抗體融合蛋白制劑用于實驗：
[0064] 表5不同蛋白濃度的GLP-1R抗體融合蛋白制劑
[0066]制備制劑處方并且通過0.22wii聚偏1，1二氟乙烯(PVDF)膜滅菌過濾。將制劑在37 °C下貯存在2mL玻璃小瓶中直至分析或最多1個月。各處方的純度值由SEC-HPLC來測定，生 物學活性由報告基因的方法來檢測，表6結果顯示:該優(yōu)選制劑處方能夠為20mg/mL濃度的 GLP-1R抗體融合蛋白提供高穩(wěn)定性，其純度在37 °C下的變化與10mg/mL下表現(xiàn)類似，僅發(fā)生 了非顯著性的改變，同時兩者在生物學活性上沒有體現(xiàn)出顯著性差異。
[0067]表6不同蛋白濃度下的GLP-1R抗體融合蛋白制劑的純度和生物學活性的檢測結果
[0069] 實例四：優(yōu)選制劑處方的震動穩(wěn)定性研究
[0070] 我們對優(yōu)選的制劑處方進行了震動條件下的穩(wěn)定性研究，以考察優(yōu)選制劑處方能 否為GLP-1R抗體融合蛋白在震動的環(huán)境下提供穩(wěn)定性，對樣品運輸和日常攜帶對其造成的 影響做評估。
[0071 ]根據(jù)表7制備GLP-1R抗體融合蛋白制劑用于實驗：
[0072]表7用于震動穩(wěn)定性研究的GLP-1R抗體融合蛋白制劑
[0074]制備制劑處方并且通過0.22M1聚偏1，1二氟乙烯(PVDF)膜滅菌過濾。將制劑在37 °〇下|￡存在2mL玻璃小瓶中，置于搖床上以70rpm的速度震蕩直至分析或最多15天。各處方 的純度值由SEC-HPLC來測定，生物學活性由報告基因的方法來檢測，表8結果顯示:在這樣 的震動條件下，GLP-1R抗體融合蛋白的穩(wěn)定性和生物學活性均保持穩(wěn)定。
[0075]表8震動穩(wěn)定性研究的GLP-1R抗體融合蛋白制劑樣品的純度和生物學活性的檢測 結果
[0077] 實例五:優(yōu)選制劑處方的加速穩(wěn)定性研究
[0078] 我們對優(yōu)選的制劑處方進行了加速穩(wěn)定性研究，以更為快速地考察在優(yōu)選制劑處 方下GLP-1R抗體融合蛋白的穩(wěn)定性隨著時間變化的趨勢。
[0079] 根據(jù)表9制備GLP-1R抗體融合蛋白制劑用于實驗：
[0080] 表9用于加速穩(wěn)定性研究的GLP-1R抗體融合蛋白制劑
[0082]制備制劑處方并且通過0.22wii聚偏1，1二氟乙烯(PVDF)膜滅菌過濾。將制劑在25 °C下貯存在2mL玻璃小瓶中直至分析或最多6個月。各處方的純度值由SEC-HPLC來測定，生 物學活性由報告基因的方法來檢測，表10結果顯示:GLP-1R抗體融合蛋白制劑可以承受在 25°C的儲存溫度下至少6個月的時間未發(fā)生在純度和生物學活性上的顯著性變化，其穩(wěn)定 性優(yōu)越。
[0083]表10加速穩(wěn)定性研究GLP-1R抗體融合蛋白制劑樣品的純度和生物學活性的檢測 結果
[0086] N/A =未測試。
[0087] 以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的 限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權項】
1. 一種藥用GLP-1R抗體融合蛋白的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于，包括治療有效劑量的 GLP-1R抗體融合蛋白、氨基酸、表面活性劑及緩沖體系，所述氨基酸的終濃度為l-500mM，表 面活性劑的終濃度為〇. 01-0.5%，所述穩(wěn)定溶液制劑的pH值為5.0至8.0。2. 根據(jù)權利要求1所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于：所述氨基酸的終濃度為80-200mM，表面活性劑的終濃度為0.01 %-0.2%，所述緩沖體系為檸檬酸鹽緩沖液，所述穩(wěn)定 溶液制劑的pH值為5.5至7.0。3. 根據(jù)權利要求2所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于:所述檸檬酸鹽緩沖液的濃度為5-30mM〇4. 根據(jù)權利要求2所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于:所述氨基酸為L-精氨酸，L-精氨 酸的終濃度為100-180mM，所述表面活性劑為吐溫-80，吐溫-80的終濃度為0.05%-0.15%。5. 根據(jù)權利要求1所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于:所述治療有效劑量的GLP-1R抗體 融合蛋白的終濃度為0. lmg/mL-lOOmg/mL。6. 根據(jù)權利要求5所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于:所述治療有效劑量的GLP-1R抗體 融合蛋白的終濃度為5mg/mL-40mg/mL。7. 根據(jù)權利要求1-6任意一項所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于:所述GLP-1R抗體融合 蛋白的輕鏈可變結構域的氨基酸序列選自SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6其中之一，重鏈可變結構域的氨基酸序列選自SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9其中之一。8. 根據(jù)權利要求7所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于:所述GLP-1R抗體融合蛋白的輕鏈 恒定結構域的氨基酸序列為SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 11，重鏈恒定結構域的氨基酸序列 為SEQ ID N0:12。9. 根據(jù)權利要求1所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于:其應用于治療糖尿病或肥胖癥。10. 根據(jù)權利要求1所述的穩(wěn)定溶液制劑，其特征在于：其應用于治療腸易激綜合征以 及通過降低血漿葡萄糖、抑制胃和/或腸運動、抑制胃和/或腸排空、或抑制食物攝入而受益 的其它疾病。
【文檔編號】A61P3/10GK105854000SQ201610077253
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年2月3日
【發(fā)明人】張 成, 章華, 范克索, 郭勇, 景書謙
【申請人】杭州鴻運華寧生物醫(yī)藥工程有限公司