調(diào)控家蠶質(zhì)型多角體病毒編碼的NS5基因的miRNA及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及到一種調(diào)控家蠶質(zhì)型多角體病毒編碼的NS5基因 的microRNA及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 家香質(zhì)型多角體病毒(Bombyxmoricytoplasmicpolyhedrosisvirus，BmCPV)屬 呼腸孤病毒科(Reoviridae)，是危害養(yǎng)蠶業(yè)的主要病原物之一，給生產(chǎn)上造成了巨大經(jīng)濟(jì) 損失。BmCPV病毒粒子直徑約為50-65nm，形狀呈正二十面體，具有獨(dú)特的單層衣殼結(jié)構(gòu)?；?因組由10節(jié)段雙鏈RNA分子組成，其中Η株第9片斷（661^&1^^?061200)和1株第9片斷 (GenBank:AF061199)均為1186bp，編碼36kD的NS5，該蛋白具有dsRNA結(jié)合活性。目前把質(zhì)型 多角體病毒按照電泳迀移率的不同分成14個(gè)電泳型，BmCPV屬I(mǎi)型。其宿主域主要是鱗翅目， 雙翅目，膜翅目和鞘翅目等昆蟲(chóng)。BmCPV專(zhuān)一性感染家蠶中腸上皮細(xì)胞，感染了BmCPV的家蠶 中腸上皮細(xì)胞發(fā)生顯著病變。感染家蠶表現(xiàn)為發(fā)育不良、體形瘦弱、行動(dòng)呆滯。隨著病程的 推進(jìn)，在中腸后部可看到白色的褶皺，這是家蠶質(zhì)型多角體病的典型病癥之一。
[0003] MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)由18-25個(gè)核苷酸組成的小的非編碼RNA^iRNA廣泛存在 于動(dòng)物、植物和病毒等生物中，在物種進(jìn)化中高度保守，并具有時(shí)空表達(dá)特異性，參與包括 生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡、腫瘤、抗病毒等一系列重要的生命過(guò)程。研究表明，宿主編碼的miRNA 在受到病毒感染后，其表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化。Fullaondo等預(yù)測(cè)在果蠅中，有超過(guò)70個(gè) miRNAs參與果蠅免疫系統(tǒng)相關(guān)的Toll信號(hào)通路、Imd信號(hào)通路以及JNK和JAK/STAT信號(hào)通路 的調(diào)控，推測(cè)由miRNA介導(dǎo)的RNA干擾途徑可能是果蠅先天的廣譜型免疫機(jī)制。miR-8是經(jīng)實(shí) 驗(yàn)室驗(yàn)證的和昆蟲(chóng)免疫應(yīng)答相關(guān)的miRNA。它可負(fù)調(diào)控果繩中編碼Drosomycin以及 Diptericin等抗菌肽(AMP)基因的表達(dá)，使得AMP在非感染情況下維持較低水平從而確保免 疫反應(yīng)維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)。果蠅中若缺失miR-8，體內(nèi)的AMP將顯著升高。miR-8對(duì)AMP的負(fù)調(diào)控也在 小菜蛾(Piute11axyloshe11a)的幼蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。該研究還發(fā)現(xiàn)，miR-8可正向調(diào)控 36印;[11-27的表達(dá)，56印;[11-27可抑制1'011通路的激活。當(dāng)感染病原菌時(shí)，由于11111?-8表達(dá)下 調(diào)從而抑制Serpin-27表達(dá)，進(jìn)而激活Toll通路。研究表明，宿主基因組編碼的miRNA既可調(diào) 控宿主的基因也可作用于病毒的基因，從而調(diào)控病毒的增殖。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，AcMNPV-miR-1可下調(diào)0DV-E25基因的表達(dá)，導(dǎo)致芽殖類(lèi)病毒粒子復(fù)制減少，加快有包涵體病毒粒子的成 形。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 解決的技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明提供一種可調(diào)控家蠶質(zhì)型多角體病毒編碼的NS5基因表 達(dá)的microRNA分子及其應(yīng)用。
[0005] 技術(shù)方案：調(diào)控家蠶質(zhì)型多角體病毒編碼的NS5基因的miRNA，命名為bmo-miR-274-3p，其特征在于核苷酸序列如SEQIDN0.1所示：
[0006] 5，-GUUUGUGACCGUCACUAACGGGCAGU-3，
[0007]所述miRNA在抑制家蠶質(zhì)型多角體病毒增殖中的應(yīng)用。
[0008]所述miRNA在抑制家蠶質(zhì)型多角體病毒編碼的NS5基因中的應(yīng)用。
[0009] 抑制家蠶質(zhì)型多角體病毒增殖的藥物，有效成分為權(quán)利要求1所述的miRNA。
[0010] 檢測(cè)所述miRNA表達(dá)水平的莖環(huán)熒光定量PCR試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴(kuò)增系統(tǒng) 和引物系統(tǒng)；所述反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由gDNAEraser、5XgDNAEraserBuffer、PrimeScriptRT EnzymeMixI、5XPrimeScriptBuffer2、莖環(huán)引物、RNase-freeddH2〇組成；所述擴(kuò)增系 統(tǒng)由2XSYBRPremixExTaq、bm〇-miR-274-3p正向引物、bm〇-miR-274-3p反向引物、ddH20 組成；所述引物系統(tǒng)由莖環(huán)引物、bm〇-miR-274-3p正向引物、bm〇-miR-274-3p反向引物、 snU6內(nèi)參正向引物，snU6內(nèi)參反向引物組成，引物濃度均為ΙΟμΜ;序列如下：
[0021 ]有益效果:本發(fā)明通過(guò)莖環(huán)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)得到在家蠶感染BmCPV中腸組織 中表達(dá)下調(diào)的bm〇-miR-274-3p。發(fā)現(xiàn)BmCPV基因組編碼的NS5基因?yàn)閎m〇-miR-274-3p的靶基 因。將人工合成的bm〇-miR-274-3p模擬物注入家蠶體內(nèi)，可顯著抑制BmCPV的增殖。本發(fā)明 還公開(kāi)了用于檢測(cè)所述miRNA分子的熒光定量試劑盒，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為莖環(huán)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)家蠶中腸組織中bm〇-miR-274-3p的相對(duì)表達(dá)量 示意圖；
[0023] 圖2為bm〇-miR-274-3p與NS5基因3'UTR的靶點(diǎn)結(jié)合示意圖；
[0024]圖3為雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)bm〇-miR-274-3p對(duì)NS5基因抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié) 果圖。構(gòu)建pmirGL0-AF061200及pmirGL0-AF061200-mut重組質(zhì)粒。合成bm〇-miR-274-3p 1^1^(3(274)及陰性對(duì)照物（叱）。在2931'細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染口111化61^0-厶卩061200 4111化61^0-AF061200+274、pmirGL0-AF061200+NC、pmirGL0-AF061200-mut、pmirGL0-AF061200-mut+ 274、pmirGL0-AF061200-mut+NC。轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞。每個(gè)樣品按照海腎熒光素酶活性進(jìn) 行均一化處理，比較螢火蟲(chóng)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。（數(shù)值表示為Mean土STDVE。**，P <0.01)；
[0025] 圖4為實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)NS5的相對(duì)表達(dá)量圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法或按照制造廠商 所建議的條件;所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。
[0027]實(shí)施例1
[0028] 應(yīng)用莖環(huán)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)bm〇-miR-274-3p在BmCPV感染家蠶中腸組織和 正常中腸組織中的表達(dá)水平：
[0029]步驟一，采用Trizol法提取待檢樣本的RNA。具體流程如下：
[0030] (1)將BmCPV感染家蠶中腸組織和正常中腸組織分別放入加有液氮的研缽中，用研 件迅速將樣品砸碎并磨成粉末，分裝到RNase-free的1.5mLEppendorf管中，每0.lg組織加lmLTrizol，樣品體積應(yīng)小于Trizol體積的10%;
[0031] (2)振蕩混勻，室溫溫育約1Omin，12000g，4°C離心1Omin;
[0032] (3)將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的離心管中，每lmL加入0.2mL氯仿（1/5體積），劇烈搖 動(dòng)15s，室溫放置5min，12000g，4°C離心15min;混合物分成下層的紅色苯酸-氯仿相，中間的 蛋白質(zhì)沉淀和上層無(wú)色水相。RNA即位于上清液；
[0033] (4)將上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈離心管中，等體積加入預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻， 室溫靜置l〇min，12000g，4°C離心10min，留下RNA沉淀，棄上清；
[0034] (5)加入 75% 乙醇，lmLTrizol加lmL75% 乙醇，渦旋混勻，7500g，4°C離心 5min， 棄上清；
[0035] (6)自然控干RNA沉淀約5-10min，用30-40yL的RNase-free水室溫溶解RNA;
[0036] (7)取lyL稀釋100倍后，5yL用于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，剩余用于分光光度 計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度，一80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0037]步驟二，樣品RNA的反轉(zhuǎn)錄
[0038]以步驟一中提取的RNA為模板，應(yīng)用試劑盒中提供的反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。
[0039] 首先去除RNA中基因組DNA污染，反應(yīng)體系共10yL，其中，5XgDNAEraserBuffer 2yL，gDNAEraserlyL，totalRNA0.5-1 .Oyg，補(bǔ)加RNase-free水至 10yL。反應(yīng)條件為：42 °C2min，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液置于4°C保存，用于下一步的反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系共20yL， 其中，5XPrimerscriptBuffer4yL，PrimerscriptRTEnzymeMixIlyL，莖環(huán)引物（10μ M)lyL，上述反應(yīng)液10yL，RNase-free水4yL。反應(yīng)條件為:42°C15min，85°C5s。反應(yīng)結(jié)束后的 cDNA置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0040] 步驟三，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)
[00411將步驟二中的cDNA用ddH20稀釋8倍后用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中的模板。應(yīng)用 試劑盒中提供的擴(kuò)增系統(tǒng)及引物系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)作3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體 系為：2XSYBRPremixExTaq10yL，bm0-miR-274_3p正向引物（10ymol/L)0.4yL，bmo_ miR-274-3p反向引物（ΙΟμπιο1/L)0.4yL，模板lyL，ddH20 8.2yL，終體積20yL。反應(yīng)條件為： 95°C預(yù)變性lmin; 95°C15s，60°Clmin，40個(gè)循環(huán)。以家蠶snU6基因?yàn)閮?nèi)參，用對(duì)定量 法分析bm0-miR-274-3p在感染BmCPV的家蠶中腸組織