一種用于呼腸孤滅活疫苗的佐劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及獸用疫苗技術領域，具體涉及一種用于呼腸孤滅活疫苗的佐劑及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] 呼腸孤病毒具是具有分節(jié)段的雙鏈RNA基因組的一類病毒，該病毒分布極廣，易 在禽類間爆發(fā)流行，致死率較高，同時還可以突破宿主屏障，感染包括人類在內(nèi)的哺乳動 物，因此該疾病對人類健康和經(jīng)濟發(fā)展具有嚴重危害。呼腸孤宿主廣泛，因此防控工作具有 較大難度，除了保證適當?shù)男l(wèi)生條件和隔離措施之外，接種疫苗是控制呼腸孤流行的關鍵 性措施?，F(xiàn)有技術中，盡管呼腸孤疫苗早已形成產(chǎn)品，但仍存在著諸如保護效力不足、需多 次免疫才能起效、成本較高等技術缺陷，從而難以滿足使用需求。
[0003] 為了提升疫苗的免疫效果，現(xiàn)有技術的研究者從多方面進行了努力，例如開發(fā)免 疫效果更好的抗原物質、在接種疫苗的同時飼喂免疫促進劑等。佐劑（adjuvant)是與抗原 混合后注射于生物體內(nèi)、能非特異性改變或增強機體對該抗原的特異性免疫應答的物質， 因此開發(fā)適宜的疫苗佐劑將有助于提升疫苗質量，增強免疫效果。
[0004] 現(xiàn)有技術中，免疫佐劑多選用白油佐劑、氫氧化鋁佐劑、類脂佐劑和蜂膠佐劑等， 其中白油佐劑被認為有助于強化疫苗免疫效力，目前應用較為廣泛。白油佐劑常用劑型包 括水包油（0/W)、水包油包水（W/0/W)、油包水（W/0)三種，其中油包水（W/0)型應用最為普 遍，但也存在一定的技術缺陷，例如其粘度較高、注射困難；同時由于疫苗中白油含量相對 較高，常常導致嚴重的接種副反應，形成無菌性化膿損害和接種部位周圍的肉芽腫，可產(chǎn)生 外部可見的浮腫、腫脹、硬結和壞死；此外有研究認為該劑型的佐劑接種后可能在接種部位 形成殘留，從而帶來安全隱患。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種用于呼腸孤滅活疫苗的佐劑及其 制備方法，以解決現(xiàn)有技術的佐劑對呼腸孤滅活疫苗免疫效力促進作用較低的技術問題。
[0006] 本發(fā)明要解決的另一技術問題是現(xiàn)有技術的油包水型佐劑易使得疫苗注射后產(chǎn) 生副作用。
[0007] 本發(fā)明要解決的再一技術問題是現(xiàn)有技術的佐劑不穩(wěn)定、易隨時間推移發(fā)生性質 改變。
[0008] 為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0009] -種用于呼腸孤滅活疫苗的佐劑，該佐劑分為油相和ISC0M基質兩部分，其中所 述油相包括以下成分：注射級白油80~85% (w/w)，span806~8% (w/w)，吐溫806~8% (w/w);所述ISC0M基質中包括以下成分：QuilA0. 2~5mg/ml，膽固醇0. 2~5mg/ml，左旋 味挫3~8mg/ml。
[0010] 優(yōu)選的，所述QuilA的含量是1~5mg/ml。
[0011] 優(yōu)選的，所述膽固醇的含量是1~5mg/ml。
[0012] 本發(fā)明同時還提供了上述佐劑的制備方法，該方法包括以下步驟：
[0013] 1)取配方量的QuilA、左旋咪唑、膽固醇溶于PBS緩沖液中得到ISC0M基質；
[0014] 2)取配方量的注射級白油，滅菌后向其中加入配方量的span80和吐溫80,乳化后 即得到油相。
[0015] 在此方法基礎上優(yōu)選的，步驟2)是：取配方量的注射級白油，滅菌后向其中加入 配方量的span80,以60~100r/min的轉速攪拌4~6min，而后在攪拌狀態(tài)下向其中加入 吐溫80,以60~100r/min的轉速攪拌4~6min，即得到油相；更優(yōu)的，上述兩次攪拌轉速 均為80r/min、攬摔時間均為5min。
[0016] 本發(fā)明的佐劑在疫苗的制備過程中可以是通過以下方法使用的：將疫苗抗原溶液 與本發(fā)明佐劑的ISCOM基質混合作為水相，將該水相與本發(fā)明佐劑的油相按（1:1)~（1:3) (v/v)比例混合，即得到疫苗。
[0017] 在以上技術方案中，ISCOM(immunostimulatingcomplex)基質是一種含有抗原成 分的免疫刺激復合物，稱為免疫刺激復合物基質，由QuilA(皂苷活性成分）、膽固醇等制備 得到，其特點在于能有效地活化輔助型T細胞和細胞毒性T細胞，促進細胞免疫應答，尤其 是Thl型細胞免疫應答，其次，ISC0M基質通常人們將其應用到活疫苗中，本發(fā)明創(chuàng)造性地 將其應用到滅活疫苗中，實驗證實，能更有效地激活免疫，顯著提高了全病毒的抗原呈遞及 疫苗的持續(xù)性。左旋咪唑是一種廣譜驅蟲藥，同時研究發(fā)現(xiàn)其具有明顯的免疫調節(jié)作用。
[0018] 本發(fā)明用于呼腸孤滅活疫苗的佐劑創(chuàng)新性的引入了ISC0M基質成分，提升了免疫 促進效果，可刺激機體產(chǎn)生較強的細胞免疫和體液免疫，具有更好的保護作用，延長疫苗免 疫保護期。當本發(fā)明佐劑用于呼腸孤滅活疫苗制備時，劑型為油包水（W/0)型，由于成分配 方的合理化設計使得利用該佐劑制備的呼腸孤滅活疫苗具有較好的穩(wěn)定性，在2-8°C條件 下保存18個月仍保持性狀穩(wěn)定。此外，實際應用發(fā)現(xiàn)，以該佐劑制備的呼腸孤滅活疫苗接 種雞后無局部或全身性不良反應，安全性可靠，而且較現(xiàn)有技術佐劑制備的呼腸孤滅活疫 苗具有更好的免疫效果。本發(fā)明以創(chuàng)新性的技術改進實現(xiàn)了突出的技術效果，同時成本較 低，易于實現(xiàn)，因此具有突出的推廣前景。
【具體實施方式】
[0019] 以下將對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在 以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所 用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。
[0020] 實施例1
[0021] (1)佐劑油相的制備
[0022] 油相是向按照百分比（白油：span80 = 17:1)組成的混合液中加入硬脂酸鋁，其 加入量為每l〇〇ml混合液加入2g硬脂酸鋁。120°C、20min高溫蒸汽滅菌，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0023] (2)佐劑ISC0M基質的制備
[0024] 分別稱取QuilA100mg、膽固醇100mg、左旋咪唑500mg，用lOmlPBS溶解混勻得 10倍濃度的ISC0M基質。
[0025] (3)呼腸孤滅活病毒液的制備
[0026] 按照《獸用生物制品質量標準匯編》（2012)，相關要求制備滅活的呼腸孤病毒抗原 水溶液，滅活前每〇. 2ml病毒液病毒含量應3 107'°LD5。。
[0027] (4)呼腸孤疫苗的制備
[0028] 在無菌操作情況下，將上述⑵中制備的ISC0M3ml與⑶中制備的呼腸孤滅活病 毒液15g放入50ml的燒杯中，混勻；另?。?)中制備的油相加熱至30°C，取13g也放入該 燒杯中，同時加入磁力轉子置磁力攪拌器（含加熱功能）上進行攪拌乳化，轉速為2000轉 /min，溫度為30°C，攪拌30min，即成，命名為呼腸孤疫苗A。
[0029] 同法不加ISC0M基質制作白油對照疫苗