一種西江病毒SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR檢測(cè)方法，設(shè)及檢測(cè)騙幅 源呼長(zhǎng)孤西江病毒的SYBRGreenI巧光定量PCR通用檢測(cè)方法，屬于分子生物工程技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 西江病毒是2006年從騙幅肺臟中分離到的一株能夠產(chǎn)生細(xì)胞合胞體的病毒，經(jīng) 初步形態(tài)學(xué)鑒定、核酸電泳圖鑒定、部分節(jié)段核巧酸序列鑒定該病毒屬于正呼腸孤病毒納 爾遜海灣病毒屬的一個(gè)新的成員，根據(jù)納爾遜海灣病毒的命名慣例，將其命名為西江病毒 (分離自我國(guó)廣東省西江流域）狂RV)，運(yùn)是我國(guó)目前為止第一次發(fā)現(xiàn)的騙幅呼腸孤病毒。
[0003] 呼腸孤病毒科是一種重要的與呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)疾病密切相關(guān)的病毒。據(jù)國(guó) 際病毒分類委員會(huì)（ICTV)第八次報(bào)告，具有雙鏈RNA(dsRNA)基因組結(jié)構(gòu)的呼腸孤病毒 科巧eoviridae)包含了 12個(gè)屬，所有能引起細(xì)胞融合的無(wú)囊膜病毒都存在于呼腸孤病毒 科。呼腸孤病毒科成員眾多，就正呼腸孤病毒屬而言，根據(jù)分離的宿主不同可分為5個(gè)種： 哺乳動(dòng)物呼腸孤病毒（MRV)、禽呼腸孤病毒（ARV)、納爾遜海灣病毒（NBV)、拂拂呼腸孤病毒 度RV)、爬蟲類呼腸孤病毒（RRV)中，除MRV外其它種的正呼腸孤病毒都可W產(chǎn)生合胞體。
[0004] 呼腸孤病毒具有廣泛的宿主范圍，騙幅也是自然宿主之一。從目前的研究發(fā)現(xiàn)看， 騙幅源的呼腸孤病毒處于一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，與其它動(dòng)物源的呼腸孤病毒不同。第一株 分離到的騙幅源呼腸孤病毒是1968年從澳大利亞納爾遜海灣的飛狐屯、臟血中分離出的， 當(dāng)時(shí)由于技術(shù)條件的限制，僅從其核酸帶型上發(fā)現(xiàn)其具有獨(dú)特之處，根據(jù)其來(lái)源地的名稱 將其命名為化IsonBayOrthoreovirus(NBV),直到2006年，在對(duì)采自馬來(lái)西亞的騙幅進(jìn)行 亨德拉尼帕病毒進(jìn)行回顧性調(diào)查時(shí)意外的從一只騙幅的尿液樣品中分離出第二株騙幅源 的呼腸孤病毒，同樣依據(jù)其樣品來(lái)源地的名稱將其命名為化Iauvirus任UlV) ,2007年王凌 發(fā)等報(bào)道了一株分離自馬六甲的騙幅呼腸孤病毒將其命名為Melakavirus(MeLV),隨后又 在香港、Kampar等地發(fā)現(xiàn)兩株騙幅呼腸孤病毒，至此屬于NBV種的呼腸孤病毒共發(fā)現(xiàn)5個(gè) 成員，運(yùn)些成員有著W下的共同特點(diǎn)：（1)均為騙幅來(lái)源；（2)均W分離地點(diǎn)對(duì)其命名。（3) 與人類呼吸系統(tǒng)疾病有著某種關(guān)系，能夠引起呼吸系統(tǒng)疾病的癥狀，但是其致病性高低不 明。西江病毒均符合上述特征，經(jīng)過(guò)病毒全基因序列測(cè)定，表明西江病毒是NBV種呼長(zhǎng)孤病 毒的一個(gè)新成員，與同種的其它成員在基因序列上具有區(qū)別，運(yùn)是我國(guó)同時(shí)也是世界首次 發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的NBV種的呼長(zhǎng)孤病毒。
[0005] 運(yùn)些處于獨(dú)特進(jìn)化分支的騙幅源呼腸孤病毒的發(fā)現(xiàn)引起了人們對(duì)其研究極大興 趣，人們比較關(guān)屯、的問題是運(yùn)些病毒究竟是否對(duì)人類或其它動(dòng)物有致病性？運(yùn)些病毒是與 呼吸系統(tǒng)的相關(guān)疾病有密切關(guān)系？同樣由于此類病毒發(fā)現(xiàn)的數(shù)量不多，因此相關(guān)研究報(bào)道 比較稀少，同時(shí)也不夠深入，僅限于流行病學(xué)調(diào)查和病毒的形態(tài)學(xué)鑒定，對(duì)于該病毒的生物 學(xué)特性、分子信息學(xué)、致病性研究幾乎為空白。目前的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)：屬于騙幅源的呼腸孤 病毒一一納爾遜海灣病毒（NBV)能夠引起人高燒和急性呼吸道癥狀，MelakaVirus(MeLV) 同樣可W引起發(fā)燒、呼吸道疾病的癥狀，并且該病毒可W在人與人、人與騙幅之間傳播。血 清學(xué)調(diào)查顯示化IauVirus同樣具有感染人的能力。近年來(lái)新發(fā)的可W引起高燒、呼吸系 統(tǒng)疾病的病毒性傳染病的爆發(fā)流行，給人類健康及屯、理帶來(lái)極大的危害和恐慌。因此關(guān)注 騙幅源的呼腸孤病毒對(duì)人類或其它動(dòng)物是否具有致病性、其是否具有獨(dú)特的生物學(xué)特性對(duì) 于應(yīng)對(duì)呼吸系統(tǒng)新發(fā)傳染性病毒病具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。
[0006] 由于對(duì)dsRNA病毒序列測(cè)定存在著一定的技術(shù)困難，再加上此類病毒發(fā)現(xiàn)的種類 比較少，相關(guān)基因信息極度匿乏，導(dǎo)致目前僅有此種病毒部分基因序列，尚無(wú)全基因組序 列，因此極大的限制了對(duì)其基因定位、結(jié)構(gòu)、功能等方面的研究，而且沒有快速的檢測(cè)方法， 為是否為該病毒感染的診斷帶來(lái)很大難題。
[0007] 巧光定量PCR具有快速、敏感和高通量的特點(diǎn)，SYBRGreenI巧光定量PCR利用 SYBRGreenI能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位放出巧光的方法廣泛應(yīng)用于核酸的特異性檢 。在西江病毒的檢測(cè)方法研究領(lǐng)域中目前尚無(wú)巧光定量PCR方法，因此建立一種快速、敏 感、特異的西江病毒巧光定量PCR方法更具有重要的實(shí)踐意義。為該病毒感染的快速診斷、 開展流行病學(xué)調(diào)查具有重要的科學(xué)價(jià)值與公共衛(wèi)生學(xué)意義。
[0008] 經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)沒有西江病毒檢測(cè)技術(shù)的專利公布。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中沒有西江病毒巧光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，而提 供一種西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR檢測(cè)方法。
[0010] 本發(fā)明的方法包括：西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR檢測(cè)方法的建立、西江 病毒SYBRGreenI巧光定量PCR方法特異性檢測(cè)、西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR 方法敏感性檢測(cè)。
[0011] 具體過(guò)程如下： 陽(yáng)01引一、設(shè)計(jì)邸VSYBRGreenI巧光定量PCR引物
[0013] 依據(jù)XRVSl基因序列，通過(guò)clustalxl. 81軟件進(jìn)行序列比對(duì)，確定XRV基因特異 序列區(qū)，在該區(qū)域設(shè)計(jì)特異性針對(duì)XRV的巧光定量引物；引物序列如下：
[0014] 引物 1 :5'CTAACTCCGCTGACACGA3' ；
[0015] 引物 2 :5'CAAACACTATTGACGCACAT3' ；
[0016] 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建
[0017] 依據(jù)步驟一設(shè)計(jì)的引物，WXRV全長(zhǎng)Sl基因CDNA為模，進(jìn)行巧光定量擴(kuò)增，繪制 巧光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線； 陽(yáng)0化]S、實(shí)驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)
[0019] 若空白對(duì)照無(wú)Ct值，且無(wú)規(guī)則擴(kuò)增曲線，陽(yáng)性對(duì)照Ct值應(yīng)<35. 0,擴(kuò)增曲線典型， 則實(shí)驗(yàn)成立；
[0020] 四、判定陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)
[0021] 在實(shí)驗(yàn)成立的前提下，待測(cè)樣品的Ct值^ 35.0,并且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判斷 為陽(yáng)性；待測(cè)樣品無(wú)Ct值并且無(wú)規(guī)則擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。 陽(yáng)02引本發(fā)明采用的XRVSYBRGreenI巧光定量PCR檢測(cè)方法，具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] 本發(fā)明的方法檢測(cè)的敏感性可達(dá)到100個(gè)拷貝的病毒RNA分子，對(duì)于單個(gè)樣本檢 測(cè)小于2個(gè)小時(shí)，操作簡(jiǎn)易，可W進(jìn)行高通量的樣品檢測(cè)。
[0024] (1)特異性好。本發(fā)明可W特異性的檢測(cè)XRV。似敏感性高。由于巧光定量PCR 利用擴(kuò)增產(chǎn)物的積累和巧光信號(hào)建立對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)備接受巧光信號(hào)并判定結(jié) 果。檢測(cè)敏感性比常規(guī)PCR更高。（3)操作簡(jiǎn)單、高通量、防污染。使用巧光定量PCR檢測(cè)， 不需要打開反應(yīng)管蓋進(jìn)行瓊脂糖電泳，不易污染后續(xù)待檢測(cè)樣品。操作簡(jiǎn)單，適合高通量大 規(guī)模樣品檢測(cè)。（4)節(jié)約時(shí)間。巧光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較短，不需要PCR產(chǎn)物的延伸時(shí)間， 整個(gè)實(shí)驗(yàn)可W更快速完成。
[0025] 本發(fā)明采用的XRVSYBRGreenI巧光定量PCR檢測(cè)方法利用了PCR技術(shù)的核酸 高效擴(kuò)增、SYBRGreenI巧光染料和計(jì)算機(jī)輔助巧光檢測(cè)技術(shù)敏感性的優(yōu)點(diǎn)，克服了常規(guī) PCR檢測(cè)的不足，極大的提高了檢測(cè)的敏感性、特異性和操作的便利性。同時(shí)，本發(fā)明中采用 的陽(yáng)性對(duì)照是根據(jù)西江病毒Sl基因序列體外轉(zhuǎn)錄的一段300nt的RNA分子，相對(duì)于W滅活 病毒液作為陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)，增加了安全性，體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子還可W大量制備，陽(yáng)性對(duì) 照來(lái)源穩(wěn)定、可靠，避免了滅活病毒株在每次實(shí)驗(yàn)中帶來(lái)的可能生物安全風(fēng)險(xiǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為XRVSYBRGreenI巧光定量PCR檢測(cè)方法特異性擴(kuò)增曲線；
[0027] 圖2為西江病毒SYBR Green I巧光定量PCR檢測(cè)方法敏感性擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
【具體實(shí)施方式】 [0028] 一：本實(shí)施方式的一種西江病毒SYBRGreenI巧光定量PCR檢測(cè) 方法，它是按照W下步驟進(jìn)行的：
[0029] 一、設(shè)計(jì)XRVSYBRGreenI巧光定量PCR引物
[0030] 依據(jù)XRVSl基因序列，通過(guò)clustalxl. 81軟件進(jìn)行序列比對(duì)，確定XRV基因特異 序列區(qū)，在該區(qū)域設(shè)計(jì)特異性針對(duì)XRV的巧光定量引物；引物序列如下：
[0031] XRV-F:5，CTAACTCCGCTGACACGA3,；
[0032] XRV-R:5'CAAACACTATTGACGCACAT3' ；
[0033] 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建
[0034] 依據(jù)步驟一設(shè)計(jì)的引物，WXRV全長(zhǎng)Sl基因CDNA為模板，進(jìn)行巧光定量擴(kuò)增，繪 制巧光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0035]S、實(shí)驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)
[0036] 若空白對(duì)照無(wú)Ct值，且無(wú)規(guī)則擴(kuò)增曲線，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照Ct值應(yīng)<35. 0,擴(kuò)增曲線典 型，則實(shí)驗(yàn)成立；
[0037] 四、判定陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)
[0038] 在實(shí)驗(yàn)成立的前提下，待測(cè)樣品的Ct值^ 35.0,并且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，判斷 為陽(yáng)性；待測(cè)樣品無(wú)Ct值并且無(wú)規(guī)則擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。
【具體實(shí)施方式】 [0039] 二：本實(shí)施方式與一不同的是：巧光定量PCR的反應(yīng) 體系為25y1，具體成分為：
[0040] 反應(yīng)體系成份 體積 SYBR Prcmix Ex Taq lU'] 12.5^1 XRV-F(IOyM) 1.0|il XRV-R(IOyM) l.Oyl XRV-P(SmM) I .Op! 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)