本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種由成骨細(xì)胞膜片和成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片構(gòu)建的血管化組織工程骨及其制備方法。

背景技術(shù)：

嚴(yán)重創(chuàng)傷、腫瘤切除、感染、先天性畸形等所造成的大塊骨缺損的治療是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)面臨的難題和巨大挑戰(zhàn),一直是人類幾個世紀(jì)以來不斷深入研究和探索的重要課題。目前臨床上常用的修復(fù)手段有自體骨移植、異體骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷。自體骨移植是公認(rèn)的骨組織修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)，但是患者要經(jīng)受自體組織移植手術(shù)的創(chuàng)傷，而且供區(qū)有限，因此,自體骨移植不能視為理想的大面積骨缺損的修復(fù)方法；異體骨移植存在免疫排斥反應(yīng)、疾病傳播等風(fēng)險，有時甚至危及病人生命；人工骨植入容易導(dǎo)致異物排斥反應(yīng)、感染等。因此,有必要尋找一種新的大塊骨缺損的修復(fù)手段。

在此情況下，組織工程學(xué)的興起和發(fā)展,為骨缺損的修復(fù)提供了新的可能，為彌補目前骨缺損治療方法的缺陷帶來了希望。

近年來,骨組織工程的研究取得了很大進展,應(yīng)用組織工程技術(shù)在小型哺乳動物體內(nèi)構(gòu)建骨組織，修復(fù)小尺寸的骨缺損的方法已基本成熟，但是對于大型哺乳動物大范圍或受區(qū)血供不佳的骨缺損，由于移植物早期沒有獨立的血液供應(yīng)，營養(yǎng)滲透不足，骨痂形成緩慢等原因，成骨效果仍不穩(wěn)定。有研究表明,決定和制約組織工程骨修復(fù)骨缺損療效的關(guān)鍵是其在體內(nèi)血管化的速度和程度。sahota等也認(rèn)為組織工程植入物失敗的主要原因在于血管化的遲滯。因此，如何建立有效的血液供應(yīng),在體內(nèi)構(gòu)建能及時血管化的組織工程骨,縮短骨愈合時間是目前骨組織工程研究的一個重要方向，也是制約組織工程骨大規(guī)模臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。

目前組織工程骨的血管化策略主要包括：支架的設(shè)計開發(fā)、應(yīng)用生長因子、體內(nèi)埋植、體內(nèi)動脈小室和整體培養(yǎng)系統(tǒng)等。盡管這些方法在一定程度解決了組織構(gòu)建時的血管化問題，但均存在不足。比如，在支架的制作過程中，對材料內(nèi)部的孔隙大小和相互連接進行修飾,可有利于血管網(wǎng)的長入，但存在炎癥反應(yīng)、潛在的免疫原性風(fēng)險等,而且血管化速度不理想；促血管生長因子應(yīng)用時存在調(diào)控問題，生長因子在體內(nèi)半衰期較短,大劑量應(yīng)用又有致畸可能，并且可能加速某些病理過程，如血管瘤的發(fā)生等；體內(nèi)埋植和體內(nèi)動脈小室均需二次手術(shù)，供體選擇困難，有潛在的疾病傳播風(fēng)險等，限制了臨床應(yīng)用；整體培養(yǎng)系統(tǒng)為完善的“人造器官”，但技術(shù)難度高，實現(xiàn)困難。

近年，國內(nèi)外研究人員通過血管內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的技術(shù)方法，構(gòu)建出血管化組織工程骨，即可形成骨組織又可同時血管化。但傳統(tǒng)的“細(xì)胞－支架”策略的不足之處在于：種子細(xì)胞在種植到支架材料的過程中，有30-40％的細(xì)胞不能粘附于支架而流失，細(xì)胞附著率低、利用率差；細(xì)胞之間相互作用少，難以形成體內(nèi)細(xì)胞應(yīng)有的微環(huán)境，細(xì)胞支架復(fù)合物植入體內(nèi)后，骨形成總是發(fā)生在支架的外周，影響成骨的大小和質(zhì)量。為了解決上述問題，人們研究出細(xì)胞膜片技術(shù)。它是通過體外對細(xì)胞進行高密度培養(yǎng),使細(xì)胞生長成為多層并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì),形成由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的細(xì)胞膜片。細(xì)胞膜片技術(shù)應(yīng)用于組織工程中主要有三方面優(yōu)勢:一、膜片的形成能夠減少組織構(gòu)建過程中細(xì)胞的流失和損傷,提高細(xì)胞利用率；二、細(xì)胞膜片具有一定的機械強度,能夠在無支架的情況下進行組織構(gòu)建,避免了支架材料引起的組織相容性問題,且易于操作、價格低廉；三、豐富的細(xì)胞外基質(zhì)為細(xì)胞提供適合的生長環(huán)境,并在發(fā)育過程中儲存和激活生長因子,為組織的發(fā)育提供結(jié)構(gòu)和功能幫助。所以，如能將成骨細(xì)胞膜片聯(lián)合內(nèi)皮細(xì)胞膜片，通過合適的方法構(gòu)建血管化組織工程骨，預(yù)計將較成骨細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)更具血管化和成骨優(yōu)勢。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是存在于脂肪組織中的成體干細(xì)胞。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，具有向成脂肪、成軟骨、成骨、成肌細(xì)胞和神經(jīng)源細(xì)胞等分化的多分化潛能,是一種理想的種子細(xì)胞。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比，存在來源廣泛、獲取方式簡單，培養(yǎng)要求低，體外擴增能力強，增殖時間短，對機體創(chuàng)傷小等優(yōu)點，有望成為組織工程更為理想的細(xì)胞來源。目前，脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞已廣泛應(yīng)用于組織再生與修復(fù)。雖然血管化組織工程骨的構(gòu)建已有很多的研究，但是利用脂肪來源的成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，制備具有成骨和成血管能力的雙細(xì)胞復(fù)合膜片來構(gòu)建血管化組織工程骨的策略卻還很少有人涉及。

另外，除了細(xì)胞之外，支架材料的生物相容性和生物降解性也是影響血管化的因素。支架材料必須具有良好的三維立體多孔結(jié)構(gòu),這樣血管才能爬行長入,并最終血管化,為組織工程骨內(nèi)細(xì)胞長期生存提供前提條件。

目前骨組織工程支架材料包括無機材料和有機材料兩大類。

有機材料在硬組織修復(fù)替代領(lǐng)域最早應(yīng)用于骨骼，并被廣泛用作骨修復(fù)材料，主要包括聚乳酸(pla)、聚乙酸(pga)、聚乙交酯-丙交酯共聚物(plga)、聚ε-己內(nèi)酯(pcl)、聚酸酐、聚磷腈、聚原酸酯等。有機材料中研究較多的是聚羥基酸類(主要包括pla、pga、plga)。這一類高分子聚合物由于其良好的生物相容性已獲得美國fda批準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。其中，plga是由聚pla和pga形成的高分子共聚物，改變pla與pga的比例，可調(diào)節(jié)plga的力學(xué)強度及其在體內(nèi)的降解時間。plga具有很好的組織相容性，已被美國fda批準(zhǔn)用于臨床，是迄今應(yīng)用最多的骨修復(fù)材料之一。但plga機械強度較差、降解產(chǎn)物略呈酸性，易引起體內(nèi)炎癥反應(yīng)，而且由于plga表面親水性差，分子鏈中缺乏活性功能基團，其生物活性稍差，使其與特定細(xì)胞相互作用變得比較困難。

用于骨組織工程支架的無機材料主要包括羥基磷灰石(ha)、磷酸三鈣(tcp)以及其他種類的陶瓷材料等。這類生物陶瓷材料由于其具有良好的生物活性和生物相容性，成為廣泛應(yīng)用的植骨代用品。盡管其具有良好的生物相容性及一定的降解性、較高的化學(xué)穩(wěn)定性和較強的骨傳導(dǎo)及骨誘導(dǎo)性等優(yōu)點。但是這種材料具有不易塑形、強度不足、脆性大、降解率低等缺點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種利用干細(xì)胞及細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建的具有良好的成骨和成血管能力，且細(xì)胞來源豐富，易于分離獲取，對供體創(chuàng)傷小，培養(yǎng)要求低，有效降低對宿主產(chǎn)生炎癥、排異等免疫反應(yīng)的血管化組織工程骨。

本發(fā)明的另一目的是提供上述血管化組織工程骨的制備方法。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的所采取的技術(shù)方案為：

一種血管化組織工程骨，其特征在于其是由多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石構(gòu)成的支架以及依次包裹在所述支架表面的成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片(內(nèi)層)和成骨細(xì)胞膜片(外層)構(gòu)成。

上述用于制備所述成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片的內(nèi)皮細(xì)胞和用于制備成骨細(xì)胞膜片的成骨細(xì)胞均來源于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。

上述血管化組織工程骨的制備方法，其特征在于其工藝包括：

1)多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石的制備

將珊瑚羥基磷灰石用質(zhì)量濃度為0.25％～1.25％的多聚賴氨酸溶液在0～4℃溫度條件下浸泡15～24h，之后負(fù)壓抽濾，置-20℃冰箱冷凍過夜，冷凍干燥即可；

2)成骨細(xì)胞膜片的制備

將第三代或第四代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞先用胰蛋白酶消化至絕大部分細(xì)胞變圓，從瓶底脫落，然后用dmem/f12培養(yǎng)基終止消化，按1×10⁶～3×10⁶個/cm²的密度接種至培養(yǎng)皿中，加入含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養(yǎng)基上，置于37℃，5％co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，然后再用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)10～14天即可；

3)成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片的制備

取第三代或第四代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞按2×10⁶～4×10⁶個/cm²的密度接種于含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗的dmem/f12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48h，然后再用血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液持續(xù)培養(yǎng)10～14天即可；

4)血管化組織工程骨的構(gòu)建

將過程3)所得的成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片纏繞在過程1)所得的多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石支架表面，包裹一圈，然后將過程2)所得的成骨細(xì)胞膜片包繞在上述成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片外面，包繞一圈，形成卷層樣復(fù)合體，以絲線纏繞固定。

上述過程1)中，每3小時震蕩搖勻浸泡液。

上述過程1)中，所述負(fù)壓抽濾至未見任何氣泡自珊瑚羥基磷灰石表面孔隙溢出即可。

上述過程1)中，所述冷凍干燥是指：將冷凍過夜后的以多聚賴氨酸溶液浸泡的珊瑚羥基磷灰石放入冷凍干燥機內(nèi)，在溫度-42℃～-47℃、負(fù)壓20-28pa條件下，預(yù)冷30min后開始抽真空，控制真空度25～28pa，冷凍干燥48～72h。

上述過程2)中，所述成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液組成為：dmem/f12培養(yǎng)基170～180ml，胎牛血清17～22ml，雙抗1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗壞血酸550～580ul，β-甘油磷酸鈉2～3ml，地塞米松15～25ul。

上述過程2)中，用誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)時，隔日換液培養(yǎng)。

上述過程3)中，所述血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液組成為：內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(egm-2)90～110ml，胎牛血清4.5～5.5ml,維生素c0.09～0.11ml,慶大霉素-兩性霉素b(ga-1000)0.09～0.11ml,氫化可的松(hydrocortisone)0.036～0.044ml,人表皮生長因子(hegf)0.09～0.11ml,人成纖維細(xì)胞生長因子(hfgf-b)0.45～0.55ml,類胰島素一號增長因子(igf-i)0.09～0.11ml,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vegf)0.09～0.11ml。

上述過程3)中，用血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液培養(yǎng)過程中，隔2-3天換液培養(yǎng)。

上述過程4)中，所述多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石支架在使用前用含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養(yǎng)基浸泡12～24h。

珊瑚羥基磷灰石(corallinehydroxyapatite,cha)是將珊瑚經(jīng)水熱交換反應(yīng)得到的產(chǎn)物，保留了珊瑚多孔性和高孔隙率的特點，使原珊瑚材料機械強度顯著增加，并可通過控制水熱轉(zhuǎn)換反應(yīng)的條件來調(diào)節(jié)cha在體內(nèi)的降解速率。cha不但克服了天然珊瑚的降解快、質(zhì)地脆弱等缺點，而且制備簡單，有良好的骨誘導(dǎo)性及生物相容性，并可與多種生長因子復(fù)合或表面修飾蛋白等分子，在修復(fù)骨缺損方面具有良好的應(yīng)用前景。

多聚賴氨酸(polylysine,pll)是由賴氨酸單體構(gòu)成的多價陽離子聚合體，由多個氨基酸片段聚合而成，可在體內(nèi)分解為賴氨酸參與人體代謝，無任何毒副作用。其常被用于骨組織工程支架材料的表面修飾，主要原因在于：①賴氨酸殘基在材料表面帶正電荷，可增強帶負(fù)電荷的成纖維細(xì)胞等的粘附能力；②其所含的胺基、羥基等可模仿細(xì)胞外基質(zhì),從而改善材料的表面活性，提高細(xì)胞粘附率，促進細(xì)胞生長、繁殖；③能促進軟骨形成；④安全，組織相容性好，其分解物為人體必需氨基酸；⑤親水性強，利于改善細(xì)胞與材料之間的粘附等。有學(xué)者報道用pll處理細(xì)胞培養(yǎng)支架、骨組織工程支架等，可增加細(xì)胞粘附力與接種率，是一種良好的組織工程支架材料表面修飾方法。

本發(fā)明依據(jù)材料優(yōu)化設(shè)計的思想，以多聚賴氨酸(pll)修飾珊瑚羥基磷灰石(cha),從而獲得生物相容性好并具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)的外源支架；利用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能的特性，將其誘導(dǎo)分化，制備具有成骨能力及成血管能力的雙細(xì)胞膜片；充分借鑒干細(xì)胞及細(xì)胞膜片技術(shù)和骨組織發(fā)育過程，探討復(fù)合構(gòu)建創(chuàng)新性的血管化組織工程骨的思路和方法，以雙細(xì)胞膜片復(fù)合pll/cha最終構(gòu)建出成骨和血管化效果較好的血管化組織工程骨。本發(fā)明的血管化組織工程骨的技術(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)在以下幾個方面：

1、以多聚賴氨酸(pll)修飾珊瑚羥基磷灰石(cha)獲得的外源支架，有利于血管爬行長入，并最終血管化，為組織工程骨內(nèi)細(xì)胞長期生存提供前提條件，同時減少了機體免疫排異及炎癥反應(yīng)；

2、選用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制備雙細(xì)胞膜片，無需額外添加不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞來源豐富，易于分離獲取，對供體創(chuàng)傷小，不違背倫理學(xué)原則，培養(yǎng)要求低；

3、本發(fā)明的血管化組織工程骨制備方法簡單，條件溫和，具有良好的成骨和成血管性能，符合生物體內(nèi)應(yīng)用的要求，作為一種新型血管化組織工程骨具有良好的應(yīng)用前景。

4、本發(fā)明的研制成功可為理想的血管化組織工程骨的開發(fā)以及大塊骨缺損的再生治療提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)，尤其是脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)的雙細(xì)胞膜片的提出與試驗，因操作技術(shù)相對簡單、成本較低、創(chuàng)傷小以及成骨和血管化效果較好，使血管化組織工程骨的應(yīng)用具有更廣闊的前景，以滿足修復(fù)各種臨床硬組織缺損的需要。

將本發(fā)明制備的血管化組織工程骨移植至免疫缺陷的裸鼠背部皮下。術(shù)后分別進行大體觀察、sem及組織形態(tài)學(xué)分析等檢測其異位成骨的能力和對血管再生的影響。結(jié)果表明：第8周時，實驗組支架孔隙內(nèi)充填膠原樣組織，有血管分布。第12周出現(xiàn)不同程度的鈣化區(qū)，組織內(nèi)可見大量血管腔。masson染色見：第8周支架近組織側(cè)著色深，密度高，以新生膠原纖維為主。第12周時可見纖維不同程度礦化，可見大量血管腔，膠原纖維稀疏。sem可見cha孔隙內(nèi)被纖維結(jié)締組織不同程度填充(×100)。5000倍時，結(jié)果顯示：第12周時纖維表面形成大量羥基磷灰石樣結(jié)構(gòu)物質(zhì)，覆蓋面積廣泛，礦化最成熟。珊瑚羥基磷灰石支架與雙細(xì)胞膜片復(fù)合構(gòu)建的血管化組織工程骨具有良好的成骨、成血管性能。

附圖說明

圖1為cha(左)和pll/cha(右)的sem圖；

圖2為成骨細(xì)胞膜片(左)和內(nèi)皮細(xì)胞膜片(右)的實物圖；

圖3為pll/cha支架與雙細(xì)胞膜片復(fù)合構(gòu)建的血管化組織工程骨實物圖；

圖4為pll/cha/雙細(xì)胞膜片復(fù)合物移植于裸鼠皮下；

圖5為a組移植8周(左)和12周(右)he染色(×200)；

圖6為a組移植8周(左)和12周(右)(×100)的掃描電鏡圖。

具體實施方法

下面用實例予以說明本發(fā)明，應(yīng)該理解的是，實例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的范圍與核心內(nèi)容依據(jù)權(quán)利要求書加以確定。

一、多聚賴氨酸修飾的珊瑚羥基磷灰石的制備和表征

(1)主要試劑

珊瑚羥基磷灰石(cha)(中國，北京意華健)，多聚賴氨酸(pll)(美國,sigma)。

(2)儀器與設(shè)備

超聲波清洗機(中國，昆山儀器設(shè)備廠)，真空冷凍干燥機(中國，上海比朗儀器公司)，s-3400n掃描電子顯微鏡(日本，hitachi)。

(3)實驗方法

①pll浸泡cha

用雙蒸水將pll配制成0.25％～1.25％w/v濃度,經(jīng)0.22μm濾器過濾除菌。在0～4℃，用配好的pll溶液浸泡cha15～24h，每3h震蕩搖勻浸泡液，使pll與cha充分接觸。

②負(fù)壓抽濾

將浸泡cha的容器置于連接負(fù)壓抽濾瓶、負(fù)壓抽濾機的無菌干燥皿中，密封好接頭與干燥皿蓋口，20℃持續(xù)負(fù)壓抽濾5h，直至未見任何氣泡自cha表面孔隙溢出，取出浸泡容器，置－20℃冰箱冷凍過夜。

③冷凍干燥

將浸泡容器置于冷凍干燥機內(nèi)，預(yù)置-42℃～-47℃，負(fù)壓20-28pa，預(yù)冷30min后開始抽真空，真空度25～28pa。冷凍干燥48h，將材料稱重并封裝，貼上標(biāo)簽,置-20℃低溫冰箱保存待用。

④表征

取復(fù)合支架樣本，其表面經(jīng)離子濺射儀噴金鍍膜后，用sem觀察支架的表面形貌。

⑤結(jié)果

sem結(jié)果顯示，cha和pll/cha均為多孔結(jié)構(gòu)，孔隙相互貫通，孔隙直徑為200-500μm。高倍鏡下，cha表面有由葉片狀結(jié)晶組成的球狀羥基磷灰石晶體(直徑500-4000nm)，pll/cha表面除羥基磷灰石晶體外，還有一層pll的不規(guī)則結(jié)晶體。

二、利用兔adscs(脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞)誘導(dǎo)分化分別構(gòu)建成骨細(xì)胞膜片、成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片

(1)主要試劑

噻唑藍(alarmarblue)(上海，翊圣)，抗壞血酸(ascrobicacid)(北京索萊寶生物科技有限公司)，直接紅80(directred80)(美國sigma)，dmem/f12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(pbs)、胎牛血清(fbs)(美國hyclone)。

(4)儀器與設(shè)備

infinitem200pro酶標(biāo)儀(瑞士，nanoquan)，h-7650透射電子顯微鏡(日本，hitachi)，s-3400n掃描電子顯微鏡(日本，hitachi)，偏光顯微鏡dm2500p(德國，leica)，正置熒光顯微鏡bx-511250ccd(日本，olympus)，co2培養(yǎng)箱(heraeus公司，德國)。

(3)實驗方法

①成骨細(xì)胞膜片的制備

將增殖狀態(tài)良好的第四代adscs(脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞)常規(guī)用1％胰蛋白酶消化，至絕大部分細(xì)胞變圓，從瓶底脫落，然后用dmem/f12培養(yǎng)基終止消化。調(diào)整細(xì)胞密度至1×10⁶～3×10⁶個/cm²，接種于預(yù)先用1％明膠包被的培養(yǎng)皿中，加入含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養(yǎng)基，置于37℃，5％co2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～48h后更換為成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液(dmem/f12培養(yǎng)基170～180ml，胎牛血清17～22ml，雙抗(青霉素、鏈霉素)1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗壞血酸550～580ul，β-甘油磷酸鈉2～3ml，地塞米松15～25ul)，隔日換液一次，觀察膜片的形成過程和形成情況，持續(xù)培養(yǎng)10～14天，皿底可見半透明乳白色薄膜樣物，膜內(nèi)有多個白色大小不等的結(jié)節(jié)時，用細(xì)胞刮刀輕輕刮擦，使膜狀物與皿底分離，可獲得成骨細(xì)胞膜片。

②成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片的制備

取第三代或第四代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞按2×10⁶～4×10⁶個/cm²的密度接種于含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48h，后更換成血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)液(內(nèi)皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基(egm-2)90～110ml，胎牛血清4.5～5.5ml,維生素c0.09～0.11ml,慶大霉素-兩性霉素b(ga-1000)0.09～0.11ml,氫化可的松(hydrocortisone)0.036～0.044ml,人表皮生長因子(hegf)0.09～0.11ml,人成纖維細(xì)胞生長因子(hfgf-b)0.45～0.55ml,類胰島素一號增長因子(igf-i)0.09～0.11ml,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vegf)0.09～0.11ml)，觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化，隔2-3天換液。持續(xù)培養(yǎng)14天，可獲得內(nèi)皮細(xì)胞膜片。

三、pll/cha/雙細(xì)胞膜片構(gòu)建血管化組織工程骨以及動物體內(nèi)異位移植實驗

(1)主要試劑

速眠新ii注射液(吉林，圣達)，蘇3號注射液(吉林，圣達)，powerdryhetoll3000真空冷凍干燥機(美國，thermofisher)，其余試劑均為分析純。

(2)儀器與設(shè)備

shz-d(iii)循環(huán)水式真空泵(鞏義，予華)。

(3)實驗方法

①pll/cha/雙細(xì)胞膜片復(fù)合體構(gòu)建血管化組織工程骨

將pll/cha切割制成0.5*0.5*2cm大小長方體，環(huán)氧乙烷消毒滅菌，無菌封裝備用。使用前用含10～12％胎牛血清和1～1.5％雙抗(青霉素、鏈霉素)的dmem/f12培養(yǎng)基中浸泡12～24h。

將前述方法制備的雙細(xì)胞膜片(成骨細(xì)胞膜片和成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片)，以細(xì)胞刮刀小心自培養(yǎng)皿底壁外周刮擦，使膜狀物與皿分離。

將成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片纏繞在支架(pll修飾的珊瑚羥基磷灰石)內(nèi)表面，包裹一圈，然后將成骨細(xì)胞膜片包繞在成血管內(nèi)皮細(xì)胞膜片外面，包繞一圈，形成卷層樣復(fù)合體，以絲線纏繞固定，記為復(fù)合體a，為實驗組；單純的成骨細(xì)胞膜片和內(nèi)皮細(xì)胞膜片包繞復(fù)合支架一圈構(gòu)建復(fù)合體分別記為復(fù)合體b和復(fù)合體c,為對照組。培養(yǎng)3天后待用。

②無外源支架血管化組織工程骨異位移植實驗

將36只裸鼠，隨機分為a組、b組、c組，將pll/cha/雙細(xì)胞膜片復(fù)合體裸鼠皮下植入術(shù)后8周和12周進行檢測(n＝6/組/時間點)。裸鼠皮下植入：將稀釋速眠新液按照0.1ml-0.2ml/20g肌肉注射麻醉，于背部做橫切口，皮下植入構(gòu)建物。實驗組為復(fù)合體a，對照組為復(fù)合體b和膜片復(fù)合體c。

③表征

大體觀察：組織工程骨植入后觀察裸鼠生活狀態(tài)和切口愈合情況和移植物變化；取材前觀察真皮、周圍組織與移植物關(guān)系。

組織學(xué)檢測：將取出的移植物分成兩份，一份使用2.5％戊二醛固定24h，sem樣品制備，觀察標(biāo)本剖面結(jié)構(gòu)。一份常規(guī)石蠟包埋，制作5μm連續(xù)切片，選取組織塊中心部位4張切片行he染色，并按照weidner等報道方法進行微血管計數(shù)，用spss20.0對結(jié)果進行統(tǒng)計分析；選取4張切片行masson染色，觀察纖維礦化狀況。

④結(jié)果

結(jié)果顯示，雙細(xì)胞膜片復(fù)合體與支架復(fù)合后，緊密貼合。植入裸鼠皮下后，切口未見炎癥反應(yīng)。術(shù)后第8周，可見移植物周圍組織粘連，附有毛細(xì)血管。第12周，移植物周圍的組織增多，表面附著小血管增多；cha孔隙內(nèi)完全被淡黃色組織填充，可見毛細(xì)血管伸入。he染色結(jié)果可見：第8周時，支架孔隙內(nèi)充斥膠原樣組織，組織內(nèi)散在分布數(shù)量不等的血管，可見紅細(xì)胞、成骨細(xì)胞形態(tài)。第12周可見組織內(nèi)細(xì)胞數(shù)量大量增加，a、b兩組出現(xiàn)不同程度的鈣化區(qū)，以a組礦化最明顯。c組未見礦化區(qū)域，組織內(nèi)可見大量有效灌注的血管。masson染色結(jié)果顯示：第8周支架孔隙內(nèi)由不等量的膠原纖維充斥，纖維分布稀疏，可見血管形成。三組之間未見明顯差異。第12周時，可見組織纖維不同程度礦化，其中以a組最為明顯。c組可見大量血管腔，膠原纖維稀疏。sem結(jié)果顯示，第8周可見三組cha孔隙內(nèi)被纖維結(jié)締組織不同程度填充。第12周，三組cha孔隙完全被纖維樣組織充填完整，組織與支架之間結(jié)合緊密。微血管計數(shù)結(jié)果顯示：第8、12周時，a、b、c三組微血管數(shù)目組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩個時間點c組分別與a、b組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，說明c組具成血管能力明顯高于其他兩組。第8周時，a組和b組之間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05),說明第8周時a組微血管數(shù)目高于b組。結(jié)果表明，pll/cha/雙細(xì)胞膜片復(fù)合體構(gòu)建的血管化組織工程骨具備良好的成骨、成血管性能。