. 3肺組織病理學觀察
[0035] 小鼠股動脈放血處死后，留取肺組織用福爾馬林固定，制備石蠟切片，進行Masson 染色，觀察肺組織纖維化改變。
[0036] I. 4 BALF收集和處理
[0037] 取Iml生理鹽水灌洗肺組織得到肺泡灌洗液。混勻取50 μ 1用于白細胞計數(shù)，余 下以3000rpm/min離心5min，取上清液進行分裝凍存于-80°C，用于BALF中細胞因子測定。
[0038] I. 5 BALF中炎癥因子的ELISA測定
[0039] 取BALF上清液按照小鼠 TGF- β IELISA試劑盒說明書進行TGF- β 1的ELISA含量 測定。
[0040] 1. 6肺組織膠原含量及髓過氧化物酶（MPO)活性測定
[0041] 取右肺，用生理鹽水制備10%的組織勻漿，取450 μ L用MPO試劑盒進行MPO活性 測定，剩余勻漿于12000g/min離心10分鐘，取上清液按膠原試劑盒說明書上說明進行膠原 含量測定，并取5 μ L上清液根據(jù)DC蛋白含量測定說明書進行上清液總蛋白含量測定。MPO 與膠原含量測定結(jié)果皆為每毫克上清液總蛋白中的MPO活性單位與膠原含量。
[0042] 1. 7肺纖維化評分標準（Ashcroft評分標準）：
[0043] 0分：正常；1分：肺泡壁或支氣管壁輕度增厚；2分，3分：肺泡壁或支氣管壁中度 增厚，但無肺結(jié)構(gòu)損毀；4分，5分：纖維組織明顯增多，伴明顯肺結(jié)構(gòu)損害，有纖維組織條索 或小的纖維組織團塊形成；6分，7分：嚴重肺結(jié)構(gòu)損毀，大片纖維化區(qū)域，蜂窩肺。；8分： 滿視野纖維組織。
[0044] 1. 8統(tǒng)計學分析
[0045] 數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標準差（I ±SEM )表示，用SPSS 10. 0 for Window統(tǒng)計軟件 做單因素方差分析和t檢驗，P〈0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0046] 2 結(jié)果
[0047] 1長春西汀對博萊霉素誘導肺組織纖維化的病理變化的影響
[0048] 博萊霉素（BLM)氣道滴入，能成功誘導了肺組織纖維化病變。用藥后第一 周即可出現(xiàn)強烈的炎癥和水腫、及細胞因子如腫瘤壞死因子α (TNF-α)，白細胞介素 1 β (IL-1 β )增加；第二周，促纖維化表達細胞因子轉(zhuǎn)化生長因子β (TGF-β )達峰值；第二 和第三周后，形成膠原沉積，類似于纖維化，Masson染色呈藍色的即沉積的膠原纖維，細胞 外基質(zhì)成分沉積，包括纖連蛋白和膠原蛋白-1。因此本研究分了二部分對長春西汀的抗肺 纖維化作用進行了研究，預防組采用了 BLM用藥后1-8天早期給藥方案，希望能明確其對早 期炎癥的作用。治療組采用了 BLM用藥后14-21天后期給藥方案，希望能明確對后期纖維 化進展的影響。
[0049] (1)預防作用：
[0050] 模型組、對照組、預防組對博萊霉素誘導肺纖維化損傷的Masson染色照片見圖1， 20X鏡拍照，標尺=10 μ m，圖1中，A組：BLM模型組；B組：正常對照組；C組：DEX陽性對照 組；D組：長春西汀預防低劑量lmg/kg組；E:組長春西汀預防中劑量3mg/kg組；F組：長 春西汀預防高劑量10mg/kg組。
[0051] 圖1可以看出，用藥模型組氣道附近膠原沉積明顯，肺泡組織結(jié)構(gòu)被嚴重破壞，間 隔消失形成空洞。正常對照組的肺組織肺泡結(jié)構(gòu)清晰且完整，無炎癥細胞浸潤。而地塞米 松陽性對照組對抗博萊霉素誘導的肺纖維化病變作用不明顯。長春西汀對此纖維化病變的 抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性，低劑量組效果不明顯，高劑量對此纖維化有明顯抑制作用。
[0052] (2)治療作用
[0053] 模型組、對照組、治療組對博萊霉素誘導肺纖維化損傷的Masson染色照片見圖2， 20X鏡拍照，標尺=10 μ m，圖2中，A組：BLM模型組；B組：正常對照組；C組：DEX陽性對照 組；D組：長春西汀治療低劑量lmg/kg組；E:組長春西汀治療中劑量3mg/kg組；F組：長 春西汀治療高劑量10mg/kg組。
[0054] 圖2可見，在造模14天后進行長春西丁藥物治療一周，我們發(fā)現(xiàn)用藥組也有明顯 的劑量依賴性減輕肺纖維化的作用。尤其是高劑量組，能明顯減少肺纖維化的程度。
[0055] 2長春西汀對博萊霉素誘導纖維化肺組織膠原含量的影響
[0056] 長春西汀預防組和治療組對肺組織膠原含量的影響柱狀圖見圖3,肺組織中膠 原含量在博萊霉素氣道滴入后Hd即快速上升，與正常對照組比較即有極顯著性差異 (P〈0. 01)。陽性對照組膠原含量有抑制趨勢，但與模型組比較無顯著性差異。預防組和治 療組中，低、中劑量長春西丁對膠原的影響也不明顯，但高劑量組下降較明顯，達統(tǒng)計學顯 著性（P〈0. 05與模型組比較）。提示長春西汀高劑量最有較好的抑制肺纖維化的作用。
[0057] 3長春西汀對博萊霉素誘導肺纖維化小鼠肺組織中MPO活性的影響
[0058] 長春西汀預防組和治療組對肺組織MPO活性的影響柱狀圖見圖4,由圖4可知，治 療組的MPO各組差異不是很大，低、中、高濃度依次降低。但空白組的含量也較高。預防組、 治療組中，空白對照組的MPO含量與模型組的MPO相當。提示MPO不是肺纖維化模型的敏 感指標。而長春西汀對MPO活性的影響不明顯，預防組略有下降趨勢。
[0059] 4 Ashcroft 評分
[0060] 長春西汀預防及治療組的ashcroft評分柱狀圖見圖5,從Ashcroft評分可以發(fā) 現(xiàn)，無論是治療組或者是預防組，空白對照組都是分數(shù)很低的，幾乎是0。模型組的評分 最高，而預防組的程度輕于治療組。在預防組中，高劑量組評分最低，地塞米松組次之，其 中高劑量組相比陽性對照組有顯著性差異（P〈〇. 05)，優(yōu)于地塞米松組；在治療組中，地塞 米松組，低劑量組、高劑量組相當，其中，高劑量組和低劑量組與模型組比較有顯著性差異 (Ρ〈0· 05) 〇
[0061] 3.討論
[0062] 憐酸二酯酶（Phosphodiesterases，F(xiàn)1DEs)是細胞內(nèi)第二信使cAMP和cGMP的水解 酶，負責維持細胞內(nèi)第二信使?jié)舛绕胶?，在信號傳遞過程中扮演著重要作用。PDEs作為一個 有11個家族成員的蛋白酶超家族，擁有非常多的變異體。對細胞的生長、增殖、及細胞代謝 都起著重要作用。
[0063] 長春西汀的作用機制目前尚不清楚，已有國外文獻報道認為長春西汀為TOEl抑 制劑，IC50為21 μΜ。我們實驗室前期的研究工作中，發(fā)現(xiàn)TOEl在肺纖維化過程中是明顯 有表達上調(diào)的，所以我們就想研究如果抑制TOEl是否能對肺纖維化過程產(chǎn)生作用。
[0064] 通過長春西汀的預防和治療研究，我們發(fā)現(xiàn)長春西汀預防和治療對博萊霉素誘導 的肺纖維化模型均有效，預防組高劑量的效果更明顯，而治療組低劑量的效果也較好，同時 治療組的肺纖維化評分下降更明顯，提示該藥對于肺纖維化的預防和治療均有一定作用。 對于肺纖維化病人，長期用藥可能有益于纖維化病變的逆轉(zhuǎn)。
【主權(quán)項】
1. 長春西汀在制備抗肺纖維化藥物中的應用。2. 如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于所述應用的方法為：將長春西汀用冰醋酸溶 解，再用生理鹽水稀釋后注射給藥；或?qū)㈤L春西汀與其他人體可接受的藥用輔料制成片劑 或膠囊，口服給藥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了長春西汀在制備抗肺纖維化藥物中的應用。本發(fā)明經(jīng)過研究表明，長春西汀對肺纖維化動物模型TGFβ有明顯的抑制作用，可用于制備抗肺纖維化藥物。本發(fā)明開拓了長春西汀有利于肺纖維化機制及治療藥物的研究，為新的治療肺纖維化的藥物提供了實驗基礎。
【IPC分類】A61P11/00, A61K31/4375
【公開號】CN104997775
【申請?zhí)枴緾N201510381517
【發(fā)明人】湯慧芳
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年6月30日