專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及疫苗制備方法技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的方法。
背景技術(shù)：
流感嗜血桿菌(Haemophilus Influenza, Hi)迄今仍是導(dǎo)致人類(lèi)侵襲性疾病的主要致病菌，其中絕大部分由b型流感嗜血桿菌(Haemophilus Influenza type b, Hib)引起。Hib腦膜炎居細(xì)菌性腦膜炎的首位，具有發(fā)病率高、病死率高和致殘率高的特點(diǎn)；其另一個(gè)特點(diǎn)是發(fā)病年齡小，嬰幼兒感染率高，發(fā)病年齡主要集中在5歲以下，尤其是2歲以下。全世界估計(jì)每年至少造成300萬(wàn)例嚴(yán)重疾病，其中約38.6萬(wàn)人死亡，已成為全球性的一大公共衛(wèi)生問(wèn)題。在發(fā)展中國(guó)家，Hib肺炎在兒童感染性疾病中占有重要地位，約占所有兒童肺炎的20%，是發(fā)展中國(guó)家兒童肺炎的重要死亡原因。在亞洲22個(gè)國(guó)家的48項(xiàng)研究中，有2/3表明Hib是兒童非結(jié)核性腦膜炎的首要致病原。我國(guó)3 5歲兒童中Hib自然感染抗體水平低，為Hib感染高危人群。因此，我國(guó)有使用Hib疫苗的必要。接種疫苗是預(yù)防絕大多數(shù)Hib嚴(yán)重病例的唯一公共衛(wèi)生措施。第一種Hib多糖疫苗于1985年4月在美國(guó)上市，這種疫苗適用于2 5歲的兒童。對(duì)于小于18月齡的兒童，這種采用PRP的疫苗的有效率實(shí)際為零，成為這種疫苗使用上的最大的障礙。流行病學(xué)調(diào)查表明6月齡前兒童就需要保護(hù)。結(jié)合疫苗的研制成功解決了疫苗在嬰幼兒中無(wú)效的問(wèn)題。結(jié)合疫苗比以往的疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性和更 好的免疫效果。結(jié)合疫苗于1987年投放市場(chǎng)，針對(duì)18月齡以上兒童。在隨后幾年間，三種新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作為結(jié)合蛋白。這些新疫苗在嬰幼兒中非常有效。即使在小年齡嬰兒中使用Hib疫苗，也是安全有效的。在Hib結(jié)合疫苗制備的過(guò)程中，目前普遍運(yùn)用的制備方法是:利用液體發(fā)酵的方法制備Hib菌液，殺菌后再經(jīng)CDAP沉淀、乙醇沉淀、冷酚抽提、無(wú)水乙醇和丙酮洗滌等步驟獲得精制Hib莢膜多糖，再用CNBr活化Hib莢膜多糖后連接己二酰肼，然后在碳二亞胺的催化作用下Hib莢膜多糖通過(guò)己二酰肼的橋連作用與載體蛋白結(jié)合，最后經(jīng)凝膠過(guò)濾層析純化收集高分子多糖蛋白結(jié)合物，即為多糖蛋白結(jié)合疫苗原液。但因制備的精制Hib莢膜多糖中存在大量分子量低于700kd的小分子多糖，這部分多糖與載體蛋白結(jié)合后分子量小，經(jīng)凝膠過(guò)濾層析后被分離出去了，導(dǎo)致結(jié)合過(guò)程中，高分子多糖蛋白結(jié)合物的收率很低，目前業(yè)內(nèi)該制備方法的Hib莢膜多糖多糖收率僅4 6%。另外因制備過(guò)程中獲得的精制Hib莢膜多糖的分子大小分布不均，每個(gè)批次的分子大小分布存在較大差異，導(dǎo)致每批多糖蛋白結(jié)合疫苗原液的理化指標(biāo)各異，影響生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性、成品疫苗的批間穩(wěn)定性和成品疫苗質(zhì)量的一致性。凝膠過(guò)濾層析也稱(chēng)分子篩層析、排阻層析，是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類(lèi)物質(zhì)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，流下時(shí)路程較長(zhǎng)，而大分子物質(zhì)卻被排除在外部，下來(lái)的路程短，當(dāng)一混合溶液通過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開(kāi)了。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種降低原料消耗、提高工藝穩(wěn)定性、產(chǎn)品一致性的制備b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的方法。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的方法，它包括以下步驟:S1、多糖的凝膠過(guò)濾層析純化，將Hib莢膜多糖用注射用水稀釋成濃度為3 6mg/ml的溶液,用孔徑0.45 μ m的濾膜澄清過(guò)濾,濾液經(jīng)Sepharose4FF凝膠層析柱層析純化,收集KD < 0.3的層析洗脫液，收集的洗脫液再用300KD超濾膜超濾濃縮至多糖濃度> 4mg/ml，即得大分子Hib莢膜多糖；S2、多糖-TT結(jié)合物的制備，它包括以下子步驟:S21、將大分子Hib莢膜多糖溶液用注射用水稀釋成2 4mg/ml的溶液，向該溶液中加入CNBr活化15 25分鐘，加入的CNBr與多糖重量比為0.5 1:1 ;再加入己二酰肼進(jìn)行10 20分鐘衍化反應(yīng)，加入的己二酰肼與多糖的重量比為3 5:1 ;反應(yīng)物經(jīng)300KD超濾膜反復(fù)用注射用水稀釋、超濾濃縮，去掉殘余CNBr，得到多糖-AH衍生物；S22、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT溶液，加入的TT溶液與多糖-AH衍生物溶液體積比為1:1，加入的TT溶液中TT濃度與步驟S21中將大分子Hib莢膜多糖溶液用注射用水稀釋成的溶液中多糖濃度的濃度比為1.5 2.5:1 ;混勻后置冰浴中，加入EDAC粉末至溶液中EDAC終濃度為18 22mmol/L，在pH為4.7±0.2、溫度為2 8°C的條件下反應(yīng)I 2h ;然后調(diào)節(jié)pH至7.0，在溫度為2 8°C的條件下靜置彡10小時(shí)；反應(yīng)物經(jīng)S印harose4FF凝膠柱分離純化，收集KD < 0.2的洗脫液段，除菌過(guò)濾，得到成品本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明提高了合格結(jié)合物收率，降低了結(jié)合過(guò)程中的原料消耗，提高了生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和終產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。本發(fā)明提出了一種先進(jìn)行多糖層析純化，再利用純化后的多糖制備結(jié)合疫苗的方法；通過(guò)凝膠過(guò)濾層析純化Hib莢膜多糖，去掉小分子部分多糖，再進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，使結(jié)合反應(yīng)更高效地進(jìn)行，繼而提高多糖與載體蛋白的結(jié)合率，增加了多糖的回收率，節(jié)省了生產(chǎn)原料，降低了生產(chǎn)成本。另外，純化Hib莢膜多糖后，多糖分子大小分布的批次間差異減小，有利于提高結(jié)合工藝的穩(wěn)定性，進(jìn)而生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的結(jié)合疫苗成品。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述:實(shí)施例1:一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的方法，它包括以下步驟:S1、多 糖的凝膠過(guò)濾層析純化，將Hib莢膜多糖用注射用水稀釋成濃度為5mg/ml的溶液，用孔徑0.45 μ m的濾膜澄清過(guò)濾，濾液經(jīng)S印har0Se4FF凝膠層析柱層析純化，以10%柱體積上樣于S印harose4FF凝膠層析柱，以0.15M氯化鈉為洗脫液洗脫，收集KD ^ 0.3的層析洗脫液，收集的洗脫液再用300KD超濾膜超濾濃縮至多糖濃度為6mg/ml，即得大分子Hib莢膜多糖；按此方法共制備大分子Hib莢膜多糖，制備結(jié)果如下:
權(quán)利要求
1. 一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的方法，其特征在于它包括以下步驟 ·51、多糖的凝膠過(guò)濾層析純化，將Hib莢膜多糖用注射用水稀釋成濃度為3 6mg /ml的溶液,用孔徑O. 45 μ m的濾膜澄清過(guò)濾,濾液經(jīng)Sepharose 4FF凝膠層析柱層析純化，收集KD ( O. 3的層析洗脫液，收集的洗脫液再用300KD超濾膜超濾濃縮至多糖濃度> 4mg/ml，即得大分子Hib莢膜多糖； ·52、多糖-TT結(jié)合物的制備，它包括以下子步驟 ·521、將大分子Hib莢膜多糖溶液用注射用水稀釋成2 4mg/ml的溶液，向該溶液中加入CNBr活化15 25分鐘，加入的CNBr與多糖重量比為O. 5 I: I ;再加入己二酰肼進(jìn)行·10 20分鐘衍化反應(yīng)，加入的己二酰肼與多糖的重量比為3 5 :1 ;反應(yīng)物經(jīng)300KD超濾膜反復(fù)用注射用水稀釋、超濾濃縮，去掉殘余CNBr，得到多糖-AH衍生物； ·522、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT溶液，加入的TT溶液與多糖-AH衍生物溶液體積比為1:1，加入的TT溶液中TT濃度與步驟S21中將大分子Hib莢膜多糖溶液用注射用水稀釋成的溶液中多糖濃度的濃度比為I. 5 2. 5:1 ;混勻后置冰浴中，加入EDAC粉末至溶液中EDAC終濃度為18 22 mmol /L，在pH為4. 7±0. 2、溫度為2 8°C的條件下反應(yīng)·1 2h ;然后調(diào)節(jié)pH至7. 0，在溫度為2 8°C的條件下靜置彡10小時(shí)；反應(yīng)物經(jīng)S印harose·4FF凝膠柱分離純化，收集KD < O. 2的洗脫液段，除菌過(guò)濾，得到成品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫苗的方法，它包括以下步驟S1、多糖的凝膠過(guò)濾層析純化，得大分子Hib莢膜多糖；S2、多糖-TT結(jié)合物的制備，它包括以下子步驟S21、向大分子Hib莢膜多糖溶液中加入CNBr活化15～25分鐘，再加入己二酰肼進(jìn)行10～20分鐘衍化反應(yīng)，去掉殘余CNBr，得到多糖-AH衍生物；S22、在多糖-AH衍生物溶液中加入TT溶液，混勻后置冰浴中，加入EDAC粉末；反應(yīng)物經(jīng)分離純化、除菌過(guò)濾，得到成品。本發(fā)明的有益效果是提高了合格結(jié)合物收率，降低了結(jié)合過(guò)程中的原料消耗，提高了生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性和終產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。
文檔編號(hào)A61K39/102GK103251943SQ201310188248
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月20日
發(fā)明者李洪光, 伍長(zhǎng)華, 關(guān)曉峰, 吳強(qiáng), 吳畏 申請(qǐng)人:成都?xì)W林生物科技股份有限公司