左卡尼汀聯(lián)合l-精氨酸在制備治療糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了含有左卡尼汀和L-精氨酸的藥物組合物，用于聯(lián)合制備治療糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷藥物中的應用，尤其是制備治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷和Müller細胞損傷藥物中的應用。本發(fā)明通過細胞和動物實驗證明，與單獨使用左卡尼汀相比，聯(lián)合L-精氨酸可以更加有效地保護糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷，尤其是糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷和Müller細胞損傷，達到了協(xié)同增效的技術效果。
【專利說明】左卡尼汀聯(lián)合L-精氨酸在制備治療糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及左卡尼汀聯(lián)合L-精氨酸在制備治療糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]隨著人類生活水平的普遍提高及人均壽命的延長，目前國內外糖尿病的發(fā)病率較以往顯著升高。糖尿病有許多并發(fā)癥，其中糖尿病視網(wǎng)膜病變(retinal retinopathy,DR)是其在眼部的最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥之一，是主要致盲性眼病之一，主要是由于視網(wǎng)膜微血管發(fā)生病變從而引起視網(wǎng)膜一系列的病理改變，其發(fā)病率及嚴重程度隨著糖尿病病程的延長而增耐。有研究報道糖尿病病程如果長達5年，則DR發(fā)病率可達44.4%,如糖尿病病程達7年，則DR的發(fā)病率可高達56 %。
[0003]目前認為DR的基本病理學改變如下:①周細胞的選擇性丟失基底膜的增厚；③微血管瘤的形成；④內皮細胞的增生；⑤新生血管的形成。其中周細胞的選擇性丟失被視為其最早期的病理學改變。正常視網(wǎng)膜毛細血管中周細胞與內皮細胞的數(shù)量之比約為I: 1，而在糖尿病及其并發(fā)癥患者 中，兩者比值約為1: 4，甚至更低。近年的研究表明，糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與氧化應激有關。氧化應激反應是指化學因素和環(huán)境因素引起體內自由基增加，導致抗氧化酶活力降低，DNA損傷，從而促進腫瘤生長、心血管疾病及細胞凋亡。在眼部，通過刺激細胞凋亡，破壞細胞膜的完整性，造成視網(wǎng)膜的不可逆損傷。高血糖使葡萄糖的有氧氧化增強，表現(xiàn)為在三羧酸循環(huán)過程產生的電子增多、線粒體的質子梯度增加，進而漏出的電子與O2結合生成02_，即活性氧(ROS)產生增加，導致氧化應激反應。Takeshi Nishikawa等研究表明:高血糖能增加線粒體ROS的產生,而這一過程又與糖尿病血管病變的發(fā)生有關。ROS宜攻擊不飽利脂肪酸，而視網(wǎng)膜又是富含多不飽和脂肪酸的膜組織，并且相較于其他組織，對氧氣的攝取能力利葡萄糖的氧化能力更強。所以糖尿病病變時，視網(wǎng)膜容易受到氧化應激的損傷。除此之外，高血糖能引起機體多條代謝通路反應改變，包括蛋白質非酶糖基化終產物(AGEs)形成、蛋白激酶C激活、多元醇代謝異常、氨基已糖途徑激活，同時也促使各種炎癥因子和細胞粘附因子的表達增多等。上述一系列病理生理改變導致視網(wǎng)膜血管壁周細胞死亡、基底膜增厚，使血管壁機能不全，破壞了血-視網(wǎng)膜屏障功能，進而導致滲透壓增高，細胞水腫。
[0004]神經(jīng)膠質細胞(neuroglial cell)又稱神經(jīng)膠細胞、膠質細胞，是神經(jīng)系統(tǒng)的組成單位之一。近年來研究表明，視網(wǎng)膜MUller細胞是視網(wǎng)膜中最主要的膠質細胞，也是一種特殊化的神經(jīng)膠質細胞，具有維持視網(wǎng)膜正常結構、參與構成血-視網(wǎng)膜屏障、支持和營養(yǎng)神經(jīng)元、調節(jié)神經(jīng)遞質循環(huán)等生理功能。其在視網(wǎng)膜病變的多種病理過程中起著非常重要的作用。
[0005]由于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制復雜，一直以來都缺乏有效的治療手段。激光和手術治療不能阻止DR的病情發(fā)展。隨著對DR發(fā)病機制的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)藥物治療可以阻斷DR發(fā)病的多個途徑。但目前常用的藥物如抗血管內皮生長因子和糖皮質激素等等，在評價其治療有效性及遠期安全性等方面?zhèn)溆袪幾h。因此，尋找安全有效的藥物，用于DR的早期治療，對降低致盲率尤為重要。
[0006]左卡尼汀(L-carnitine, LC)又名左旋肉堿,是哺乳類動物體內能量代謝所必須的天然物質，主要于肝臟、腎臟、心臟等組織內由三甲賴氨酸轉化成Y - 丁酰甜菜堿，再由肝臟、腎及腦組織將其轉化成卡尼汀而合成，參與體內脂類代謝，對機體細胞能量代謝產生及轉運起重要作用，是心、腦、腎等組織器官代謝所需能量的主要來源之一。同時LC還具有促進蛋白質降解、抗氧化、保護細胞膜等功能。左卡尼汀目前已廣泛應用于心肌病、肝臟疾病、透析病人、糖尿病、男性不育、神經(jīng)肌肉疾病、腎臟疾病等疾病的治療。正常情況下，LC可將長鏈脂肪酸通過位于線粒體外膜的卡尼汀脂酰轉移酶-1及內膜的卡尼汀脂酰轉移酶-1I將其轉運到線粒體中，然后在線粒體酶的作用可將脂酰輔酶A(CoA)在線粒體中進行β_氧化。缺血、缺氧時脂類代謝發(fā)生障礙，可導致長鏈脂?？嵬≡诰€粒體中堆積及脂酰-CoA的堆積，致使游離的卡尼汀被大量消耗減少，而堆積的脂酰-CoA可導致膜結構的改變、膜相崩解致細胞死亡。如體內有足量的游離卡尼汀，則可使堆積的脂酰-CoA進入線粒體中在線粒體酶的作用下進行β -氧化，從而糾正脂類代謝障礙所致的能量失衡，防上脂質過氧化。另外有研究表明，LC除了可以促進脂肪酸通過β_氧化進行氧化利用外，它還可作為一種氧自由基清除劑有效的清除體內的氧自由基，其在增強機體氧化應激、防止脂質過氧化等方面具有明顯保護作用。
[0007]陳杰(碩士論文《左卡尼汀對體外高糖培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的保護作用及機制探討》)、尹曉琳(碩士論文《左卡尼汀對高糖條件下視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的保護作用》)、于常紅(左卡尼汀對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞保護作用的實驗研究，《中國藥理學通報》，2013年第29卷第11期)都就左卡尼汀對視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的保護作用進行了研究。這些研究表明，左卡尼汀對高糖造成的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞氧化損傷的保護作用與其發(fā)揮抗氧化特性有關。作為一種抗氧化劑，左卡尼汀可減少氧自由基的生成、增強細胞的抗氧化能力，并可穩(wěn)定線粒體膜電位、改善線粒體功能，從而抑制高糖狀態(tài)下氧化應激所造成的細胞凋亡。
[0008]另外，張瑩(碩士論文《左卡尼汀對體外高糖培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜MUller細胞的保護作用及機制》)研究了左卡尼汀對視網(wǎng)膜MUller細胞的保護作用。研究表明，高糖對視網(wǎng)膜MU11 er細胞的損傷主要是由于ROS大量增加引起的氧化應激損傷，而LC對高糖損傷視網(wǎng)膜MUller細胞具有保護作用，可以抑制Milller細胞的凋亡，其機制可能與減少ROS生成，抑制線粒體膜通透性，維持線粒體膜電位有關。
[0009]但鑒于糖尿病性視網(wǎng)膜病變的復雜發(fā)病機制，以及發(fā)病的多個途徑，如何進一步找尋更加安全有效的藥物是人們關注的重點。
【發(fā)明內容】
[0010]鑒于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明人通過理論并結合大量細胞、動物實驗發(fā)現(xiàn)，左卡尼汀聯(lián)合L-精氨酸可以協(xié)同保護糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷，尤其是糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷和MUller細胞損傷。
[0011]因此，本發(fā)明的目的是提供一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物中含有左卡尼汀和L-精氨酸，用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷。[0012]進一步地，所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩爾比為1:1~10。
[0013]進一步地，所述組合物的劑型為片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、溶液劑、乳劑或混懸劑。
[0014]本發(fā)明的另一目的是提供左卡尼汀聯(lián)合L-精氨酸在制備治療糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷的藥物中的應用，尤其是治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷和MUller細胞損傷的藥物中的應用。
[0015]進一步地，上述應用中左卡尼汀和L-精氨酸的摩爾比為1:1~10，更進一步優(yōu)選為1: 3~8，最優(yōu)選為1 : 6。
[0016]進一步地，上述應用中左卡尼汀和L-精氨酸可以以片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、溶液劑、乳劑、混懸劑等常規(guī)劑型進行給藥。
[0017]L-精氨酸(L-Arginine，L-Arg)是一種α氨基酸，其在多個過程中都扮演著重要的角色，例如細胞分裂、傷口復原、排出氨、免疫功能和分泌激素等。L-精氨酸和氨分子在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的催化下相互作用生成NO和L-胍氨酸。NO可激活鳥苷酸環(huán)化酶(cGMPase)生成環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)，進而發(fā)揮其生物學效應，這一途徑稱為NO途徑。NOS是一種含鐵的單胺氧化酶，是NO合成過程中的限速酶，根據(jù)NOS的組織分布范圍、鈣依賴性和基因表達的不同，將NOS分為誘導型NOS(inducible NOS, iNOS)、神經(jīng)元型 NOS (neuronal NOS, nNOS)及內皮型 NOS (endothe N0S，eNOS)。NO 主要的生物學作用為:(1)生理劑量的NO可參與免疫反應及炎癥過程中的信息傳遞，大劑最的NO則能引起神經(jīng)元細胞損傷或殺死正常細胞，并導致細胞問信息傳導障礙。(2)信息傳遞作用:N0是自主神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元釋放的一種不典型神經(jīng)遞質，廣泛地存在于人體內的各個臟器，以局部擴散的方式作用于鄰近細胞，通過NO途徑生成的cGMP發(fā)揮生物學效應:(3)舒張血管:N0與GC結合并激活sGC，從而使cGMP水平升高而發(fā)揮其生物學效應:即通過松馳血管平滑肌，舒張血管來調節(jié)外周血管阻力，并參與調控腦循環(huán)、冠狀動脈循環(huán)和肺循環(huán)；(4)炎癥介質:白細胞介素I (IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、脂多糖可誘導中性粒細胞和巨噬細胞L-Arg-NO途徑的表達，生成大量NO，一方面可殺死胞內細菌、腫瘤細胞和寄生蟲，另一方面又能損傷正常組織，造成細胞死亡，即參與機體的自身免疫反應。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:通過細胞和動物實驗證明，與單獨使用左卡尼汀相比，聯(lián)合L-精氨酸可以更加有效地保護糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷，尤其是糖尿病視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷和MUller細胞損傷，達到了協(xié)同增效的技術效果。
【具體實施方式】
[0019]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。
[0020]實驗例I
[0021]1.1實驗動物
[0022]選擇出生l-3d的標準普通級SD大鼠，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心提供，符合國家醫(yī)用動物使用標準，標準號為清潔級。
[0023]1.2SD大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的原代培養(yǎng)及高糖模型的建立，包括以下步驟(具體操作參見“左卡尼汀對體外高糖培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的保護作用及機制探討”，陳杰，青島大學碩士論文，2013):
[0024]1.2.1配制以下主要試劑
[0025]含10%胎牛血清培養(yǎng)液、葡萄糖、5-溴-2’脫氧尿苷、4%多聚甲醛、PBS磷酸鹽緩沖液。
[0026]1.2.2多聚賴氨酸處理細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板
[0027]為促進所培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的貼壁，于接種前預先用多聚賴氨酸處理細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板。方法:于實驗前一天，25mm2培養(yǎng)瓶加入100 μ g / ml多聚賴氨酸2.0ml,均勻覆蓋瓶底，于37°C培養(yǎng)箱內過夜，吸除培養(yǎng)瓶內多聚賴氨酸，PBS洗三遍，放于37°C培養(yǎng)箱內干燥備用。擬行免疫熒光鑒定的細胞接種于6孔板，培養(yǎng)板中預先放置27_X 29_的蓋玻片，并如上所述方法用多聚賴氨酸提前處理。
[0028]1.2.3原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞懸液的制備
[0029]將出生l-3d的SD大鼠浸泡至75%酒精中進行消毒5min，超凈工作臺內無菌取眼球，于冰浴PBS (含青霉素100U / ml青霉素及100 μ g / ml鏈霉素)洗3遍，顯微鏡下自角鞏膜緣后約1_處作環(huán)形切口，去除眼前節(jié)組織及玻璃體，鈍性分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，冰浴PBS漂洗2遍。顯微眼科剪將取出的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層剪成約Imm2大小的組織塊，收集于離心管內。加入 約10倍體積的0.125%胰蛋白酶，37°C消化10-15min。含10%胎牛血清的DMEM / F12培養(yǎng)液終止消化，吸管輕輕反復吹打成單細胞懸液后400目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，1000r / min離心5min，收集細胞沉淀，含10%胎牛血清的DMEM / F12培養(yǎng)液重懸細胞。細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，調整細胞密度為IX IO6個/ ml ο
[0030]1.2.4原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的接種培養(yǎng)
[0031]細胞懸液制備好后將其接種于事先置有包被了多聚賴氨酸蓋玻片的6孔板或者多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當培養(yǎng)24h時加入終濃度為20μ8 / ml的5-溴-2’脫氧尿苷以抑制非神經(jīng)細胞的生長，48h時換液，此后每2_3d
換液一次。
[0032]1.2.5高糖模型的建立
[0033]將細胞懸液接種于24孔板中，細胞培養(yǎng)3d時，選擇30mmol / L葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細胞形態(tài)。
[0034]1.3實驗分組及方法
[0035]①正常細胞培養(yǎng)組(對照組)；②高糖損傷組(HG);③左卡尼汀保護組(LC，100 μ mo I / L) L-精氨酸保護組(L-Arg, 600 μ mo I / L);⑤左卡尼汀(50 μ mo I / L)和L-精氨酸(300 μ mo I / L)的協(xié)同保護組(LC+L-Arg-l);⑥左卡尼汀(50 μ mo I / L)和L-精氨酸(50μπιΟ1 / L)的協(xié)同保護組(LC+L-Arg-2);⑦左卡尼汀(30μπιΟ1 / L)和L-精氨酸(300ymol/L)的協(xié)司保護組(LC+L-Arg-3)。
[0036]第①組取原代視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞正常培養(yǎng)，第②組取高糖模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞進行培養(yǎng)，第③-⑦組取高糖模型的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞并加入相應的保護劑進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間在24h和48h時進行臺盼藍拒染實驗計算細胞存活率。具體步驟為:首先消化離心收集細胞，根據(jù)細胞量用適當?shù)募毎貞乙褐貞壹毎?，吸?00μ I重懸的細胞至離心管中，加Λ 100 μ I臺盼藍染色液,輕輕混勻，染色3min。吸取少量已染色的細胞,用細胞計數(shù)板計數(shù)，每個樣品至少計數(shù)500個細胞。[0037]細胞存活率=(細胞總數(shù)一藍色細胞數(shù))/細胞總數(shù)X 100 %。
[0038]1.4統(tǒng)計學處理
[0039]實驗數(shù)據(jù)以Y± s表示，Y代表均值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計學方法采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P〈0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學意義。
[0040]1.5實驗結果
[0041]該實驗結果(見表1)顯示:高糖作用下視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞凋亡率顯著升高(P〈0.01)，左卡尼汀保護組細胞凋亡率低于高糖損傷組(P〈0.05)，提示左卡尼汀能夠抑制高糖損傷所致的細胞凋亡；但三種摩爾比的左卡尼汀和L-精氨酸的協(xié)同保護組細胞凋亡率明顯低于高糖損傷組(P〈0.01)，提示左卡尼汀利L-精氨酸發(fā)揮了協(xié)同增效的作用。
[0042]表1左卡尼汀聯(lián)合L-精氨酸對糖尿病性視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷的影響
【權利要求】
1.一種藥物組合物，其特征在于，所述組合物中含有左卡尼汀和L-精氨酸，用于治療糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷。
2.根據(jù)權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩爾比為1:1~10。
3.根據(jù)權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，所述組合物的劑型為片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、溶液劑、乳劑或混懸劑。
4.左卡尼汀聯(lián)合L-精氨酸在制備治療糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷的藥物中的應用。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其中所述糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)損傷為視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷或MUller細胞損傷。
6.根據(jù)權利要求4所述的應用，其中所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩爾比為I: I ~10。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其中所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩爾比為I: 3 ~8。
8.根據(jù)權利要求6所述的應用，其中所述左卡尼汀和所述L-精氨酸的摩爾比為1: 6。
9.根據(jù)權利要求4所述的應用，其中所述左卡尼汀和所述L-精氨酸以片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、溶液劑、乳劑、混懸劑進行給藥。
【文檔編號】A61P27/02GK103948581SQ201410080375
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月26日 優(yōu)先權日:2014年2月26日
【發(fā)明者】曹玉, 王云霄, 趙振寰, 王蘭鳳, 耿清波 申請人:青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院