加成糖鏈的多肽及含有該多肽的醫(yī)藥組合物的制作方法
【專利摘要】[問題]為了提供具有均一糖鏈結構的加成糖鏈的多肽，其中所述加成糖鏈的多肽具有干擾素β活性。[解決手段]發(fā)現(xiàn)經(jīng)由包括合成加成糖鏈的肽片段、至少2個肽片段的步驟，及連接所述加成糖鏈肽片段與至少2個肽片段的步驟的方法，即可制作具有均一糖鏈結構且具有干擾素β活性的加成糖鏈的多肽。
【專利說明】加成糖鏈的多肽及含有該多肽的醫(yī)藥組合物

【技術領域】
[0001]本發(fā)明是有關加成糖鏈的多肽及含有該多肽的醫(yī)藥組合物。

【背景技術】
[0002]天然的人類干擾素β (IFN-β)為由166個氨基酸殘基構成的糖蛋白質。干擾素β為屬于細胞因子家族，已知參與免疫調節(jié)作用、抗病毒活性、細胞增殖抑制作用。此外，人類干擾素β在其氨基酸序列的第17位、31位、141位具有3個Cys，在第80位的天冬酰胺具有I個復合型N結合型的寡糖。此外，已知在第31位及141位的Cys具有二硫鍵。作為藥劑的干擾素β利用細胞表達系統(tǒng)制造，根據(jù)用于表達的宿主不同，分類為IFN-P-1a或IFN-13_lb。IFN-13-la為糖蛋白質，而IFN-13-lb不具有寡糖。而已知，具有糖鏈的IFN-β-1a與IFN-β -1b相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗腫瘤特性方面具有更強力的效倉泛。
[0003]此處，糖蛋白質中所含的糖鏈結構已知對于藥物動力學具有強的影響力。尤其，已知在糖鏈的非還原末端有無唾液酸存在，對于延長血中半衰期方面有影響。然而，有報道指出至今生物合成的IFN-P-1a在其多肽中所具有糖鏈的結構為不均一的(例如經(jīng)由CE-TOF-MS分析糖鏈結構不均一性的結果記載于非專利文獻I)。此外，對于從合成的IFN-β或天然存在的IFN-β分離糖鏈結構實質上均一的IFN-β則均無報道。導致在推測何種糖鏈結構在生物活性上重要時有障礙。
[0004]近年來，利用細胞表達系統(tǒng)的生物技術可制造含有干擾素，如胰島素、紅細胞生成素(Erythropoietin) >G-CSF的生物活性蛋白質制劑。有報道指出對于這些蛋白質制劑中，蛋白質之糖基化模式對于如折疊步驟、構象特性(conformat1n property,)、穩(wěn)定性、免疫反應、血中半衰期及生物體系中蛋白質功能等蛋白質的物理特性或化學特性造成變化(非專利文獻2)。此外，若考慮到經(jīng)由非人類型糖鏈產(chǎn)生的重大免疫原性，加成于這些蛋白質制劑的糖鏈的結構則優(yōu)選為人類型的糖鏈。
[0005]這些糖蛋白質制劑其唯一的方法是經(jīng)由細胞表達系統(tǒng)制造。然而，這些細胞表達系統(tǒng)的技術，如上所述，不能控制到糖鏈的結構，其結果，造成所制造的糖蛋白質中糖鏈的結構的不均一性(例如，非專利文獻3)。因此，有制造批次間的質量差異性或糖鏈不能最優(yōu)化等的問題。因此，長期期待可容易調整糖鏈結構的均一糖蛋白質的制備方法，但至今，對于經(jīng)由化學合成，在活體內(nèi)顯示生物活性的人類型均一糖蛋白質的合成尚無報道。
[0006]此外，根據(jù)這樣的細胞表達系統(tǒng)的技術制造的生物活性的糖蛋白質有可能含有病毒或遺傳物質。此外，在使用從源自生物的樣品所制備的糖鏈合成生物活性的糖蛋白質時，這些遺傳物質等有可能混入。為了制造安全的蛋白質制劑，期待有可適用將這些遺傳物質分解的加熱處理法。然而，現(xiàn)今對于生物活性的糖蛋白質制劑的加熱處理會使糖蛋白質失去活性，對于適用的加熱處理法尚無報道。
[0007]現(xiàn)有技術文獻
[0008]非專利文獻
[0009]非專利文獻1:Anal B1anall Chem(2011)400:295-303
[0010]非專利文獻2:Nat.B1technol.，2006，24，1241-1252
[0011]非專利文獻3:J.B1technol, 42, 117-131(1995)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012](發(fā)明要解決的問題)
[0013]本發(fā)明的目的是提供具有均一糖鏈結構的加成糖鏈的多肽，所述加成糖鏈的多肽具有干擾素β活性。
[0014](解決問題的手段)
[0015]本發(fā)明的發(fā)明人等為了解決上述問題進行深入研究，結果成功地制造具有均一糖鏈結構的加成糖鏈的多肽，所述加成糖鏈的多肽具有干擾素β活性。
[0016]亦即，本發(fā)明是有關加成糖鏈的多肽，其是選自由
[0017](a)由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽；
[0018](b)由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽中，I個或多個氨基酸缺失、經(jīng)取代或經(jīng)加成的多肽；
[0019](C)干擾素β的類似物；及
[0020](d)相對于由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性的多肽；
[0021]所組成的組的多肽中，在相當于干擾素β中第80位的氨基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性的加成糖鏈的多肽；其特征為上述加成糖鏈的多肽具有實質上均一的糖鏈。
[0022]此處，于本發(fā)明加成糖鏈的多肽之一個實施方案，其特征為上述加成糖鏈的多肽系經(jīng)由化學合成制作的。
[0023]此外，本發(fā)明的另一方面為經(jīng)由包含:合成加成糖鏈的肽片段、至少2個肽片段的步驟，以及將上述加成糖鏈的肽片段與上述至少2個肽片段連接的步驟的方法，而獲得的加成糖鏈的多肽，且
[0024]上述加成糖鏈的多肽是選自由
[0025](a)由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽；
[0026](b)在由列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽中，I個或多個氨基酸缺失、經(jīng)取代或經(jīng)加成的多肽；
[0027](C)干擾素β的類似物；及
[0028](d)相對于由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性的多肽；
[0029]所組成的組的多肽，其中，在相當于干擾素β中第80位的氨基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性。
[0030]此外，于本發(fā)明加成糖鏈的多肽的一個實施方案中，加成糖鏈的多肽為經(jīng)由包含:合成加成糖鏈的肽片段、至少2個肽片段之步驟，及將上述加成糖鏈的肽片段與上述至少2個肽片段連接的步驟的方法而獲得的加成糖鏈的多肽，
[0031]上述加成糖鏈的多肽是選自由
[0032](a)由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽；
[0033](b)在由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽中，I個或多個氨基酸缺失、經(jīng)取代或經(jīng)加成的多肽；
[0034](c)干擾素β的類似物；及
[0035](d)相對于由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性的多肽；
[0036]所組成的組的多肽，其中，在相當于干擾素β中第80位的氨基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性。
[0037]此處，在本發(fā)明加成糖鏈的多肽的一個實施方案中，其特征為上述加成糖鏈的多肽中的糖鏈為天冬酰胺結合型糖鏈。
[0038]此外，于本發(fā)明加成糖鏈的多肽的一個實施方案中，其特征為上述加成糖鏈的多肽中的糖鏈為下述式(a)表示的二唾液酸糖鏈或下述式(b)表示的去唾液酸糖鏈。
[0039][化學式I]
[0040]

【權利要求】
1.加成糖鏈的多肽，其特征在于，所述加成糖鏈的多肽是在選自由 (a)由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽； (b)在由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽中，I個或多個氨基酸缺失、經(jīng)取代或經(jīng)加成的多肽； (C)干擾素β的類似物；及 (d)相對于由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性的多肽； 所組成的組的多肽中，在相當于干擾素β中第80位的氨基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性的加成糖鏈的多肽，且所述加成糖鏈的多肽具有實質上均一的糖鏈。
2.如權利要求1所述的加成糖鏈的多肽，其中，所述加成糖鏈的多肽經(jīng)由化學合成而制備。
3.加成糖鏈的多肽,所述加成糖鏈的多肽為經(jīng)由包括合成加成糖鏈的肽片段、至少2個肽片段的步驟、及將所述加成糖鏈的肽片段與所述至少2個肽片段連接的步驟的方法而獲得的加成糖鏈的多肽，其特征在于， 所述加成糖鏈的多肽是在選自由 (a)由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽； (b)在由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽中，I個或多個氨基酸缺失、經(jīng)取代或經(jīng)加成的多肽； (C)干擾素β的類似物；及 (d)相對于由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性的多肽； 所組成的組的多肽中，在相當于干擾素β中第80位的氨基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性的加成糖鏈的多肽。
4.如權利要求3所述的加成糖鏈的多肽，其中，所述加成糖鏈的多肽中的糖鏈為天冬酰胺結合型糖鏈。
5.如權利要求4所述的加成糖鏈的多肽,其中，所述加成糖鏈的多肽中的糖鏈為下述式(a)表示的二唾液酸糖鏈或下述式(b)表示的去唾液酸糖鏈， [化學式I]
(a)[化學式2]
6.如權利要求3至5中任一項所述的加成糖鏈的多肽，其中，所述加成糖鏈的多肽在相當于干擾素β第31位及第141位的Cys形成二硫鍵。
7.如權利要求3至6中任一項所述的加成糖鏈的多肽，其中，所述加成糖鏈的多肽經(jīng)加熱處理。
8.如權利要求1或2所述的加成糖鏈的多肽，其中，所述加成糖鏈的多肽具有90%以上的純度。
9.組合物，所述組合物含有如權利要求1至7中任一項所述的加成糖鏈的多肽，其特征在于，所述組合物中的加成糖鏈的多肽是實質上均一的。
10.如權利要求9所述的組合物，其中，所述組合物中的加成糖鏈的多肽90%以上是均一的。
11.如權利要求9或10所述的組合物，其中，所述組合物中加成糖鏈的多肽具有90%以上的純度。
12.醫(yī)藥組合物，其特征為含有: (I)如權利要求1至7中任一項所述的加成糖鏈的多肽及/或其藥學上可接受的鹽，及 (II )藥理學上可接受的載體。
13.如權利要求12所述的醫(yī)藥組合物，其中， 于所述加成糖鏈的多肽中，糖鏈實質上是均一的。
14.如權利要求13所述的醫(yī)藥組合物，其中， 于所述加成糖鏈的多肽中，糖鏈90%以上是均一的。
15.如權利要求12至第14中任一項所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述加成糖鏈的多肽具有90%以上的純度。
16.如權利要求12至15中任一項所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于， 所述醫(yī)藥組合用于治療或預防干擾素β相關的疾病。
17.如權利要求16所述的醫(yī)藥組合物，其中， 所述干擾素β相關的疾病為選自由包含多形性膠質母細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤及星形細胞瘤在內(nèi)的腦腫瘤、皮膚惡性黑色素瘤、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝硬化及多發(fā)性硬化癥所組成的組的至少I種疾病。
18.干擾素β相關的疾病的治療或預防方法，其特征在于，施用有效量的如權利要求1至7中任一項所述的加成糖鏈的多肽。
19.如權利要求18所述的治療或預防方法，其中， 所述干擾素β相關的疾病為選自由包含多形性膠質母細胞瘤、成神經(jīng)管細胞瘤及星形細胞瘤在內(nèi)的腦腫瘤、皮膚惡性黑色素瘤、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝硬化及多發(fā)性硬化癥所組成的組的至少一種疾病。
20.加成糖鏈的多肽，其特征在于，所述加成糖鏈的多肽是在選自由 (a)由序列編號I表示氨基酸序列構成的多肽； (b)在由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽中，I個或多個氨基酸缺失、經(jīng)取代或經(jīng)加成的多肽； (C)干擾素β的類似物 '及 (d)相對于由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性的多肽； 所組成的組的多肽中，在相當于干擾素β中第80位的氨基酸具有糖鏈的加成糖鏈的多肽，且是在相當于干擾素β第17位、31位及141位的Cys經(jīng)保護基保護的加成糖鏈的多肽。
21.如權利要求20所述的加成糖鏈的多肽，其中，所述糖鏈為下述式(c)表示的二唾液酸糖鏈或下述式(b)表示的去唾液酸糖鏈: [化學式3]
式中，R 表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph (OMe) 2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph (NO2)2，而且，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基、Me表示甲基、Ph表不苯基； [化學式4]
22.如權利要求20或21所述的加成糖鏈的多肽，其中，在相當于所述干擾素β第17位、31位及141位的Cys被選自由Acm基、烷氧基甲基、三苯基甲基、叔丁基、苯甲基及β位經(jīng)取代的乙基所組成的組的任一種保護基保護。
23.加成糖鏈的多肽的制造方法，其特征在于，所述加成糖鏈的多肽的制造方法包括:在權利要求20至22中任一項所述的加成糖鏈的多肽中，對經(jīng)保護基保護的相當于所述干擾素β第17位、31位及141位的Cys進行脫保護的步驟。
24.如權利要求23所述的加成糖鏈的多肽的制造方法，其中，在將Cys的保護基脫保護之前，對所述加成糖鏈 的多肽進行加熱處理。
25.加成糖鏈的多肽，其特征在于，所述加成糖鏈的多肽是選自由 (a)由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽； (b)在由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽中，I個或多個氨基酸缺失、經(jīng)取代或經(jīng)加成的多肽； (C)干擾素β的類似物 '及 (d)相對于由序列編號I表示的氨基酸序列構成的多肽，具有80%以上同源性的加成糖鏈的多肽； 所組成的組的多肽中，在相當于干擾素β中第80位的氨基酸具有糖鏈的加成糖鏈的多肽，且 所述糖鏈為下述式(c)表示的存在于糖鏈非還原末端的唾液酸的羧基經(jīng)保護的二唾液酸糖鏈 [化學式5]
式中，R 表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph (OMe) 2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph (NO2)2，而且，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基，Me表示甲基，Ph表不苯基。
26.加成糖鏈的多肽的制造方法，其特征在于，所述加成糖鏈的多肽的制造方法包括對在權利要求25所述的加成糖鏈的多肽中的存在于糖鏈非還原末端的唾液酸的羧基的保護基進行脫保護的步驟。
27.如權利要求23、24及26中任一項所述的加成糖鏈的多肽的制造方法，其中，所述加成糖鏈的多肽的制造方法進一步包括將所述加成糖鏈的多肽進行折疊的步驟。
【文檔編號】A61K38/21GK104080803SQ201280058952
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權日:2011年10月1日
【發(fā)明者】坂本泉, 深江一博, 手塚克成, 田鶴圭亮, 前田政敏, 梶原康宏, 辻孝 申請人:株式會社糖鎖工學研究所