多肽、支架組合物、軟骨組織修復(fù)用組合物、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用組合物及糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn) ...的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及多肽、支架組合物、軟骨組織修復(fù)用組合物、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用組合物及 糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn)用組合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，謀求陷入功能障礙或功能衰竭的生物體組織或臟器再生的再生醫(yī)療的實(shí)用 化得到發(fā)展。再生醫(yī)療是使用細(xì)胞、支架及生長(zhǎng)因子這三種因子重新構(gòu)出僅通過(guò)生物體所 具有的自然治愈能力無(wú)法恢復(fù)的生物體組織并使其具有與原來(lái)的組織相同的形態(tài)或功能 的新的醫(yī)療技術(shù)。
[0003] 在再生醫(yī)療的領(lǐng)域中，為了補(bǔ)充由細(xì)胞進(jìn)行的組織的修復(fù)或再生等，有時(shí)利用生 物親和性高的膠原或明膠。特別是有時(shí)在骨或皮膚等三維結(jié)構(gòu)的組織的再生中使用膠原或 明膠，為了進(jìn)行更良好的組織再生，對(duì)膠原或明膠進(jìn)行了各種改良。
[0004] 已知軟骨、例如關(guān)節(jié)軟骨是由極少（2%左右）的軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的組 織，該細(xì)胞外基質(zhì)由約70%的水分、約20%的膠原、約10%的蛋白多糖構(gòu)成。細(xì)胞外基質(zhì) 中蛋白多糖是由約95%的被稱為糖胺聚糖（GAG)的多糖類和約5%的蛋白質(zhì)構(gòu)成的糖蛋 白。在這樣的軟骨中，軟骨細(xì)胞被自身產(chǎn)生的膠原或蛋白多糖將周圍包圍而得到支撐。特 別是糖胺聚糖具有在軟骨基質(zhì)內(nèi)保持水分的作用，被認(rèn)為是參與軟骨的退化抑制或修復(fù)的 物質(zhì)。因此，作為軟骨細(xì)胞的支架材料，研宄了基于軟骨細(xì)胞的基質(zhì)產(chǎn)生變得良好的支架材 料的開(kāi)發(fā)。
[0005] 作為軟骨細(xì)胞的支架材料，以往使用天然II型膠原。
[0006] 另外，在日本特表2007-528699號(hào)公報(bào)中，公開(kāi)了涂敷有強(qiáng)化了細(xì)胞結(jié)合性的RGD 富集明膠樣蛋白的細(xì)胞支撐物，并記載了這樣的細(xì)胞支撐物可以在例如皮膚移植、創(chuàng)傷治 愈或者增強(qiáng)骨或軟骨的生長(zhǎng)（再生）時(shí)使用。
[0007] 在國(guó)際公開(kāi)第2008/133196號(hào)中，公開(kāi)了具有作為細(xì)胞粘附信號(hào)的RGD序列的基 因重組明膠，并記載了能夠作為細(xì)胞粘附性基質(zhì)使用。另外，在國(guó)際公開(kāi)第2008/133196號(hào) 中，記載了在細(xì)胞治療的情況下，通常優(yōu)選成為細(xì)胞的支架的細(xì)胞粘附性的基質(zhì)材料，但記 載了在軟骨再生中，優(yōu)選可耐受強(qiáng)度的基質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明所要解決的問(wèn)題
[0009] 然而，如上述那樣，細(xì)胞外基質(zhì)中GAG是大力參與軟骨細(xì)胞代謝的基質(zhì)物質(zhì)，但就 目前使用的天然II型膠原而言，在細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生促進(jìn)的方面并不充分。另外，關(guān)于促進(jìn) 基于軟骨細(xì)胞的基質(zhì)產(chǎn)生的支架材料，以往是未知的。此外，關(guān)于從細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的觀點(diǎn) 出發(fā)可促進(jìn)軟骨組織修復(fù)的軟骨組織修復(fù)用組合物及軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用組合物、以及可良好 地促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖在細(xì)胞中的產(chǎn)生的組合物，也尚未得到提供。
[0010] 因此，本發(fā)明的課題在于提供軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生促進(jìn)優(yōu)異的支架組合 物、軟骨組織修復(fù)用組合物、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用組合物及糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn)用組合物以及用 于它們的材料。
[0011] 用于解決問(wèn)題的方法
[0012] 本發(fā)明如下。
[0013] [1] -種多肽，其具有每10kDa分子量的RGD序列的含有數(shù)為0.30個(gè)以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有數(shù)為0. 15個(gè)以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有數(shù)低于〇. 30個(gè)的氨基酸序列。
[0014] [2]根據(jù)[1]所述的多肽，其總長(zhǎng)的氨基酸殘基數(shù)為300~1400。
[0015] [3]根據(jù)[1]或[2]所述的多肽，其與天然人II型膠原的氨基酸序列的同源性達(dá)到 85%以上。
[0016] [4]根據(jù)[1]~[3]中任一項(xiàng)所述的多肽，其分子量為30kDa~80kDa。
[0017] [5]根據(jù)[1]~[4]中任一項(xiàng)所述的多肽，其等電點(diǎn)（pi)為6.0以下。
[0018] [6]根據(jù)[1]~[5]中任一項(xiàng)所述的多肽，其為重組肽。
[0019][7] -種多肽，其為下述（A)、⑶或（C)的多肽：
[0020] (A)具有序列號(hào)1~3所示的氨基酸序列的多肽，
[0021] (B)具有在序列號(hào)1~3所示的氨基酸序列中缺失、替換或附加了 1個(gè)或多個(gè)氨基 酸的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn)能力的多肽，
[0022] (C)具有與序列號(hào)1~3所示的氨基酸序列的序列同源性為80%以上的氨基酸序 列，且具有GAG產(chǎn)生促進(jìn)能力的多肽。
[0023] [8] -種多肽，其具有與序列號(hào)1~3所示的氨基酸序列的序列同源性為90%以 上的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn)能力。
[0024] [9] 一種多肽，其具有與序列號(hào)1~3所示的氨基酸序列的序列同源性為95%以 上的氨基酸序列，且具有糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn)能力。
[0025][10]-種支架組合物，其包含[1]~[9]中任一項(xiàng)所述的多肽。
[0026] [11] 一種軟骨組織修復(fù)用組合物，其包含[1]~[9]中任一項(xiàng)所述的多肽。
[0027] [12] -種軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用組合物，其包含[1]~[9]中任一項(xiàng)所述的多肽。
[0028] [13] -種糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn)用組合物，其包含[1]~[9]中任一項(xiàng)所述的多肽。
[0029] [14] [1]~[9]中任一項(xiàng)所述的多肽在支架組合物的制造中的用途。
[0030] [15] [1]~[9]中任一項(xiàng)所述的多肽在軟骨組織修復(fù)用組合物的制造中的用途。
[0031] [16] [1]~[9]中任一項(xiàng)所述的多肽在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用組合物的制造中的用途。
[0032] [17] [1]~[9]中任一項(xiàng)所述的多肽在糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn)用組合物的制造中的用 途。
[0033] [18]-種軟骨的損傷的修復(fù)或再生方法，其包含將[11]所述的軟骨組織修復(fù)用 組合物投與給軟骨的損傷部位。
[0034] 發(fā)明效果
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，能夠提供軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生促進(jìn)優(yōu)異的支架組合物、軟骨 組織修復(fù)用組合物、軟骨細(xì)胞培養(yǎng)用組合物及糖胺聚糖產(chǎn)生促進(jìn)用組合物以及用于它們的 材料。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1是表示基于實(shí)施例及比較例的各多肽的GAG產(chǎn)生促進(jìn)能力評(píng)價(jià)的結(jié)果的圖 表。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本發(fā)明中的多肽為具有每10kDa分子量的RGD序列的含有數(shù)為0.30個(gè)以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有數(shù)為0. 15個(gè)以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有數(shù)低于〇. 30個(gè)的氨基酸序列的多肽。
[0038] 本發(fā)明中，通過(guò)具有上述構(gòu)成，在軟骨細(xì)胞與本發(fā)明的多肽接觸時(shí)可促進(jìn)基于軟 骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)、特別是糖胺聚糖（以下，有時(shí)稱為GAG。）的產(chǎn)生。
[0039] 即，例如為了比天然II型膠原更加促進(jìn)GAG的產(chǎn)生，RGD序列及GFPGER序列需要 分別存在上述規(guī)定的含有數(shù)以上，另一方面，GVMGFP序列在多肽整體中需要每10kDa分子 量為〇或不超過(guò)〇. 30個(gè)。另外，本發(fā)明中，通過(guò)滿足RGD序列、GFPGER序列及GVMGFP序列 的含有數(shù)的上述的關(guān)系，可促進(jìn)基于軟骨細(xì)胞的GAG產(chǎn)生。此外推測(cè)，在與本發(fā)明的多肽接 觸后的軟骨細(xì)胞的周邊存在豐富的GAG，可得到軟骨細(xì)胞的優(yōu)異的增殖或生長(zhǎng)。但是，本發(fā) 明并不限于這些理論。
[0040] 以下，有時(shí)將本發(fā)明的多肽稱為"特定多肽"。
[0041] 以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
[0042] 本說(shuō)明書中"工序"這一用語(yǔ)不僅包括獨(dú)立的工序，在無(wú)法與其他工序明確區(qū)別的 情況下只要可達(dá)成該工序所期望的目的，也就包含在本用語(yǔ)中。
[0043] 另外，本說(shuō)明書中使用"~"表示的數(shù)值范圍表示包含"~"的前后記載的數(shù)值分 別作為最小值及最大值的范圍。
[0044] 此外，本說(shuō)明書中，關(guān)于組合物中各成分的量，在組合物中存在多種屬于各成分的 物質(zhì)的情況下，只要沒(méi)有特別說(shuō)明，是指組合物中存在的該多種物質(zhì)的合計(jì)量。
[0045] 本發(fā)明中，有時(shí)將氨基酸序列中的氨基酸殘基用本技術(shù)領(lǐng)域中公知的單字母表 述（例如，在甘氨酸殘基的情況下為"G"）或三字母表述（例如，在甘氨酸殘基的情況下為 "Gly"）來(lái)表示。
[0046] 本發(fā)明中，關(guān)于多肽的氨基酸序列的" ％ "只要沒(méi)有特別說(shuō)明，則以氨基酸（或亞 氨基酸）殘基的個(gè)數(shù)為基準(zhǔn)。
[0047] 本說(shuō)明書中，對(duì)氨基酸序列的特定的氨基酸殘基使用的"對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基"等表 述意味著表示，將進(jìn)行對(duì)比的2個(gè)以上的氨基酸序列通過(guò)該技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法在考慮 到插入、缺失、及替換的基礎(chǔ)上，按照相同的氨基酸殘基成為最多的方式排列（對(duì)齊）時(shí)，與 作為基準(zhǔn)的氨基酸序列中的特定的氨基酸殘基的位置一致的另一氨基酸序列中的氨基酸 殘基。
[0048] 本發(fā)明中，關(guān)于對(duì)比的2種多肽的氨基酸序列的"同源性"是指通過(guò)以下的式子計(jì) 算得到的值。另外，多個(gè)多肽的對(duì)比（對(duì)齊）按照相同的氨基酸殘基的數(shù)目成為最多的方 式根據(jù)常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行。
[0049] 另外，作為關(guān)于重組的多肽的同源性的判斷，按照同源性成為最高的方式，將所對(duì) 比的2種多肽分別分成達(dá)到10個(gè)氨基酸殘基以上的任意的片段，使來(lái)自一個(gè)多肽的片段與 來(lái)自所對(duì)比的另一個(gè)多肽的片段之間對(duì)應(yīng)，在對(duì)應(yīng)了的片段間將氨基酸序列進(jìn)行比較、綜 合，求出同源性。另外，關(guān)于包含多個(gè)重復(fù)序列（10個(gè)氨基酸殘基以上的序列）的多肽，將 第2個(gè)以上的重復(fù)的部分除去，求出對(duì)應(yīng)的部分的同源性（％ )。
[0050] 同源性（％)=[(相同的氨基酸殘基的數(shù)目V(對(duì)齊長(zhǎng)度）]x 100
[0051] [特定多肽]
[0052] 本發(fā)明的特定多肽具有每10kDa分子量的RGD序列的含有數(shù)為0. 30個(gè)以上、每 10kDa分子量的GFPGER序列的含有數(shù)為0. 15個(gè)以上、每10kDa分子量的GVMGFP序列的含 有數(shù)低