用突變體BaEV糖蛋白假型化的慢病毒載體的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及用于將生物材料轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的假型化病毒載體顆粒，其中所述載體顆粒至少包含：嵌合包膜糖蛋白，其包含或由狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成；或修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用突變體BaEV糖蛋白假型化的慢病毒載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及能夠有效基因轉(zhuǎn)移造血細(xì)胞的假型化慢病毒載體。

【背景技術(shù)】
[0002]基因治療對(duì)于許多遺傳性和獲得性疾病的治愈是有希望的，如其在X連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID-Xl)、腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥和慢性肉芽腫病的治療中的成功所證明的。最近，報(bào)道了使用慢病毒載體成功治療患有X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(ALD)的患者。在該試驗(yàn)中，基于造血干細(xì)胞(HSC)的基因治療能夠阻止患有這種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致命性脫髓鞘性疾病的兩名患者的疾病進(jìn)展。重要的是，為了校正造血系統(tǒng)的所有這些缺陷，必須將治療基因遞送到既能夠自我更新又能夠分化為所有造血譜系的細(xì)胞中。由于HSC符合這些標(biāo)準(zhǔn)，所以它們代表基因治療應(yīng)用的有吸引力的候選。
[0003]然而，HSC的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)中的主要障礙在于，75%的HSC停留在細(xì)胞周期的Gtl期，并且對(duì)于經(jīng)典慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)不是非常容許。該限制阻礙了常規(guī)慢病毒載體用于HSC基因治療的應(yīng)用，因?yàn)樗鼈儾辉试S有效地將基因轉(zhuǎn)移到靜態(tài)(Gtl)HSC的亞群(Sutton等人(1999) J.Virol.73:3649-3660)。為了克服該限制，許多使用慢病毒載體用于hCD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究采用高載體輸入且存在非常強(qiáng)的細(xì)胞因子雞尾酒(TP0、SCF、Flk-3、IL-6、IL-3)以誘導(dǎo)HSC周期進(jìn)入。很多時(shí)候，纖維連接蛋白(纖連蛋白的片段)用于共定位載體顆粒和靶細(xì)胞，或應(yīng)用多次載體施用以實(shí)現(xiàn)HSC中的高基因轉(zhuǎn)移率。然而，延長(zhǎng)細(xì)胞因子刺激的不良影響是人HSC的多潛能和長(zhǎng)期移植的降低。而且，過(guò)高的載體劑量產(chǎn)生多拷貝整合(特別是插入突變)的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]因此，對(duì)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)靜態(tài)HSC且限制性多拷貝整合的風(fēng)險(xiǎn)的病毒載體存在需要。
[0005]有效地將基因轉(zhuǎn)移到靜態(tài)T和B淋巴細(xì)胞中用于基因治療或免疫治療目的可以允許治療造血系統(tǒng)的幾種遺傳障礙(諸如免疫缺陷)，和對(duì)于癌癥和獲得性疾病開(kāi)發(fā)新的治療策略。慢病毒載體(LV)不能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)一些特定的靜態(tài)細(xì)胞類(lèi)型，諸如靜息T細(xì)胞和B細(xì)胞(Bovia 等人(2003)BloodlOl:1727-1733 ;Verhoeyen 等人(2003)BloodlOl:2167-2174)。在T細(xì)胞中，用水皰性口炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的慢病毒載體的基因組的逆轉(zhuǎn)錄、核輸入(nuclear import)和隨后整合的完成無(wú)法有效進(jìn)行，除非它們經(jīng)由T細(xì)胞受體或通過(guò)誘導(dǎo)它們進(jìn)入細(xì)胞周期的Glb期的存活-細(xì)胞因子而活化。B細(xì)胞的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是另一回事，因?yàn)樯踔罛細(xì)胞受體(BCR)刺激誘導(dǎo)增殖也不足以允許VSV-G假型化慢病毒載體(VSV-G-LV)的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0006]因此，對(duì)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)靜息T細(xì)胞和B細(xì)胞的病毒載體存在重要需要。
[0007]為了通過(guò)慢病毒載體將基因遞送至造血細(xì)胞中，需要將允許有效的載體-細(xì)胞融合的“進(jìn)入”包膜蛋白遞呈在其表面。將異源包膜糖蛋白引入慢病毒載體的核心上的過(guò)程被稱(chēng)為“假型化”。與由HIV-1衍生的病毒核心相關(guān)的VSV-G已經(jīng)使用很長(zhǎng)時(shí)間。盡管如此，使用VSV-G-LV 存在缺點(diǎn)。毒性與VSV-G的長(zhǎng)期表達(dá)相關(guān)，這使得生成穩(wěn)定細(xì)胞系變得困難。此外，VSV-G-LV對(duì)人補(bǔ)體敏感，這使得它們不適合體內(nèi)使用。只有高VSV-G-LV劑量(感染復(fù)數(shù)=50-100的MOI)允許高效h⑶34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，這增加了多拷貝整合的風(fēng)險(xiǎn)，從而增加了遺傳毒性的風(fēng)險(xiǎn)(Di Nunz1等人(2007)Hum.GeneTher.18:811-820)。人類(lèi)也可以發(fā)展針對(duì)VSV-G的強(qiáng)烈免疫應(yīng)答，這可能降低第二次施用VSV-G-LV的效力。所有這些證據(jù)限制VSV-G-LV的體外和體內(nèi)使用。
[0008]包含與鼠白血病病毒A (MLV-A)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾(被稱(chēng)為T(mén)R)融合的RDl 14貓白血病病毒包膜糖蛋白的胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域的嵌合包膜糖蛋白(下文稱(chēng)為RD114/TR且在國(guó)際申請(qǐng)WO 03/091442中描述)似乎是一種相當(dāng)好的替代性包膜。事實(shí)上，該假型對(duì)人補(bǔ)體系統(tǒng)不敏感，這使得其對(duì)體內(nèi)應(yīng)用具有吸引力。RD114/TR-LV允許有效轉(zhuǎn)導(dǎo)人和獼猴⑶34+細(xì)胞。然而，轉(zhuǎn)導(dǎo)水平保持遠(yuǎn)低于VSV-G-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平，且RDl 14的滴度遠(yuǎn)低于VSV-G-LV的滴度。此外，RD114/TR糖蛋白不能有效進(jìn)入鼠細(xì)胞。所以，該受體特異性限制了該LV起作用的潛力，因?yàn)榇蠖鄶?shù)適合用于基因治療的臨床前疾病模型是小鼠模型。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明源自本發(fā)明人的意外發(fā)現(xiàn):用嵌合包膜糖蛋白(其包含或由狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成)或修飾的BaEV包膜糖蛋白(其中胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽)假型化的慢病毒載體顯示特別適合于將基因轉(zhuǎn)移到造血細(xì)胞(包括HSC和靜息T細(xì)胞和B細(xì)胞)中的轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。事實(shí)上，在溫和細(xì)胞因子刺激后，這些新的LV假型可以低載體劑量非常有效且穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)多達(dá)70%的h⑶34+細(xì)胞。對(duì)于獼猴和人⑶34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，BaEV-LV遠(yuǎn)勝過(guò)VSV-G和RD114/TR-LV。此外，本發(fā)明人表明，BaEV-LV轉(zhuǎn)導(dǎo)非常早期的h⑶34+祖細(xì)胞 (包括HSC)，因?yàn)檫@些細(xì)胞能夠重構(gòu)免疫缺陷小鼠模型，并且在幾種造血組織中和那些組織中在不同的血細(xì)胞譜系中發(fā)現(xiàn)高水平轉(zhuǎn)導(dǎo)的血細(xì)胞。重要的是，BaEV-LV能夠以高水平轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-7預(yù)刺激的記憶性和初始T細(xì)胞(naive T cell)。此外，與VSV-G-LV和RD114/TR-LV相反，這些BaEV-LV也允許高水平轉(zhuǎn)導(dǎo)靜息和BCR刺激的B細(xì)胞而不誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)換。
[0011]因此，本發(fā)明涉及用于將生物材料轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的假型化病毒載體顆粒，其中所述載體顆粒至少包含:
[0012]-嵌合包膜糖蛋白，其包含或由狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成；或
[0013]-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽。
[0014]本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒，其用于治療造血功能障礙。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及包含作為活性成分的根據(jù)本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒的藥物。
[0016]本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒用于將生物材料離體轉(zhuǎn)移到造血細(xì)胞中的用途。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及一種用于轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的方法，其包括在實(shí)現(xiàn)通過(guò)假型化病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的條件下將造血細(xì)胞與根據(jù)本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒接觸。
[0018]本發(fā)明還涉及產(chǎn)生如上述定義的假型化病毒載體顆粒的穩(wěn)定病毒包裝細(xì)胞系。
[0019]發(fā)明詳述
[0020]假型化病毒載體顆粒
[0021]本發(fā)明涉及用于將生物材料轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的假型化病毒載體顆粒，其中所述載體顆粒至少包含:
[0022]-嵌合包膜糖蛋白，包含或由狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成；或
[0023]-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽。
[0024]如本文所預(yù)期，術(shù)語(yǔ)“載體顆粒”是指易于在其表面顯示嵌合包膜糖蛋白或修飾的BaEV包膜糖蛋白并可逆地結(jié)合生物材料的任何顆粒。優(yōu)選的是，此類(lèi)載體顆粒是病毒載體顆粒，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒。優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒選自癌病毒載體顆粒，包括鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、呼吸道合胞病毒(RSV)或Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)載體顆粒；慢病毒載體顆粒，諸如人免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-1或HIV-2、猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)和山羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒(CAEV)載體顆粒；和泡沫病毒載體顆粒，諸如人泡沫病毒(HFV)載體顆粒。
[0025]慢病毒載體顆粒是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且特別在Naldini等人(2000)Adv.Virus.Res.55:599-609 和 Negre 等人(2002) B1chimie84:1161-1171 中描述。通常，根據(jù)本發(fā)明的慢病毒載體顆粒至少包含以下組分:(i)包膜組分，其由與包膜蛋白結(jié)合的磷脂雙分子層構(gòu)成，其中所述包膜蛋白至少包含上述定義的嵌合或修飾的糖蛋白，所述包膜環(huán)繞Qi)由gag蛋白結(jié)合構(gòu)成的核心組分,所述核心本身環(huán)繞(iii)通常由核糖核酸(RNA)構(gòu)成的基因組組分和(iv)酶組分(pol)。所述生物材料可以存在于包膜內(nèi)、核心內(nèi)和/或基因組組分內(nèi)。
[0026]慢病毒載體顆?？梢匀菀椎赜杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員，例如，通過(guò)遵循由Sandrin等人(2002)BloodlOO:823-832提供的通用指導(dǎo)來(lái)制備。簡(jiǎn)而言之，慢病毒載體顆?？赏ㄟ^(guò)在所謂生產(chǎn)細(xì)胞(例如293T人胚胎腎細(xì)胞)中共表達(dá)包裝元件(即核心和酶組分)、基因組組分和包膜組分來(lái)生成。通常可以采用3至4種質(zhì)粒，但數(shù)目可以根據(jù)慢病毒組分被分解成單獨(dú)單元的程度而更多。
[0027]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“假型化病毒載體”是指包含外來(lái)病毒包膜糖蛋白的病毒載體。通常，根據(jù)本發(fā)明的病毒載體用上文定義的嵌合或修飾的糖蛋白假型化。
[0028]狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒或BaEV是以多個(gè)前病毒拷貝存在于狒狒DNA中的C型逆轉(zhuǎn)錄病毒。BaEV包膜糖蛋白特別地在Benveniste等人(1974)Nature248:17-20和Todaro等人(1974)Cell2:55-61 中描述。
[0029]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“BaEV包膜糖蛋白”是指BaEV包膜糖蛋白的野生型形式或與所述野生型BaEV包膜糖蛋白至少80%、優(yōu)選至少85%、還優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95 %、還更優(yōu)選至少99 %相同的所述野生型BaEV包膜糖蛋白的突變體，條件是所述突變體糖蛋白保留野生型糖蛋白結(jié)合造血細(xì)胞膜并與造血細(xì)胞膜融合的能力。
[0030]通常，野生型BaEV包膜糖蛋白由核酸序列SEQ ID N0:1編碼。優(yōu)選地，它由序列SEQ ID N0:2組成。如技術(shù)人員已知的，BaEV包膜糖蛋白由胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。包膜糖蛋白序列中對(duì)應(yīng)于胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域的區(qū)域可以由技術(shù)人員容易地確定。通常，胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸530至564之間。優(yōu)選地，BaEV包膜糖蛋白的野生型胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域包含或由氨基酸序列SEQID NO:3組成。通常，跨膜結(jié)構(gòu)域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸507至529之間。優(yōu)選地，BaEV包膜糖蛋白的野生型跨膜結(jié)構(gòu)域包含或由氨基酸序列SEQ ID N0:4組成。通常，胞外結(jié)構(gòu)域位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸I至506之間。優(yōu)選地，BaEV包膜糖蛋白的野生型胞外結(jié)構(gòu)域包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:5組成。
[0031]在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，BaEV包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽。
[0032]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“融合抑制性R肽”是指包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的C-末端部分，其攜帶酪氨酸內(nèi)吞信號(hào)-YXXL，并在病毒顆粒成熟過(guò)程中被病毒蛋白酶裂解，從而增強(qiáng)包膜糖蛋白的膜融合。BaEV包膜糖蛋白的融合抑制性R肽通常位于野生型BaEV包膜糖蛋白的氨基酸547和564之間。優(yōu)選地，BaEV包膜糖蛋白的融合抑制性R肽包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:6組成。
[0033]因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽的修飾的BaEV包膜糖蛋白包含或由氨基酸序列SEQ ID N0:7組成。此類(lèi)修飾的BaEV包膜糖蛋白在下文中稱(chēng)為“BaEVRLess”。
[0034]在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，BaEV包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域被鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域替代。
[0035]鼠白血病病毒包膜糖蛋白特別地在Ott等人(1990) J.Virol.64:757-766中描述。鼠白血病病毒包膜糖蛋白優(yōu)選是菌株4070A的包膜糖蛋白。
[0036]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“MLV包膜糖蛋白”是指MLV包膜糖蛋白的野生型形式或與所述野生型MLV包膜糖蛋白至少80%、優(yōu)選至少85%、還優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95 %、還更優(yōu)選至少99 %相同的所述野生型MLV包膜糖蛋白的突變體，條件是所述突變體糖蛋白保留野生型包膜糖蛋白與病毒核心蛋白、特別是慢病毒核心蛋白相互作用的能力。
[0037]包膜糖蛋白序列中對(duì)應(yīng)于胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的區(qū)域可以由技術(shù)人員容易地確定。通常，MLV包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域位于野生型MLV包膜糖蛋白的氨基酸622至654之間。優(yōu)選地，MLV包膜糖蛋白的野生型胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域包含或由氨基酸序列SEQ ID NO:8組成。
[0038]因此，在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，包含或由BaEV包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與MLV包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成的嵌合包膜糖蛋白包含或由氨基酸序列SEQ ID N0:9組成。此類(lèi)嵌合包膜糖蛋白在下文中稱(chēng)為“BaEV/TR”。
[0039]本發(fā)明人證明了 BaEV/TR和BaEVRLess糖蛋白比野生型BaEV糖蛋白以更高的水平結(jié)合至慢病毒表面上。
[0040]本發(fā)明人進(jìn)一步證明，病毒載體顆粒上共同顯示特定細(xì)胞因子使得增強(qiáng)目標(biāo)細(xì)胞的革巴向轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0041]因此，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的病毒載體顆?？蓛?yōu)選在其表面上進(jìn)一步顯示，選自干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TP0)、IL-2、IL-15和IL-7的至少一種細(xì)胞因子。
[0042]優(yōu)選地，所述至少一種細(xì)胞因子選自人SCF、人ΤΡ0、人IL-2、人IL-15和人IL_7。
[0043] 在本發(fā)明的上下文中，細(xì)胞因子可以是野生型細(xì)胞因子或任何與所述野生型細(xì)胞因子至少80 %、優(yōu)選至少85 %、還優(yōu)選至少90 %、更優(yōu)選至少95 %、還更優(yōu)選至少99 %相同的所述野生型細(xì)胞因子的突變體，條件是所述突變體細(xì)胞因子呈現(xiàn)與衍生其的野生型細(xì)胞因子基本上相同的特性。
[0044]野生型SCF細(xì)胞因子優(yōu)選包含或由序列SEQ ID NO:10組成。野生型TPO優(yōu)選包含或由序列SEQ ID N0:11組成。野生型IL-2優(yōu)選包含或由序列SEQ ID N0:12組成。野生型IL-7優(yōu)選包含或由序列SEQ ID NO: 13組成。野生型IL-15優(yōu)選包含或由序列SEQ IDNO: 14組成。
[0045]相同性百分比可以通過(guò)執(zhí)行基于Needleman-Wunsch比對(duì)算法的成對(duì)總體比對(duì)來(lái)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)序列沿其整個(gè)長(zhǎng)度的最佳比對(duì)(包括空位)(例如，使用Needle)和使用BL0SUM62矩陣(空位開(kāi)放罰分為10且空位延伸罰分為0.5)來(lái)計(jì)算。
[0046]在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒通過(guò)本文以下部分“用于產(chǎn)生假型化病毒載體顆粒的方法”中描述的方法可獲得或獲得。
[0047]生物材料
[0048]本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒對(duì)于將生物材料轉(zhuǎn)移入細(xì)胞、特別是造血細(xì)胞是特別感興趣的。
[0049]因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上定義的假型化病毒載體顆粒進(jìn)一步包含生物材料。
[0050]如本文中所預(yù)期，表述“生物材料”涉及易于改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和/或功能的一種或多種化合物。在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選的是，所述生物材料是一種或多種核酸，在慢病毒載體顆粒的情況下，其可以包含在載體顆粒的基因組內(nèi)?；蚪M通常包含一種或多種核酸，其優(yōu)選連接至對(duì)于其在靶細(xì)胞中表達(dá)所需的基因元件，諸如啟動(dòng)子和終止子，側(cè)翼為對(duì)于在核心元件中包括基因組、其逆轉(zhuǎn)錄成脫氧核糖核酸(DNA)、逆轉(zhuǎn)錄的基因組輸入靶細(xì)胞的核和逆轉(zhuǎn)錄的基因組整合在靶細(xì)胞的基因組內(nèi)所需的順式作用元件。
[0051]目標(biāo)核酸的實(shí)例包括球蛋白基因，造血生長(zhǎng)因子，其包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)；白細(xì)胞介素(特別是白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素12等)和細(xì)胞集落刺激因子(諸如粒細(xì)胞集落刺激因子，粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子，或干細(xì)胞集落刺激因子)；血小板特異性整合素a IIbii ;多藥耐藥基因；患有慢性肉芽腫病(CGD)的患者中缺陷的gp91或gp47基因；使細(xì)胞耐受病原體諸如人免疫缺陷病毒感染的抗病毒基因；編碼以下的基因:在血友病患者中突變的凝血因子VIII或IX、參與T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的配體諸如T細(xì)胞抗原受體、B細(xì)胞抗原受體(免疫球蛋白)、白細(xì)胞介素受體常見(jiàn)Y鏈、單獨(dú)的T和B細(xì)胞抗原受體的組合和/或T和B細(xì)胞抗原受體與單鏈抗體(ScFv)的組合、IL2、IL12、TNF、Y干擾素、CTLA4、B7等；腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的基因，諸如 Me I ana、MAGE 基因(諸如 MAGE-1、MAGE-3)、PI98、P1A、gplOO 等。
[0052]如本文所預(yù)期，“轉(zhuǎn)移”涉及載體顆粒在結(jié)合靶細(xì)胞后初始將生物材料遞送至靶細(xì)胞的膜或細(xì)胞質(zhì)的能力。遞送后，生物材料可以被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的其它隔室。
[0053]如本文中所預(yù)期，待轉(zhuǎn)移生物材料的受體細(xì)胞或靶細(xì)胞涉及易于被上述定義的載體顆粒結(jié)合的任何細(xì)胞。當(dāng)載體顆粒是慢病毒載體顆粒時(shí)，祀細(xì)胞涉及易于被載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的任何細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選是造血細(xì)胞，特別是人造血細(xì)胞。
[0054]造血細(xì)胞
[0055]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“造血細(xì)胞”通常是指血細(xì)胞，來(lái)自髓樣和淋巴樣譜系兩者。特別地，術(shù)語(yǔ)“造血細(xì)胞”包括未分化或分化不良的細(xì)胞，諸如造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，和分化細(xì)胞，諸如T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞。優(yōu)選地，造血細(xì)胞選自造血干細(xì)胞，⑶34+祖細(xì)胞，特別是外周血⑶34+細(xì)胞，非常早期⑶34+祖細(xì)胞，B細(xì)胞⑶19+祖細(xì)胞，髓樣⑶13+祖細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，腫瘤B細(xì)胞，特別是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(BCLL)細(xì)胞和邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)B細(xì)胞和胸腺細(xì)胞。
[0056]如技術(shù)人員已知，每個(gè)造血細(xì)胞都從骨髓造血干細(xì)胞產(chǎn)生。
[0057]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“造血干細(xì)胞”或“HSC”是指能夠補(bǔ)充所有血細(xì)胞類(lèi)型并自我更新的細(xì)胞。造血干細(xì)胞特別可以被定義為當(dāng)被注入造血系統(tǒng)被耗盡的受體小鼠的循環(huán)中時(shí)將髓樣細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞維持在穩(wěn)健可檢測(cè)水平(通常大于外周血細(xì)胞的1% )持續(xù) 16 周的細(xì)胞(Schroeder (2010)Cell Stem Cell6:203-207)。
[0058]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“⑶34+祖細(xì)胞”是指包括HSC亞群、多能干細(xì)胞和譜系發(fā)生(lineage commitment)的早期階段的細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群體。在正常成年動(dòng)物中，⑶34+祖細(xì)胞連續(xù)遷移到骨髓并從骨髓遷移出。它們可以分化以產(chǎn)生在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的所有造血細(xì)胞譜系。表述“外周血⑶34+細(xì)胞”更具體是指血液中存在的⑶34+細(xì)胞。
[0059]本發(fā)明人用強(qiáng)細(xì)胞因子雞尾酒(SCF、TPO和Flt3-L)預(yù)刺激人⑶34+早期祖細(xì)胞并用BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)它們。他們證明，假型化慢病毒載體顆?？捎行У剞D(zhuǎn)導(dǎo)人⑶34+早期祖細(xì)胞，特別是在存在纖維連接蛋白的情況下轉(zhuǎn)導(dǎo)超過(guò)70%。
[0060]發(fā)明人進(jìn)一步證明用BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒獲得的高人CD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)是由于短期祖細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。事實(shí)上，在SCF/TP0預(yù)刺激后BaEV/TR和BaEVRLess慢病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+細(xì)胞與由它們衍生的集落形成祖細(xì)胞的比例之間沒(méi)有顯著差異。相反，對(duì)于用VSV-G假型化的慢病毒載體顆粒，轉(zhuǎn)導(dǎo)的集落形成祖細(xì)胞的比例顯著低于衍生它們的轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶34+細(xì)胞的比率。
[0061]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“非常早期CD34+祖細(xì)胞”是指在HSC中富集的CD34+祖細(xì)胞的亞群。
[0062]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“B細(xì)胞⑶19+祖細(xì)胞”是指表達(dá)細(xì)胞表面⑶10、⑶34和⑶19的B譜系細(xì)胞群體。
[0063]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“髓樣⑶13+祖細(xì)胞”是指表達(dá)細(xì)胞表面⑶34和⑶13和任選CD33的髓樣譜系細(xì)胞群體。
[0064]本發(fā)明人證明了 BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒能夠高效轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠再植免疫缺陷小鼠的造血祖細(xì)胞。他們?cè)u(píng)價(jià)了這些假型化慢病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的人⑶34+細(xì)胞在Rag2+ Y +Balbc免疫缺陷小鼠模型和NOD/SCID/ y c-/_ (NSG)小鼠模型中的長(zhǎng)期重構(gòu)能力。他們證明了非常早期⑶34+祖細(xì)胞，以及B細(xì)胞⑶19+祖細(xì)胞和髓樣⑶13+細(xì)胞通過(guò)本發(fā)明的BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒以低感染性載體顆粒劑量轉(zhuǎn)導(dǎo)至相同的程度。此外，BaEV/TR-LV和BaEVRLess-LV轉(zhuǎn)導(dǎo)的hCD34+細(xì)胞導(dǎo)致骨髓中的高重構(gòu)水平和骨髓中SCID再植細(xì)胞的最高轉(zhuǎn)導(dǎo)水平(高達(dá)90%⑶45+GFP+細(xì)胞)。他們還證明，在初級(jí)受體小鼠中在所有造血組織(骨髓、胸腺、脾臟)中都持續(xù)這些高轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。對(duì)于骨髓中的未成熟的祖細(xì)胞(hCD34+細(xì)胞)、淋巴樣細(xì)胞(CD19+)和髓樣細(xì)胞(CD13+和CD14+)檢測(cè)到相同高水平轉(zhuǎn)導(dǎo)。相反，用VSV-G假型化的慢病毒載體顆粒以低得多的水平轉(zhuǎn)導(dǎo)早期CD34+祖細(xì)胞、CD13+髓樣祖細(xì)胞和單核細(xì)胞。對(duì)于用RD114/TR假型化的慢病毒載體顆粒，還檢測(cè)到所有不同骨髓細(xì)胞譜系的低轉(zhuǎn)導(dǎo)。在脾中，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞和單核細(xì)胞的相同圖象。RD114/TR-LV表明SCID再植細(xì)胞的可變轉(zhuǎn)導(dǎo)水平(范圍為3.2-76%的GFP+CD45+ 細(xì)胞)。
[0065]本發(fā)明人還表明，在免疫缺陷小鼠中，在脾臟和骨髓中，在從初始受體分離的h⑶34+細(xì)胞的二次移植后，GFP+h⑶45+細(xì)胞的百分比維持或增加。此外，對(duì)于BaEV/TR-和BaEVRLess-LV兩者，在這些二級(jí)受體小鼠的骨髓中檢測(cè)到高水平的GFP+h⑶34+早期祖細(xì)胞、淋巴樣(⑶19+)和髓樣(⑶13+)細(xì)胞，并且在這些不同譜系中檢測(cè)到相同百分比的GFP+細(xì)胞。因此本發(fā)明人表明，二級(jí)重構(gòu)SCID再植細(xì)胞能夠多向分化，并且真正人HSC被BaEV/TR-和BaEVRLess-LV基因修飾至高水平。
[0066]本發(fā)明人還表明，BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒允許有效轉(zhuǎn)導(dǎo)人T細(xì)胞，特別是IL-7預(yù)刺激的人T細(xì)胞。在存在纖維連接蛋白的情況下，對(duì)于相同載體劑量，這些假型化的慢病毒載體顆粒優(yōu)于用VSV-G假型化的慢病毒載體顆粒。重要的是，BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒允許有效轉(zhuǎn)導(dǎo)初始和記憶IL-7預(yù)刺激的T細(xì)胞兩者。事實(shí)上，它們?cè)试S轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-7刺激的T細(xì)胞而不折損它們的初始表型。高度感興趣的是，它們?cè)贛OI為10時(shí)也允許T細(xì)胞受體(TCR)刺激后接近100%的T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移。
[0067]因此，在一個(gè)特定實(shí)施方案中，造血靶細(xì)胞是T細(xì)胞，優(yōu)選初始或記憶T細(xì)胞。
[0068]BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒也允許高效轉(zhuǎn)導(dǎo)20_30 %的靜息B細(xì)胞，因此遠(yuǎn)勝過(guò)用VSV-G或RD114/TR假型化的慢病毒載體顆粒(其無(wú)法轉(zhuǎn)導(dǎo)或非常低效地轉(zhuǎn)導(dǎo)靜息人B細(xì)胞)。而且，B細(xì)胞受體(BCR)刺激后，BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)高達(dá)70%的B細(xì)胞，而用VSV-G假型化的慢病毒載體顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不超過(guò)5%。重要的是，BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)記憶以及初始B細(xì)胞。
[0069]因此，在一個(gè)特定實(shí)施方案中，造血靶細(xì)胞是B細(xì)胞，特別是靜息B細(xì)胞，優(yōu)選初始或記憶B細(xì)胞。它也可以是癌B細(xì)胞，特別是B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(BCLL)細(xì)胞或邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)B細(xì)胞。
[0070]因?yàn)樾叵偌?xì)胞基因轉(zhuǎn)移對(duì)于免疫調(diào)節(jié)的潛在價(jià)值，本發(fā)明人評(píng)價(jià)了 BaEVgp-LV與其他LV假型相比用于轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的胸腺細(xì)胞亞群的表現(xiàn)。從人胸腺分離胸腺細(xì)胞之后，他們?cè)诖嬖诖婊罴?xì)胞因子IL-7的情況下用編碼GFP報(bào)道分子的VSV-G-、RD114/TR-、BaEV/TR-和 BaEVRLess-LV 以 10 的 MOI 轉(zhuǎn)導(dǎo)它們。發(fā)明人表明，RD114/TR-LV、BaEV/TR-LV 和BaEVRLess-LV允許優(yōu)先轉(zhuǎn)導(dǎo)在早期發(fā)育階段的胸腺細(xì)胞(雙陰性和未成熟的CD4單陽(yáng)性細(xì)胞)，而它們轉(zhuǎn)導(dǎo)更成熟細(xì)胞仍然處于較低水平。如已經(jīng)對(duì)于成人T細(xì)胞所檢測(cè)的，BaEVgpLV比RD114/TR-LV更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)所有不同的胸腺細(xì)胞亞群。而且，用不同的慢病毒載體假型轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)不同胸腺細(xì)胞亞群的分布沒(méi)有影響。因此本發(fā)明人證明，BaEVgp-LV是用于轉(zhuǎn)導(dǎo)胸腺細(xì)胞的優(yōu)異工具，且它們對(duì)于轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟的雙陰性(DN)和未成熟的CD4單陽(yáng)性細(xì)胞(ISP)胸腺細(xì)胞亞群尤其優(yōu)于VSV-G-和RD114/TR-LV。
[0071]因此，在一個(gè)特定實(shí)施方案中，造血靶細(xì)胞是胸腺細(xì)胞。
[0072]最后，本發(fā)明人用T細(xì)胞存活細(xì)胞因子IL-7預(yù)刺激新鮮分離的總CBT細(xì)胞來(lái)保持T細(xì)胞初始表型，并隨后以10或20的Μ0Ι、或?qū)τ赩SV-G-LV以50的MOI用編碼GFP報(bào)道分子的不同載體:VSV-G-、RD114/TR-、BaEV/TR-和BaEVRLess-LV轉(zhuǎn)導(dǎo)它們。他們表明，BaEV/TR-和BaEVRLess-LV在MOI = 10時(shí)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(40-50%轉(zhuǎn)導(dǎo))高度優(yōu)于VSV-G或RDl 14/TR-LV。重要的是，當(dāng)載體劑量2倍增加時(shí)，BaEV/TR-和BaEVRLess-LV容易達(dá)到65%轉(zhuǎn)導(dǎo)(Μ0Ι = 20)。在所有情況下，初始近期胸腺細(xì)胞遷移者(⑶69L+⑶45RA+CD31+)轉(zhuǎn)導(dǎo)的程度與更成熟的初始CB T細(xì)胞0:D69L+ra45RA+ra31-)相同。而且，轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)這兩種初始CB T細(xì)胞群體的分布沒(méi)有影響。
[0073]因此，在一個(gè)特定實(shí)施方案中，造血靶細(xì)胞是初始細(xì)胞。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“初始細(xì)胞”是指還沒(méi)有經(jīng)歷響應(yīng)刺激的細(xì)胞活化的細(xì)胞。特別地，“初始細(xì)胞”可以是尚未暴露于抗原的細(xì)胞。
[0074]因?yàn)榧?xì)胞因子雞尾酒的強(qiáng)烈刺激誘導(dǎo)HSC分化和其自我更新能力的喪失，特別感興趣的是，預(yù)刺激盡可能少的細(xì)胞，以盡可能避免它們分化和保持更多它們的“干細(xì)胞特征”。
[0075]本發(fā)明人對(duì)于人CD34+早期祖細(xì)胞采用固定的10的MOI (感染性顆粒的數(shù)量/每個(gè)細(xì)胞)的本發(fā)明的假型化病毒載體和不同的細(xì)胞因子預(yù)刺激方案:1)無(wú)刺激；2)用SCF或TPO刺激；3)用SCF和TPO刺激；4)用SCF、TP0和Flt3_L刺激。重要的是，使用的最強(qiáng)細(xì)胞因子預(yù)刺激比目前在臨床設(shè)置中使用的目標(biāo)在于限制細(xì)胞分化的預(yù)刺激雞尾酒更低。本發(fā)明人證明了 BaEV/TR和BaEVRLess慢病毒載體顆粒能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)10-20%的未刺激的人CD34+早期祖細(xì)胞，而用VSV-G或RDl 14/TR假型化的慢病毒載體(如國(guó)際申請(qǐng)W02009/013324中描述)在相同載體劑量未能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)未刺激的靜態(tài)人CD34+早期祖細(xì)胞。而且，對(duì)于BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體，單一 TPO刺激足以轉(zhuǎn)導(dǎo)高達(dá)60%的人⑶34+早期祖細(xì)胞，而用VSV-G或RDl 14/TR假型化的慢病毒載體在這些條件下僅轉(zhuǎn)導(dǎo)8-20%的人⑶34+早期祖細(xì)胞。SCF單一預(yù)刺激允許用BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)高達(dá)30-50%的人⑶34+早期祖細(xì)胞，而用VSV-G或RD114/TR假型化的慢病毒載體只達(dá)到10%的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。最后，TPO和SCF預(yù)刺激或TP0、SCF和Flt3_L預(yù)刺激與單一 BaEV/TR或BaEVRLess假型化的慢病毒載體孵育的組合導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)高達(dá)75%的人⑶34+早期祖細(xì)胞，而用RD114/TR假型化的慢病毒載體只實(shí)現(xiàn)40%的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0076]因此，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，造血靶細(xì)胞沒(méi)有用至少一種細(xì)胞因子預(yù)刺激。特別地，它沒(méi)有用SC、TPO和/或Flt3-L預(yù)刺激。
[0077]在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，造血靶細(xì)胞僅用SCF或TPO預(yù)刺激。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，造血靶細(xì)胞僅用SCF和TPO預(yù)刺激。
[0078]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“預(yù)刺激(prestimulat1n)”或“預(yù)刺激的(prestimulated) ”是指造血細(xì)胞以適于誘導(dǎo)造血細(xì)胞的特定活化的濃度或持續(xù)適于誘導(dǎo)造血細(xì)胞的特定活化的時(shí)間與至少一種細(xì)胞因子接觸。
[0079]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“fms樣酪氨酸激酶受體-3配體”、“Flt3配體”或“Flt3_L”是指通過(guò)活化造血祖細(xì)胞增加免疫細(xì)胞的數(shù)量的細(xì)胞因子。Flt3-L優(yōu)選是人Flt3-L，更優(yōu)選包含或由SEQ ID NO:15組成。
[0080]用于產(chǎn)生假型化病毒載體顆粒的方法
[0081]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生假型化病毒載體顆粒的方法，其包括:
[0082]a)用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以得到生產(chǎn)細(xì)胞:
[0083](i)至少一種第一核酸序列，包含具有包裝能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的基因組；
[0084](ii)至少一種第二核酸序列，包含編碼來(lái)自所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的核心蛋白的cDNA ;和
[0085](iii)至少一種第三核酸序列，包含編碼以下的cDNA:
[0086]-嵌合包膜糖蛋白，包含或由狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成，如上所定義；或
[0087]-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽，如上所定義；
[0088]b)將生產(chǎn)細(xì)胞在培養(yǎng)物中維持足夠時(shí)間，以允許表達(dá)cDNA以產(chǎn)生編碼蛋白；和
[0089]c)允許編碼蛋白形成本發(fā)明的病毒載體顆粒。
[0090]“逆轉(zhuǎn)錄病毒”是指基因組由RNA分子組成且包含逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒，即逆轉(zhuǎn)錄病毒科的成員。逆轉(zhuǎn)錄病毒分為癌病毒、慢病毒和泡沫病毒。優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是癌病毒，例如，MLV、ALV、RSV或MPMV ;慢病毒，例如HIV-1、HIV_2、SIV、EIAV或CAEV ;或泡沫病毒，諸如HFV。這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的基因組容易從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。更優(yōu)選地，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是慢病毒，特別是 HIV-l、HIV-2 或 SIV0
[0091]在本發(fā)明的上下文中 ，“包含具有包裝能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的基因組的核酸序列”是指包含被稱(chēng)為“順式作用”序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒核酸序列的序列。這些包括用于控制轉(zhuǎn)錄和整合的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR),對(duì)于衣殼化(encapsidat1n)所需的psi序列，和對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組的逆轉(zhuǎn)錄所需的引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS)和多聚嘌呤追蹤(polypurinetrack, PPT)序列。有利地，所述包含具有包裝能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的基因組的核酸序列進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)基因。
[0092]在不存在任何反式互補(bǔ)功能的情況下，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組可以是復(fù)制缺陷型或具有復(fù)制能力的。具有復(fù)制能力的基因組可以進(jìn)一步包含gag、pol和env逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。在復(fù)制缺陷型基因組中，病毒基因gag、pol和env缺失。然而，本發(fā)明的病毒載體顆粒的裝配可以通過(guò)反式提供另一種編碼gag、pol和/或env糖蛋白、但對(duì)于“順式”序列有缺陷的質(zhì)粒來(lái)實(shí)現(xiàn)。它們的表達(dá)允許轉(zhuǎn)基因的衣殼化，不包括對(duì)于病毒基因組的增殖和完整病毒顆粒的形成所必需的基因。
[0093]“來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒的核心蛋白”是指gag和pol基因編碼的蛋白。gag基因編碼由逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白酶進(jìn)一步加工成包含核心的結(jié)構(gòu)蛋白的多蛋白。Pol基因編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。
[0094]出于轉(zhuǎn)染的目的，所述第一、第二和第三核酸序列可以在相同載體或在兩種或三種分開(kāi)的載體上攜帶。通常，一種質(zhì)粒編碼病毒載體顆粒的核心逆轉(zhuǎn)錄病毒組分。gag和pol基因的來(lái)源為病毒載體顆粒給出了其名稱(chēng)。例如，表述“HIV-1衍生的載體顆粒”通常表明載體顆粒的gag和pol基因是HIV-1的gag和pol基因。
[0095]術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”是指將外來(lái)核酸(DNA、cDNA或RNA)引入細(xì)胞，使得宿主細(xì)胞將表達(dá)引入的基因或序列以產(chǎn)生所需物質(zhì)，通常是由引入的基因或序列編碼的蛋白。引入的基因可以包括調(diào)節(jié)或控制序列，諸如由細(xì)胞的遺傳機(jī)制使用的啟動(dòng)、終止、啟動(dòng)子、信號(hào)、分泌或其它序列。接受并表達(dá)引入的DNA或RNA的宿主細(xì)胞已經(jīng)被“轉(zhuǎn)染”。
[0096]為了產(chǎn)生載體顆粒，可以采用與慢病毒Gag和Pol基因的表達(dá)相容的任何細(xì)胞，或可工程化為支持此類(lèi)表述的任何細(xì)胞。例如，可以使用生產(chǎn)細(xì)胞，諸如293T細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞(特別是對(duì)于HIV衍生的載體)、TE671和HT1080細(xì)胞(特別是對(duì)于MLV衍生的載體)。
[0097]治療應(yīng)用
[0098]本發(fā)明還涉及包含作為活性成分的如上所定義的假型化病毒載體顆粒(特別是進(jìn)一步包含優(yōu)選是一種或多種核酸的生物材料的如上所定義的假型化病毒載體顆粒)的藥物。
[0099]其還涉及包含如上所定義的假型化病毒載體顆粒(特別是進(jìn)一步包含優(yōu)選是一種或多種核酸的生物材料的如上所定義的假型化病毒載體顆粒)和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。
[0100]本發(fā)明還涉及一種用于治療需要其的受試者的方法，其包括向需要其的受試者施用治療有效量的如上所定義的假型化病毒載體顆粒(特別是進(jìn)一步包含優(yōu)選是一種或多種核酸的生物材料的如上所定義的假型化病毒載體顆粒)。
[0101]在本發(fā)明的上下文中，“受試者”是指人或非人哺乳動(dòng)物，諸如嚙齒類(lèi)動(dòng)物(大鼠、小鼠、兔)，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(黑猩猩)，貓科動(dòng)物(貓)，犬科動(dòng)物(狗)。優(yōu)選地，受試者是人。
[0102]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)可接受的載體”是指可以與本發(fā)明的病毒載體一起向患者施用且不破壞其藥理活性的載體，并且當(dāng)以足以遞送藥學(xué)有效量的病毒載體的劑量施用時(shí)，所述載體是無(wú)毒的。
[0103]可用于本發(fā)明的藥物組合物中的藥學(xué)可接受的載體和媒介物可包括，但不限于，離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物遞送系統(tǒng)(SEDDS)諸如d-α -生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、藥物劑型中使用的表面活性劑諸如吐溫或其他類(lèi)似的聚合物遞送基質(zhì)、血清蛋白諸如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)諸如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)諸如硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。環(huán)糊精諸如α _、β -和Y -環(huán)糊精，或化學(xué)修飾的衍生物諸如羥基烷基環(huán)糊精，包括2-和3-羥基丙基-β-環(huán)糊精，或者其他溶解的衍生物也可有利地用于增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的組合物的遞送。
[0104]可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的施用方法。特別地，根據(jù)本發(fā)明的假型化病毒載體顆?？衫缤ㄟ^(guò)口服途徑或通過(guò)腸胃外途徑(特別是通過(guò)靜脈內(nèi)注射和股骨(骨髓腔)內(nèi)注射)而施用。當(dāng)選擇腸胃外途徑時(shí)，假型化病毒載體顆?？梢允窃诎碴郴驘恐袟l件化的可注射溶液和懸浮液形式。用于腸胃外遞送的形式通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒與緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑和漿化劑混合而常規(guī)獲得。然后根據(jù)已知技術(shù)，將這些混合物滅菌且以靜脈內(nèi)注射劑的形式條件化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用基于有機(jī)磷酸鹽的緩沖劑作為緩沖劑。漿化劑的實(shí)例包括甲基纖維素、阿拉伯膠和羧甲基纖維素鈉。穩(wěn)定劑的實(shí)例包括亞硫酸鈉和偏亞硫酸鈉，以及防腐劑的實(shí)例包括對(duì)羥基苯甲酸鈉、山梨酸、甲酚和氯甲酚。
[0105]“治療有效量”是指病毒載體賦予治療的受試者治療效果的量。治療效果可以是客觀(guān)的(即，可通過(guò)一些測(cè)試或標(biāo)記測(cè)量)或主觀(guān)的(即，受試者給出效果的指示或感覺(jué)效果)。如技術(shù)人員已知，有效劑量將取決于施用途徑、受試者的大小和/或重量以及與其他試劑共同使用的可能性而變化。
[0106]當(dāng)假型化病毒載體顆粒被用作藥物并在治療方法中向受試者施用時(shí)，優(yōu)選通過(guò)靜脈內(nèi)途徑或通過(guò)髓狀途徑、特別是股骨或肱骨髓狀途徑施用。對(duì)于靜脈內(nèi)施用，可以使用如上所定義的約5.1O8至約19個(gè)假型化病毒載體顆粒的單位劑量，而對(duì)于髓狀施用，可以使用如上所定義的約18至約5.1O8個(gè)假型化病毒載體顆粒的單位劑量。
[0107]在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒用于治療造血功能障礙或自身免疫性疾病。
[0108]本發(fā)明還涉及如上所定義的假型化病毒載體顆粒用于制備意欲用于治療造血功能障礙或自身免疫性疾病的藥物的用途。其還涉及用于治療受試者的造血功能障礙或自身免疫性疾病的方法，其包括向需要其的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒。
[0109]如本文中所使用，表述“造血功能障礙”是指血液疾病，特別是涉及造血細(xì)胞的疾病。優(yōu)選地,所述造血功能障礙是單基因造血疾病。
[0110]如本文中所使用，表述“單基因造血疾病”是指由于單一基因的突變導(dǎo)致的遺傳性造血疾病。
[0111]造血功能障礙的實(shí)例包括脊髓發(fā)育不良、再生障礙性貧血、范可尼貧血、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、鐮狀細(xì)胞病、Diamond Blackfan貧血、Schachman Diamond障礙、科斯特曼氏綜合征、慢性肉芽腫病、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、白細(xì)胞粘附缺陷、血友病、地中海貧血、地中海貧血、白血病諸如急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、急性粒細(xì)胞性(髓性)白血病(AML)、成人淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)、慢性髓性白血病(CML)、幼年慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)和幼年骨髓單核細(xì)胞性白血病(JMML)、重癥聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)、X-連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷、Wiskott-Aldrich綜合征(WAS)、腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥、慢性肉芽腫病、Chediak-Higashi綜合征、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和AIDS。
[0112]優(yōu)選地，造血功能障礙選自范可尼貧血、血友病、β -地中海貧血、Wiskott-Aldrich綜合征、X-連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷、腺苷脫氨酶缺乏癥、慢性肉芽腫病和腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。
[0113]如本文中所使用，表述“自身免疫性疾病”是指由于機(jī)體對(duì)通常存在于機(jī)體中的物質(zhì)和組織的過(guò)度活躍的免疫應(yīng)答導(dǎo)致的疾病。因此，通過(guò)特異性靶向參與該過(guò)度活躍的免疫應(yīng)答的免疫細(xì)胞(造血細(xì)胞)，本發(fā)明的載體顆?？梢允侵委熥陨砻庖咝约膊〉挠杏霉ぞ?。
[0114]自身免疫性疾病特別包括急性播散性腦脊髓炎、急性出血性腦白質(zhì)炎、阿狄森氏病、丙種球蛋白血癥、斑禿、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、抗合成酶綜合征、特應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、自身免疫性再生障礙性貧血、自身免疫性心肌病、自身免疫性腸病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性?xún)?nèi)耳病、自身免疫性淋巴增生綜合征、自身免疫性周?chē)窠?jīng)病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病綜合征、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性蕁麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病、巴洛同心圓硬化、Bechets綜合征、伯格氏病、比克斯塔夫氏腦炎、布勞綜合征、大皰性類(lèi)天皰瘡、癌癥、卡爾斯曼氏病、乳糜瀉、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、慢性復(fù)發(fā)性多灶性骨髓炎、Churg-Strauss綜合征、瘢痕性類(lèi)天皰瘡、科根綜合征、冷凝集素病、補(bǔ)體組分2缺乏癥、顱動(dòng)脈炎、CREST綜合征、克羅恩病、庫(kù)欣氏綜合征、皮膚白血球血管炎、德戈氏病、德?tīng)柨鲜喜　捳顦悠ぱ?、皮肌炎、I型糖尿病、彌漫性皮膚全身性硬化癥、德雷斯勒氏綜合征、盤(pán)狀紅斑性狼瘡、濕疹、接骨點(diǎn)炎相關(guān)的關(guān)節(jié)炎、嗜酸細(xì)胞性筋膜炎、嗜酸細(xì)胞性胃腸炎、獲得性大皰性表皮松解癥、結(jié)節(jié)性紅斑、原發(fā)性混合型冷球蛋白血癥、埃文氏綜合征、進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良(firodysplasia ossificans progressiva)、纖維化肺泡、胃炎、胃腸道類(lèi)天皰瘡、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、腎小球腎炎、肺出血腎炎綜合征、格雷夫斯氏病、格林-巴利綜合征(GBS)、橋本氏腦炎、橋本氏甲狀腺炎、溶血性貧血、Henoch-Schonlein紫癜、妊娠皰疹、低丙球蛋白血癥、特發(fā)性炎癥性脫髓鞘疾病、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜、IgA腎病、包涵體肌炎、炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、間質(zhì)性膀胱炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎、幼年型類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、川崎病、蘭伯特-伊頓肌無(wú)力綜合征、白血球破裂性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線(xiàn)狀I(lǐng)gA病(LAD)、盧伽雷氏病、狼瘡狀肝炎、紅斑狼瘡、馬吉德綜合征、美尼爾氏病、顯微性多血管炎、米勒-費(fèi)雪綜合征、混合性結(jié)締組織病、硬皮病、穆哈-哈伯曼病、多發(fā)性硬化、重癥肌無(wú)力、肌炎、正視神經(jīng)脊髓炎(neu1pyelitisoptica)、神經(jīng)性肌強(qiáng)直、眼瘢痕性類(lèi)天皰瘡、斜視性陣攣肌陣攣綜合征、奧德甲狀腺炎(ordthyroiditis)、復(fù)發(fā)性風(fēng)濕、副腫瘤性小腦變性、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)、ParryRomberg綜合征、Parsonnage-Turner綜合征、扁平部睫狀體炎、天皰瘡、尋常型天皰瘡、惡性貧血、靜脈周?chē)阅X脊髓炎、POEMS綜合征、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、進(jìn)行性炎性病變、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、壞疽性膿皮病、純紅細(xì)胞再生障礙、Rasmussen氏腦炎、雷諾現(xiàn)象、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、萊特爾氏綜合征、多動(dòng)腿綜合征、腹膜后纖維化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性發(fā)燒、結(jié)節(jié)病、施密特綜合征、施尼茨勒綜合征、鞏膜炎、硬皮病、干燥綜合征、脊椎關(guān)節(jié)病、斯蒂爾病、僵人綜合征、亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、Susac氏綜合征、Sweet氏綜合征、西德納姆舞蹈病、交感性眼炎、高安氏動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎、Tolosa-Hunt綜合征、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結(jié)腸炎、未分化結(jié)締組織病、未分化脊柱關(guān)節(jié)病、 血管炎、白癜風(fēng)和韋格納氏肉芽腫病。
[0115]優(yōu)選地，自身免疫性疾病選自癌癥、糖尿病、血友病、葡萄膜炎和腦脊髓炎。
[0116]如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“癌癥”包括任何類(lèi)型的癌癥，但優(yōu)選包括由造血細(xì)胞產(chǎn)生的癌癥，包括白血病，特別是B-CLL、CML或基于T細(xì)胞的白血病，諸如ALT，以及黑色素瘤。
[0117]轉(zhuǎn)導(dǎo)方法
[0118]本發(fā)明還涉及如上所定義的假型化病毒載體顆粒用于將上述“生物材料”部分中所定義的生物材料離體轉(zhuǎn)移入上述“造血細(xì)胞”部分中定義的造血細(xì)胞的用途。
[0119]本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及用于轉(zhuǎn)導(dǎo)如上述“造血細(xì)胞”部分中定義的造血細(xì)胞的方法，其包括在實(shí)現(xiàn)通過(guò)假型化病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的條件下將造血細(xì)胞與如上所定義的假型化病毒載體顆粒接觸。
[0120]如本文所預(yù)期，“轉(zhuǎn)移”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”涉及載體顆粒在結(jié)合靶細(xì)胞后初始將生物材料遞送至靶細(xì)胞的膜或細(xì)胞質(zhì)的能力。遞送后，生物材料可以被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞的其它隔室。
[0121]實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞的條件是技術(shù)人員眾所周知的，并且通常包括優(yōu)選以1、5、10或100的Μ0Ι、優(yōu)選在無(wú)血清培養(yǎng)基中將待轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞(優(yōu)選在用纖維連接蛋白包被的燒瓶、板或皿中培養(yǎng)，并且任選用細(xì)胞因子雞尾酒預(yù)刺激)與本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒孵育。
[0122]包裝細(xì)胞系
[0123]本發(fā)明還涉及穩(wěn)定的病毒包裝細(xì)胞系，其產(chǎn)生如上所定義的假型化病毒載體顆粒，所述假型化病毒載體顆粒包含至少一種嵌合包膜糖蛋白，所述嵌合包膜糖蛋白包含或由BaEV包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與MLV包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成。
[0124]事實(shí)上，本發(fā)明人證明了 BaEV/TR糖蛋白對(duì)293T生產(chǎn)細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。
[0125]在本發(fā)明的上下文中，穩(wěn)定的病毒包裝細(xì)胞系是指穩(wěn)定表達(dá)本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒的不同組分的細(xì)胞系。通常，將編碼本發(fā)明的假型化病毒載體顆粒的不同組分的核酸整合到細(xì)胞系的基因組中。
[0126]特別地，此類(lèi)穩(wěn)定的病毒包裝細(xì)胞系可以是與慢病毒gag和pol基因的表達(dá)相容的任何細(xì)胞，或可工程化為支持此類(lèi)表達(dá)的任何細(xì)胞。例如，它們可以是293T細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞(特別是對(duì)于HIV衍生的載體)，可以使用TE671和HT1080細(xì)胞(特別是對(duì)于MLV衍生的載體)。
[0127]本發(fā)明將通過(guò)以下附圖和實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。
[0128]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0129]圖1顯示BaEV野生型糖蛋白、RDl 14/TR和BaEV/TR嵌合糖蛋白和BaEVRLess糖蛋白的示意性表示。RDl 14和BaEV野生型糖蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域交換成MLV-A糖蛋白之一，分別導(dǎo)致嵌合的RD114/TR和BaEV/TR糖蛋白。刪除BaEV野生型糖蛋白的胞質(zhì)尾R肽，導(dǎo)致BaEVRLess突變體糖蛋白。
[0130]圖2顯示代表通過(guò)用系列稀釋的濃縮載體制劑感染HEK293T細(xì)胞而獲得的編碼GFP標(biāo)記基因的不同假型化慢病毒載體顆粒(假型化的VSV-G⑴、RD114/TR⑵、BaEVwt (3)、BaEV/TR (4)和BaEVRLess (5))的滴度的柱狀圖。感染后3天通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定GFP+細(xì)胞的百分比。感染性滴度計(jì)算為GFP感染單位(IU)/ml。顯示平均值(η = 7)，除了 BaEVwt (η = 3) ο
[0131]圖3 顯示代表通過(guò) VSV-G (I)、RDl 14/TR (2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293T細(xì)胞相對(duì)于在FCS中孵育的相同病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的相對(duì)百分比的柱狀圖，所述假型化慢病毒載體顆粒在37°C下在熱滅活的人血清(白色條；血清在56°C下熱滅活，然后與載體孵育以滅活補(bǔ)體，其中新鮮血清含有活性補(bǔ)體)或在新鮮人血清(黑色條)中孵育I小時(shí)。顯示載體與3種不同供體(A、B和C)的血清孵育的值。
[0132]圖4 顯示代表通過(guò) VSV-G (I)、RDl 14/TR (2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以10的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)未刺激(白色條)、SCF預(yù)刺激(虛線(xiàn)條)、ΤΡ0預(yù)刺激(垂直陰影線(xiàn)條)，SCF+TP0預(yù)刺激(水平陰影線(xiàn)條)或SCF+TP0+FU3-L預(yù)刺激(黑色條)的人CD34+細(xì)胞的百分比的柱狀圖。轉(zhuǎn)導(dǎo)后6天進(jìn)行表達(dá)GFP的細(xì)胞的分析。
[0133]圖5 顯示代表通過(guò) VSV-G(X)、RD114/TR(_)、BaEV/TR(A)或 BaEVRLess ()假型化慢病毒載體顆粒以1、5、10、20 (和對(duì)于VSV-G假型化慢病毒載體顆粒為100)的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)SCF/TP0預(yù)刺激的⑶34+細(xì)胞的百分比的圖。轉(zhuǎn)導(dǎo)后6天通過(guò)FACS進(jìn)行表達(dá)GFP的細(xì)胞的分析。
[0134]圖6 顯示代表通過(guò) VSV-G(X)、RD114/TR(_)、BaEV/TR(A)或 BaEVRLess ()假型化慢病毒載體顆粒以1、5、10、20 (和對(duì)于VSV-G假型化慢病毒載體顆粒為100)的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)SCF+TP0+FU3-L預(yù)刺激的⑶34+細(xì)胞的百分比的圖。轉(zhuǎn)導(dǎo)后6天通過(guò)FACS進(jìn)行表達(dá)GFP的細(xì)胞的分析。
[0135]圖7 顯示代表通過(guò) VSV-G (I)、RDl 14/TR (2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以100 (對(duì)于VSV-G)和10 (對(duì)于其他假型)的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)SCF+TP0預(yù)刺激(白色條)或SCF+TP0+FU3-L預(yù)刺激(黑色條)臍血衍生的⑶34+細(xì)胞后表達(dá)GFP的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞集落形成細(xì)胞(CFC)的百分比的柱狀圖。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，將細(xì)胞接種在供給細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)髓樣分化。接種后，在培養(yǎng)的第14天，通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞集落形成細(xì)胞(CFC)進(jìn)行評(píng)分。
[0136]圖8 顯示代表通過(guò) VSV-G (I)、RDl 14/TR (2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以100 (對(duì)于VSV-G)和10 (對(duì)于其他假型)的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)SCF+TP0預(yù)刺激的臍血衍生的CD34+細(xì)胞后表達(dá)GFP的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞集落形成細(xì)胞(CFC)(黑色條)和表達(dá)GFP的CD34+細(xì)胞(白色條)的百分比的柱狀圖。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，將細(xì)胞接種在供給細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)髓樣分化。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后6天通過(guò)FACS分析測(cè)定GFP+⑶34+細(xì)胞的百分比。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后17天通過(guò)FACS分析測(cè)定GFPCFC的百分比。星號(hào)表明GFP+⑶34+細(xì)胞的比例統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同于GFP+集落轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的比例(Student’s T檢驗(yàn):*:p < 0.05，NS:不顯著)ο
[0137]圖9 顯示代表用 VSV-G (I)、RDl 14/TR ⑵、BaEV/TR (3)和 BaEVRLess ⑷假型化慢病毒載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)SCF+TP0預(yù)刺激的CD34+細(xì)胞48小時(shí)后在骨髓中表達(dá)GFP的⑶45+人細(xì)胞(白色條)、⑶34+⑶19—未成熟祖細(xì)胞(黑色條)、⑶34+CD19+B祖細(xì)胞(虛線(xiàn)條)、CD20+B細(xì)胞(垂直陰影條)、CD13+髓樣祖細(xì)胞(水平陰影條)和CD14+粒細(xì)胞和單核細(xì)胞(斜線(xiàn)陰影條)的百分比的柱狀圖。照射新生Rag2+小鼠后，它們分別肝內(nèi)注射2.1O5個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的人CD34+細(xì)胞。重構(gòu)12周后，分析小鼠骨髓中的人細(xì)胞移植(⑶45)，并且如指示通過(guò)FACS分析不同造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)(GFP+細(xì)胞)的百分比。
[0138]圖10顯示代表用VSV-G、RD114/TR、BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)SCF/TP0預(yù)刺激的CD34+細(xì)胞48小時(shí)后在脾臟中表達(dá)GFP的⑶45+人細(xì)胞(白色條)、⑶34+⑶10TD19—極不成熟祖細(xì)胞(黑色條)、⑶34+⑶1+CD19—B前/原B細(xì)胞(虛線(xiàn)條)、CD19+CD20-前B細(xì)胞(垂直陰影條)、CD34+CD10+CD19.未成熟B細(xì)胞(水平陰影條)、CD20+成熟B細(xì)胞(斜線(xiàn)陰影條)和CD3+T細(xì)胞(交叉陰影條)的百分比的柱狀圖。照射新生Rag2+ ； Y C^BalbC小鼠后，它們分別肝內(nèi)注射2.1O5個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的人⑶34+細(xì)胞。重構(gòu)12周后，分析小鼠脾臟中的人細(xì)胞移植(⑶45)，并且如指示通過(guò)FACS分析不同造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)(GFp+細(xì)胞)的百分比。
[0139]圖11 顯示代表通過(guò) VSV-G (I)、RDl 14/TR ⑵、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess ⑷假型化SIV載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)獼猴骨髓CD34+細(xì)胞相對(duì)于在FCS中孵育的相同病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的相對(duì)百分比的柱狀圖，所述假型化SIV載體顆粒在37°C下在熱滅活的獼猴血清(白色條；血清在56°C下熱滅活，然后與載體孵育以滅活補(bǔ)體，其中新鮮血清含有活性補(bǔ)體)或在新鮮獼猴血清(黑色條)中孵育I小時(shí)。顯示載體與2種不同獼猴(A和B)的血清孵育的值。
[0140]圖12顯示代表在存在纖維連接蛋白的情況下通過(guò)VSV-G⑴、BaEV/TR⑵或BaEVRLess (3)假型化SIV載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的SCF+FU3-L+IL-3+IL-6預(yù)刺激的食蟹猴骨髓CD34+細(xì)胞的百分比的柱狀圖。
[0141]圖13顯示代表在存在纖維連接蛋白的情況下通過(guò)VSV-G⑴、BaEV/TR⑵或BaEVRLess (3)假型化SIV載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的SCF+FU3-L+IL-3+IL-6預(yù)刺激的恒河猴骨髓CD34+細(xì)胞的百分比的柱狀圖。
[0142]圖14顯示代表在存在(黑色條)或不存在(白色條)纖維連接蛋白的情況下通過(guò) VSV-G(I)、RDl 14/TR(2)、BaEV/TR(3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以 10 的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的IL-7預(yù)刺激的T細(xì)胞的百分比的柱狀圖。
[0143]圖15 顯示代表通過(guò) VSV-G(I)、RD114/TR(2) ,BaEV/TR(3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的IL-7預(yù)刺激的記憶性T細(xì)胞(白色條)和初始T細(xì)胞(黑色條)的百分比的柱狀圖。
[0144]圖16顯示代表在存在(黑色條)或不存在(白色條)纖維連接蛋白的情況下通過(guò) VSV-G(I)、RD114/TR(2)、BaEV/TR(3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以 10 的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的TCR預(yù)刺激的T細(xì)胞的百分比的柱狀圖。
[0145]圖17顯示代表在存在(黑色條)或不存在(白色條)纖維連接蛋白的情況下通過(guò)VSV-G(I)、RD114/TR(2)、BaEV/TR (3)或BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的靜息B細(xì)胞的百分比的柱狀圖。
[0146]圖18 顯示代表通過(guò) VSV-G(I)、RD114/TR(2) ,BaEV/TR(3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的記憶性靜息B細(xì)胞(白色條)和初始靜息B細(xì)胞(黑色條)的百分比的柱狀圖。
[0147]圖19 顯示代表通過(guò) VSV-G(I)、RD114/TR(2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的BCR預(yù)刺激的記憶性靜息B細(xì)胞(白色條)和初始靜息B細(xì)胞(黑色條)的百分比的柱狀圖。
[0148]圖20顯示代表在存在(黑色條)或不存在(白色條)纖維連接蛋白的情況下通過(guò)VSV-G(I)、RD114/TR(2)、BaEV/TR (3)或BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號(hào)中注明的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的MZL B細(xì)胞的百分比的柱狀圖。
[0149]圖2IA顯示代表在小鼠的第一次和第二次移植后通過(guò)FACS檢測(cè)的GFP+h⑶45+細(xì)胞的百分比的圖。臍血h⑶34+細(xì)胞用細(xì)胞因子雞尾酒(TP0+SCF+Flk-3L)預(yù)刺激16h，并用BaEV/TR-LV和BaEVRLess-LV以MOI = 10轉(zhuǎn)導(dǎo)36h。隨后，將細(xì)胞(2xl05個(gè))注射到照射的新生NOD/SCIDyc-/-小、鼠(NSG小鼠)的肝臟中。重構(gòu)8-9周后，這些初始小鼠移植(第一次)的不同造血組織(骨髓、脾臟和胸腺)通過(guò)抗hCD45染色分析人細(xì)胞移植。對(duì)于每種載體類(lèi)型和各造血組織注明通過(guò)FACS檢測(cè)的GFP+hCD45+細(xì)胞的百分比。隨后，從各這些初始移植小鼠的骨髓中分離hCD34+細(xì)胞，并且在初始移植的相同程序后將1-2χ105個(gè)分離的h⑶34+細(xì)胞注射到一只或兩只小鼠中。移植后8-9周，分析這些第二次(第2次)移植小鼠的骨髓、脾臟和胸腺中轉(zhuǎn)導(dǎo)的人細(xì)胞移植(hCD45+GFP+)。初始和相應(yīng)第二次移植通過(guò)相同符號(hào)注明。圖21B顯示代表針對(duì)BaEV/TR-LV轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)FACS檢測(cè)代表性第二次受體NSG小鼠的骨髓樣品中GFP+人B細(xì)胞(CD19+)、人未成熟祖細(xì)胞(CD34+)和髓樣祖細(xì)胞(CD13+)的圖。
[0150]圖22A顯示胸腺細(xì)胞分化的示意圖。HSC，造血干細(xì)胞；DN，雙陰性；ISP，未成熟的CD4單陽(yáng)性細(xì)胞；DP，雙陽(yáng)性；SP4，單陽(yáng)性CD4+ ;SP8，單陽(yáng)性CD8+ ;TCR，T細(xì)胞受體。圖22B顯示代表用編碼GFP報(bào)道分子的VSV-G-、RD114/TR-、BaEV/TR-和BaEVRLess-LV以10的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá)GFP的新鮮分離的胸腺細(xì)胞的百分比的柱狀圖。對(duì)⑶3、⑶4和⑶8多重染色后，通過(guò)FACS測(cè)定不同胸腺細(xì)胞亞群中的轉(zhuǎn)導(dǎo)。圖22C顯示代表與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的胸腺細(xì)胞相t匕，將總胸腺細(xì)胞與不同載體孵育后不同胸腺細(xì)胞亞群的分布的柱狀圖。
[0151]圖23A顯示代表用IL-7預(yù)刺激48h且隨后用編碼GFP報(bào)道分子的不同載體:VSV-G-、RD114/TR-、BaEV/TR-和 BaEVRLess-LV 以 50 的 MOI 轉(zhuǎn)導(dǎo)后表達(dá) GFP 的新鮮分離的總CB T細(xì)胞的百分比的柱狀圖。轉(zhuǎn)導(dǎo)第3天，針對(duì)人表面標(biāo)記(⑶45RA、⑶62L、⑶31)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，并且通過(guò)FACS分析測(cè)定最近胸腺細(xì)胞遷移者(RA+/62L+/31+)和更成熟的初始CB T細(xì)胞(RA+/62L+/31-)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。圖23B顯示代表與未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞相比，將CBT細(xì)胞與不同載體孵育后不同初始CB T細(xì)胞亞群的分布的柱狀圖。

【具體實(shí)施方式】
[0152]以下實(shí)施例表明了 BaEV/TR-和BaEVRLess假型慢病毒載體顆粒用作基因轉(zhuǎn)移載體相比于之前的假型慢病毒載體的有利特性。
[0153]材料與方法
[0154]慢病毒載體的產(chǎn)生和滴定
[0155]通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville, MD，CRL-1573)生成自我失活的HIV-1-衍生的載體。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將2.6106個(gè)HEK293T細(xì)胞接種至10-cm2組織培養(yǎng)皿上。使293T細(xì)胞在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM, Invitrogen)中生長(zhǎng)。使用8.6 μ g Gag-Pol包裝構(gòu)建體8.91和編碼GFP的HIV-1衍生的SIN轉(zhuǎn)移載體pHIV-SFFV-GFP-SIN和2.5 μ g編碼VSV-G糖蛋白(GP)的 pMD.G 或 7 μ gphCMV-RD 114/TR, phCMV-BaEVWT, phCMV-BaEV/TR 或 phCMV-BaEVRLess通過(guò)磷酸沉淀轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后16小時(shí),用無(wú)血清培養(yǎng)基(Opt1-MEM, Invitrogen)替代DMEM培養(yǎng)基，并在轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，收獲載體，過(guò)濾通過(guò)0.45 μ m孔徑的膜，并使用超濾濃縮系統(tǒng)(Vivaspin，Satorius ;3000g，2小時(shí)(4°C ))，或通過(guò)將病毒上清液在4°C下以3000g離心過(guò)夜而低速濃縮或者通過(guò)超速離心(4°C，25000rpm，2小時(shí))而濃縮。隨后，將載體儲(chǔ)存于-80°C。為了測(cè)定HIV載體的轉(zhuǎn)染效率和感染滴度，將載體制備物的系列稀釋液添加至293T細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定GFP+細(xì)胞的百分比。將感染滴度表示為感染性載體顆粒/每毫升(感染性單位IU/mL)。在增殖的293T細(xì)胞上測(cè)定感染復(fù)數(shù)(MOI)，并在所有轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中標(biāo)明。
[0156]假型載體在人或獼猴血清中的穩(wěn)定性。
[0157]將感染性假型HIV或SIV載體顆粒(在50 μ I懸浮緩沖液中150000個(gè)GFP感染性單位)與50 μ I熱滅活或新鮮的人血清混合。作為參考，將病毒顆粒在37°C下孵育I小時(shí)，然后用于轉(zhuǎn)導(dǎo)HEK293T靶細(xì)胞。計(jì)算人血清孵育的病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)相對(duì)于FCS中孵育的相同病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)的百分比。
[0158]樣品收集和人⑶34+細(xì)胞的分離
[0159]根據(jù)赫爾辛基宣言在知情同意后將來(lái)自足月妊娠的臍帶血(CB)樣品收集在含有抗凝血?jiǎng)?SIGMA)的無(wú)菌試管中。通過(guò)在Lymphoprep墊(Axis shield)上離心分離低密度PBMC細(xì)胞。根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用CD34磁性分離試劑盒(Miltenyi MACS7MiltenyiB1tec)從單核細(xì)胞級(jí)分純化⑶34+干細(xì)胞/祖細(xì)胞。用APC-結(jié)合的抗⑶34抗體(BDPharmingen)通過(guò)FACS分析評(píng)估所選擇的⑶34+級(jí)分的純度,其對(duì)于所有實(shí)驗(yàn)均超過(guò)95 %。隨后，將CD34+細(xì)胞冷凍在FCS (胎牛血清，Lonza)，10% DMSO中并儲(chǔ)存于_80°C。
[0160]T細(xì)胞和B細(xì)胞分離和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)
[0161]將在知情同意后從健康成年供體獲得的成體外周血樣品收集在含有酸性檸檬酸葡萄糖(AO))的管中。使用花環(huán)四聚體復(fù)合物系統(tǒng)(StemSep Technologies, Vancouver,Canada)通過(guò)陰性選擇純化⑶3+T細(xì)胞和⑶19+B細(xì)胞。分別使用抗h⑶19APC和抗h⑶3APC抗體監(jiān)測(cè)分離的B細(xì)胞和T細(xì)胞的純度，并通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選法(FACScalibur ；BD)進(jìn)行分析。將T和B淋巴細(xì)胞在補(bǔ)充有10% FCS和青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(GibcobRL Invitrogen, Auckland, New Zealand)中培養(yǎng)。將 T 細(xì)胞在存在 hIL_2 (lng/ml)的情況下用抗⑶3+抗CD28抗體(I μ g/ml)預(yù)刺激或者用rIL_7預(yù)刺激3天，如Verhoeyen等人(2003)BloodlOl:2167-2174(10ng/ml ；BDB1sciences, Le Pont de Claix, France)所述。將B細(xì)胞立即接種用于轉(zhuǎn)導(dǎo)或用金黃色葡萄球菌Cowan (SAC ；0.001 % ；Calb1chem,San Diego, CA)+IL-2 (lng/ml ；SIGMA)預(yù)刺激，如 Levy 等人.(2010)Bloodll6:498-500 所述。簡(jiǎn)而言之，將1E5細(xì)胞接種在48孔板中，并以指定劑量添加濃縮載體。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后72小時(shí)通過(guò)FACS測(cè)定GFP+細(xì)胞的百分比。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞在補(bǔ)充有rhIL-7的RPMI中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天補(bǔ)充，并收獲用于FACS分析、qPCR和Alu-PCR。將B細(xì)胞轉(zhuǎn)移至在補(bǔ)充有10%AB 血清、5% FCS、50ng/ml rhSCF、10ng/ml rhIL-15 和 5ng/ml rhIL-2 的 RPMI 中的 MS5 細(xì)胞單層，每4天更新培養(yǎng)基。
[0162]獼猴骨髓⑶34+細(xì)胞的分離
[0163]根據(jù)國(guó)家指南，從毛里求斯進(jìn)口 3-4.5kg的成年雄性食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis)),并單籠圈養(yǎng)在2級(jí)生物安全動(dòng)物設(shè)施(CEA, Fontenay-aux Roses)中。所有實(shí)驗(yàn)程序均根據(jù)歐洲動(dòng)物護(hù)理指南進(jìn)行。根據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)區(qū)域委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行研究。在用10mg/kg氯胺酮(ImalgSne 1000)麻醉動(dòng)物后進(jìn)行所有程序和血液采樣。
[0164]通過(guò)針吸(aspirat1n)從肱骨和髂骨獲得骨髓單核細(xì)胞并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Ficoll密度梯度離心來(lái)分離。將細(xì)胞在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中洗滌兩次并重懸浮于PBS/1%FCS中。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明通過(guò)陽(yáng)性免疫磁性選擇(克隆561 ；Dynabeads M-450CD34 ；Dynal)富集級(jí)分。免疫選擇后，使用抗⑶34單克隆抗體(克隆563，BD-Pharmingen)將⑶34+細(xì)胞純化級(jí)分染色。⑶34+選擇細(xì)胞的純度范圍為85-95%。
[0165]轉(zhuǎn)導(dǎo)人和獼獼HSC。
[0166]將人和獼猴CD34+細(xì)胞在24孔板中在補(bǔ)充有抗生素(PENSTREP，Invitrogen)和人重組細(xì)胞因子(如注明):干細(xì)胞因子(rSCF，100ng/ml)、血小板生成素(ΤΡ0，20ng/ml)和Flt3配體(Flt3_L, 100ng/ml) (Preprotech)(用于人CB CD34+細(xì)胞)的無(wú)血清培養(yǎng)基(CellGro，CellGenix)中孵育過(guò)夜。對(duì)于食蟹猴骨髓⑶34+細(xì)胞，將人重組白細(xì)胞介素(IL-6) (20ng/ml)和白細(xì)胞介素(IL-3) (20ng/ml) (Preprotech)添加至之前的雞尾酒中。將5.1O4個(gè)預(yù)刺激的CD34+細(xì)胞在48孔板中在無(wú)血清培養(yǎng)基(CellGro，CellGenix)中用MOI為1、5、10、20或100 (如指示)的濃縮慢病毒載體上清液轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)指示時(shí),在纖維連接蛋白(retronectin)包被板(重組人纖連蛋白片段CH-296) (Takara)上進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第3天，用細(xì)胞因子補(bǔ)充細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)3天和6天后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定GFP+細(xì)胞的百分比。
[0167]⑶34+細(xì)胞的克隆形成測(cè)定
[0168]將CD34+細(xì)胞如上文所述進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，在PBS(Invitrogen)中洗滌并且以1000個(gè)細(xì)胞/ml的密度鋪板在完全甲基纖維素培養(yǎng)基(1%甲基纖維素，15(%?85，1(%854，牛胰胰島素[I μ g/ml],鐵飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白[200mg/ml], 10-4M2-巰基乙醇,2mM L-谷氨酰胺，SCF[50ng/ml], IL-3 [10ng/ml], IL-6 [10ng/ml],促紅細(xì)胞生成素[3U/ml]) (Stem Celltechnologies)中。在接種后14天通過(guò)光鏡和突光顯微鏡對(duì)GFP+集落評(píng)分。
[0169]Western 印跡分析
[0170]通過(guò)超速離心(2小時(shí)，25000rpm, 4 °C )在蔗糖墊上純化BaEVwt、BaEV/TR和BaEVRLess假型LV，并在重懸浮于PBS中后進(jìn)行冷凍。膜的上部用針對(duì)BaEV糖蛋白的表面結(jié)構(gòu)域的抗體染色，膜的下部用針對(duì)P24HIV-1衣殼的抗體染色，以評(píng)估純化載體的等同載荷。指示了 BaEV突變體糖蛋白和HIV衣殼的位置。
[0171]動(dòng)物
[0172]從Mamoro Ito 博士和 Taconic (CIEA, Kawasaki, Japan)獲得 BALB/cRag2+,Yc_7_免疫缺陷小鼠。將使用的所有小鼠飼養(yǎng)在Ecole Normale Superieure de Lyon,France (PBES)的動(dòng)物設(shè)施中。將動(dòng)物在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間保持在無(wú)菌條件下，并且由當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)批準(zhǔn)方案后根據(jù)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理指南進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。
[0173]Balb-c Rag2^, Y cv_小鼠的條件化和重構(gòu)
[0174]將2-4日齡的新生BALB/c Rag2^, Y c+小鼠進(jìn)行2x1.5Gy的亞致死照射。為了評(píng)估轉(zhuǎn)導(dǎo)的hCB-⑶34+細(xì)胞的重構(gòu)/分化能力，將后者細(xì)胞以10的MOI用BaEV/TR-、BaEVRLess-、RDl 14/TR-, VSV-G-LV轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)，將2.1O5個(gè)細(xì)胞肝內(nèi)注射入新生小鼠。在人細(xì)胞移植10-12周時(shí)，從面靜脈采集外周血，以通過(guò)FACS分析人移植(h⑶45+細(xì)胞)的百分比來(lái)檢查重構(gòu)效率。
[0175]FACS 分析
[0176]在人細(xì)胞移植的10-12周時(shí)根據(jù)生物倫理程序處死小鼠，并收獲所有造血組織。隨后，從骨髓、脾、胸腺和外周血提取細(xì)胞。為了檢測(cè)移植細(xì)胞的LV轉(zhuǎn)導(dǎo)，使用APC-偶聯(lián)的抗hCD45抗體進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，用于檢測(cè)骨髓中的總的人細(xì)胞移植。APC-偶聯(lián)的抗體(BD Pharmingen)用于檢測(cè)h⑶19 (B細(xì)胞)、h⑶34 (早期祖細(xì)胞)和h⑶13 (髓樣祖細(xì)胞)。
[0177]MS
[0178]突變體BaEV/TR糖蛋白和BaEVRLess糖蛋白可以有效假型化HIV-1載體
[0179]本發(fā)明人通過(guò)用MLV-A糖蛋白之一交換其胞漿結(jié)構(gòu)域來(lái)工程化BaEV/TR嵌合糖蛋白(圖1)。通過(guò)從羧基末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域刪除融合抑制性R肽而工程化第二個(gè)突變體，導(dǎo)致BaEVRLess糖蛋白(圖1)。本發(fā)明人比較了這些不同的突變BaEV糖蛋白將源自HIV-1的慢病毒載體假型化為VSV-G和RDl 14/TR糖蛋白的能力。
[0180]通過(guò)用gagpol包裝和編碼GFP的HIV載體一起瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞而生成RD114/TR、BaEV/TR、BaEVRLess和VSV-G假型化HIV載體。通過(guò)低速或超速離心(100倍)濃縮載體上清液。在HEK293T細(xì)胞上的感染測(cè)定表明，對(duì)于BaEV/TR和BaEVRLess假型化LV獲得高于1.107IU/ml的滴度，導(dǎo)致與BaEVwt-LV相比滴度增加40倍。RD114/TR和VSV-G假型化載體得到6.10 7IU/ml和1.109IU/ml的滴度(圖2)。免疫印跡證實(shí)，與等量HIV-1衣殼的BaEV/TR和BaEVRLess糖蛋白相比，慢病毒載體表面上BaEVwt糖蛋白的引入更少。這些數(shù)據(jù)與BaEV/TR和BaEVRLess假型化LV與BaEVwt-LV相比獲得的滴度增加一致。
[0181]BaEV突變體糖蛋白假型化LV (BaEV/TR和BaEVRLess)的感染滴度與RD114/TR-LV之一類(lèi)似，并因此進(jìn)一步考慮用于轉(zhuǎn)導(dǎo)人CD34+早期祖細(xì)胞和T細(xì)胞和B細(xì)胞。
[0182]BaEV突變體假型化載體的穩(wěn)定性和對(duì)人血清滅活的耐受性
[0183]鑒于臨床體內(nèi)應(yīng)用，BaEV突變體假型化LV必須耐受人補(bǔ)體系統(tǒng)。該穩(wěn)定性通過(guò)比較在56°C下在人血清中孵育I小時(shí)的LV的感染滴度來(lái)測(cè)定。據(jù)報(bào)道熱破壞人補(bǔ)體，所以熱滅活的人血清用作對(duì)照。將獲得的殘余感染滴度報(bào)道為與胎牛血清孵育的LV的感染性(100 % )(圖3)。如預(yù)期的，VSV-G假型化LV被3種不同的人血清滅活。BaEV/TR和BaEVRLess假型化LV在存在含補(bǔ)體的血清的情況下保持穩(wěn)定，因?yàn)閷?duì)于三種不同供體，在存在人補(bǔ)體的情況下孵育后檢測(cè)到轉(zhuǎn)導(dǎo)效率沒(méi)有降低。因此，本發(fā)明人得出結(jié)論:BaEV/TR和BaEVRLess LV對(duì)人補(bǔ)系統(tǒng)統(tǒng)耐受的程度與RD114/TR-LV相同。對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，BaEV突變體假型化LV在人血清中的穩(wěn)定性使得它們成為比VSV-G LV假型更好的候選。
[0184]對(duì)于人CD34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，BaEV假型化LV高度優(yōu)于VSV-G-和RD114/TR-LV
[0185]BaEV/TR和BaEV RLess假型化LV都結(jié)合hCD34+細(xì)胞的細(xì)胞膜上的hASCTl和hASCT2，而RD114/TR LV只結(jié)合hASCT2。據(jù)之前描述，RD114/TR-LV只能在存在纖維連接蛋白(retronectin)的情況下有效轉(zhuǎn)導(dǎo)h⑶34+細(xì)胞。事實(shí)上，纖維連接蛋白是據(jù)報(bào)道允許結(jié)合細(xì)胞和載體兩者并因此增加h⑶34+細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)的纖連蛋白的片段。為了評(píng)價(jià)纖維連接蛋白在BaEV假型化LV轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，本發(fā)明人最初用強(qiáng)細(xì)胞因子雞尾酒(rSCF+rTP0+rFlt3-L)預(yù)先刺激h⑶34+細(xì)胞，并且在包被或未包被纖維連接蛋白的孔中用VSV-G, RD114/TR, BaEV/TR, BaEVRLe s s假型化LV以10的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)它們。本發(fā)明人觀(guān)察到，在存在纖維連接蛋白的情況下，BaEV-LV都以超過(guò)70%轉(zhuǎn)導(dǎo)h⑶34+細(xì)胞。
[0186]如上面所提到的，用細(xì)胞因子雞尾酒強(qiáng)烈刺激將誘導(dǎo)HSC分化并使它們喪失自我更新能力。事實(shí)上，細(xì)胞被預(yù)刺激越少，它們分化也越少，且它們保持它們的^干細(xì)胞^特征越多。此外，細(xì)胞因子刺激越強(qiáng)，在高載體劑量時(shí)每個(gè)細(xì)胞將發(fā)生多載體整合的風(fēng)險(xiǎn)越高。這可能會(huì)增加基因治療應(yīng)用中基因毒性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本發(fā)明人測(cè)試了在低細(xì)胞因子預(yù)刺激與低載體劑量組合后BaEV假型化LV是否可以有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)h⑶34+細(xì)胞。
[0187]首先，他們對(duì)于hCD34+細(xì)胞采用固定的10的MOI (感染性顆粒的數(shù)量/每個(gè)細(xì)胞)和不同的細(xì)胞因子預(yù)刺激方案(圖4):1)無(wú)刺激；2)用單一細(xì)胞因子rSCF或rTPO刺激；3)rSCF和rTPO ；4) rSCF+rTP0+rFlt3_L。重要的是，本文使用的最強(qiáng)細(xì)胞因子預(yù)刺激低于目前在臨床設(shè)置中使用的目標(biāo)在于限制細(xì)胞分化的刺激雞尾酒。本發(fā)明人觀(guān)察到，對(duì)于BaEV假型化LV，單一 TPO刺激足以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)高達(dá)60%的hCD34+細(xì)胞，而VSV-G-LV和RD114/TR-LV在TPO刺激后只轉(zhuǎn)導(dǎo)8-20 %的h⑶34+細(xì)胞。SCF單一預(yù)刺激允許轉(zhuǎn)導(dǎo)高達(dá)30-50 %的h⑶34+細(xì)胞，而 VSV-G-LV 和 RD114/TR-LV 只達(dá)到 10% 的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。TP0+SCF 或 TP0+SCF+FLK-3 預(yù)刺激與單一 BaEV-LV孵育的組合導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)高達(dá)75%的h⑶34+細(xì)胞，而RD114/TR-LV實(shí)現(xiàn)不超過(guò)40%的轉(zhuǎn)導(dǎo)?？傊?，對(duì)于所有不同的細(xì)胞因子預(yù)刺激方案，對(duì)于h⑶34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，BaEVLV假型的表現(xiàn)勝過(guò)VSV-G-和RD114/TR-LV。此外，在未刺激的細(xì)胞上獲得的結(jié)果表明，在存在纖維連接蛋白的情況下，BaEV/TR LV和BaEVRLess LV能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)10-20%的未刺激的hCD34+細(xì)胞。相反，VSV-G-和RDll4/TR LV以相同的載體劑量(Μ0Ι = 10)無(wú)法有效轉(zhuǎn)導(dǎo)未刺激的靜態(tài)h⑶34+細(xì)胞。
[0188]其次，必須避免插入突變的風(fēng)險(xiǎn)以限制基因治療的副作用。因此，為了限制多拷貝整合，本發(fā)明人降低載體劑量。在rSCF+rTPO和rSCF+rTP0+rFlt3_L刺激下測(cè)試不同的MOI (圖5和6)。BaEV/TR假型化LV在低載體劑量時(shí)明顯更好地轉(zhuǎn)導(dǎo)h⑶34+細(xì)胞，在5的MOI 達(dá)到 60 % (rSCF+rTPO)和 70 % (rSCF+rTP0+rFlt3-L)。BaEVRLess-LV 在 5 的 MOI 高度優(yōu)于RD114/TR-LV。VSV-G LV在低載體劑量(M0I5-10)時(shí)效率仍低得多。只有在100的MOI (目前用于臨床基因治療試驗(yàn)的載體劑量)，這些VSV-G-LV允許有效轉(zhuǎn)導(dǎo)h⑶34+細(xì)胞。但VSV-G-LV轉(zhuǎn)導(dǎo)率仍遠(yuǎn)低于BaEV-LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)率(VSV-G-LV(Μ0Ι為100) = 50-60%和BaEV-LV(Μ0120) = 75-90%;圖5和6)。在更高的刺激條件下，本發(fā)明人注意到，對(duì)于BaEV/TR-LV 和 RDll4/TR LV，BaEV/TR-、BaEVRLess-LV 和 RDl 14/TR-LV 在 10 的 MOI 達(dá)到穩(wěn)態(tài)(分別為75%和50%的轉(zhuǎn)導(dǎo))。因此，與小于或等于10的低載體劑量的BaEV LV孵育足以非常有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)hCD34+細(xì)胞，并且程度比RD114/TR-LV和VSV-G LV高得多?？傊?，BaEV假型化LV和特別是BaEV/TR-LV似乎比當(dāng)前可用的VSV-G-LV和RD114/TR-LV載體更有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)h⑶34+細(xì)胞。顯然，VSV-G-LV h⑶34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率取決于細(xì)胞因子刺激雞尾酒，而對(duì)于BaEV假型化LV則不是這樣的。
[0189]低BaEV-LV載體劑量允許以高比率轉(zhuǎn)導(dǎo)短期祖細(xì)胞。
[0190]本發(fā)明人想確認(rèn)用BaEV假型獲得的高h(yuǎn)CD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)是由于短期祖細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，他們通過(guò)在半固體甲基纖維素培養(yǎng)基中進(jìn)行克隆形成測(cè)定來(lái)確定造血祖細(xì)胞上BaEV假型化LV的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。以10的MOI用RD114/TR、BaEV/TR、BaEVRLess假型化載體和以100的MOI用VSV-G轉(zhuǎn)導(dǎo)rSCF+rTPO和rSCF+rTP0+rFlt3_L預(yù)刺激的細(xì)胞。本發(fā)明人對(duì)于VSV-G選擇更高的Μ0Ι，因?yàn)榕R床試驗(yàn)?zāi)壳皩?duì)于該假型以100的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)h⑶34+細(xì)胞。因此，使用該高載體劑量用于比較似乎更相關(guān)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后三天，將細(xì)胞在甲基纖維素培養(yǎng)基(補(bǔ)充有細(xì)胞因子)中培養(yǎng)，其允許它們分化成髓樣集落。發(fā)明人觀(guān)察14天后表達(dá)或不表達(dá)GFP+的成紅細(xì)胞集落、粒單核細(xì)胞(granulomonocytic)集落和混合集落。首先，他們比較了對(duì)于不同預(yù)刺激的表達(dá)GFP的集落數(shù)(圖7)。對(duì)于所有測(cè)試的載體，兩種刺激都給出了類(lèi)似結(jié)果。以10的MOI用兩種BaEV突變體假型化載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的集落形成祖細(xì)胞的比例高于以100的MOI用VSV-G —種轉(zhuǎn)導(dǎo)的集落形成祖細(xì)胞的比例(BaEV/TR-LV = 50-70%,BaEVRLess-LV = 45-70 %, VSV-G-LV = 25-50 % ) ? 在用于 BaEV/TR 和 BaEVRLess 假型化LV的相同載體劑量，只有10-35%的集落形成祖細(xì)胞克隆用RD114/TRLV假型轉(zhuǎn)導(dǎo)。在rSCF+rTPO預(yù)刺激后RDl 14/TR-、BaEV/TR-、BaEVRLessLV轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD34+細(xì)胞與由它們衍生的集落形成祖細(xì)胞的比例之間沒(méi)有顯著差異，表明hCD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)是穩(wěn)定的(圖8)。相反，對(duì)于VSV-G LV，集落形成祖細(xì)胞的比例顯著低于它們衍生的轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶34+細(xì)胞的比率(圖8)，表明VSV-G假型化載體轉(zhuǎn)導(dǎo)更多的分化CD34+細(xì)胞或者比其它測(cè)試載體毒性更大。
[0191]這些結(jié)果顯示，BaEV/TR-和BaEVRLess-LV假型以高比率轉(zhuǎn)導(dǎo)短期再植祖細(xì)胞。
[0192]BaEV假型化LV在免疫缺陷小鼠中以高效率轉(zhuǎn)導(dǎo)再植造血祖細(xì)胞
[0193]為了測(cè)定兩種BaEV突變體假型化載體在再植造血祖細(xì)胞上的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，臍血CD34.細(xì)胞用rSCF、rTPO和FLk_3L預(yù)刺激16小時(shí)，然后以10的MOI用RD114/TR, BaEV/TR，BaEVRLess假型化載體或以100的MOI用VSV-G-假型化LV轉(zhuǎn)導(dǎo)，并移植入亞致死照射的免疫缺陷的Balbc, Rag2^, y z+新生小鼠或NOD/SCID/ y c-/_ (NSG)小鼠(表1)。兩種小鼠模型允許移植完整的人血液系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈、B和NK細(xì)胞。
[0194]8-10周后，將動(dòng)物處死，并通過(guò)FACS分析測(cè)定骨髓中的總?cè)梭w血液有核細(xì)胞表1.BaEV/TR-和BaEVRLess-LV允許有效轉(zhuǎn)導(dǎo)SCID再植細(xì)胞

【權(quán)利要求】
1.用于將生物材料轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的假型化病毒載體顆粒，其中所述載體顆粒至少包含: -嵌合包膜糖蛋白，其包含或由狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成；或-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述病毒載體顆粒是慢病毒載體顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述慢病毒載體顆粒選自HIV和SIV。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述生物材料是一種或多種核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述病毒載體顆粒進(jìn)一步顯示至少一種選自干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-15和IL-7的細(xì)胞因子。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述假型化病毒載體顆粒意欲用于將生物材料轉(zhuǎn)移入造血細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的假型化病毒載體顆粒，其用于治療造血功能障礙或自身免疫性疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的假型化病毒載體顆粒的用途，其中所述造血功能障礙選自范可尼貧血、血友病、β -地中海貧血、Wiskott-Aldrich綜合征、X-連鎖重癥聯(lián)合免疫缺陷、腺苷脫氨酶缺乏癥、慢性肉芽腫病和腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良。
9.用于產(chǎn)生假型化病毒載體顆粒的方法，其包括 a)用以下物質(zhì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以得到生產(chǎn)細(xì)胞: (i)至少一種第一核酸序列，包含具有包裝能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的基因組； (?)至少一種第二核酸序列，包含編碼來(lái)自所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的核心蛋白的cDNA，和 (iii)至少一種第三核酸序列，包含編碼以下的cDNA: -嵌合包膜糖蛋白，包含或由狒狒內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結(jié)構(gòu)域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域的融合體組成，如上所定義；或-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域缺乏融合抑制性R肽，如上所定義； b)將所述生產(chǎn)細(xì)胞在培養(yǎng)物中維持足夠時(shí)間，以允許表達(dá)cDNA以產(chǎn)生編碼蛋白；和 c)允許編碼蛋白形成假型化病毒載體顆粒。
10.藥物，其包含作為活性成分的如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中定義的假型化病毒載體顆粒。
11.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中定義的假型化病毒載體顆粒用于將生物材料離體轉(zhuǎn)移到造血細(xì)胞中的用途。
12.用于轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞的方法，其包括在實(shí)現(xiàn)通過(guò)所述假型化病毒載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)所述造血細(xì)胞的條件下將所述造血細(xì)胞與如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中定義的假型化病毒載體顆粒接觸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述造血細(xì)胞選自造血干細(xì)胞、⑶34+祖細(xì)胞、非常早期⑶34+祖細(xì)胞、B細(xì)胞⑶19+祖細(xì)胞、髓樣⑶13+祖細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、外周血⑶34+細(xì)胞、癌B細(xì)胞(BCLL)、邊緣區(qū)淋巴瘤(MZL)B細(xì)胞和胸腺細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述造血細(xì)胞不用至少一種細(xì)胞因子預(yù)刺激。
15.穩(wěn)定的病毒包裝細(xì)胞系,其產(chǎn)生如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)中定義的假型化病毒載體顆粒。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104080917SQ201280053749
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月29日
【發(fā)明者】阿奈·吉拉爾-加涅潘, 埃爾莎·費(fèi)爾赫芬, 迪米特里·拉維爾特, 弗朗西斯-盧瓦克·科塞 申請(qǐng)人:國(guó)家健康與醫(yī)學(xué)研究院, 里昂高等師范學(xué)院