一種檢測抗血小板溶栓素蛋白(agkisacucetin)的間接雙抗體夾心ELISA方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測抗血小板溶栓素蛋白(agkisacucetin)的間接雙抗體夾心ELISA方法，包括以下步驟：(1)人血清樣本離心采集；(2)抗抗血小板溶栓素的特異性單克隆抗體1B9制備；(3)抗抗血小板溶栓素的特異性兔多抗的制備；(4)雙抗體夾心ELISA方法檢測血清樣本中的抗血小板溶栓素蛋白。本發(fā)明所述間接雙抗體夾心ELISA方法快速、靈敏，最低檢測限達(dá)到0.001ng/ml，能準(zhǔn)確檢測出血清樣本中的抗血小板溶栓素的含量，具有較好的臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】—種檢測抗血小板溶栓素蛋白(agki sacucet i η)的間接雙
抗體夾心ELISA方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測抗血小板溶栓素(agkisacucetin)的間接雙抗體夾心ELISA方法。
技術(shù)背景
[0002]心腦血管疾病尤其是血栓引起的腦梗塞和心機(jī)梗塞嚴(yán)重威脅著人類健康，影響患者的生存質(zhì)量。隨著人口老齡化和不良飲食習(xí)慣等危險因素的增加，心腦血管疾病的發(fā)病率和死亡率日趨上升，這類疾病是目前世界上的第三大致死因素，每年因心腦血管疾病死亡的人數(shù)接近世界總死亡人口的1/4，不僅在急性發(fā)作期給病人的生命帶來極大的威脅，而且由于極易發(fā)生的愈后不良，導(dǎo)致物力、財力的巨大耗費(fèi)，嚴(yán)重影響人類的期望壽命和生存質(zhì)量。
[0003]心腦血管疾病的預(yù)防和治療-直是醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的研究熱點(diǎn)?？寡ㄋ幬锎痤}分為抗凝藥物、溶栓藥物和抑制血小板聚集藥物三種。其中，抑制血小板聚集藥物可以最有效的抑制血栓形成和再梗，且對凝血系統(tǒng)影響小，出血副作用小，具有良好的發(fā)展前景。
[0004]本研究前期發(fā)現(xiàn)一種通過介導(dǎo)血小板聚集關(guān)鍵成分的血小板膜糖蛋白GPIb蛋白的安全高效的新型抗血栓藥物，抗血小板溶栓素，該藥物從尖吻蝮蛇蛇毒中提取。動物藥效學(xué)試驗(yàn)表明，該藥對瑞斯托霉素誘導(dǎo)的血小板聚集作用效果明顯，出血作用小，作用部位較為專一，效果較持久；在不穩(wěn)定性心絞痛血栓模型中，可明顯縮短凝血酶時間和活化部分凝血活酶時間，顯著地抑制血小板聚集，可明顯降低循環(huán)性的血流下降的頻率和幅度。I期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示藥物能有效的抑制血小板聚集，且藥物劑量與血小板聚集抑制程度之間存在正相關(guān)性。為進(jìn)一步研究抗血小板溶栓素藥物在人體血清中的代謝狀況，評價該藥物在人體中的安全性和有效性，建立一種快速而且行之有效的檢測方法迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供一種檢測抗血小板溶栓素的雙抗體夾心ELISA方法，操作簡便，可以快速、高效地檢測人血清中含有的抗血小板溶栓素蛋白。
[0006]所述檢測人血清中抗血小板溶栓素的雙抗體夾心ELISA方法包括以下步驟:
[0007](3)人血清樣本采集
[0008]受試者在給藥前和給藥后不同時間點(diǎn)采血，加入不含任何抗凝劑的干采血管中，3000rpm離心1min,收集上層血清。
[0009](4)抗抗血小板溶栓素的特異性單克隆抗體1B9制備
[0010]選用6-12周齡Balb/c小鼠，經(jīng)三次高純度抗血小板溶栓素原料藥腹腔注射免疫激發(fā)，第一次以每只小鼠0.1-0.2mg加等量弗氏完全佐劑，2-4周后以每只小鼠0.01-0.2mg加等量弗氏不完全佐劑，融合前三天以每只小鼠0.03-0.05mg，至免疫小鼠脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)胞。取免疫小鼠脾細(xì)胞懸液和骨髓瘤細(xì)胞以1: 5的比例在聚乙二醇作用下按常規(guī)法融合，形成雜交瘤細(xì)胞。篩選陽性克隆，進(jìn)行亞克隆化，將分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系以無血清培養(yǎng)基在體外進(jìn)行增量培養(yǎng)，獲得的培養(yǎng)液過以ProteinA偶聯(lián)的親和層析柱，純化得到濃度為2.941mg/ml抗抗血小板溶栓素的特異性單克隆抗體1B9。
[0011](3)抗抗血小板溶栓素的特異性兔多抗的制備
[0012]選用體重2_3kg的純種新西蘭兔，背部皮下多點(diǎn)皮內(nèi)注射高純度抗血小板溶栓素原料藥，每點(diǎn)注射0.01-0.02mg加等量弗氏完全佐劑，共0.05mg劑量，2-3周后加強(qiáng)免疫一次，劑量共0.0125mg,加等量弗氏不完全佐劑。加強(qiáng)免疫后2周，從兔緣靜脈取2_3ml血，制備抗血清，并分離得到濃度為8.557mg/ml的抗抗血小板溶栓素的特異性兔多抗。
[0013](4)血清中抗血小板溶栓素含量檢測方法
[0014]具體過程如下:
[0015]①包被1B9單抗:用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液將(2)中所制備的單抗1B9稀釋500-1000倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1-0.2ml單抗稀釋液，4°C過夜或保持18-24h。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用pH7.5磷酸鹽洗滌緩沖液洗3次，每次3_5min。
[0016]②加樣:加入待檢血清樣或作適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)參考品于反應(yīng)孔中，同時作空白孔和陽性孔對照，37°C孵育l_2h，洗滌。
[0017]③加兔多抗:用I %牛血清白蛋白溶液將(3)中制備的兔多抗稀釋300-500倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1-0.2ml單抗稀釋液，37°C孵育l_2h，洗滌。
[0018]④加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗:用I %牛血清白蛋白溶液將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗稀釋1500-2000倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1-0.2ml稀釋液，37°C孵育Ih，洗滌。
[0019]⑤底物顯色:于上述各反應(yīng)孔中加入臨時配制的OPD底物反應(yīng)溶液0.1-0.2ml，于室溫下避光反應(yīng)2min，再加IM H2SO40.1-0.2ml終止反應(yīng)。
[0020]⑥結(jié)果判定:將上述酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上于492nm處測OD值。根據(jù)相應(yīng)已知濃度對照品的OD值與濃度關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再由待測血清樣品所測OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求得相應(yīng)樣品中抗血小板溶栓素濃度。
[0021]步驟(2)親和層析柱的制備方法為:上述純化得到的抗血小板溶栓素單克隆抗體以0.lmol/1朽1檬酸鈉緩沖液于4°C透析過夜后，加IOml CNBr-Sepharose4B到IOml抗體溶液中，放在搖床或振蕩器上，4°C輕輕振搖過夜。再加入lml2mol/l乙醇胺溶液封閉CNBr_Sepharose4B殘余的活性基團(tuán),4°C繼續(xù)振搖lh。將偶聯(lián)好抗體的Sepharose4B柱裝到適當(dāng)?shù)膶游鲋?。?.lmol/1檸檬酸鈉緩沖液洗柱，接著用兩倍體積的0.lmol/1、pH6.5、含lmol/1氯化鈉的檸檬酸鈉緩沖液洗脫，最后用2倍柱體積的PBS洗。
[0022]步驟3中兔抗血清質(zhì)量的評價方法為:取高純度抗血小板溶栓素原料藥，分別用
0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至一系列濃度，固定在載體上；加入兔抗血清樣本，使其中存在的抗體與抗血小板溶栓素結(jié)合成為復(fù)合物；再加入一定濃度酶標(biāo)記二抗，使其與抗血清中的兔多抗結(jié)合形成復(fù)合物；顯色；讀取產(chǎn)物在492nm處的OD值；根據(jù)結(jié)果計(jì)算兔抗血清的效價。
[0023]步驟4中1B9單抗、兔多抗?jié)舛鹊倪x擇采用棋盤滴定法:分別以1: 250，I: 500，I: 750，I: 1000，I: 1250，I: 1500比例稀釋的1B9單抗包被酶標(biāo)板，分別加入1、10、lOOng/ml 的抗血小板溶栓素，再加入以 1: 225，I: 300，I: 375，I: 425，I: 475，I: 500，I: 575比例稀釋的兔多抗和1: 1500稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗，顯色終止液終止后，在492nm處讀取OD值。
[0024]步驟4中HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗?jié)舛鹊拇_定方法為:以1: 1000比例稀釋的1B9抗體包被，加入lng/ml的抗血小板溶栓素，再加入1: 425稀釋的兔多抗，最后分別加入 I: 1250、I: 1500、I: 1750、I: 2000、I: 2250、I: 2500 比例稀釋的 HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗，顯色終止液終止后，在492nm處讀取OD值。
[0025]雙抗體夾心ELISA方法適用于測定二價或二價以上各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，其步驟是受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過反應(yīng)也結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度。
[0026]本發(fā)明提供了一種臨床上能夠大量測定血清中抗血小板溶栓素的方法，具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0027]1.該方法靈敏度高，最低檢出限能夠達(dá)到0.001ng/ml，對抗血小板溶栓素蛋白有特異性，且準(zhǔn)確度較高，批間誤差和批內(nèi)誤差均小于8%。
[0028]2.該方法操作簡便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確。
[0029]3.檢測時采用可拆卸式的酶標(biāo)板，單個樣品或多樣品、單項(xiàng)目或多項(xiàng)目可自由檢測。
[0030]4.該方法分析可采用酶標(biāo)儀分析，可實(shí)現(xiàn)自動化，檢測數(shù)據(jù)可信、嚴(yán)謹(jǐn)。
【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1
[0032]標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0033](I)人血清樣本采集
[0034]受試者在給藥前采血，加入不含任何抗凝劑的干采血管中，3000rpm離心lOmin，收集上層血清。取抗血小板溶栓素原料藥(濃度為0.26mg/ml)，用血清將其稀釋3ug/ml、2ug/ml、lug/ml、250ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、lng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.lng/ml、
0.05ng/ml、0.01ng/ml、0.001ng/ml、0.0001ng/ml、0.00001ng/ml。
[0035](2)雙抗體夾心ELISA法，具體過程如下:
[0036]①包被1B9單抗:用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液將(2)中所制備的單抗1B9稀釋1000倍,在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1ml單抗稀釋液，4°C過夜或保持18_24h。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用pH7.5磷酸鹽洗滌緩沖液洗3次，每次3min。
[0037]②加樣:加入含不同濃度抗血小板溶栓素的血清，同時作空白孔和陽性孔對照，37°C孵育Ih，洗滌。
[0038]③加兔多抗:用I %牛血清白蛋白溶液將(3)中制備的兔多抗稀釋425倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1ml單抗稀釋液，37°C孵育lh，洗滌。
[0039]④加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗:用1%牛血清白蛋白溶液將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗稀釋2000倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1ml稀釋液，37°C孵育lh，洗滌。
[0040]⑤底物顯色:于上述各反應(yīng)孔中加入臨時配制的OPD底物反應(yīng)溶液0.1ml，于室溫下避光反應(yīng)2min，再加IM H2SO40.1ml終止反應(yīng)。
[0041]⑥結(jié)果判定:將上述酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上于492nm處測OD值。
[0042]以抗血小板溶栓素的濃度為橫坐標(biāo)，各濃度相應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得出血清中抗血小板溶栓素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定濃度范圍在0.00lng/ml至lng/ml之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好，R2達(dá)到0.99以上。見附圖1，回歸方程為:
[0043]y = 0.928x+0.4671, R2 = 0.9986
[0044]實(shí)施例2
[0045]定量下限試驗(yàn)(LLOQ)
[0046](2)人血清樣本采集
[0047]受試者在給藥前采血，加入不含任何抗凝劑的干采血管中，3000rpm離心10min，收集上層血清。配制抗血小板溶栓素濃度為Ing/mL的含藥血清5份。
[0048](2)雙抗體夾心ELISA法，具體過程如下:
[0049]①包被1B9單 抗:用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液將(2)中所制備的單抗1B9稀釋1000倍,在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1ml單抗稀釋液，4°C過夜或保持18_24h。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用pH7.5磷酸鹽洗滌緩沖液洗3次，每次3min。
[0050]②加樣:加入待檢血清樣，同時作空白孔和陽性孔對照，37°C孵育lh，洗滌。
[0051]③加兔多抗:用I %牛血清白蛋白溶液將(3)中制備的兔多抗稀釋425倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1ml單抗稀釋液，37°C孵育lh，洗滌。
[0052]④加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗:用1%牛血清白蛋白溶液將HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗稀釋2000倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1ml稀釋液，37°C孵育lh，洗滌。
[0053]⑤底物顯色:于上述各反應(yīng)孔中加入臨時配制的OPD底物反應(yīng)溶液0.1ml，于室溫下避光反應(yīng)2min，再加IM H2SO40.1ml終止反應(yīng)。
[0054]⑥結(jié)果判定: 將上述酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上于492nm處測OD值，將能滿足測定3~5個消除半衰期時樣品中的藥物濃度或能檢測出Cmax的1/10~1/20時的藥物濃度作為本測定方法的定量下限。
[0055]經(jīng)測定本方法的定量下限為0.0Olng/mL。結(jié)果見表1。
[0056]表1 APT定量下限準(zhǔn)確度(η = 5)
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測抗血小板溶栓素蛋白(agkisacucetin)的間接雙抗體夾心ELISA方法,其特征在于包括以下步驟: (1)人血清樣本采集 受試者在給藥前和給藥后不同時間點(diǎn)采血，加入不含任何抗凝劑的干采血管中，3000rpm離心1min,收集上層血清。 (2)抗抗血小板溶栓素(agkisacucetin)的特異性單克隆抗體1B9制備 選用6-12周齡Balb/c小鼠，經(jīng)三次高純度抗血小板溶栓素原料藥腹腔注射免疫激發(fā)，第一次以每只小鼠0.1-0.2mg加等量弗氏完全佐劑，2-4周后以每只小鼠0.01-0.2mg加等量弗氏不完全佐劑，融合前三天以每只小鼠0.03-0.05mg，至免疫小鼠脾臟能夠提供處于增殖狀態(tài)的特異性B細(xì)胞。取免疫小鼠脾細(xì)胞懸液和骨髓瘤細(xì)胞以1:5的比例在聚乙二醇作用下按常規(guī)法融合，形成雜交瘤細(xì)胞。篩選陽性克隆，進(jìn)行亞克隆化，將分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞系以無血清培養(yǎng)基在體外進(jìn)行增量培養(yǎng)，獲得的培養(yǎng)液過以Protein A偶聯(lián)的親和層析柱，純化得到濃度為2.941mg/ml抗抗血小板溶栓素的特異性單克隆抗體1B9。 (3)抗抗血小板溶栓素的特異性兔多抗的制備 選用體重2-3kg的純種新西蘭兔，背部皮下多點(diǎn)皮內(nèi)注射高純度抗血小板溶栓素原料藥，每點(diǎn)注射0.01-0.02mg加等量弗氏完全佐劑，共0.05mg劑量，2-3周后加強(qiáng)免疫一次，劑量共0.0125mg，加等量弗氏不完全佐劑。加強(qiáng)免疫后2周，從兔緣靜脈取2_3ml血，制備抗血清，并分離得到濃度為8.557mg/ml的抗抗血小板溶栓素的特異性兔多抗。 (4)血清中抗血小 板溶栓素含量檢測方法 具體過程如下: ①包被1B9單抗:用0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液將(2)中所制備的單抗1B9稀釋500-1000倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1-0.2ml單抗稀釋液，4°C過夜或保持18-24h。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用pH7.5磷酸鹽洗滌緩沖液洗3次，每次3_5min。 ②加樣:加入待檢血清樣或作適當(dāng)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)參考品于反應(yīng)孔中，同時作空白孔和陽性孔對照，37°C孵育l_2h，洗滌。 ③加兔多抗:用1%牛血清白蛋白溶液將(3)中制備的兔多抗稀釋300-500倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1-0.2ml單抗稀釋液，37°C孵育l_2h，洗滌。 ④加HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗:用I %牛血清白蛋白溶液將0.01mg/ml的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗稀釋1500-2000倍，在每個聚苯乙烯酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加0.1-0.2ml稀釋液，37 °C孵育Ih，洗滌。 ⑤底物顯色:于上述各反應(yīng)孔中加入臨時配制的鄰苯二胺(OPD)底物反應(yīng)溶液0.1-0.2ml，于室溫下避光反應(yīng)2min，再加IM H2SO40.1-0.2ml終止反應(yīng)。 ⑥結(jié)果判定:將上述酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上于492nm處測OD值。根據(jù)相應(yīng)已知濃度對照品的OD值與濃度關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再由待測血清樣品所測OD值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，求得相應(yīng)樣品中抗血小板溶栓素濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測抗血小板溶栓素蛋白的雙抗體夾心ELISA方法，其特征在于步驟(2)親和層析柱的制備方法為:上述純化得到的抗血小板溶栓素單克隆抗體以0.lmol/1檸檬酸鈉緩沖液于4°C透析過夜后，加10mlCNBr-Sepharose4B到1ml抗體溶液中，放在搖床或振蕩器上，4°C輕輕振搖過夜。再加入lml2mol/l乙醇胺溶液封閉CNBr_Sepharose4B殘余的活性基團(tuán)，4°C繼續(xù)振搖Ih。將偶聯(lián)好抗體的Sepharose4B柱裝到適當(dāng)?shù)膶游鲋?。?.lmol/1檸檬酸鈉緩沖液洗柱，接著用兩倍體積的0.lmol/1、pH6.5、含lmol/1氯化鈉的檸檬酸鈉緩沖液洗脫，最后用2倍柱體積的PBS洗。
3.如權(quán)利要求1所述的一種檢測抗血小板溶栓素蛋白的雙抗體夾心ELISA方法，其特征在于步驟3中兔抗血清質(zhì)量的評價方法為:取高純度抗血小板溶栓素原料藥，分別用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至一系列濃度，固定在載體上；加入兔抗血清樣本，使其中存在的抗體與抗血小板溶栓素結(jié)合成為復(fù)合物；再加入一定濃度酶標(biāo)記二抗，使其與抗血清中的兔多抗結(jié)合形成復(fù)合物；顯色；讀取產(chǎn)物在492nm處的OD值；根據(jù)結(jié)果計(jì)算兔抗血清的效價。
4.如權(quán)利要求1所述的一種檢測抗血小板溶栓素蛋白的雙抗體夾心ELISA方法，其特征在于步驟4中1B9單抗工作濃度為2.941mg/ml稀釋500-1000倍，兔多抗工作濃度為8.557mg/ml 稀釋 300-500 倍。
5.如權(quán)利要求1所述的一種檢測抗血小板溶栓素蛋白的雙抗體夾心ELISA方法，其特征在于步驟4中HRP-標(biāo)記 的羊抗兔IgG 二抗工作濃度為稀釋1500-2000倍。
【文檔編號】G01N33/543GK104034894SQ201310078642
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月5日
【發(fā)明者】趙亞男, 戴向榮, 周理想, 李相鴻, 戴敏, 孫華 申請人:皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院