專利名稱：一種檢測糖鏈異常IgA腎病的裝置及應(yīng)用此裝置的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及了一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱及應(yīng)用此裝置的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，用于對IgA腎病發(fā)生進(jìn)行診斷。
背景技術(shù)：
IgA腎病(IgAN)是一組多病因引起的具有相同免疫病理學(xué)特征的慢性腎小球疾病。臨床上約40％-45％的患者表現(xiàn)為肉眼或顯微鏡下血尿，35％-40％的患者表現(xiàn)為顯微鏡下血尿伴蛋白尿，其余表現(xiàn)為腎病綜合征和腎功能衰竭。IgA腎病是世界范圍內(nèi)一種常見的腎小球疾病，它的流行在不同洲、不同國家或在一個國家不同地區(qū)的差異很大，如亞洲的日本、新加坡，IgA腎病的發(fā)病率占原發(fā)性腎小球疾病的50％，而美國西部的印第安人低發(fā)區(qū)只占2％。一般而言，白人、黃種人明顯高于黑人的發(fā)病率。我國IgA腎病的發(fā)病率占原發(fā)性腎小球疾病的26％～34％。男女之比大約是2∶1。以血尿為主的IgA腎病目前尚無特效的治療。
目前診斷依據(jù)1.肉眼血尿或顯微鏡下血尿或無癥狀性蛋白尿(尤其男性青年)；2.血尿為腎小球性(畸形紅細(xì)胞為主)，蛋白尿為高、中分子或混合性蛋白尿，血清IgA可能升高；3.腎活檢免疫病理檢查腎小球系膜區(qū)可見到顆粒狀I(lǐng)gA為主的免疫熒光；4.除外鏈球菌感染后急性腎小球腎炎、非IgA系膜增生性腎炎、薄基底膜腎病、狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、肝硬化及酒精性肝病的腎損害等。本病診斷依靠腎活檢標(biāo)本的免疫病理學(xué)檢查，臨床缺乏簡便的免疫學(xué)檢測方法。
IgA分IgA1和IgA2兩個亞型。正常人血清中IgA1約占80％～90％。IgA1與IgA2亞型的重要區(qū)別之一就是IgA1分子的絞鏈上有O-連接寡糖鏈，其結(jié)構(gòu)式為Ser(Thr)-GalNAc-Gal-NA，而IgA2及其它免疫球蛋白則無此糖鏈結(jié)構(gòu)。因此通常所說的糖鏈異常IgA既指糖鏈異常IgA1。
蛋白質(zhì)糖基化的方式有兩種N-連接方式和O-連接方式。N-連接糖基與肽鏈上的天冬酰胺殘基相連，其糖基鏈較長且結(jié)構(gòu)復(fù)雜；O-連接糖基與肽鏈上的絲氨酸或蘇氨酸殘基相連，其糖基鏈較短且結(jié)構(gòu)簡單。大多數(shù)的血清糖蛋白僅含有N-連接糖基而無O-連接糖基，膜上的糖蛋白的糖基則多為O-連接糖基。
所有的免疫球蛋白均為糖蛋白，其中IgA糖基化程度很高，分子中含有8％的糖，而且它為少見的幾種既含N-連接糖基又含O-連接糖基的血清蛋白之一，其分子每側(cè)重鏈中含有2個或多于2個的N-連接糖基和3-5個O-連接糖基。目前已知的含有O-連接糖基的血清蛋白有IgD、C1抑制物、纖溶酶原、白介素-2、白介素-6、載脂蛋白CIII、載脂蛋白E和促紅細(xì)胞生成素，但這些糖蛋白在血清中的含量遠(yuǎn)小于IgA1。
IgA1分子O-連接糖基最基本的結(jié)構(gòu)是N一乙酰乳糖胺(GalNAc)以O(shè)-連接方式與肽骨架上的絲氨酸或蘇氨酸殘基相連。在此基礎(chǔ)上N一乙酰半乳糖胺可通過β1、3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在其末端連上半乳糖基。
目前研究表明，IgA腎病與IgA糖鏈上半乳糖狀態(tài)相關(guān)。IgA腎病其典型的病理改變?yōu)槟I小球基底膜上IgA1單體及聚合IgA1復(fù)合物的大量沉積。研究發(fā)現(xiàn)該沉淀實際上是包含IgA1的免疫復(fù)合物，而導(dǎo)致此免疫復(fù)合物的產(chǎn)生原因是IgA1由于異常糖鏈變化即半乳糖缺失而產(chǎn)生自身抗原性。
IgA1的寡糖鏈半乳糖基缺失，導(dǎo)致其末端糖基N一乙酰乳糖胺GalNAc處于暴露狀態(tài)。病人IgA1較正常IgA1與凝集素HAA(Helix aspersa agglutin)，結(jié)合率明顯增加。
IgA1半乳糖基化缺失的致病原因與肝細(xì)胞對其代謝性清除減少有關(guān)。肝細(xì)胞膜上含有非唾液酸糖蛋白受體，該受體通過IgA1寡糖鏈上的半乳糖Gal與IgA1特異識別，而去半乳糖型IgA1失去與此受體結(jié)合能力，因此，導(dǎo)致循環(huán)中去半乳糖基IgA1含量增加，并沉積到基底膜上。此外，去半乳糖基IgA1還易與IgG形成較大復(fù)合物，也阻礙了肝細(xì)胞對其攝取和處理的效能。IgA1寡糖鏈的末端半乳糖是由β1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(β1，3-GTase)催化的，IgAN病人也伴有此酶的活性降低。用去半乳糖處理后的絞鏈區(qū)IgA1與T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞共培養(yǎng)，以觀察受體細(xì)胞對其重新半乳糖基化的轉(zhuǎn)化能力實驗表明；病人與正常人T細(xì)胞和單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率無差別，而B細(xì)胞轉(zhuǎn)化率在病人則明顯降低，提示B細(xì)胞中β1，3-Gtase酶量及活性的變化。
因此IgA腎病中IgA1糖鏈異常變化后會影響其與相應(yīng)受體或其它蛋白的相互作用，從而更易于與系膜基質(zhì)成份結(jié)合和形成免疫復(fù)合物，沉積于腎小球，這是導(dǎo)致IgA腎病的分子機理。
因此，檢測血清中糖鏈異常IgA1是早期診斷IgA腎病的關(guān)鍵。
目前國內(nèi)外尚缺乏對靈敏、特異診斷的實驗室檢查方法，金標(biāo)準(zhǔn)只能依靠腎活檢穿刺術(shù)取腎組織，通過免疫熒光等病理分析來確診。由于腎活檢是一種創(chuàng)傷性手術(shù)，有一定的危險性，可引起血尿等并發(fā)癥，同時手術(shù)費用昂貴，所以常不被病人所接受。
臨床需要一種能夠快速高效檢測糖鏈異常IgA的試劑盒，但是一直沒有進(jìn)展。造成此困難的原因是正常IgA與糖鏈異常IgA1的差異只存在于糖鏈，既其只有質(zhì)的細(xì)微改變而無明顯量的變化，以往手段無法進(jìn)行二者的有效區(qū)分。
凝集素是一類廣泛存在于自然界的一大類非免疫來源的蛋白質(zhì)或糖蛋白，它能與糖專一性地、非共價地可逆結(jié)合，并且有凝集血細(xì)胞的作用，故稱為凝集素。
Sumner和Howell于1936年首先從刀豆(jackbean，Canavalia ensiformis)種子純化了伴刀豆凝集素-ConA。ConA能凝集溶液中的糖元和淀粉，ConA的血凝作用可被蔗糖抑制，因而推測ConA的血凝作用是與細(xì)胞表面糖作用的結(jié)果。
目前已有近千種植物被測得具有凝集素活性。植物中，不只種子中存在凝集素，根、莖、葉、皮、果實汁中也發(fā)現(xiàn)有凝集素。除植物外，其它生物，如各種真菌、某些病毒、無脊椎動物、脊椎動物及至人體的各種組織和器官中都存在凝集素。
凝集素可與糖專一性地結(jié)合。目前按結(jié)合糖的類型，凝集素可分為六類D-甘露糖或D-葡萄糖；N-乙酰氨基葡萄糖；N-乙酰氨基半乳糖；D-半乳糖；L-巖藻糖；唾液酸。凝集素HAA(Helix aspersa agglutin)來源于歐洲花園蝸牛，能特異與缺失半乳糖的GalNAc結(jié)合，類似的凝集素還有目前蝸牛凝集素HPA(Helix pomatia agglutin)，野生長絨毛豌豆凝集素VVA(Vicia villosa agglutin)，花生凝集素PNA(Peamut agglutinin)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱及含有該預(yù)裝柱的診斷試劑盒。通過該試劑盒可以真實地檢測出血清或尿液中糖鏈異常IgA的含量水平，準(zhǔn)確地診斷出IgA腎病，具有極高的靈敏度，方法快速簡便。
一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱，該預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離心管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液，所述分離管底部有一濾布，使得瓊脂糖顆粒無法穿過的濾布。該裝置通過離心收集純化的組分。
所述凝集素包括歐洲花園蝸牛凝集素HAA(Helix aspersa agglutin)、蝸牛凝集素HPA(Helix pomatia agglutin)，野生長絨毛豌豆凝集素VV(Vicia villosa)，花生凝集素PNA(Peamut agglutinin)。
所述親合介質(zhì)是采用瓊脂糖凝膠為基礎(chǔ)載體的介質(zhì)包括瓊脂糖sepharose4B、瓊脂糖凝膠sepharose 6B或瓊脂糖凝膠sepharose FF，瓊脂糖凝膠sepharoseCL-4B、瓊脂糖凝膠sepharose CL-6B。
所述緩沖溶液為凝集素的活性保護(hù)液。
所述瓊脂糖凝膠為sepharose 4B，緩沖液為凝集素的活性保護(hù)液，含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L的MnCl2和50mmol/L的Tris-HCL，PH 7.5。
所述濾布是能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布。
所述檢測的標(biāo)本是血清和尿液，血清指去除血液中細(xì)胞成分，離心后的上清液體。
所述裝有偶聯(lián)凝集素的瓊脂糖凝膠由以下步驟得到的采用Pharmacia公司經(jīng)CNBr活化的Sepharose 4B偶聯(lián)凝集素HAA(采購自Sigma公司)。
(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；(2)稱取2mgHAA，溶于7.5mL偶聯(lián)緩沖液(0.1mmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH 8.3)，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；
(3)以10mL偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的HAA，測定洗滌液中的HAA含量，計得偶聯(lián)率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩沖液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA、1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明提供了與微量離心柱配套使用，用于洗脫結(jié)合到HAA-Sepharose上面的糖鏈異常IgA1的洗脫液，其制作方法和組成如下20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4緩沖液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，為保證長時間保存而不長菌，加入防腐劑Proclin 300至0.1％。
洗脫步驟在洗脫時，將上述溶液加入其中，在溫箱中溫育30分鐘，達(dá)到洗脫的目的。
本發(fā)明提供了一種采用該預(yù)裝離心柱進(jìn)行純化糖鏈異常IgA步驟及其相關(guān)試劑組成。
該組合包括預(yù)裝微量離心柱(內(nèi)裝已經(jīng)偶聯(lián)了歐洲花園蝸牛凝集素HAA的瓊脂糖和其保護(hù)液)，清洗液(20mmTris-Hcl，PH7.4緩沖液，0.1％Proclin300)，洗脫液(20mmTris-Hcl，NaCL 150mm，ph7.4緩沖液，其中含有500mmα-甲基-D-甘露糖苷，0.1％，Proclin 300)。
1.將待檢測血清或尿液完全離心，血清要求無溶血；取出預(yù)裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取250ul血清或尿液于試管中，并加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋后標(biāo)本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請不要蓋離心管蓋子，樣本稀釋液將在15分鐘內(nèi)流入下層收集管中；試管中剩余150ul稀釋標(biāo)本(樣本①)準(zhǔn)備對照檢測用。
4.將收集管內(nèi)液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數(shù)滴出現(xiàn)在下層收集管時，蓋上離心管蓋，放置37℃恒溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)室溫下離心2分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本②)備檢測。
本發(fā)明提供了一種含有上述預(yù)裝離心柱的化學(xué)發(fā)光試劑盒及其制作方法。
該化學(xué)發(fā)光試劑盒包括了分離IgA腎病糖鏈異常IgA1的預(yù)裝離心柱；包被了羊抗人IgA的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板；陽性對照物、陰性對照物；酶標(biāo)記的抗IgA1單克隆抗體；底物溶液A、顯色液B、糖鏈異常IgA1清洗緩沖液、糖鏈異常IgA1洗脫液、IgA標(biāo)準(zhǔn)品。
本試劑盒的制作方法如下(1)包被將普通高滴度的羊抗人IgA多抗(來源于Sigma公司)用0.05M檸檬酸緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板可選用國產(chǎn)板或進(jìn)口板；規(guī)格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；(2)陽性、陰性對照物陽性對照物收集IgA腎病病人血清，過濾除菌、分裝；陰性對照物收集正常人血清，過濾除菌、分裝；(3)酶標(biāo)記單抗購買自Sigma公司的HRP-鼠抗人IgA1。
(4)輔助試劑的配制方法如下a)底物溶液A通過市售獲得b)顯色液B通過市售c)糖鏈異常IgA1清洗緩沖液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑d)糖鏈異常IgA1洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑d)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了羊抗人IgA多抗的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板、陽性對照物、陰性對照物、酶標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體、底物溶液A、顯色液B、糖鏈異常IgA1清洗緩沖液、糖鏈異常IgA1洗脫液、IgA標(biāo)準(zhǔn)品共同包裝，得到試劑盒。
本發(fā)明還提供了一種含有上述預(yù)裝離心柱的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒及其制作。
該試劑盒包括了分離IgA腎病糖鏈異常IgA1的預(yù)裝離心柱；包被了羊抗人IgA多抗的酶標(biāo)板；陽性對照物、陰性對照物；酶標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體；底物溶液A、顯色液B、反應(yīng)終止液、糖鏈異常IgA1清洗緩沖液、糖鏈異常IgA1洗脫液、IgA標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮洗滌液。
本試劑盒的制作方法如下(1)包被將普通高滴度的羊抗人IgA多抗(來源于Sigma公司)用0.05M碳酸緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用吐溫磷酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磷酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。酶標(biāo)板是聚苯乙烯酶標(biāo)板，可選用國產(chǎn)板或進(jìn)口板；規(guī)格可以是96孔平板或12×8、12×4可拆條板；(2)陽性、陰性對照物陽性對照物收集IgA腎病病人血清，過濾除菌、分裝；陰性對照物收集正常人血清，過濾除菌、分裝；(3)酶標(biāo)記單抗標(biāo)記HRP的鼠抗人IgA1單克隆抗體來源于Sigma公司。
(4)輔助試劑的配制方法如下a)底物溶液A磷酸-檸檬酸緩沖液(pH5.0)配制的3％過氧化氫溶液；b)顯色液B四甲基聯(lián)苯胺(TMB)甲醇溶液，濃度為0.1mg/ml；c)糖鏈異常IgA1清洗緩沖液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑d)糖鏈異常IgA1洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑e)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；f)反應(yīng)終止液2mol/L硫酸；(5)將預(yù)裝離心柱、包被了羊抗人IgA多抗的酶標(biāo)板、陽性對照物、陰性對照物、酶標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體、底物溶液A、顯色液B、糖鏈異常IgA1清洗緩沖液、糖鏈異常IgA1洗脫液、反應(yīng)終止液、IgA標(biāo)準(zhǔn)品共同包裝，得到試劑盒。
本發(fā)明克服了以往IgA腎病無特異檢測方法的缺點，避免腎活檢給病人帶來的痛苦，操作者只需要離心和溫育等簡單操作，在2小時內(nèi)就可以完成檢測，直接定量計算出血樣或尿液標(biāo)本中所含的糖鏈異常IgA1的含量，方法簡便，檢測快捷，結(jié)果準(zhǔn)確，為IgA腎病的預(yù)防、診斷、治療提供了支持。


附圖為本發(fā)明預(yù)裝離心柱的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
下面用實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的具體改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
參見附圖，本發(fā)明提供的一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA1的預(yù)裝離心柱，由位于上部的分離管1和位于下部的收集管3組成，通?？梢圆捎脤⒎蛛x管插接到收集管上的方式實現(xiàn)兩者的連接，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)4(為圖面清晰起見，圖中標(biāo)注的是用于裝親合介質(zhì)的管內(nèi)空間，沒有繪出介質(zhì)實物)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液(為圖面清晰起見，圖中標(biāo)注的是用于裝緩沖溶液的管內(nèi)空間，沒有繪出溶液實物)，所述分離管底部主要是一濾布，該濾布采用能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布，以便在離心分離時，分離出來的液體和蛋白質(zhì)能夠透過該濾布進(jìn)入下面的收集管?？梢允褂矛F(xiàn)有的這種濾布，并通過在分離管底部設(shè)置一個夾持塑料墊圈，將濾布固定住。
實施例1檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒的制作該試劑盒(96人份)組成包括IgA腎病糖鏈異常IgA親和吸附離心管96份IgA腎病陰性、陽性對照物各1瓶；
羊抗人IgA多抗包被板(96孔)1塊；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；IgA標(biāo)準(zhǔn)品1瓶；底物溶液A、顯色液B各1瓶，5ml/瓶；反應(yīng)終止液1瓶，5ml/瓶；糖鏈異常IgA清洗緩沖液25ml/瓶糖鏈異常IgA洗脫液15ml/瓶濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)20ml/瓶具體操作如下1.制備IgA腎病-陰性、陽性對照物1)收集血清或尿液從醫(yī)院或血站獲得健康正常人血清，于-20℃保存?zhèn)溆?；?dāng)試劑盒用于檢測尿液時，對照陽性采用IgA腎病陽性病人尿液。
2)分裝陽性對照物在無菌條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃；陰性對照物正常人血清，經(jīng)檢定為IgA腎病陰性。取多份以上血清合并成批，經(jīng)60℃1小時處理后，過濾除菌。在無菌的條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃。
2.制作羊抗人IgA多抗包被板a)包被酶標(biāo)板采用進(jìn)口或國產(chǎn)的12×8可拆條板。將羊抗人IgA多抗用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用清洗緩沖液洗板，再用該封閉液2％BSA封閉過夜，甩干后晾干，即獲得羊抗人IgA多抗包被酶標(biāo)板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；
b)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體可以市售(Sigma公司)獲得4)分裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟3)獲得的酶標(biāo)鼠抗人IgA1單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.輔助試劑的配制1)底物溶液A磷酸-檸檬酸緩沖液(PH5.0)配制的3％過氧化氫溶液，按5ml/瓶分裝；2)顯色液BTMB(0.1mg/ml)甲醇溶液，按5ml/瓶分裝；3)反應(yīng)終止液2mol/L H2SO4，按3ml/瓶分裝；4)糖鏈異常IgA清洗緩沖液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑5)糖鏈異常IgA洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑6)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；實施例2檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制作該試劑盒(96人份)組成包括IgA腎病糖鏈異常IgA親和吸附離心管96份IgA腎病陰性、陽性對照各1瓶；羊抗人IgA多抗包被板(96孔)1塊；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體1瓶，6ml/瓶；IgA標(biāo)準(zhǔn)品1瓶底物溶液A、顯色液B各1瓶，5ml/瓶；糖鏈異常IgA清洗緩沖液25ml/瓶糖鏈異常IgA洗脫液15ml/瓶濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)20ml/瓶具體操作如下1.制備IgA腎病-陰性、陽性對照物1)收集血清或尿液從醫(yī)院或血站獲得健康正常人血清，于-20℃保存?zhèn)溆?；?dāng)試劑盒用于檢測尿液時，對照陽性采用IgA腎病陽性病人尿液。
2)分裝陽性對照物在無菌條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃；陰性對照物正常人血清，經(jīng)檢定為IgA腎病陰性。取多份以上血清合并成批，經(jīng)60℃1小時處理后，過濾除菌。在無菌的條件下分裝入1.5ml eppendorf管中，每管0.5ml。貯存于4℃。
2.制作羊抗人IgA多抗包被板a)包被化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板采用進(jìn)口或國產(chǎn)的12×8可拆條板。將步驟1)羊抗人IgA多抗用0.05mol/L檸檬酸緩沖液稀釋為20μg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100μl，吸附過夜，用清洗緩沖液洗板，再用該封閉液緩沖液封閉過夜，甩干后晾干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。按96孔/塊用鋁箔袋包裝、真空封閉；b)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體通過市售(Sigma公司)獲得4)分裝用含10％胎牛血清的緩沖液稀釋由步驟3)獲得的酶標(biāo)鼠抗人IgAl單克隆抗體至合適的工作濃度，按6ml/瓶分裝，貯存于4℃。
4.輔助試劑的配制1)底物溶液A1.0ml EDTA(1.0×10-2M、1.0ml H2O2(7.5×10-3M)、0.4ml HCl(1.0×10-2M)和0.2ml Tween20(1％)2)顯色液Bluminol 5.0×10-4Mol/L；
3)糖鏈異常IgA清洗緩沖液20mmTris-Hcl，PH7.4，含0.1％Proclin 300防腐劑4)糖鏈異常IgA洗脫液20mmTris-Hcl，PH7.4，150mmNaCl，500mmol/Lα-甲基-D-甘露糖苷，含0.1％Proclin 300防腐劑5)濃縮洗滌液(20倍濃縮液，20×)PBS(pH7.4)配制的0.05％吐溫20溶液；實施例3預(yù)裝離心柱的制備和使用1、預(yù)裝離心柱由離心柱和填充介質(zhì)組成，離心柱由上部的離心管和下部的收集管組成，二者套在一起，組成離心柱，輔助試劑包括糖鏈異常IgA清洗液和糖鏈異常IgA洗脫液。
2、離心柱填充材料的制備采用Pharmacia公司經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B和Sigma公司的HAA，按以下步驟偶聯(lián)(1)將1.5g Sepharose 4B浸泡于1mmol/L HCl至膨脹，移入砂蕊漏斗，以300mL 1mmol/L HCl洗滌約30min；(2)稱取50mg HAA，溶于7.5mL偶聯(lián)緩沖液(0.1mmol/L NaHCO3，pH8.3，0.5mol/L NaCl)，與經(jīng)洗滌的Sepharose 4B合并，以帶塞的10mL試管上下顛倒混勻(室溫，2h)；(3)以10mL偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的HAA。經(jīng)測定洗滌液中的HAA含量，計得偶聯(lián)率為98％；(4)用0.2mol/L甘氨酸封閉剩余活化基因；(5)依次用10mL 0.1mol/L醋酸緩沖液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/L Tris緩沖液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗滌3次，再以含0.1％BSA，1mmol/L CaCl2和0.1mmol/L MnCl2的PBS(PBS-BSA)洗滌1次，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 3、在上部分離心管中，加入一層濾布，并加一個塑料墊圈固定，該濾布的孔徑小于瓊脂糖，因此瓊脂糖不能經(jīng)過，但是蛋白質(zhì)量和液體可以流過。取300ul已經(jīng)偶聯(lián)的凝集素的sepharose 4B加入離心柱上部的離心管中。
4、加入1ml-2ml凝集素保存緩沖液，緩沖液充滿存在介質(zhì)的部位，并大部分存在于下面的收集管中，本發(fā)明預(yù)裝離心柱下部收集管中的緩沖液含1mmol/L的CaCl2、1mmol/L MnCl2和50mmol/L Tris-HCL，PH 7.5本預(yù)裝離心柱的使用方法如下1.將待檢測血清或尿液完全離心，血清無溶血；取出預(yù)裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。
2.樣本稀釋吸取250ul樣本于試管中，并加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋后標(biāo)本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請不要蓋離心管蓋子，樣本稀釋液將在15分鐘內(nèi)流入下層收集管中；4.將收集管內(nèi)液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數(shù)滴出現(xiàn)在下層收集管時，蓋上離心管蓋，放置37℃恒溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)室溫下離心2分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本②)備檢測。
本發(fā)明的試劑盒的質(zhì)量檢測方法是
1)蛋白載量偶聯(lián)HAA的含量通過計算偶聯(lián)前蛋白含量減去未偶聯(lián)蛋白獲得含量。要求不低于7mg/ml，在7-10mg/ml可以取得較好的結(jié)果。
2)準(zhǔn)確性5份正常陰性質(zhì)控血清(包括特異性對照血清)參考品、5份正常尿液參考品的檢測結(jié)果，無假陽性出現(xiàn)。3份IgA腎病患者血清和2份IgA腎病患者尿液標(biāo)本檢測結(jié)果無假陰性出現(xiàn)。
3)精密度隨機抽取20盒不同批次試劑盒，用同一份陽性質(zhì)控血清按說明書操作步驟進(jìn)行重復(fù)測定。計算每次測定結(jié)果，求出均值、SD和變異系數(shù)CV。精密度試驗結(jié)果顯示批間CV小于10％。
3)檢測靈敏度根據(jù)IgA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋測定結(jié)果，本試劑盒的檢測靈敏度為10ng/ml。
實施例4用本發(fā)明提供的檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行糖鏈異常IgA含量檢測的方法和步驟是一、試劑盒組成1，羊抗人IgA多抗包被板2，鼠抗人IgA1單抗酶標(biāo)記物3，化學(xué)發(fā)光底物A和B4，濃縮洗滌液5，預(yù)裝HAA-Sepharose 4B親和吸附離心管6，糖鏈異常IgA清洗液7，糖鏈異常IgA洗脫液8，IgA定量標(biāo)準(zhǔn)品9，說明書10，蓋板膜二、標(biāo)本處理和糖鏈異常IgA純化
1.取出預(yù)裝微量離心柱，棄去下層收集管中液體。將待檢測血清或尿液完全離心，血清要求無溶血；2.樣本稀釋吸取250ul血清或尿液于試管中，并加入350ul清洗液稀釋、搖勻。
3.加樣吸出450ul稀釋后標(biāo)本加入上部分離心管中。37℃溫箱靜置，此操作請不要蓋離心管蓋子，樣本稀釋液將在15分鐘內(nèi)流入下層收集管中；試管中剩余150ul稀釋血清(樣本①)準(zhǔn)備對照檢測用。
4.將收集管內(nèi)液體棄去；5.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；6.棄去下層收集管中液體；7.往上部離心管中加入清洗液600ul，等待清洗液全部流入下層收集管中(約3分鐘)，蓋上離心管蓋，2000轉(zhuǎn)(或3000轉(zhuǎn))室溫下離心2分鐘；8.棄去下層收集管中液體；9.加入洗脫液450ul，等洗脫液體數(shù)滴出現(xiàn)在下層收集管時，蓋上離心管蓋，放置37℃恒溫箱中，溫育30分鐘；10.取出離心管，2000(或3000轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)室溫下離心2分鐘；11.收集流入下層收集管中的液體(樣本②)備檢測。
三、定量檢測糖鏈異常IgA1.設(shè)計好包被板的位置及數(shù)量，未用的包被板密閉，放入到2-8℃冰箱中。
2.加入待檢查糖鏈異常IgA的標(biāo)本到相應(yīng)的包被板微孔中。
3.37℃溫育30分鐘。
4.洗滌5次，扣干包被板上殘留的液體。
5.依次向各孔中加入100μl的酶結(jié)合物。
6.37℃溫育30分鐘7.洗滌5次，扣干包被板上殘留的液體8.向每孔加入50μl底物液，請預(yù)先將A、B液等體積混合；或向每孔中先加25μl底物A再加25μl底物B，輕輕拍勻5秒鐘。
9.在加入底物后10分鐘內(nèi)采用化學(xué)發(fā)光儀進(jìn)行檢測。四、結(jié)果判定制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測定的RLU值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線；計算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2，當(dāng)R2＞0.95時本次測定有效；將檢測所得的讀值按該試劑標(biāo)準(zhǔn)品曲線計算糖鏈異常IgA含量，比值判定糖鏈異常IgA≥10ng/mL為IgA腎病或患IgA腎病高危者糖鏈異常IgA1％判定(IgA1樣本2含量÷IgA1樣本1含量)*100％糖鏈異常IgA1％≥10％為IgA腎病陽性糖鏈異常IgA1％＜10％為IgA腎病陰性實施例5采用本發(fā)明提供的試劑盒對IgA腎病病人陽性樣品的檢測結(jié)果為判斷本發(fā)明酶聯(lián)免疫試劑盒與臨床IgA腎病檢測結(jié)果的符合率，取本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行了對比檢測實驗。采用北京大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供的20份已知IgA腎病標(biāo)本和來自河北血液中心的20份正常獻(xiàn)血員血清進(jìn)行對比檢測。
表1.在不同標(biāo)本中檢出率比較

實施例5采用本發(fā)明提供的試劑盒對IgA腎病病人血清樣品和尿液樣品檢測的對比結(jié)果為判斷本發(fā)明對兩種樣本檢測的差異，取本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光試劑盒試劑盒對來自美國阿拉巴馬州伯明翰大學(xué)醫(yī)學(xué)系提供的10份已知IgA腎病血清和尿液標(biāo)本進(jìn)行對比檢測。
表2.在不同標(biāo)本中檢出率比較

結(jié)果表明兩種體液檢測無明顯差異。
權(quán)利要求
1.一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱，其特征在于其由上部分離管和下部收集管組成，所述上部離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，上部的分離管底部有一濾布，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。為純化親和吸附的蛋白，并配套清洗液和洗脫液。
2，如權(quán)利要求1所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述凝集素為歐洲花園蝸牛凝集素HAA、蝸牛凝集素HPA、或野生長絨毛豌豆凝集素VVA、花生凝集素PNA。
3.如權(quán)利要求1所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述親合介質(zhì)是采用瓊脂糖基礎(chǔ)介質(zhì)包括瓊脂糖凝膠sepharose 4B、瓊脂糖凝膠sepharose 6B、或瓊脂糖凝膠sepharose FF，瓊脂糖凝膠sepharoseCL-4B、瓊脂糖凝膠sepharose CL-6B所述緩沖溶液為凝集素的活性保護(hù)液。
4.如權(quán)利要求1所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述濾布是能阻擋偶聯(lián)有凝集素的親合介質(zhì)穿過而不阻擋液體和蛋白質(zhì)穿過的濾布。
5.如權(quán)利要求3所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱，其特征在于所述裝有偶聯(lián)凝集素HAA的瓊脂糖凝膠通過以下步驟獲得(1)將溴化氫活化Sepharose 4B用1mmol/L HCl浸泡、洗滌；(2)稱取HAA，溶于偶聯(lián)緩沖液中，與經(jīng)洗滌的Sepharose4B合并混勻；(3)用偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的HAA，測定洗滌液中的HAA含量，計得偶聯(lián)率為98％；(4)用甘氨酸封閉剩余活化基因，洗滌，4℃暫存?zhèn)溆谩?br> 6.如權(quán)利要求1所述的分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱，其特征在所述檢測的標(biāo)本是血清和尿液，血清指去除血液中細(xì)胞成分，離心后的上清液體。
7.一種檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的定量檢測試劑盒，其特征為試劑盒所含的標(biāo)本處理系統(tǒng)如權(quán)利要求1所述，經(jīng)過權(quán)利要求1所述的裝置進(jìn)行純化獲得糖鏈異常IgA后，進(jìn)行檢測獲得其含量。該種定量檢測方法包括放射免疫測定法、熒光免疫測定法(時間分辨熒光技術(shù))、酶免疫測定法、免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫測定法、電化學(xué)發(fā)光免疫測定法。
8.一種如權(quán)利要求7所述的檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的定量檢測試劑盒，其特征為標(biāo)本處理系統(tǒng)如權(quán)利要求1所述，檢測糖鏈異常IgA和糖鏈異常IgA含量采用化學(xué)發(fā)光方法，檢測試劑盒包括下列組件(1)分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱；(2)包被了羊抗人IgA多抗的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板；(3)陽性對照物、陰性對照物；(4)酶標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體；(5)化學(xué)發(fā)光底物溶液A、化學(xué)發(fā)光底物顯色液B、糖鏈異常IgA清洗緩沖液、糖鏈異常IgA洗脫液、IgA標(biāo)準(zhǔn)品，所述分離糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。
9.一種如權(quán)利要求7所述的檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的定量檢測試劑盒，其特征為標(biāo)本處理系統(tǒng)如權(quán)利要求1所述，檢測糖鏈異常IgA采用酶聯(lián)免疫定量分析方法，檢測試劑盒包括下列組件(1)分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱；(2)包被了羊抗人IgA多抗的酶標(biāo)板；(3)陽性對照物、陰性對照物；(4)酶標(biāo)記的鼠抗人IgA1單克隆抗體；(5)底物溶液A、顯色液B、糖鏈異常IgA清洗緩沖液、糖鏈異常IgA洗脫液、反應(yīng)終止液、IgA標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮洗滌液，所述分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱由上部分離管和下部收集管組成，所述上部分離管裝有偶聯(lián)凝集素的親合介質(zhì)，所述下部收集管中裝有緩沖溶液。
10，一種如權(quán)利要求7所述的檢測IgA腎病糖鏈異常IgA的定量檢測試劑盒，其判定方法為計算糖鏈異常IgA占總IgA的比值、計算糖鏈異常IgA的含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種分離IgA腎病糖鏈異常IgA的預(yù)裝離心柱。該離心柱由上部分離管和下部收集管組成。上部分離管裝有偶聯(lián)蝸牛凝集素(HAA)的親合介質(zhì)，上部分離管底部是一個濾布，下部收集管中裝有緩沖溶液。蝸牛凝集素(HAA)能與糖鏈異常IgA相結(jié)合。經(jīng)過離心洗脫，獲得與蝸牛凝集素HAA相結(jié)合的糖鏈異常IgA。本發(fā)明還涉及了一種含有該預(yù)裝離心柱的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和一種含有該預(yù)裝離心柱的酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒及其制備、使用方法。應(yīng)用該試劑盒可快速、簡便的測定糖鏈異常IgA的含量，準(zhǔn)確的對IgA腎病進(jìn)行早期診斷，為IgA腎病的預(yù)防、診斷、治療提供支持。
文檔編號G01N33/53GK101051010SQ20071010750
公開日2007年10月10日 申請日期2007年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月17日
發(fā)明者林長青 申請人:北京熱景生物技術(shù)有限公司