專利名稱：抗血小板膜糖蛋白vi單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及血小板膜糖蛋白VI (以下簡稱為GPVI)的抗體和該抗體的識別區(qū)域。
背景技術：
血小板在血栓形成、機體防御方面擔負著極為重要的作用，已經了解到其生理作用與各種病態(tài)相關。特別是血小板在形成止血血栓的功能中受人矚目，例如，血管內皮細胞受損傷，則血管內皮下的主要基質蛋白-膠原蛋白暴露，血小板與其粘附。接著，來自膠原蛋白的信號激活血小板，最終經由血纖蛋白原使血小板聚集。根據情況，這可能成為血栓栓塞性疾病等病態(tài)的原因，因此人們將其作為治療的目標。

以往，為了治療或預防由于血小板聚集而導致的血栓形成，使用了阿司匹林、噻氯匹定、GPIIb/IIIa拮抗劑等抗血小板藥，其有效性和出血等副作用方面有很多問題，人們希望出現不具有上述問題、具有充分的安全性、以及確實且適當作用的優(yōu)異的抗血小板藥。存在于血小板膜上的GPVI是血小板的膠原蛋白受體，已經得知其在膠原蛋白的刺激產生的血小板活化中擔負中心性作用(參照高山博史，日本血栓止血學會志,2003年，第14卷，第2號，75-81頁)。S卩，Sugiyama等人報道稱自身免疫性血小板減少癥患者的血小板中特異性缺失62kDa的膜蛋白，未見膠原蛋白導致的血小板聚集(參照TateoSugiyama等5人，Blood，美國，1987年，第69卷，第6號，1712-1720頁)，并且該患者的血小板中缺失的蛋白質是GPVI，由患者血清純化的抗體的Fab片段抑制膠原蛋白引發(fā)的血小板聚集(參照Tateo Sugiyama等6人，Blood，美國，1987年，第69卷，第6號，1712-1720頁；以及 Masaaki Moroi 等 4 人，Journal of Clinical Investigation,美國，1989 年，第84 卷，第 5 號，1440-1445 頁)。目前，來自自身免疫疾病患者的抗人GPVI自身抗體有Sugiyama等人(參照TateoSugiyama 等 6 人，Blood,美國，1987 年，第 69 卷，第 6 號，1712-1720 頁)或 Takahashi 等人(參照 Hoyu Takahashi 等 2 人，American Journal of Hematology,美國，2001 年，第 67卷，第4號，262-267頁)的報道。但是，在Sugiyama等人的報告中，由患者血漿純化的抗人GPVI自身抗體具有引發(fā)血小板聚集的作用，因此無法直接應用于藥物中。Takahashi等人的文獻(參照 Hoyu Takahashi 等 2 人，American Journal of Hematology,美國，2001 年，第67卷，第4號，262-267頁)中記載存在推測為GPVI的約62kDa的蛋白的自身抗體；以及該抗體引發(fā)血小板聚集。為了將來自這些患者的抗GPVI抗體作為藥物臨床應用，必須以穩(wěn)定的品質大量生產安全性高的抗體，但是工業(yè)化生產方法尚未確立。目前制備的抗GPVI抗體是抗小鼠GPVI單克隆大鼠抗體(參照歐洲專利申請公開公報第1228768號)、以及抗人GPVI單克隆小鼠抗體(參照國際專利申請公開公報第01/00810 號和國際專利申請公開公報第 02/080968 號；Thromb Haemost，2003Jun ；89(6)996-1003)。識別人GPVI的人單鏈抗體(scFv :單鏈Fv)是使用噬菌體展示法等制備的(參照國際專利申請公開公報第01/00810號、國際專利申請公開公報第02/080968號、以及PeterA Smethurst等16人，Blood,美國，2002年,第100卷,第11號,474a頁)。這些單鏈抗體是通過肽接頭將人抗體的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)結合，是具有來自人的可變區(qū)的抗體，但是與細胞所產生的通常的免疫球蛋白相比，通常與抗原的親和性低，在生物體內的半衰期也短，另外,Smethurst等人的研究中，單鏈抗體內，關于抑制血小板聚集的克隆(10B12) JfGPVI上的表位進行分析，第59號的賴氨酸(Lys 59)顯示具有相關的可能性(參照 Hoyu Takahashi 等 2 人，American Journal of Hematology,美國，2001 年，第 67 卷，第 4 號，262-267 頁;以及 Peter A Smethurst 等 16 人，Blood，美國，2002 年，第 100 卷，第11 號，474a 頁)ο如上所述，目前報道的所有的抗人GPVI抗體都含有上述人自身抗體，具有在體外
(in vitro)以單獨的抗體活化血小板的作用、和/或引發(fā)或促進血小板聚集的作用，因此，給予生物體時可能引起血小板減少。事實上，Nieswandt等人多次報道了在體內(in vivo)使血小板上的GPVI消失的單克隆抗體(JAQ1、JAQ2和JAQ3)，但是各種抗體在給予后都會引發(fā)血小板減少。近年來，有人報道了 GPVI的激動劑-膠原蛋白、convulxin和CRP、以及抑制GPVI與膠原蛋白的結合的抗體(9012. 2)可激活血小板，并與其相伴，通過經由金屬蛋白酶的切斷產生來自血小板的GPVI的釋放(St印hens G等5人，Blood. 2005Jan I ；105(1) :186-91 ；Gardiner EE 等 5 人，Blood. 2004 ;104 :3611-3617 ;Bergmeier W 等 7 人，ThrombHaemost. 2004 ；91 :951-958)。并且還使用9012. 2抗體等推定了 GPVI上與膠原蛋白相互作用相關的氨基酸殘基(Val34、Leu36) (Lecut C等8人，J Biol Chem. 2004 ；279 52293-52299.)。高山等人使用自身免疫疾病患者的淋巴細胞克隆抗人GPVI抗體，體外研究了其性質(國際專利申請公開公報第05/007800號)。但是，目前為止的任何報告中都未公開不激活血小板、和/或不引發(fā)生物體內血小板減少、并具有使血小板膜上的GPVI消失的作用的抗體。

發(fā)明內容
如上所述，在人們需求安全性高、有效性優(yōu)異、且容易使用的藥物作為抗血小板藥的狀況下，人們迫切希望能夠有可給予生物體的抗GPVI抗體。本發(fā)明的目的在于提供與存在于血小板、例如哺乳類的血小板、具體來說人、猴、大鼠、小鼠血小板，特別是人血小板膜上的糖蛋白GPVI特異性結合的新型抗體，優(yōu)選單克隆抗體。特別提供可以給予生物體、有效且在血小板減少等副作用方面沒有問題的抗GPVI抗體。還提供與GPVI、特別是人GPVI特異性結合、并含有新型的CDR序列的抗體。還進一步提供產生這些抗體的細胞。本發(fā)明人等為解決上述課題，著眼于建立多種產生抗GPVI抗體的小鼠雜交瘤，對它們所產生的抗體的性狀進行分析。基于該研究方向進行了深入的研究，結果成功地獲得了產生抗體的雜交瘤，該抗體具有與GPVI結合的能力、具有使膠原蛋白導致的血小板聚集的性能降低的活性。又對各抗體的GPVI上的識別區(qū)域進行分析，獲得了與GPVI的表位有關的有益的信息。還分離該單克隆進行進一步的研究，結果成功地獲得了編碼該抗體的基因，明確了該抗體的CDR氨基酸的序列為新的序列。又通過基因重組技術制備了重組抗體，完成了本發(fā)明。本說明書中，將雜交瘤(例如克隆F1232-18)所產生的抗體記為F1232-18抗體。本發(fā)明的第一方案是顯示特定的功能或特性的、與GPVI例如哺乳類的GPVI、具體來說是人、猴、大鼠或小鼠GPVI、特別是人GPVI特異性結合的抗體，優(yōu)選單克隆抗體(以下分別記為抗人GPVI抗體和抗人GPVI單克隆抗體)或其活性片段或它們的衍生物。具體來說涉及以下(I)具有以下性質的抗體或其活性片段或它們的衍生物a)與GPVI、特別是人血小板膜糖蛋白VI (GPVI)特異性結合，b)使血小板活化的作用、和/或引發(fā)生物體內血小板減少的作用弱，以及c)通過與血小板接觸,使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(2)抗GPVI抗體或其活性片段或它們的衍生物，特別是具有上述(I)的性質的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們不介導血小板GPVI的釋放、特別是伴隨血小板活化的經由金屬蛋白酶的切斷導致的血小板GPVI的釋放，通過與血小板接觸，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(3)抗GPVI抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們介導血小板GPVI的內化，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(4) (1)-(3)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們介導血小板GPVI的內化，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(5) (1)-(4)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們通過在生物體內與血小板接觸，使血小板膜上的GPVI至少部分消失；(6) (1)-(5)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，將它們給予生物體內，通過與血小板接觸，使血小板應答膠原蛋白發(fā)生聚集的能力降低或缺失；(7) (1)-(6)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們對于出血時間的延長作用
M ；(8) (1)-(7)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們與GPVI的解離常數為4X 1(Γ8Μ 以下。上述(1)-(8)的抗體優(yōu)選為單獨不會引發(fā)人血小板聚集的抗體。優(yōu)選的例子有表6和表11所例舉的克隆，優(yōu)選識別GPVI的環(huán)9的抗體或將其與人IgG、更優(yōu)選人IgG4重組的嵌合抗體或人源化抗體。本發(fā)明的抗體還是GPVI、特別是人GPVI與抗體的解離常數(Kd值)優(yōu)選為10_8M以下，更優(yōu)選4X10_9M以下的抗體。本發(fā)明的抗體或其活性片段或它們的衍生物只要具有與GPVI的結合能力即可，例如也包含嵌合抗體和人源化抗體、Fab (抗原結合片段)、Fab’、F(ab’)2、單鏈抗體(scFv)、二硫鍵穩(wěn)定性抗體(dsFv)、雙鏈抗體(diabody)、納米抗體(nanobody)和含有Q)R的肽等，以及標記抗體、綴合抗體(conjugatedantibody)和抗體融合蛋白等。本發(fā)明的第一方案的抗體等優(yōu)選與GPVI例如哺乳類的GPVI，具體來說人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特別是人GPVI特異性結合，使膠原蛋白引發(fā)的血小板聚集能力特異性降低，但對其它激動劑例如ADP或凝血酶引發(fā)的聚集能力沒有影響。還優(yōu)選單獨不引發(fā)人血小板聚集。該抗體在與抑制膠原蛋白引發(fā)的人血小板聚集的濃度或用量同等、優(yōu)選10倍、更優(yōu)選100倍、進一步優(yōu)選1000倍的情況下，單獨不會顯著引發(fā)人血小板聚集。這里，上述(1)-(8)的抗體只要具有上述特性即可，可以是抑制GPVI特別是人GPVI與膠原蛋白結合的抗體，優(yōu)選是以10_8M以下、更優(yōu)選10_9M以下、進一步優(yōu)選KTkiM以下的解離常數(Kd值)抑制GPVI特別是人GPVI與膠原蛋白的結合的抗體。本發(fā)明的抗體未必限定于特定的克隆，具有與本發(fā)明的優(yōu)選例子同樣作用的抗體均包含在本發(fā)明的范圍內。本發(fā)明的抗體的作用的有無可通過實施例所示的方法或公知的方法確認。本發(fā)明還包含與優(yōu)選的抗體在GPVI上的識別區(qū)域、結合部位或表位相同或至少部分共通的抗體，例如與GPVI的結合中具有互相競爭關系的抗體均包含在本發(fā)明的范圍內。與本發(fā)明的抗體在識別區(qū)域或結合部位上是否有共通性，這可以按照實施例所記載的方法或公知的方法確認。即，本發(fā)明可提供在本發(fā)明的特定抗體與GPVI結合中參與競爭的抗體。本發(fā)明的實施例的競爭試驗的分類中，可將表I所例舉的被分類為八種類型，優(yōu)選類 型d、e或h，更優(yōu)選類型d或e的抗體作為本發(fā)明的抗體。上述(1)-(8)的抗體的優(yōu)選例子有識別GPVI、特別是識別人GPVI的環(huán)9的至少一部分的抗體。本發(fā)明的第二實施方案是由新的GPVI例如哺乳類的GPVI，具體來說人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特別是人GPVI上的識別區(qū)域、結合部位或表位所規(guī)定的抗GPVI抗體，優(yōu)選單克隆抗體。具體來說有以下抗體(9)抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們特異性識別含有GPVI、特別是人GPVI結構域I的環(huán)2、環(huán)3和環(huán)5、或環(huán)4和環(huán)5，或者結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11、或者結構域I的環(huán)2，更優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，進一步優(yōu)選結構域2的環(huán)9的至少一部分的氨基酸序列或GPVI上的結構；(10) (9)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，其中，GPVI結構域I的環(huán)2、環(huán)3和環(huán)5、或環(huán)4和環(huán)5，或者結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11的至少一部分為人GPVI的環(huán)2的E2UK22 和 P23，環(huán) 3 的 G33 及環(huán) 5 的 A57、K59 和 L62，或環(huán) 4 的 S43、S44、S45、R46 和 E48及環(huán) 5 的 A57、K59 和 L62，或者環(huán) 9 的 T116、R117、G119 和 Q122、或環(huán) 9 的 T116、R117、G119和Q122及環(huán)11的R139 ；(11) (9)或(10)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們與GPVI特別是人GPVI結構域I的環(huán)2、環(huán)3和環(huán)5、或環(huán)4和環(huán)5，或者結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11、或者結構域I的環(huán)2，更優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，進一步優(yōu)選結構域2的環(huán)9特異性結合；(12) (1)-(8)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們識別含有GPVI特別是人GPVI結構域I的環(huán)2、環(huán)3和環(huán)5、或環(huán)4和環(huán)5，或者結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11、或者結構域I的環(huán)2，更優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，進一步優(yōu)選結構域2的環(huán)9的至少一部分的氨基酸序列或GPVI上的結構；(13) (1)-(8)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們特異性識別含有人GPVI結構域I的環(huán)2的E21、K22和P23，環(huán)3的G33及環(huán)5的A57、K59和L62，或環(huán)4的S43、S44、S45、R46和E48及環(huán)5的A57、K59和L62，或者結構域2的環(huán)9的T116、R117、G119和Q122，或環(huán)9的Tl 16、Rl 17、Gl 19和Q122及環(huán)11的R139的氨基酸序列或GPVI上的結構；(14) (1)-(8)的抗體或其活性片段或它們的衍生物，它們與GPVI特別是人GPVI結構域I的環(huán)2、環(huán)3和環(huán)5、或環(huán)4和環(huán)5，或者結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11、或結構域I的環(huán)2，更優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，進一步優(yōu)選結構域2的環(huán)9特異性結合。這里，上述各環(huán)的至少一部分例如是在人GPVI中，與不同種GPVI例如猴、小鼠或大鼠GPVI對應的氨基酸殘基不同的殘基。GPVI、例如人GPVI的模型結構可通過實施例記載的方法推定，各環(huán)的結構位置如

圖1、3和47所示。上述環(huán)內，結構域2的環(huán)9、環(huán)9和環(huán)11，以及結構域I的環(huán)2，優(yōu)選結構域2的環(huán)9、或環(huán)9和環(huán)11，進一步優(yōu)選結構域2的環(huán)9是很重要的本發(fā)明的抗體識別區(qū)域，優(yōu)選采用識別它們的抗體。優(yōu)選的例子有表6和11所例舉的抗體或將它們與人IgG、更優(yōu)選人IgG4重組所得的嵌合抗體或人源化抗體。本發(fā)明的第二方案的抗體是通過與本發(fā)明第八方案的肽和/或第九方案的多肽
的結合性來進行分類，或者確認結合區(qū)域。即，本發(fā)明提供一種抗GPVI抗體，該抗體與本發(fā)明第八方案的肽和/或第九方案的多肽內的特定部位的結合性不同，優(yōu)選降低。具體來說，是與特定的GPVI突變體的結合性、和與人GPVI和/或其它GPVI突變體的結合性顯著不同、優(yōu)選降低的抗GPVI抗體。具體的確認方法、所使用的多肽等、適合的分類和適合的抗體的例子如實施例所示。對本發(fā)明的抗體的抗原結合價并沒有特別限定，可以是如Fab或scFv等的I價抗體，但從生物體內特別是血液中的穩(wěn)定性、與GPVI的結合性或作用的強度角度考慮，優(yōu)選2價以上的多價抗體例如2價、3價、4價或10價的抗體，更優(yōu)選2價抗體。因此，本發(fā)明的第二方案可提供識別GPVI上的特定區(qū)域、特別是環(huán)9的I價抗體和2價以上的多價抗體例如2價、3價、4價或10價抗體，優(yōu)選2價抗體。這里，4價抗體的例子有IgA，10價抗體的例子有IgM，但并不限于此。另外，3價抗體生理上并不存在，但是利用具有固有的三聚體化特性的天然或合成肽、例如生腱蛋白(tenascin)分子的結構域(AA 110-139,Swissprot#P10039 (雞)，或Swissprot#P24821 (人))，通過化學或基因工程學與I價抗體(scFv或Fab等)結合，可以制備3價抗體(參照日本特表2004-508828號公報)。本發(fā)明的第二方案的抗體優(yōu)選顯示第一方案的抗體的特定功能或特性。本發(fā)明的第三方案是含有新的CDR氨基酸序列或可變區(qū)氨基酸序列的抗GPVI抗體，優(yōu)選與人IgG、特別是人IgG4重組的嵌合抗體，更優(yōu)選CDR移植抗體，特別是人源化抗體。具體來說有以下抗體(15)抗GPVI抗體或其活性片段或它們的衍生物，其中，至少抗體的H鏈或L鏈一方的3組⑶R、優(yōu)選抗體H鏈和L鏈兩者6組⑶R含有表8、9、12和13記載的克隆、優(yōu)選識別GPVI環(huán)9的抗體的CDR的氨基酸序列作為分別對應的CDR的氨基酸序列；(16)抗GPVI抗體的重鏈或其活性片段或它們的衍生物，其中，在VH⑶Rl、VHCDR2和VH CDR3中分別具有SEQ ID NO. 15、16和17的氨基酸序列；SEQ ID NO. 18、19和20的氨基酸序列；SEQ ID NO. 21、22 和 23 ;SEQ ID NO. 24、25 和 26，SEQ ID NO. 27、28 和 29，SEQ ID NO. 30、31 和 32，SEQ ID NO. 33、34 和 35，SEQ ID NO. 36、37 和 38，SEQ ID NO. 39、40 和 41，SEQ ID NO. 42,43 和 44，SEQ ID NO. 45,46 和 47，或 SEQ ID NO. 48,49 和 50 的氨基酸序列，或者表12記載的任意的克隆的VH⑶Rl、VH⑶R2和VH⑶R3 ；(17)抗GPVI抗體的輕鏈或其活性片段或它們的衍生物，其中，在VL⑶Rl、VLCDR2和VL CDR3中分別具有SEQ ID NO. 51、52和53的氨基酸序列；SEQ ID NO. 54、55和56的氨基酸序列；SEQ ID NO. 57、58 和 59，SEQ ID NO. 60、61 和 62，SEQ ID NO. 63、64 和 65，SEQ ID NO. 66,67 和 68，SEQ ID NO. 69,70 和 71，SEQ ID NO. 72,73 和 74，SEQ ID NO. 75、76 和 77，SEQ ID NO. 78,79 和 80，SEQ ID NO. 81,82 和 83，或 SEQ ID NO. 84,85 和 86 的氨基酸序列，或者表13記載的任意的克隆的VL⑶Rl、VL⑶R2和VL⑶R3 ；(18)抗GPVI抗體或其活性片段或它們的衍生物，其中，在VHCDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDRUVL CDR2 和 VL CDR3 中分別具有 SEQ ID NO. 15、16、17、51、52 和 53 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 18、19、20、54、55 和 56 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 21、22、23、57、58 和 59的氨基酸序列，SEQ ID NO. 24、25、26、60、61 和 62 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 27、28、29、63、64和65的氨基酸序列，SEQ ID NO. 30、31、32、66、67和68的氨基酸序列，SEQ ID NO. 33、34、35、69、70 和 71 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 36、37、38、72、73 和 74 的氨基酸序列，SEQ IDNO. 39、40、41、75、76 和 77 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 42、43、44、78、79 和 80 的氨基酸序列，SEQ ID NO. 45、46、47、81、82 和 83 的氨基酸序列，或 SEQ ID NO. 48、49、50、84、85 和 86 的氨基酸序列，或者表12和表13記載的任意的克隆的VH CDRUVH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2 和 VL CDR3 ；

(19)嵌合抗體或其活性片段或它們的衍生物，其中，至少抗體的H鏈或L鏈的可變區(qū)、優(yōu)選抗體的H鏈和L鏈兩者的可變區(qū)與含有表7或表14記載的克隆、優(yōu)選識別GPVI環(huán)9的抗體所具有的可變區(qū)的氨基酸序列作為分別對應的可變區(qū)的氨基酸序列的抗人GPVI抗體、特別是人IgG、優(yōu)選人IgG4重組。第三方案的抗體優(yōu)選具有第一方案和/或第二方案的抗體等的特性和/或識別區(qū)域特異性。本發(fā)明的第四方案是多核苷酸或核酸，該多核苷酸或核酸含有編碼第一至第三方案的抗體或其活性片段或它們的衍生物的至少H鏈或L鏈一方的3組CDR、優(yōu)選H鏈和L鏈的6組CDR、或可變區(qū)的堿基序列。具體來說有以下多核苷酸或核酸(20)多核苷酸,該多核苷酸含有編碼第一至第三方案的抗體或其活性片段或它們的衍生物的H鏈和/或L鏈的堿基序列；(21) (20)的多核苷酸，其中，該多核苷酸含有在表8和9或者表12和13記載的克隆、優(yōu)選識別GPVI環(huán)9的抗體基因中，編碼分別對應至少抗體的H鏈或L鏈一方的3組⑶R、優(yōu)選抗體H鏈或L鏈兩者6組⑶R的堿基序列；(22)多核苷酸，該多核苷酸含有在識別表7或表14記載的克隆GPVI環(huán)9的抗體的基因中，編碼分別對應的至少抗體的H鏈或L鏈的可變區(qū)、優(yōu)選抗體的H鏈和L鏈兩者的可變區(qū)的喊基序列；(23)多核苷酸，該多核苷酸含有編碼H鏈的可變區(qū)的SEQ ID NO. 280的堿基序列、和編碼L鏈的可變區(qū)的SEQ ID NO. 284的堿基序列，或者含有編碼H鏈的可變區(qū)的SEQ IDNO. 282的堿基序列、和編碼L鏈的可變區(qū)的SEQ ID NO. 284的堿基序列。本發(fā)明還提供來自含有特定的小鼠種系抗體基因片段組合的抗體基因的抗人GPVI抗體基因或其重鏈或輕鏈可變區(qū)基因。即，(24)抗人GPVI抗體基因或其重鏈可變區(qū)基因，該基因來自抗體重鏈基因，該抗體重鏈基因含有表16記載的小鼠種系抗體基因片段VH、D1^P Jh的任意組合；(25)抗人GPVI抗體基因或其重鏈可變區(qū)基因，該基因含有上述重鏈可變區(qū)基因中編碼CDR氨基酸序列的核苷酸序列；(26)抗人GPVI抗體基因或其輕鏈可變區(qū)基因，該基因來自抗體輕鏈基因，該抗體輕鏈基因含有表16記載的小鼠種系抗體基因片段\和I的任意組合；(27)抗人GPVI抗體基因或其輕鏈可變區(qū)基因，該基因含有上述輕鏈可變區(qū)基因中編碼CDR氨基酸序列的核苷 酸序列；這里，優(yōu)選表16記載的小鼠種系抗體基因片段內，各抗體克隆的第一行表示的得分高的片段的組合，例如克隆F1246-1 -1的重鏈基因中，優(yōu)選Vh (3 3.9)、DH(DSP2. 7或DSP2. 5)和Jh(JH4)的組合。來自上述抗體基因的基因只要其編碼的抗體顯示同樣的抗原特異性，包含該抗體基因本身或伴隨有I個堿基以上的突變的基因，該突變可以是天然產生的以及人為導入的任意形式。同時，本發(fā)明還提供由抗人GPVI抗體基因或其重鏈或輕鏈可變區(qū)基因編碼的抗體或其活性片段或它們的衍生物，其中，所述基因來自含有特定的小鼠種系抗體基因片段的組合的抗體基因。即，(28)抗人GPVI抗體或其重鏈可變區(qū)多肽，它們由上述(24)-(25)的抗體基因或其重鏈可變區(qū)基因編碼；(29)抗人GPVI抗體或其輕鏈可變區(qū)多肽，它們由上述(26)-(27)的抗體基因或其輕鏈可變區(qū)基因編碼。本發(fā)明進一步提供聚乙二醇(PEG)化的抗GPVI抗體，特別是抗人GPVI抗體，具體來說，提供上述本發(fā)明的抗體，優(yōu)選識別GPVI環(huán)9的抗體或其活性片段或它們的衍生物。使PEG與抗體等結合的方法可按照公知的方法(例如參照Roberts M. J等人.Advanced Drugdelivery Reviews 54 (2002) 459-476)進行，具體如實施例 31 所述。本發(fā)明的第五方案是產生第一至第三方案的抗體或其活性片段或它們的衍生物的細胞，或者含有第四方案的多核苷酸的細胞。具體有以下細胞(30)產生上述(1)-(19)中任一項的抗體或其活性片段或它們的衍生物的細胞，特別是轉化細胞或雜交瘤；(31)含有上述(20)-(23)中任一項的多核苷酸的細胞，特別是轉化細胞或雜交瘤。本發(fā)明的第六方案是制備第一至第三方案的抗體的方法，其特征在于使用第四方案的多核苷酸或含有該多核苷酸的表達載體、或第五方案的細胞。具體來說如下(32)第一至第三方案的抗體的制備方法，該方法包括培養(yǎng)上述(30)或(31)的細胞的步驟；以及收集由該細胞產生的單克隆抗體的步驟；(33)第一至第三方案的抗體的制備方法，該方法包括使用上述(19)-(23)的多核苷酸、含有這些多核苷酸的表達載體、(30)或(31)的任意的細胞的步驟。本發(fā)明的第七方案涉及含有本發(fā)明第一至第三方案的抗體或其活性片段或它們的衍生物作為有效成分的藥物組合物，因此，優(yōu)選為預防和/或治療血栓性、栓塞性或動脈硬化性疾病的藥物組合物。本發(fā)明的抗體幾乎沒有血小板活化作用、血小板聚集作用、血小板減少作用和出血時間延長作用等的副作用，對上述疾病等的預防和/或治療有效。本發(fā)明的第八方案涉及構成GPVI上的特定結構、特別是環(huán)結構的肽，具體來說有(34)肽，該肽含有GPVI、特別是人GPVI結構域I的環(huán)2、環(huán)3和環(huán)5、或環(huán)4和環(huán)5，或者結構域2的環(huán)9，或環(huán)9和環(huán)11，特別是由上述的任意的氨基酸序列構成的肽。這里，該肽可以含有來自不同種GPVI的氨基酸序列或GPVI以外的多肽、例如Fe的氨基酸序列。本發(fā)明的第九方案是特定的GPVI突變體，例如在氨基酸置換體、種間的結構域置換體、或種間的部分序列置換體，例如環(huán)置換體等。優(yōu)選為將構成圖I和圖3所示的GPVI的I或2個以上環(huán)結構的氨基酸用其它氨基酸或多種類(例如人、猴、小鼠和大鼠)所對應的環(huán)的氨基酸置換得到的突變體，具體例子如表4或實施例所述。具體有(35)含有SEQ ID NO. 137-151的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的第十方案是抗體或其活性片段或它們的衍生物的篩選方法，該方法包括以下步驟a)測定與血小板膜糖蛋白VI (GPVI)、特別是人GPVI的結合性的步驟，b)測定使血小板活化的作用和/或引發(fā)生物體內血小板減少的作用的步驟，以及c)測定通過與血小板接觸，使血小板膜上的GPVI至少部分消失的活性的步驟。本發(fā)明的第十一方案是抗體表位的推定方法或抗體識別區(qū)域的鑒定方法，該方法包括測定第八方案的肽或第九方案的多肽與抗體的反應性、例如結合性的步驟。本發(fā)明的第十二方案是GPVI特異性抗體的制備方法，其特征在于使用本發(fā)明第八方案的肽或第九方案的多肽等，具體如下(36) GPVI特異性抗體、優(yōu)選本發(fā)明的第一至第三方案的抗體的制備方法，其特征在于將本發(fā)明第八方案的肽或第九方案的多肽等作為免疫用的給予抗原，或者作為體外免疫用抗原使用；(37)GPVI特異性抗體、優(yōu)選本發(fā)明第一至第三方案的抗體的制備方法，其特征在于使用本發(fā)明第八方案的肽或第九方案的多肽等作為用于檢測或鑒定抗體的抗原。即，將本發(fā)明的抗體可識別的GPVI、特別是人GPVI上的氨基酸序列、例如與環(huán)結構相對應的氨基酸序列在小鼠GPVI上重組的GPVI重組體本身作為免疫原和/或檢測用抗原，可得到可識別相同識別領域的新型抗體。作為人治療用抗體的更優(yōu)選的制備方法，有人公開了使用人抗體基因轉基因非人動物的方法(W02002/070648 (日本特表2005-504507)、W02002/043478 (日本特表2004-515230))。不同種的GPVI、例如在小鼠GPVI中插入人GPVI的部分氨基酸序列得到的蛋白質免疫上述轉基因動物例如免疫小鼠時，可有效地獲得不與GPVI的小鼠氨基酸序列反應，而與插入的人氨基酸序列、優(yōu)選通過表位進行反應的人抗體。因此，該方法得到的人抗體可用作具有本發(fā)明第一或第二方案抗體特征的人抗體，該方法特別有用。本發(fā)明的第十三方案是使用第一至第三方案的抗體，對試樣中GPVI進行檢測或定量的方法。該方法可以測定血小板上GPVI或體液、特別是血液中GPVI，可應用于疾病的診斷方法，優(yōu)選伴隨有血栓形成的疾病的診斷方法。該方法還可應用于與GPVI相關的治療的監(jiān)控，特別是以血小板上的GPVI為指標，對抗GPVI抗體的效果進行預測或判定，或者進行預后的判定等。附圖簡述圖I是人可溶解型GPVI和小鼠可溶解型GPVI的氨基酸序列的比對。方框表示GPVI的各結構域以及通過建模預測的環(huán)區(qū)域的位置(L1-L14)。圖2表示GPVI缺失患者的抗體與小鼠抗人GPVI單克隆抗體的競爭試驗的結果。YA-Abs-88和YA-Abs-03表示GPVI缺失患者的抗GPVI抗體。
圖3是人可溶解型GPVI和大鼠可溶解型GPVI的氨基酸序列的比對。方框表示各結構域和通過建模預測的環(huán)區(qū)域的位置(L1-L14)。圖4表示研究小鼠雜交瘤抗體和嵌合抗體的反應性的結果。圖5表示嵌合抗體和雜交瘤抗體抑制GPVI與膠原蛋白的結合。圖6表示研究抗人GPVI抗體與GPVI突變體的結合特性的結果。圖7表示研究CF1232-37-2與各種hGPVI小鼠環(huán)置換體的反應性的結果。圖8表示人血小板和食蟹猴血小板活化作用。通過FACS測定人血小板⑷和食蟹猴血小板(B)的CD62P(P表示選擇蛋白表達量)，以平均熒光強度(MFI)表示。圖9表示引發(fā)人血小板聚集的作用。圖10表示F1232-37-2對膠原蛋白引發(fā)的人血小板聚集的作用。圖11表示F1232-37-2對ADP引發(fā)的人血小板聚集的作用。圖12表示對食蟹猴靜脈內給予小鼠抗人GPVI單克隆抗體F1232-37-2和F1199-6的試驗結果。圖13表示小鼠/人嵌合抗人GPVI抗體的食蟹猴ex vivo (先體外后體內)試驗(單次靜脈內試驗CF1232-37-2單次靜脈內給予試驗)的結果。圖14表示c小鼠/人嵌合抗人GPVI抗體的食蟹猴ex vivo試驗(反復靜脈內給予試驗)的結果。將0.3mg/kg CF1232-37-2每隔I天給予食蟹猴，測定給予4次時膠原蛋白引發(fā)的血小板聚集能力(A)和血小板GPVI量(B)。圖15表示c小鼠/人嵌合抗人GPVI抗體的食蟹猴試驗(皮下給予試驗)的結果。在對食蟹猴皮下給予CF1232-37-2后，在不同時間采血，測定2yg/mL膠原蛋白引發(fā)的血小板聚集能力㈧和血小板GPVI量⑶。圖16表示F1232-37_2Fab抑制膠原蛋白引發(fā)的血小板聚集的作用。圖17表示F1232-37_2F(ab’ )2的食蟹猴ex vivo試驗結果。圖18表示CF1232-37-2雙鏈穩(wěn)定共表達質粒的構建。圖19表示在COS細胞中表達的CF1232-37-2和在CHO細胞中表達的CF1232-37-2的抗原結合反應性。圖20表示重鏈可變區(qū)的氨基酸序列及其人源化情況。圖21表示輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列及其人源化情況。圖22表示人源化抗體與GPVI的結合特異性。圖23表示給予了嵌合抗GPVI抗體的食蟹猴血小板的膠原蛋白引發(fā)的聚集能力試驗的結果。圖24表示食蟹猴出血時間試驗的結果。A :表示靜脈內給予依替巴肽5分鐘后和給予抗GPVI抗體CF1232-37-2的48小時后血小板的膠原蛋白引發(fā)的聚集能力。B :表示將靜脈內給予依替巴肽5分鐘后和給予抗GPVI抗體CF1232-37-2的48小時后的出血時間與給予各組藥物之前的值進行比較的結果。圖25表示抗GPVI抗體導致的血小板GPVI抗原釋放的確認試驗結果。圖26表示抗GPVI抗體的全抗體以及Fab抗體的PEG化的結果。各泳道表示如下1 F1232-37-2 全抗體；2 :F1232-37_2 的 PEG 化反應物；3 =PEG 化 F1232-37-2 純化物；4 F1232-37-2Fab 抗體；5 :F1232-37_2Fab 的 PEG 化反應物；6 PEG 化 F1232_37_2Fab 純化物。圖27表示PEG化抗GPVI抗體的GPVI抗原結合活性試驗的結果。圖28表不大鼠GPVI基因的核昔酸序列以及由其編碼的氣基酸序列。圖29是表示由實 施例35得到的rGPVI-Fc融合蛋白的SDS-PAGE結果的圖。泳道I表示分子量標記，泳道2表示rGPVI-hFc融合蛋白，泳道3表示rGPVI_mFc融合蛋白。圖30表示研究與GPVI環(huán)置換體的結合能力的結果。圖31表示研究抗大鼠GPVI抗體與大鼠血小板的結合能力的結果。圖32表示研究給予了抗大鼠GPVI抗體的大鼠血小板聚集能力的結果。圖33表示實施例40中的GPVI消失的結果。圖34表示研究抗GPVI抗體對膠原蛋白致死模型的效果的結果。圖35表示研究抗GPVI抗體對電刺激引發(fā)的動脈血栓模型的效果的結果。圖36是表示CypHer5E標記cF1232-37_2/CH0的抗原結合評價的圖。圖37表示CypHer5E標記cF1232-37_2/CH0的體外內化的結果。圖38表示CypHer5E標記F1239-6-1的抗原結合評價。圖39表示CypHer5E標記F1239-6-1的體外內化的結果。圖40表示CypHer5E標記F1239-6-1的體內內化的結果。圖41表示CF1232-37-2S/C0S的血小板活化評價(CD62P)的結果。圖42表示CF1232-37-2S/C0S對于膠原蛋白引發(fā)的血小板聚集的抑制作用。圖43是表示CF1232-37-2S/C0S的食蟹猴ex vivo試驗結果的圖。表示通過膠原蛋白引發(fā)的血小板聚集能力的結果。圖44是表示研究PEG化F1239_6_lFab的抗原結合活性的結果圖。圖45表示給予高劑量CF1232-37-2下食蟹猴的出血時間。圖46表示實施例50中大鼠出血時間的測定結果。圖47表示人可溶解型GPVI和食蟹猴可溶解型GPVI的氨基酸序列的比對。方框表示GPVI的各結構域以及通過建模預測的環(huán)區(qū)域的位置(L1-L14)。實施發(fā)明的最佳方式(構成)本發(fā)明的抗體是特異性識別存在于血小板例如哺乳類的GPVI，具體來說人、猴、大鼠、小鼠血小板，特別是人血小板上的膜糖蛋白GPVI的抗體。本發(fā)明的抗體所識別的GPVI不一定限于血小板上，例如也可以識別巨核細胞的GPVI。這里，本發(fā)明中作為對象的GPVI是哺乳類的GPVI，例如有人、猴、大鼠、小鼠GPVI，特別是人GPVI。以下進一步詳細說明本發(fā)明。本說明書中，氨基酸序列以一個字母標記或以三個字母標記記載。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，優(yōu)選為單克隆抗體。對該單克隆抗體的制備方法沒有特別限定，例如可以是雜交瘤產生的單克隆抗體、插入了抗體基因的重組細胞所產生的單克隆抗體、或者通過EBV(埃巴病毒)轉化的細胞所產生的單克隆抗體的任意抗體。還可以是含有至少一個本發(fā)明的單克隆抗體的抗體的混合物或多克隆抗體、或者多個本發(fā)明的單克隆抗體的混合物。本發(fā)明的抗體也包含雙特異性抗體或多特異性抗體。本發(fā)明的抗體是與GPVI例如哺乳類的GPVI，具體來說人、猴、大鼠、小鼠GPVI、特別是人GPVI特異性結合的抗體。本發(fā)明的抗體與GPVI、特別是人GPVI的結合可通過公知的方法測定，具體來說有實施例所例舉的方法。本發(fā)明的抗體中，GPVI、特別是人GPVI與抗體的解離常數(Kb值)為4X10_8M，優(yōu)選KT8M以下，更優(yōu)選4X KT9M以下，進一步優(yōu)選KT9M以下。對測定人GPVI與抗體的解離常數的方法沒有特別限定，可按照常規(guī)方法進行。例如可使用固定在芯片上的GPVI-Fc，通過BIAC0RE3000等蛋白質相互作用分析裝置測定。還可以使用血小板特別是人或猴血小板，通過公知的方法例如使用RI標記抗體的方法進行測定。具體來說如實施例5和52所示。本發(fā)明的第一方案的抗體通過與血小板接觸、特別是在生物體內接觸，具有使血小板膜上的GPVI至少部分消失的作用。該作用可在將本發(fā)明的抗體與血小板接觸一定時間后分離血小板，通過測定其表面上的GPVI表達量來確認。GPVI表達量可通過使用FACS等的常規(guī)方法測定，具體方法如實施例所示。本發(fā)明的抗體例如以3mg/kg、優(yōu)選lmg/kg、更優(yōu)選O. 3mg/kg、進一步優(yōu)選O. lmg/kg的給予量給予,與給予前的值或者對照組的值進行比較，具有使血小板上的GPVI消失20%以上、優(yōu)選40%以上、更優(yōu)選60%以上、進一步優(yōu)選80%以上的作用。本發(fā)明的抗體具有GPVI消失作用，該作用并不介導血小板GPVI的釋放、特別是伴隨著血小板活化的經由金屬蛋白酶切斷而導致的血小板釋放GPVI，或者，引發(fā)該釋放作用弱、優(yōu)選沒有顯著的引發(fā)作用、更優(yōu)選實質上沒有引發(fā)作用，是通過與血小板接觸使血小板膜上的GPVI至少部分消失的抗體。這里，是否有釋放可通過公知的方法(Stephens G等5人，Blood. 2005Jan I ；105(1) :186-91 ；Gardiner EE 等人·，Blood. 2004 ;104 :3611-3617 ;Bergmeier W 等人.，Thromb Haemost. 2004 ；91 :951-958.)檢測，具體可米用實施例 30 所述的方法。本發(fā)明的抗體是介導血小板GPVI的內化，通過與血小板接觸使血小板膜上的GPVI至少部分消失的抗體或其活性片段或它們的衍生物。這些抗體與引發(fā)伴隨著血小板活化的經由金屬蛋白酶切斷而導致的血小板釋放GPVI的抗體不同，如下所述，其本身活化血小板的作用、和/或引發(fā)生物體內血小板減少的作用弱，優(yōu)選幾乎沒有作用是有用的。上述抗體的優(yōu)選例子是識別GPVI環(huán)9的抗體。根據本發(fā)明的抗體，血小板GPVI的內化可通過公知方法確認，優(yōu)選使用如實施例所示的標記物例如熒光物、優(yōu)選PH敏感性熒光物的方法，具體來說，用這些標記物直接或間接標記本發(fā)明的抗體，由此可以檢測抗體所結合的GPVI是否被攝取到血小板內，或者可以測定其攝取量。優(yōu)選的方法如實施例所示。本發(fā)明的抗體本身活化血小板的作用、和/或引發(fā)生物體內血小板減少的作用弱、優(yōu)選幾乎沒有作用。血小板的活化可通過公知的方法測定，可以以血小板表面抗原、優(yōu)選CD62P的表達量作為指標。例如有以下方法經過一定時間后，從給予了本發(fā)明抗體的生物體中分離血小板，按照常規(guī)方法測定其CD62P的表達量的方法；以及將本發(fā)明的抗體與從生物體中分離的血小板接觸，經過一定時間后通過常規(guī)方法測定該CD62P的表達量的方法等。其具體方法如實施例所示。在以⑶62P的表達量為指標時，使血小板上的GPVI至少部分消失的給予量或濃度下，本發(fā)明的抗體導致的血小板活化的程度是對照血小板的5倍以下、優(yōu)選2倍以下、更優(yōu)選I. 5倍以下、進一步優(yōu)選幾乎相同程度。生物體內血小板是否有減少，這可以在將本發(fā)明的抗體給予生物體后的不同時間進行采血，按照常規(guī)方法測定血小板數，通過與給予前的值或對照個體血小板數進行比較來確認。具體方法如實施例所示。在使血小板上的GPVI至少部分消失的給予量或濃度下，以給予前的值或者對照組的值為100%，本發(fā)明的抗體導致的血小板數的變化為50%以上、優(yōu)選70 %以上、更優(yōu)選90 %以上，進一步優(yōu)選大致相同程度。本發(fā)明的抗體具有使膠原蛋白導致的人血小板聚集能力降低的作用，即，通過給予生物體內并與血小板接觸，使血小板應答膠原蛋白并聚集的能力降低或缺失。該作用可如下確認將本發(fā)明的抗體給予生物體內，與血小板接觸，然后在不同的時間分離血小板，測定膠原蛋白引發(fā)的血小板聚集。這里，血小板聚集可通過公知的方法測定，例如用血小板聚集能力測定裝置等，以光透射率為指標，通過計算聚集率來測定，通常以光透射率最大的點的聚集率(以下稱為最大聚集率)表示。后述的實施例8等記載的方法中，本發(fā)明的抗體在3mg/kg、優(yōu)選lmg/kg、更優(yōu)選O. 3mg/kg、進一步優(yōu)選O. lmg/kg的給予量下,與給予前的值或者對照組的值進行比較，具有降低20%、優(yōu)選40%以上、更優(yōu)選60%以上、進一步優(yōu)選80%以上的使血小板的膠原蛋白聚集能力降低的作用。

本發(fā)明的抗體優(yōu)選對于膠原蛋白以外的引發(fā)血小板聚集的物質、例如ADP或凝血酶導致的聚集幾乎沒有影響，在對膠原蛋白聚集能力有影響的給予量或濃度下，最大聚集率優(yōu)選為對照的80%以上、更優(yōu)選為對照的90%以上、進一步優(yōu)選為對照的95%以上。測定抑制膠原蛋白以外的引發(fā)血小板聚集的物質導致的人血小板聚集的方法可按照常規(guī)方法進行。本發(fā)明的抗體是出血時間延長作用弱、優(yōu)選沒有顯著延長作用、更優(yōu)選實質沒有延長作用的抗體。出血時間可通過公知的方法測定，具體可采用實施例28或50所述的方法。本發(fā)明的抗體即使給予治療用量或更多的量、例如O. 3mg/kg、優(yōu)選lmg/kg、更優(yōu)選3mg/kg、進一步優(yōu)選10mg/kg的給予量,也實質上不延長出血時間，具體來說，出血時間是給予前的值、正常值或對照組的5倍以下，優(yōu)選3倍以下，進一步優(yōu)選2倍以下，特別優(yōu)選I. 5倍以下。上述優(yōu)選例子可例舉識別GPVI、特別是人GPVI環(huán)9的抗體。目前報道的抗人GPVI抗體、包括上述人自身抗體，體外以單獨的抗體幾乎都具有活化血小板的作用、和/或引發(fā)或促進血小板聚集的作用，因此給予生物體時可能引起血小板減少。有報道稱=Fab片段等形態(tài)不引發(fā)血小板聚集，但是也不能完全否定生物體內由于一些原因導致Fab發(fā)生交聯(lián)或聚集，顯示出與IgG等同樣的動態(tài)的可能性。因此，優(yōu)選的抗GPVI抗體不是抗體的活性片段，而是在完全的抗體分子例如IgG的形態(tài)下也不顯示上述作用，或者上述作用低。從生物體內的動態(tài)和穩(wěn)定性來看，自然形態(tài)的抗體分子例如IgG等優(yōu)異。通常，與Fab等片段相比，IgG在血液中半衰期長很多，在血栓形成、特別是伴隨有心房纖顫的血栓形成等慢性疾病或需要長時間給予抗體的病態(tài)中，優(yōu)選血液中半衰期長的分子形態(tài)、特別是 IgG0本發(fā)明的抗體還可以特異性抑制血小板上的GPVI與膠原蛋白的結合。例如，在后述實施例所記載的方法中，本發(fā)明的抗體是優(yōu)選以100 μ g/mL以下、更優(yōu)選10 μ g/mL以下、進一步優(yōu)選I μ g/mL以下、特別優(yōu)選O. I μ g/mL的濃度50%抑制GPVI與膠原蛋白結合的抗體。對測定膠原蛋白與GPVI結合的方法沒有特別限定，可按照常規(guī)方法進行。本發(fā)明的第二方案是由新的GPVI上的識別區(qū)域、結合部位或表位所規(guī)定的抗GPVI抗體，優(yōu)選單克隆抗體。本發(fā)明的抗體GPVI上的識別區(qū)域等通過公知的方法確認或推定。例如，應用本發(fā)明的第十一方案的方法，通過測定與第八方案的肽或第九方案的多肽的反應性來實施。具體方法如實施例所示。例如，在實施例7或實施例18所記載的方法中，可以以反應性或抑制率與對照(例如hGPVI-Fc)比較顯著變化、例如為50%、優(yōu)選30%、更優(yōu)選10%以下的情況，或者IC50等值顯著變化、例如為3倍、10倍、更優(yōu)選30倍、進一步優(yōu)選100倍的情況為基準進行確認或推定。確認了 GPVI上的識別區(qū)域、結合部位或表位的抗體可單獨或者通過與其它抗體的組合，用于檢測特定的GPVI分子種類，或者用于分析GPVI的結構與功能的關系。本發(fā)明的第三方案涉及含有新的CDR氨基酸序列或可變區(qū)氨基酸序列的抗人GPVI抗體?？贵w的重鏈和輕鏈的N末端一側存在可變區(qū)，分別稱為重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可
變區(qū)(VL)?？勺儏^(qū)內存在互補性決定區(qū)域(CDR)，該部分負責抗原識別的特異性?？勺儏^(qū)的CDR以外的部分具有保持CDR結構的作用，被稱為構架區(qū)(FR)。在重鏈和輕鏈的C末端一側存在恒定區(qū)，分別稱為重鏈恒定區(qū)(CH)、輕鏈恒定區(qū)(CL)。重鏈可變區(qū)中存在第一互補性決定區(qū)域(⑶Rl)、第二互補性決定區(qū)域(⑶R2)和第三互補性決定區(qū)域(CDR3)三個互補性決定區(qū)域。重鏈可變區(qū)中的三個互補性決定區(qū)域總稱為重鏈互補性決定區(qū)域。輕鏈可變區(qū)中同樣存在第一互補性決定區(qū)域(CDRl)、第二互補性決定區(qū)域(CDR2)和第三互補性決定區(qū)域(CDR3)三個互補性決定區(qū)域。輕鏈可變區(qū)中的三個互補性決定區(qū)域總稱為輕鏈互補性決定區(qū)域。對本發(fā)明抗體的⑶R序列并沒有限定，VH⑶Rl、VH⑶R2和VH⑶R3的氨基酸序列的優(yōu)選組合，VL⑶Rl、VL⑶R2和VL⑶R3的氨基酸序列的優(yōu)選組合，以及VH⑶Rl、VH⑶R2、VHCDR3、VL OTRUVL⑶R2和VL⑶R3的氨基酸序列的優(yōu)選組合如表8和表9以及表12和表13所示。優(yōu)選含有識別GPVI環(huán)9的抗體的CDR氨基酸序列中的任意一個以上、優(yōu)選H鏈的三個、更優(yōu)選全部氨基酸序列的抗體。對CDR以外的氨基酸序列沒有特別限定，來自其它抗體、特別是其它種抗體的所謂的CDR移植抗體也包含在本發(fā)明的抗體中。其中，優(yōu)選CDR以外的氨基酸序列是來自人的人源化抗體，根據需要，構架區(qū)(FR)可以伴隨有I至數個氨基酸殘基的附加、缺失、置換和/或插入。人源化抗體的制備方法可采用公知的方法，具體方法如實施例所示。本發(fā)明的抗體VH和VL的氨基酸序列并不受限定，優(yōu)選的抗體是含有SEQ IDNO. 281的氨基酸序列作為VH或SEQ ID NO. 285的氨基酸序列作為VL的任意一個以上的抗體，或者是含有SEQ ID NO. 283的氨基酸序列作為VH或SEQ ID NO. 285的氨基酸序列作為VL的任意一個以上的抗體。本發(fā)明的抗體并不限定為特定的氨基酸序列，在對其活性和/或抗原性沒有實質影響的范圍內，在本發(fā)明的抗體氨基酸序列中，例如允許在可變區(qū)、特別是FR部分有I至數個氨基酸殘基的附加、缺失、置換和/或插入。本發(fā)明的抗體優(yōu)選抗體的恒定區(qū)含有來自人抗體、更優(yōu)選人IgG、進一步優(yōu)選人IgG4的氨基酸序列。本發(fā)明的抗體并不限于特定的分子種類?？贵w、即免疫球蛋白的結構含有重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)，根據重鏈的類型U、α、μ、δ、ε )分為五個同種型(IgG、IgA、IgM、IgD, IgE) o其中，IgG和IgA重鏈不同(例如人有Y I、Y 2、Y 3、Y 4、α I、α 2)，因此分為亞類(例如人有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2)。輕鏈被分為κ或λ的任意型。本發(fā)明的抗體的類型、亞型或同種型并不受限定，可以是被分類的即可。優(yōu)選同種型為IgG的抗體，從沒有補體結合性的角度考慮，進一步優(yōu)選亞類為IgG4的抗體。本發(fā)明的抗體只要具有活性、例如與GPVI的結合能力即可，可以是抗體的片段、特別是活性片段或一部分。這里，抗體的活性片段是具有抗體的至少一種活性、特別是抗原結合活性的片段。例如有？813(抗原結合片段)、？313’、？(313’)2、單鏈抗體(SCFV)、二硫鍵穩(wěn)定性抗體(dsFv)、雙鏈抗體、SC (Fv)2 (例如參照 Orita T，Blood. 2005 ；105 =562-566)、納米抗體(例如參照 Cortez-Retamozo V. , Cancer Research 64, 2853-2857, 2004)和含有CDR的肽等?？贵w的衍生物是具有抗體的至少一種活性、特別是抗原結合活性的來自抗體的物質，有結合了其它物質的抗體或抗體的活性片段、用其它物質修飾的修飾抗體或其活性片段、或者向抗體的結構特別是氨基酸序列中導入突變的分子。本發(fā)明的抗體對其抗原結合價并沒有特別限定，可以是Fab或scFv的一價抗體，從在生物體內、特別是血液中的穩(wěn)定性、與GPVI的結合性或作用強度的角度考慮，優(yōu)選二價以上的多價抗體，例如二價、三價、四價或十價抗體，更優(yōu)選二價抗體。

本發(fā)明的第四方案提供編碼本發(fā)明的第一至第三方案的抗體的多核苷酸或核酸。該多核苷酸只要是編碼本發(fā)明抗體的氨基酸序列即可，沒有限定，多核苷酸包含DNA和RNA。編碼本發(fā)明抗體的⑶R序列的多核苷酸并不受特別限定，編碼VH⑶Rl、VH⑶R2和VH⑶R3氨基酸序列的堿基序列的優(yōu)選組合、編碼VL⑶R1、VL⑶Rl和VIXDR3氨基酸序列的堿基序列的適當組合、以及編碼VH CDRl、VH CDR2和VH CDR3、VLCDRl、VL CDRl和VLCDR3氨基酸序列的堿基序列的優(yōu)選組合如表8和表9以及表12和表13所示。對編碼本發(fā)明抗體的VH和VL的氨基酸序列的多核苷酸并沒有特別限定，優(yōu)選含有編碼 VH氨基酸序列的 SEQ ID NO. 87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107 和 109 的堿基序列，或者編碼 VL 氨基酸序列的 SEQ ID NO. 88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110的堿基序列的其中之一，更優(yōu)選含有兩者的堿基序列的多核苷酸，還優(yōu)選編碼VH氨基酸序列的序列號的堿基序列、或編碼VL氨基酸序列的序列號的堿基序列的其中之一，更優(yōu)選含有兩者堿基序列的多核苷酸。編碼本發(fā)明的抗體恒定區(qū)的多核苷酸優(yōu)選含有來自人抗體、更優(yōu)選人IgG、進一步優(yōu)選人IgG4的堿基序列。通過將含有本發(fā)明抗體的核苷酸序列的載體或基因通過轉移到細胞中，可以制備產生本發(fā)明的抗體的細胞。轉移方法可按照公知方法進行，具體方法如實施例所示。本發(fā)明的第五方案提供產生本發(fā)明的抗體的細胞。上述細胞的例子有雜交瘤、轉化體、或者導入了本發(fā)明的抗體基因的基因重組細胞等。產生抗體的雜交瘤具體可例舉表6和11所示的克隆。本發(fā)明可以提供上述發(fā)明的細胞所產生的抗體。本發(fā)明的第八方案和第九方案可提供與GPVI相關的新型肽或多肽。這些肽等可通過公知的方法制備，具體方法如實施例所示。第八方案的肽或第九方案的多肽可作為制備抗GPVI抗體的免疫用的給予抗原、或者檢測GPVI抗體的抗原使用。(制備方法)本發(fā)明的第六方案提供抗體的生產方法。對制備本發(fā)明的抗體的方法并沒有特別限定，可按照以下的方法制備。即，以人GPVI或其片段或它們的衍生物、例如人GPVI-Fc作為抗原，給予動物例如小鼠，從其末梢血采集淋巴細胞，制備與小鼠骨髓瘤細胞的雜交瘤。得到上述制備的雜交瘤所產生的抗體，選擇與GPVI具有結合能力、具有第一至第三抗體特性的抗體，得到產生該抗體的細胞。通過培養(yǎng)該細胞可得到本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的抗體可以制備成使用公知的方法(分別為Nature，312 :643，1984 ;Nature, 321 :522，1986，之后開發(fā)了很多方法)得到的重組人抗體的形式。首先，從產生本發(fā)明的抗體的細胞例如淋巴細胞、優(yōu)選生產抗GPVI單克隆抗體的雜交瘤中獲得編碼VH或VL的核酸、例如cDNA，確定堿基序列和氨基酸序列。接著，將獲得的編碼VH和VL的cDNA分別插入到動物細胞用表達載體中，構建人抗體表達載體，導入動物細胞，使其表達，由此制備抗體。其中，所述動物細胞用表達載體含有由同一細胞或另外的人細胞制備的、編碼人抗體CH和/或人抗體CL的基因。對導入到動物細胞中的基因的制備方法沒有特別限定，可以從來自雜交瘤的基因組DNA或cDNA中獲得，也可以通過PCR從雜交瘤的mRNA中獲得，還可以通過化學合成獲得。對插入了編碼本發(fā)明抗體的VH或VL的核酸的載體并沒有特別限定，優(yōu)選使用蛋白質基因等的表達中常用的、特別適合抗體基因表達的載體或高表達用載體。優(yōu)選的例子有含有EF啟動子和/或CMV增強子的載體，例如有pEF-BOS或者在實施例中使用的載體。通常是分別制備插入了編碼VH或VL的核酸的表達載體，對宿主細胞進行共轉染，也可以插入到單一的表達載體中。對導入了表達載體的宿主細胞并沒有特別限定，優(yōu)選蛋白質基因等的表達中常用的、特別適合抗體基因表達的細胞。例如有細菌(大腸桿菌等)、放線菌、酵母、昆蟲細胞(SF9等)、哺乳類細胞(COS-1、CH0、骨髓瘤細胞等)。為了工業(yè)化生產重組抗體，通常利用可使該抗體穩(wěn)定高效率生產的重組動物細胞株，例如CHO細胞株。上述重組細胞株的制備、克隆、為了高表達而進行的基因擴增以及篩選可采用公知的方法(例如參照Omasa T. :J. Biosci. Bioeng.，94，600-605，2002等)。在建立穩(wěn)定高產率動物細胞株的過程中使用了兩種啟動子，通過利用啟動子活性不同的組合、例如活性高的和活性低的，優(yōu)選通過利用活性相對弱的啟動子作為選擇標記的表達啟動子，可以有效地(選擇性地)取得表達性能高的克隆。優(yōu)選的啟動子的組合的例子和具體方法如實施例所示。重組人抗體的制備中使用的人抗體的恒定區(qū)例如可以使用C Y I或C Y 4作為人抗體重鏈恒定區(qū)，使用Ck等任意的人抗體的恒定區(qū)作為人抗體輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的抗體內，含有人的氨基酸序列的抗體除了人體內天然存在的抗體之外，也包含含可變重鏈和可變輕鏈的組合文庫，例如人抗體噬菌體文庫和由產生人抗體的轉基因動物得到的抗體等。人抗體噬菌體文庫是將由人B細胞制備的抗體基因插入到噬菌體基因中，使Fab、單鏈抗體等抗體活性片段在噬菌體表面表達的文庫。通過對這些文庫進行篩選，也可以獲得本發(fā)明的抗體。這些方法以及其它方法是本領域技術人員所周知的(Huse 等人，Science 246 1275-1281 (1989) ；ffinter 和 Harris, immunol. Today 14 243-246(1993) ;Ward 等人，Nature 341 :544-546(1989) ;Harlow 和 Lane，同前，(1988)；Hilyard等，Protein Engineering A practical approach (IRL Pressl992) ；Borrabeck,Antibody Engineering,第 2 版(Oxford University Press 1995))。以與固定抗原的基質的結合活性為指標，可以由該文庫回收表達具有所需抗原結合活性的抗體活性片段的噬菌體。進一步通過基因工程的方法，可將該抗體的活性片段變換成含有兩條完全的H鏈或兩條完全L鏈的人抗體分子。本發(fā)明除含有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體之外，也包含本發(fā)明的抗體的活性片段等。抗體活性片段例如有Fab(抗原結合片段)、Fab’、F(ab’)2，通過接頭將抗體的活性片段結合的形式的有單鏈抗體(scFv)或二硫鍵穩(wěn)定性抗體(dsFv)，含有抗體活性片段的肽例如有含有CDR的肽。它們可以通過用適當的蛋白分解酶對本發(fā)明的抗體進行處理的方法，或者基因重組技術等公知的方法制備。本發(fā)明的抗體為IgM時，本發(fā)明的Fab可以將本發(fā)明的抗GPVI抗體用蛋白分解酶-胃蛋白酶處理得到；抗體為IgG時，本發(fā)明的Fab可以將本發(fā)明的抗GPVI抗體用蛋白質分解酶-木瓜水解酶處理得到。或者，將編碼該抗體的Fab的DNA插入到原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，將該載體導入原核生物或真核生物中使其表達，可以制備 Fab0
本發(fā)明的F(ab’)2可以將本發(fā)明的抗GPVI抗體用蛋白質分解酶-胃蛋白酶處理獲得?；蛘邔⑾率鯢ab’進行硫醚結合或二硫鍵結合來制備。本發(fā)明的Fab’可以通過將與GPVI特異性反應的F(ab’)2用還原劑二硫蘇糖醇處
理獲得。本發(fā)明的scFv中所含的VH和VL可以使用本發(fā)明的雜交瘤所產生的抗體或人抗體的任意一種。本發(fā)明的scFv可如下制備獲得編碼本發(fā)明的抗GPVI抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，將該表達載體導入原核生物或真核生物使其表達，從而可制備scFv。dsFv是指將VH和VL中的各一個氨基酸殘基置換為半胱氨酸殘基，將所得的多肽經由該半胱氨酸殘基間的二硫鍵結合所得。置換為半胱氨酸殘基的氨基酸殘基可按照Reiter等人所示的方法[Protein Engineering, 7,697 (1994)],根據抗體的立體結構預測來選擇。本發(fā)明的dsFv中所含的VH和VL可以使用來自本發(fā)明的第一或第二方案的任意抗體。本發(fā)明的dsFv可如下制備獲取編碼本發(fā)明的抗GPVI抗體的VH和VL的cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，通過將該表達載體導入原核生物或真核生物使其表達，從而可制備dsFv。含有⑶R的肽是含有H鏈或L鏈⑶R的至少一個區(qū)域以上的構成。多個⑶R可以直接或者經由適當的肽接頭結合。本發(fā)明的含有CDR的肽可如下制備獲得編碼本發(fā)明的抗GPVI抗體的VH和VL的cDNA，然后構建編碼⑶R的DNA，將該DNA插入到原核生物用表達載體或真核生物用表達載體中，將該表達載體導入原核生物或真核生物使其表達，從而可制備含有CDR的肽。含有CDR的肽可通過Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化學合成方法制備。本發(fā)明的抗體或活性片段或它們的衍生物也包含例如雜交瘤所產生的抗體、用EBV轉化的細胞所產生的抗體、由cDNA表達的重組抗體、或者使放射性同位素、蛋白質、肽或低分子化合物等與這些抗體的活性片段化學結合所得的抗體、或者基因工程學融合的抗體。例如結合了聚乙二醇等的抗體穩(wěn)定性等方面應用價值高，是一個優(yōu)選的例子。還可以通過化學方法[抗體工學入門(金光修著1994年(株)地人書館)]，使放射性元素同位素、蛋白質、肽或低分子化合物等與本發(fā)明的抗GPVI抗體或抗體的活性片段的H鏈或L鏈的N末端一側或C末端一側、抗體或抗體活性片段中適當的取代基或支鏈、以及抗體或抗體活性片段中的糖鏈結合來制備。雜交瘤是指淋巴細胞與來自人、小鼠、大鼠等的骨髓瘤細胞進行細胞融合所得的、產生具有所需抗原特異性的單克隆抗體的細胞，可按照公知方法制備。制備單克隆抗體 時，優(yōu)選考慮與細胞融合時使用的骨髓瘤細胞的配合性來選擇。骨髓瘤細胞可以使用公知的各種細胞。其中包含來自人的SK0-007、人小鼠雜合骨髓瘤SHM-D33、來自小鼠的P3、P3U1、SP2/0、NS-1，來自大鼠的YB2/0和Y3_Agl，2，3等骨髓瘤細胞。制備人抗體時，有以下方法利用體外免疫導致的淋巴細胞的活化來制備雜交瘤的方法；以及使用重組人抗體基因得到的動物、特別是轉基因小鼠，例如KM小鼠制備雜交瘤的方法。(W02002/070648 (日本特表 2005-504507)、W02002/043478 (日本特表2004-515230))。向不同種GPVI例如小鼠GPVI中插入人GPVI的部分氨基酸序列所得的蛋白質在免疫上述轉基因動物、例如小鼠時，可以有效地獲得不與GPVI的小鼠的氨基酸序列反應，而與插入的人氨基酸序列、優(yōu)選表位反應的人抗體。因此，由該方法得到的人抗體作為具有本發(fā)明第一或第二方案抗體特征的人抗體，是有用的，該方法特別有效。對雜交瘤制備中使用的細胞沒有特別限定，在制備人抗體時，優(yōu)選在雜交瘤制備中使用的多種細胞中的至少一種是來自人的細胞。來自人的細胞可使用末梢血、淋巴結或脾臟等的人淋巴細胞，特別優(yōu)選確認有自身抗體產生的人的淋巴細胞。淋巴細胞的活化可通過公知的方法進行。例如優(yōu)選以下方法由人的末梢血或脾臟采集B細胞，通過體外免疫方法進行抗原刺激，制備與來自人B細胞的骨髓瘤細胞或來自小鼠的骨髓瘤細胞的雜交瘤的方法；用EBV轉化，與小鼠骨髓瘤細胞融合的方法；用PWM等促細胞分裂原刺激，使B細胞多克隆激活并融合的方法(免疫試驗操作法I · II、右田俊介等人編集、南江堂)等。對用于免疫動物的給予抗原、或者用于刺激細胞的抗原沒有特別限定?？乖鞍踪|的來源動物可以根據抗體的使用目的適當選擇，可以是來自天然物的抗原、遺傳工程制備的抗原、化學合成的抗原、與其它蛋白質或肽的融合蛋白等均可。例如可以使用血小板、血小板的膜、純化GPVI、重組GPVI、GPVI-Fc，優(yōu)選為GPVI-Fc。本發(fā)明第八方案的肽或第九方案的多肽適合作為制備抗GPVI抗體的免疫用的給予抗原使用?；罨馨图毎c骨髓瘤細胞的融合可按照Milstein等的公知的方法(Methods inEnzymoI.，73卷3頁)進行。例如有使用聚乙二醇(PEG)作為融合劑的方法(單克隆抗體試驗操作法入門、安東民衛(wèi) 千葉丈著、講談社)或電融合法等。免疫細胞與骨髓瘤細胞的混合比只要是它們可以融合的比例即可，沒有限定，優(yōu)選相對于活化淋巴細胞，使用1/10量-等量的骨髓瘤細胞。使用PEG (平均分子量1，000-4, 000)進行細胞融合的方法中，PEG的濃度沒有限定，優(yōu)選以50%進行?？梢蕴砑佣谆鶃嗧?DMSO)等輔助劑作為融合效率促進齊U。融合時通過將加溫至37°C的PEG溶液添加到混合的細胞中引發(fā)，反應1-5分鐘后，添加培養(yǎng)基終止。由該融合形成的雜交瘤在含有次黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷和氨基蝶呤的培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)等選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)I天-10天，分離未融合細胞。通過所產生的抗體進一步選擇所得雜交瘤。選擇的雜交瘤可通過公知的極限稀釋法形成單一克隆，確立單一克隆性抗體產生雜交瘤。檢測雜交瘤所產生的抗體的活性的方法可以使用公知的方法。這里，抗體的活性的檢測分兩階段第一階段是檢測與GPVI抗原的結合能力，第二階段是檢測抑制GPVI與膠原蛋白結合的活性。第一階段的活性的檢測方法例如有=ELISA法、蛋白質印跡法、放射免疫測定法。第二階段的活性的檢測方法例如有=ELISA法(結合抑制型)、蛋白質相互作用分析法(BIAC0RE等)、抑制血小板聚集的測定法。第八方案的肽或第九方案的多肽可以作為檢測抗GPVI抗體的抗原使用。具體方法如實施例所示。將建立的雜交瘤按照公知的方法培養(yǎng)，可以從其培養(yǎng)上清中獲得單克隆抗體?？贵w的純化可以采用鹽析法、凝膠過濾法、離子交換色譜法或親和柱層析法等公知的純化方法進行。 抗體的濃度可以通過公知的蛋白質定量方法、例如通過測定280nm下的吸光度來測定。作為確認本發(fā)明的抗GPVI抗體的抗原結合性的方法、或者使用本發(fā)明的抗GPVI抗體檢測生物試樣中GPVI的方法，可以使用熒光抗體法、酶聯(lián)免疫抗體法(ELISA)、放射線物質標記免疫抗體法(RIA)、免疫組織染色法、免疫細胞染色法等免疫組織化學染色法(ABC法、CSA法等)、蛋白質印跡法、免疫沉淀法、上述酶免疫測定法、夾心ELISA法[單克隆抗體試驗手冊、(講談社寸、工'y亍I 7 I、” ,1987年);生物化學實驗講座5免疫生化學研究法(東京化學同人、1986年)]等。(用途)本發(fā)明的抗體是與人GPVI特異性結合的抗體，本發(fā)明的抗體、抗體的活性片段、與化學物質結合得到的抗體的修飾物、或者含有它們的混合液的組合物等具有包括人的疾病的預防、診斷和治療用途，以及檢測受檢試樣、細胞和組織等中的人GPVI的用途等的各種用途。用涂藥物本發(fā)明的抗體與人GPVI結合的特異性高，且單獨使用時對人血小板活化和/或促進或引發(fā)血小板減少的作用低，因此對于人的疾病、例如血小板活化或聚集、或血管內皮障礙或者動脈硬化反應引起的疾病的預防和/或治療有效，另外，也可用于血栓或栓塞引起的疾病、例如血栓形成和栓塞等的預防和/或治療。這些疾病中，不僅包括動脈血栓形成，也包括靜脈血栓形成，還包含心房纖顫弓I發(fā)的腦梗塞。本發(fā)明的抗體可以預防和/或治療的人類疾病或病態(tài)具體有心肌梗塞，血栓溶解療法時、實施經皮冠狀竇內腔擴張術時、施行支撐架時、實施旁路手術時或者實施人工血管時或者這些手術之后的血管內皮肥厚、血管再狹窄、心絞痛或心肌梗塞、心房纖顫或心房撲動，以及上述原因的血栓形成、栓塞或腦梗塞、閉塞性血栓動脈炎、急性動脈閉塞癥、閉塞性動脈硬化癥或深部靜脈血栓形成等，還有腦梗塞(粥樣血栓性腦梗塞、腔隙性腦梗塞、心源性腦梗塞)、一過性腦缺血發(fā)作、株網膜下腔出血后的腦血管攣縮、肺血栓、肺栓塞、血管性紫癜、特發(fā)性血小板減少性紫癜、血栓性血小板減少性紫癜、播散性血管內凝血綜合征、體外循環(huán)時防止血液凝固、全身性紅斑狼瘡、多發(fā)性動脈炎、抗磷脂抗體綜合癥、紫癜性腎炎、伴隨糖尿病的內皮細胞損傷、糖尿病性腎炎、糖尿病性視網膜癥、腎栓塞、伴隨移植治療的并發(fā)癥(肝靜脈閉塞癥、移植物抗宿主病)等。對于之前所述的預防和/或治療對象疾病，本發(fā)明的抗體可以單獨給予，或者與其它藥理活性成分聯(lián)合使用。所述藥理活性成分例如有公知的溶栓劑(例如組織纖溶酶原激活物(t-PA)及其衍生物(包括突變體或所謂的第二代)、尿激酶、鏈激酶)、或者公知的抗血小板藥(例如阿司匹林、噻氯匹定、氯吡格雷、血栓烷拮抗劑、血栓烷合成抑制劑、GPIIb/IIIa拮抗劑)、公知的抗凝藥(例如華法林、肝素、低分子肝素、戊多糖、凝血酶抑制齊U、FXa抑制劑、FVIIa抑制劑)等。這里所述的聯(lián)合使用除了指給予同時含有本發(fā)明的抗體和該藥理活性成分的合劑之外，也包含將本發(fā)明的抗體和該藥理活性成分分別制成制齊U，在同一時期或者不同時間給予的情況，只要是在患者血液中同時存在即可，其給予形式不限。含有本發(fā)明的抗體以及制劑學上可接受的組合物作為有效成分的藥物可使用通常使用的制劑用的載體或賦形劑、其它添加劑，制成例如片劑、注射劑、散劑、栓劑等，對人
或其它動物給予。應用于人時，其給予途徑有口服給予、靜脈內給予(單次給予、連續(xù)輸液、間歇輸液)、皮下給予、肌內給予、關節(jié)內給予、經皮給予、經鼻給予等，通常是口服給予或靜脈內給予。本發(fā)明的抗體對人的臨床給予量可以考慮適用患者的癥狀、體重、年齡或性別等，適當確定，通常成人每天靜脈內給予I-IOOOOmg,優(yōu)選IO-IOOOmg,可以將其分成一次或多次給予。給予量根據各種條件變動，因此也可能以比上述給予量少的量即足夠。這里，本發(fā)明的抗體在識別GPVI方面是共通的，但本發(fā)明也包含具有不同機理的各種抗體。例如，直接抑制GPVI與膠原蛋白結合的、或者通過切斷GPVI來抑制血小板活化和/或聚集的抗體有望獲得比較即時性的效果，因此可能至少在疾病的急性期(例如心肌梗塞時或實施PTCA時或者實施之前或之后立即)有用。上述情況下，優(yōu)選為了使本發(fā)明的抗體與血液中血小板表面的GPVI大部分結合而給予較大量的抗體，例如可以采取單次或分次靜脈注射或靜脈滴注的形式。另外，將GPVI攝入到內部的抗體可能無法獲得即時效果，但是，考慮到人的血小板在血液中的壽命(9-10天左右)以及人抗體在血液中的半衰期(IgG時為數周)，則有望獲得持續(xù)性的效果，因此，例如可在疾病的慢性期(例如心肌梗塞發(fā)病后或實施PTCA后數天-數月)有效。這種情況下，在部分優(yōu)選完全抑制血液中血小板與膠原蛋白的反應性的程度下，以較長的間隔、例如一個周期為數天-數周，給予使血小板表面的GPVI消失所需量的抗體，例如可單次或分次靜脈注射或靜脈滴注。因此，優(yōu)選的方案中，本發(fā)明的抗體可以同時具有這些效果。還可以實施將多種有望獲得各效果的抗GPVI抗體組合的治療。非口服給予的組合物包含通常溶解于可接受的載體、優(yōu)選水性載體中的免疫球蛋白溶液或它們的混合液?？墒褂酶鞣N水性載體例如水、緩沖水、磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)、O. 4%生理鹽水、O. 3%甘氨酸、人白蛋白溶液等。這些溶液是無菌的，通常不存在微粒物質。這些組合物可通過常用的熟知的滅菌方法滅菌。為了接近生理學條件，組合物中可以根據要求含有藥學上可接受的輔助物質，例如PH調節(jié)和緩沖劑、毒性調節(jié)劑等，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣和乳酸鈉。這些制劑中的抗體濃度可在廣范圍內、即約低于O. 005 %重量(通常至少為約I %重量)-15或20%重量的大的量范圍內變化，主要根據所選擇的給予的特定方式，按照溶液容量、粘性等進行選擇。用于制備非口服給予組合物的現實的方法是本技術領域的技術人員所公知或了解的，例如在 > 安 > 卜 > 文7 7 - 7 二-亍4力卟寸4工> 7 (第15版、7夕八7'
、y '> >夕''力二 ^卜 >>'>>八二7、1980)(該引例視為本說明書的一部分)有更為詳細的記載。適合灌洗或其它途徑的組合物可以根據所需的特定應用來選擇。上述藥學組合物可包含抗GPVI抗體和在該疾病中常用的其它治療藥。在任何情況下都可以采用單次給予和持續(xù)給予。預防性或治療性的有效量可根據對象疾病、病態(tài)和患者的狀態(tài)等適當確定。本發(fā)明的抗體可以為了儲藏而冷凍或冷凍干燥，在使用之前在適當的載體中重新構成。該技術已知對于通常的免疫球蛋白是有效的，可以采用公知的冷凍干燥和重新構成技術。冷凍干燥和重新構成可能導致各種程度的抗體活性損失(例如常用的免疫球蛋白、
IgM抗體有產生比IgG抗體更大的活性損失的傾向)，以及在使用水平上，為了補充該損失必須進行調節(jié)，這是本領域技術人員應該認識到的。用涂GPVI檢測使用本發(fā)明的抗體或抗體的活性片段檢測受檢試樣中GPVI的方法可包括以下步驟使受檢試樣與本發(fā)明的抗體或抗體的活性片段接觸的步驟；檢測與本發(fā)明的抗體或抗體活性片段結合的受檢試樣中GPVI的步驟?？梢赃M一步包括對受檢試樣中的GPVI進行定量的步驟。可通過檢測受檢試樣中GPVI的方法進行疾病的診斷。特別是可用作人的疾病例如血栓性、栓塞性或動脈硬化性疾病的診斷。使用本發(fā)明的抗體檢測受檢試樣中GPVI的方法有夾心ELISA系、抑制ELISA系、熒光抗體法、免疫組織化學染色法、放射性物質標記免疫抗體法、蛋白質印跡法、免疫沉淀法等，但并不限于此。作為對象的受檢試樣并不受限定，可以使用生物試樣，有動物、特別是人的體液或組織、細胞和菌體以及它們的提取液、培養(yǎng)上清、涂抹標本和切片，優(yōu)選血小板或血衆(zhòng)或者血清。通過測定血小板上的GPVI，可應用于與GPVI相關的治療的監(jiān)控，特別是以血小板上的GPVI消失為指標，對抗GPVI抗體的效果進行預測或判定，或者進行預后的判定等。
實施例通過以下實施例進一步詳述本發(fā)明，但不應理解為本發(fā)明受這些實施例的限定。實施例IGPVI胞外區(qū)-Fe融合蛋白的制備A.人GPVI胞外區(qū)-小鼠Fe融合蛋白(hGPVI-mFc)的制備(l)hGPVI-mFc融合蛋白表汰質粒的構建以小鼠基因組DNA作為模板，擴增編碼小鼠免疫球蛋白(mIgG2a)重鏈恒定區(qū)各結構域的基因區(qū)。即，用以下的引物對進行PCR反應，結果，用mIgG2a-a(SEQ ID NO. 152)和 mIgG2a-c(SEQ ID NO. 154)擴增了 CHl 結構域，用 mIgG2a_b(SEQ ID NO. 153)和mIgG2a-e (SEQ ID NO. 156)擴增了絞鏈部分、用 mlgG2a_d (SEQ ID NO. 155)和 mIgG2a_g(SEQID NO. 158)擴增了 CH2 結構域、用 mIgG2a-f (SEQ ID NO. 157)和mIgG2a_h (SEQ ID NO. 159)擴增了 CH3結構域。接著將上述四種擴增產物混合，使用引物mIgG2a-a和mIgG2a_h進行PCR反應，得到各結構域連接的擴增產物(編碼重鏈恒定區(qū)(C Y 2a)的DNA片段)。將該擴增產物克隆到pT7-BlueT載體上，然后用限制酶Bam HI和KpnI切取編碼小鼠Fe區(qū)的DNA片段，制備片段A。另一方面，用限制酶Xba I和Bgl II由pCAGGS-GPVI-Fc質粒切取編碼人GPVI胞外結構域的DNA片段，制備片段B。在用Xba I和Kpn I切斷制備的表達載體pEF2cew的EF啟動子下游，將這些片段連接成片段A+片段B，構建表達hGPVI-mFc (SEQ IDNO. 222)的質粒(pTK-2249)。(2) hGPVI-mFc融合蛋白的表汰和鈍化C0S-1細胞在加入了 10%胎牛血清的DulbeccoMEM培養(yǎng)基中繼代，將pTK-2249與轉染試劑(FuGENE6，u力工夕人7 %吁人V 9 ^制備)以適當量混合，然后滴加到無血清的DulbeccoMEM培養(yǎng)基中，將其與培養(yǎng)液更換，進行轉染。在5% C02存在下、在37°C下培養(yǎng)3天，然后將該培養(yǎng)上清用蛋白A柱(Pros印-A、MILLIP0RE)純化，將所得作為制備抗人GPVI抗體用的抗原。B.人GPVI朐外區(qū)-人Fe融合蛋白(hGPVI-hFc)表汰質粒(dTK-2233)的構律和將具有編碼人hGPVI-hFc的基因的質粒(pCAGGS-GPVI-Fc)用限制酶Xba I和Eco T22I切斷，制備片段J，用限制酶Eco T22I和Bgl II切斷，制備片段K，在表達質粒pEF2ceW的EF-I α啟動子下游連接成片段J+K，構建hGPVI-mFc表達質粒(pTK_2233)。另夕卜，hGPVI-hFc的表達和純化與hGPVI-mFc相同。C.小鼠GPVI朐外區(qū)-人Fe融合蛋白(hGPVI-hFc)表汰質粒(dTK-2440)的構律以小鼠基因組DNA為模板，用表述的引物對進行PCR反應。結果，用mGPVI_h(SEQID NO. 162)和 mGPVI-i (SEQ ID NO. 163)得到 PCR 擴增產物 hi，用 mGPVI-j (SEQ IDNO. 164)和 mGPVI-k(SEQ ID NO. 165)得到 PCR 擴增產物 jk，用 mGPVI-1 (SEQ ID NO. 166)和 mGPVI-m(SEQ ID NO. 167)得到 PCR 擴增產物 Im,用 mGPVI_n(SEQ ID NO. 168)和 mGPVI-o (SEQ ID NO. 169)得到 PCR 擴增產物 no,用 mGPVI-p (SEQ ID NO. 170)和mGPVI-c (SEQ ID NO. 160)得到PCR擴增產物pc。將這些擴增產物混合作為模板，再將引物 mGPVI-e(SEQ ID NO. 161)、mGPVI-q(SEQ ID NO. 171)、mGPVI-r(SEQ ID NO. 172),mGPVI-s (SEQ ID NO. 173)和mGPVI-c混合，進行PCR反應，得到各片段連接起來的擴增產物。將該擴增產物克隆到pT7-BlueT載體上，制備pTK-2437。在ρΤΚ_2437的含有小鼠GPVI胞外結構域的基因區(qū)5’ 一側具有限制酶Nhe I的識別位點，3’ 一側具有Bam HI的識別位點，用這些酶切斷，制備DNA片段。然后將該片段插入到用限制酶Xda I和Bam HI切斷制備的ρΤΚ-2233中，構建小鼠mGPVI-Fc表達質粒(pTK-2440)。P.食蟹猴GPVI胞外區(qū)-人Fe融合蛋白表達質粒的構建(I)食蟹猴D1D2-人D3嵌合GPVI-人Fe融合蛋白表汰質粒的構建根據已知序列的人GPVI基因信息設計和制備適當的引物對，使用這些人GPVI引物，進行以食蟹猴基因組DNA為模板的PCR反應，確定食蟹猴GPVI基因序列的一部分。接著，以該序列為基礎，重新設計和制備食蟹猴用的引物對，用各引物對、以食蟹猴的基因組 DNA 為模板再次進行 PCR 反應，用 macGPVI-a(SEQ ID NO. 174)和 macGPVI-b (SEQ IDNO. 175)得到擴增產物 ab，用 hGPVI-d (SEQ ID NO. 180)和 macGPVI-c (SEQ ID NO. 176)得到擴增產物 dc，用 macGPVI-d(SEQ ID NO. 177)和 hGPVI_h(SEQ ID NO. 182)得到擴增產物dh，用hGPVI-g(SEQ ID NO. 181)和macGPVI-g(SEQ ID NO. 178)得到擴增產物gg。另一方面，以 ρΤΚ-2233 為模板，通過使用 macGPVI-h(SEQ ID NO. 179)和 IgGl-i (SEQ ID NO. 183)的PCR反應，得到擴增產物hi。將以上五種擴增產物混合作為模板，通過macGPVI-a和IgGl-i再次進行PCR。該操作得到的擴增產物含有將食蟹猴GPVI的Dl和D2、人D3融合而成的嵌合GPVI基因，用限制酶Nhe I和Bam HI切斷后，插入到用限制酶Xba I和Bam HI切斷制備的ρΤΚ-2233中，構建食蟹猴D1D2-人D3嵌合GPVI-人Fe融合蛋白(GPVI-FFH_hFc、SEQID NO. 223)表達質粒(pTK-2462)。實施例2抗人GPVI抗體的制備Α.兔多克隆抗體的制備為了制備抗人GPVI多克隆抗體，對兔進行免疫。即，將20 μ g實施例IA中制備的hGPVI-mFc在500 μ L生理鹽水中稀釋，與500 μ L弗氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，然后給予2. 1-2. 2kg的雌性新西蘭白兔(北山f ”的背部皮下。2周后，再將20μ g hGPVI-mFc在500 μ L生理鹽水中稀釋，與500 μ L的弗氏不完全佐劑(DIFCO)等量混合，給予背部皮下。給予結束I周后，由耳靜脈采血，按照規(guī)定方法分離抗血清，純化抗體。即，向抗血清中添加硫酸銨，使最終飽和濃度為33%，在4°C下攪拌I小時，然后將析出的沉淀離心。接著將沉淀用Dulbecco磷酸緩沖液(以下記為D-PBS)溶解，用D-PBS透析過夜。過濾透析液，然后供給蛋白A柱(口七A、S V 7 )，用O. IM甘氨酸鹽酸緩沖液(ρΗ3· O)洗脫結合的IgG組分，得到純化抗體。所得洗脫組分用IM Tris鹽酸緩沖液(ρΗ7. O)迅速中和，用D-PBS透析，然后由280nm的吸光度計算蛋白濃度(吸光系數0. 714mg/mL)。以下，將所得抗體記為抗GPVI多克隆抗體。B.抗人GPVI單克降抗體的制備將20 μ g GPVI-mFc與弗氏完全佐劑(DIFCO)等量混合，制成給予抗原。將給予抗原給予雌性ddY小鼠(8周齡、SLC) 2次，3天后由淋巴結分離淋巴細胞。將所得淋巴細胞與P3X63-Ag. 8. Ul (ATTC)混合，然后使用聚乙二醇(PEG1500、Sigma)，按照安東民衛(wèi)、千葉丈/著“單克隆抗體試驗操作入門”(講壇社，83頁)進行細胞融合。通過HAT培養(yǎng)基選擇雜交瘤，I周后，用兩種方法對產生目標抗體的雜交瘤進行篩選。即，使用了以與在板上固相化的hGPVI-hFc的結合活性作為指標的方法，以及以抑制膠原蛋白與GPVI結合活性為指標的方法。(I)以結合活性作為指標的雜交瘤的篩選用D-PBS將由實施例IB制備的hGPVI-hFc稀釋為2 μ g/mL,以50 μ L/孔添加到免疫板(MaXisorp、NUNC)中。在37°C下反應I小時，然后用離子交換水清洗5次。將含有2% StabilGuard(Surmodics)的 D-PBS (pH7. 4)以 100 μ L 添加到各孔中，進行封閉。接著，將培養(yǎng)上清添加到各孔中，在37°C下反應I小時，然后用含有O. 05%吐溫-20的生理鹽水清洗3次。將過氧化物酶標記抗小鼠免疫球蛋白抗體(DAKO、P260)用含有10%兔血清的D-PBS稀釋為1000倍，向各孔中添加50 μ L。在37°C下反應I小時，然后同樣清洗5次，向各孔中添加TMB溶液(BioFix)。在室溫下反應10分鐘，然后用O. 5M硫酸溶液中止反應，用板分光光度計(I &十7\ > JX、大日本制藥)測定450nm的吸光度。結果，選擇與hGPVI-hFc反應的細胞，通過極限稀釋法(安東民衛(wèi)、千葉丈/著“單克隆抗體試驗操作入門”(講壇社，97頁))進行克隆。8天后同樣進行篩選，選擇與hGPVI-hFc反應的抗體。(2)以抑制膠原蛋白-GPVI結合活性為指標的雜交瘤的篩選用D-PBS將膠原蛋白(Horn)稀釋為10 μ g/mL,以50 μ L/孔添加到免疫板(Maxisorp, NUNC)中。在4°C下反應過夜，然后用離子交換水清洗5次，用含有5% BSA的D-PBS封閉。接著添加25 μ L/孔培養(yǎng)上清，再以25 μ L/孔添加用D-PBS制備成2 μ g/mL的hGPVI-hFc，在37°C下反應I小時，然后用含有O. 05%吐溫-20的生理鹽水清洗3次。將過氧化物酶標記的抗人IgG抗體(BioMeda)用含有10%山羊血清的D-PBS稀釋成1000倍，向各孔中添加50 μ L。在37°C下反應I小時，然后同樣清洗5次，將TMB溶液(BioFix)添加到各孔中。在室溫下反應10分鐘,然后用O. 5M硫酸溶液中止反應，用板分光光度計(I ^
JX、大日本制藥)測定450nm下的吸光度。選擇相對于未添加抗體的孔的吸光度降低50%以上吸光度的孔作為產生抗GPVI抗體的雜交瘤。結果，通過多次的細胞融合(F編號表示I次)選擇了具有抑制膠原蛋白與GPVI 的結合活性的雜交瘤。(3)雜交瘤所產生的抗體的制備產生抗GPVI抗體的雜交瘤用10% FCS/RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma)培養(yǎng)，然后更換為雜交瘤-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen)進行培養(yǎng),使其產生抗體,使用蛋白A柱(Prosep-rA、^ 'J )，由培養(yǎng)上清中純化抗體。即，將所得培養(yǎng)上清吸附于預先用D-PBS平衡的蛋白A柱(Pros印-A、Millipore)，將未吸附的蛋白質用D-PBS清洗，然后用25mM甘氨酸-鹽酸緩沖液(PH3.0)洗脫吸附組分。然后用生理鹽水進行透析，所得抗體的濃度是使用吸光系數(El% :1.4)，由28011111的吸光度進行計算。以下，將所得抗體記為抗GPVI單克隆抗體。實施例3抗GPVI單克降抗體的分組通過將實施例2所得的抗體按照與GPVI的結合特性、即結合區(qū)的不同進行分類，使用F1199、F1201、F1202、F1210和F1211各抗體進行競爭測定。首先，按照中根等人的方法(J. Histochem. Cytochem. ,22,1084,1974)制備各抗GPVI單克隆抗體的過氧化物酶標記抗體。接著使用這些過氧化物酶標記抗體進行與各純化抗體的競爭測定，對抗體進行分類。即，用D-PBS將hGPVI-hFc稀釋為2 μ g/mL，以50 μ L/孔添加到免疫板中。在37°C下反應I小時，然后用離子交換水清洗5次，向各孔中添加含有2% StabilGuard的D-PBS，進行封閉。接著，將25 μ L上述標記抗體和25 μ L各純化抗體添加到孔中，在37°C下反應I小時，然后用含有O. 05%吐溫-20的生理鹽水清洗5次，用TMB溶液(BioFix)顯色。在室溫下反應10分鐘，然后用O. 5M硫酸溶液中止反應，用板分光光度計(7 f 7々Y > JX、大日本制藥)測定450nm的吸光度。以未添加純化抗體時的吸光度為100 %，計算對各標記抗體的抑制活性，對各純化抗體進行分類。結果，將與標記抗體(i)、(ii)、(V)、(viii)競爭的抗體分為a組。將與標記抗體(i)、(V)、(vii)競爭的抗體分為b組。將與標記抗體(i)、(ii)、(vii)、(viii)競爭的抗體分為c組。將與標記抗體(iii)、(iV)競爭的抗體分為d組,將與標記抗體(iii)、(iv)、(Vi)競爭的抗體分為e組。還將標記抗體(iii)、(vi)分為f組。未見有規(guī)則性的分為g組和h組。g組和h組互相不競爭，因此分為不同的組。因此，可以確認制備的抗GPVI單克隆抗體可以識別GPVI表面上的至少八種區(qū)域。實施例4供給候ex vivo試驗的抗.體的分組在制備的抗人GPVI單克隆抗體中，按照實施例3的分組方法將與猴GPVI結合并可用于ex vivo試驗的抗體進行分組。S卩，使用實施例3制備的各標記抗體,按照與實施例3同樣的方法進行競爭測定,對各抗體進行分類。如表I所示，與實施例3同樣可分為至少識別七種區(qū)域的抗體組。表I
權利要求
1.抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段，該抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段與人GPVI結構域2的環(huán)9特異性結合。
2.抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段，該抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段與SEQ ID NO. 147的氨基酸序列所示的人GPVI突變體的結合活性、和與SEQ ID NO. 135的氨基酸序列所示的人GPVI-hFc的結合活性相比降低至50%以下，上述人GPVI突變體簡稱hGPVI-mL9-hFc,上述人 GPVI-hFc 簡稱 GPVI-HHH-hFc。
3.抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段，該抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段與人GPVI的結合受到SEQ ID NO. 135的氨基酸序列所示的人GPVI-hFc的抑制，但未受到SEQ IDNO. 147的氨基酸序列所示的人GPVI突變體的抑制，上述人GPVI-hFc簡稱GPVI-HHH-hFc，上述人GPVI突變體簡稱hGPVI-mL9-hFc。
4.權利要求I 3中任一項所述的抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段，該抗人GPVI抗體為嵌合抗體。
5.權利要求I 3中任一項所述的抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段，該抗人GPVI抗體為人源化抗體。
6.權利要求I 3中任一項所述的抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段，該抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段的抗原結合價為I價。
7.細胞，該細胞產生權利要求I 3中任一項所述的抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段。
8.權利要求I 3中任一項所述的抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段，該抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段進行了聚乙二醇化，上述聚乙二醇簡稱PEG。
9.抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段的制備方法，其特征在于使用權利要求7所述的細胞。
10.制備抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段的方法，所述方法包括培養(yǎng)權利要求7所述的抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段生產細胞的步驟，和收集由該細胞產生的單克隆抗體的步驟。
11.權利要求9或10所述的方法，其中權利要求7所述的抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段生產細胞為含有包含編碼H鏈可變區(qū)域的SEQ ID NO :280的多核苷酸序列和編碼L鏈可變區(qū)域的SEQ ID NO :284的多核苷酸序列的載體，或者包含編碼H鏈可變區(qū)域的SEQ ID NO :282的多核苷酸序列和編碼L鏈可變區(qū)域的SEQ ID NO :284的多核苷酸序列的載體的細胞。
12.藥物組合物，該藥物組合物含有權利要求I 3中任一項所述的抗人GPVI抗體或 其抗原結合性片段作為有效成分。
13.用于血栓或栓塞的權利要求12所述的藥物組合物。
14.篩選與環(huán)9特異結合的、抗人GPVI抗體或其抗原結合性片段的方法，其包括以下步驟 a)測定與人血小板膜糖蛋白VI的結合性的步驟，上述糖蛋白VI簡稱GPVI， b)測定使血小板活化的作用或引發(fā)生物體內血小板減少的作用的步驟，以及 c)測定通過與血小板接觸，使血小板膜上的GPVI至少部分消失的活性的步驟。
全文摘要
本法明提供具有以下性質的抗體或其活性片段或它們的衍生物a)與人血小板膜糖蛋白VI(GPVI)特異性結合；b)使血小板活化的作用、和/或引發(fā)生物體內血小板減少的作用弱，以及c)通過與血小板接觸，使血小板膜上的GPVI至少部分消失。
文檔編號G01N33/577GK102875679SQ201210278310
公開日2013年1月16日 申請日期2006年4月28日 優(yōu)先權日2005年4月28日
發(fā)明者高山博史, 白川嘉門, 古迫正司, 保坂義隆, 松末朋和, 內藤克紀, 堀田優(yōu)米, 川原哲史, 本田元康 申請人:持田制藥株式會社