專利名稱：人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療用人源基因工程單克隆抗體的制備及應(yīng)用，尤其是特異性針對狂犬病毒糖蛋白的中和性基因工程單克隆抗體。
自1975年B淋巴細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞融合技術(shù)問世以來，單克隆抗體作為一類用于基礎(chǔ)研究，實(shí)驗(yàn)室診斷，臨床治療和預(yù)防的新型產(chǎn)物，其運(yùn)用價值和開發(fā)前景已獲得普遍的肯定。分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的研究發(fā)展導(dǎo)致了基因工程抗體的產(chǎn)生和發(fā)展。通過抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源及人源抗體，使對單克隆抗體的研究有了突破性進(jìn)展并越來越顯示出其重要意義及實(shí)際運(yùn)用前景。80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫技術(shù)興起和整個基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當(dāng)今世界人源或基因工程抗體的開發(fā)研究取得很大進(jìn)展并已由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開發(fā)階段。目前美國FDA批準(zhǔn)上市或待批的生物制品中，各種形式的單克隆抗體和基因工程抗體占到一定比例，目前以批準(zhǔn)上市的67種生物制品中，治療和預(yù)防用單克隆抗體和基因工程抗體共有9種。正在待批中等抗體有54種。其中已批準(zhǔn)上市并且產(chǎn)生巨大經(jīng)濟(jì)和社會效益的四種人源化基因工程抗體中，其中有一種即為抗病毒基因工程抗體，其商品名為“SynagisTM″，為人源化抗呼吸道合病毒(RSV)基因工程抗體，而來源于噬菌體抗體庫篩選的人源抗RSV病毒基因工程抗體已被批準(zhǔn)進(jìn)入II期臨床，另一種抗病毒抗體抗乙型肝炎表面抗原抗體也在審批之中。
至今為止，大多數(shù)病毒性疾病無特異性治療藥物。狂犬病的暴露后治療一直是世界性難題，對于嚴(yán)重暴露者(III)而言，世界衛(wèi)生組織建議同時用疫苗和狂犬病毒免疫球蛋白(Rabies Immune Globulin，RIG)進(jìn)行主動和被動免疫治療，目前可以選用的抗血清有馬抗狂犬病毒免疫球蛋白(ERIG)和人血來源的抗狂犬病毒免疫球蛋白(HRIG)。但由于ERIG在注入人體后有較強(qiáng)的副反應(yīng)，所以美國免疫學(xué)會建議在HRIG和ERIG中優(yōu)先選用HRIG進(jìn)行治療，但由于HRIG來源少，價格高，而且血制品中不僅非特異性雜蛋白多，特異性抗體含量很低，而且最大的問題是血源制品潛在的未能檢出的病原污染問題，從長遠(yuǎn)利益考慮應(yīng)當(dāng)摒棄。因此以人源基因工程產(chǎn)品替代血制品已成為國內(nèi)外研究的一大方向，并正在逐步走向成功。用純鼠源單克隆抗體預(yù)防和治療病毒性疾病在國際上尚無任何批準(zhǔn)的先例，鼠源抗體人用最大的不利之處為異源蛋白，在人體內(nèi)易引起遺傳免疫排斥而使抗體失效并引起免疫性疾病。因此，特異性抗病毒人源中和性抗體是病毒性疾病預(yù)防和治療的最有前景的生物制品之一。人源抗病毒基因工程抗體的研究除已成功的抗RSV抗體外，通過噬菌體表面呈現(xiàn)系統(tǒng)，基因工程抗體庫技術(shù)和分子生物學(xué)手段的聯(lián)合運(yùn)用，這一領(lǐng)域的研究已取得重大進(jìn)展目前已研制成功的人源抗病毒全抗體有抗以下病毒的抗體呼吸道合胞病毒，愛滋病毒(HIV)，乙肝病毒，單純皰疹病毒(HSV)，漢坦病毒等以及尚未發(fā)表的本所已研制成功的抗甲型肝炎病毒，狂犬病毒抗體等。人源抗狂犬病毒基因工程抗體制劑的研制成功，將為國內(nèi)外首創(chuàng)，有可能獲一類新藥證書。
本發(fā)明的目的是通過基因工程手段和噬菌體表面表達(dá)技術(shù)結(jié)合運(yùn)用，直接從人抗體基因庫中篩選出中和性抗狂犬病毒的基因工程單克隆抗體，獲得其抗體基因，為將來可能的臨床抗病毒預(yù)防和治療提供可行性的特異性抗體藥物。
本發(fā)明陳述的人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體包括1、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10，包括Fab抗體和IgG全抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用。其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核和真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合狂犬病毒的功能性中和抗體。
2、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10，其主要特征在于抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，如圖9，是人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列。
3、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10，其主要基因特征在于特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對人源抗狂犬病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達(dá)，其輕鏈(VL)和重鏈各自相應(yīng)的三個CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列。重鏈(VH)三個CDR區(qū)的氨基酸序列包括CDR1為GGSITSHHYWS；CDR2為YHSGTTNYNPSLKSRV；CDR3為VRVTTGAFNL。輕鏈(VL)三個CDR區(qū)的氨基酸序列包括CDR1為RASQSVSSNLA；CDR2為ASTRAA；CDR3為QQYNTWPPYT。
4、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10Fab抗體，其特征在于為一種在原核細(xì)胞中獲得穩(wěn)定有效表達(dá)的基因重組的人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程單克隆抗體Fab抗體，由重鏈Fd和Kappa鏈組成。
5、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10IgG全抗體，其特征在于由全長IgG1重鏈基因和全長lambda鏈輕鏈組成，其輕重鏈先導(dǎo)序列和重鏈Fc基因來源于載體pAc-L-Fc，已在專利申請?zhí)枮?0105698.0的專利申請中陳述。在輕鏈基因先導(dǎo)序列和VL基因之間含有SacI酶切點(diǎn)；在重鏈基因先導(dǎo)序列和VH基因之間含有XhoI酶切點(diǎn)；在重鏈Fd基因和Fc基因之間含有SpeI酶切點(diǎn)。
6、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10，其主要功能特征在于特異性識別狂犬病毒糖蛋白蛋白，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。
7、人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的中和性抗體可變區(qū)，F(xiàn)ab或全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組病毒系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體基因或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和狂犬病毒感染的抗體產(chǎn)物，其基因表達(dá)產(chǎn)物可望在臨床上用于預(yù)防和治療由狂犬病毒引起的狂犬病。
8、人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)發(fā)表的抗狂犬病毒中和抗體RVG10的可變區(qū)中的CDR區(qū)特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈6個CDR區(qū)的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗狂犬病毒糖蛋白的中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。
傳統(tǒng)的利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)獲得人源單克隆抗體相當(dāng)困難，而且建立的細(xì)胞系通常不穩(wěn)定，基因易丟失。本發(fā)明陳述的人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體，是在獲得抗體基因的基礎(chǔ)上獲得基因產(chǎn)物的表達(dá)，此抗體基因可隨著質(zhì)粒DNA在細(xì)菌內(nèi)的復(fù)制而穩(wěn)定復(fù)制，并可根據(jù)不同需要任意改建抗體基因，從而獲得一種可行性的臨床治療用抗體制劑。
以下的優(yōu)先實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明，擔(dān)不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容在這些實(shí)施例中，為說明本發(fā)明，采用噬菌體表達(dá)載體為pComb3(Barbas C.III et al，Proc.Natl.Acas.Sci USA 1991，8910164-10168)。所用主要菌株為商品化產(chǎn)品XLI-Blu(美國Strategene公司)。所用噬菌體為VCSM13?？袢《緸槲覈蛛x的AG株。
實(shí)施例1-6為人源抗狂犬病毒中和性基因工程Fab抗體和全抗體RVG10的篩選制備方法；實(shí)施例7為人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10的基因特征；實(shí)例8-12為人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10的蛋白及功能特征。
實(shí)例1，人源IgG Fab段基因的PCR擴(kuò)增用淋巴細(xì)胞分離液從經(jīng)狂犬病毒PM株Vero細(xì)胞疫苗免疫過的供體外周抗凝血中分離淋巴細(xì)胞，用Tril-Zon(美國Gibco，BRL)提取總細(xì)胞RNA，用Olig-dT引物將提取的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Gibco，BRL)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用一組特異性IgGFabGamma鏈、Kampa鏈及Lamda鏈引物(表1)，對人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃1分鐘，54℃1分鐘、72℃2分鐘，35個循環(huán)(PE 480)，上述PCR產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，經(jīng)過DNA純化柱Spin-X(美國Gibco，BRL)純化后，獲得650-700bp左右的Kamba、Lamda和Fd鏈PCR產(chǎn)物。
實(shí)例2，噬菌體抗體基因庫的建立將不同引物合成的Kamba和Lamda鏈PCR產(chǎn)物混合，將不同引物合成的Fd鏈混合，分別用SacI/XbaI和XhoI/SpeI克隆入噬菌體載體pComb3，將克隆入輕，重鏈基因的pComb3載體DNA連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，用10ul蒸溜水懸起，電轉(zhuǎn)導(dǎo)入事先制備好的200ul電轉(zhuǎn)菌XLI-Blu，(電轉(zhuǎn)條件為Bio-Red電轉(zhuǎn)儀，0.2cm電轉(zhuǎn)杯，2.5K伏)，電轉(zhuǎn)后加10mlSOC培養(yǎng)液，37℃1小時，加入10ml帶有氨芐青霉素和四環(huán)素的SB培養(yǎng)液(3)，37℃1小時，加入80-100ml前述SB，37℃2小時后加入輔助噬菌體M13GCM 1 X10 12，1小時后加入卡那霉素(70ug/ml)，37℃搖床培養(yǎng)過夜。用4％PEG8000和3％NaCl沉淀噬菌體上清，經(jīng)9000rpm，20分鐘，4℃離心后，用2ml 0.02M PBS PH 7.4重懸沉淀，建立噬菌體抗體庫，分裝保存于-20℃冰柜中。
實(shí)例3，用于抗體庫富集篩選的狂犬病毒抗原的制備1)狂犬病毒顆粒的純化所用病毒為BHK-21細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的病毒上清(流研所賈珂麗老師惠贈)。將上清在4000rpm離心10分鐘，棄去細(xì)胞碎片。先用15％、20％、25％、30％的蔗糖溶液做墊層離心，以確定合適的蔗糖濃度。選用SW40的轉(zhuǎn)頭。每管加入10ml病毒培養(yǎng)上清，然后將1ml蔗糖溶液加入溶液底部，4℃，25000rpm離心2小時。然后將超離純化的樣品進(jìn)行電泳鑒定，確定合適濃度的蔗糖溶液。用合適的濃度，采用SW28轉(zhuǎn)頭，4℃，25000rpm離心2小時純化抗原。將純化的的抗原進(jìn)行SDS-PAGE分析和Western Blot鑒定。2)感染細(xì)胞裂解液的制備用狂犬病毒aG株感染的細(xì)胞，用2％NP40細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，制成狂犬病毒抗原。
實(shí)例4，噬菌體抗體庫的特異性富集篩選用0.1M NaHCO3(pH8.6)的溶液包被純化的狂犬病毒抗原(0.5-1μg/ml)，每孔55μl，4℃過夜；次日用1×PBST洗去未吸附的抗原，用4％的脫脂奶37℃封閉1小時，棄封閉液；每孔加入50μl噬菌體抗體庫，37℃孵育2小時，棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用1×TBST(50mM Tris-HCl，150mMNaCl，0.5％Tween 20，pH7.5)洗液沖洗各孔，沖洗時，用帶有吸頭的移液器反復(fù)吹打，共洗10-20遍，以充分洗去未吸附的噬菌體；最后用ddH2O洗兩遍，吸凈孔中的液體；每孔加入50μl Gly-HCl(pH2.2)的洗脫液，室溫孵育10分鐘。加入適量的2M Tris，以中和洗脫下來的噬菌體；將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮制備的XLI-Blu菌液中(OD600＝1)，室溫孵育15-20分鐘；然后轉(zhuǎn)入250ml三角瓶中，加入SB10ml(氨芐青霉素20μg/ml，四環(huán)素10μg/ml)，立即取10μl涂氨芐青霉素平皿，以滴定噬菌體；三角瓶與37℃振蕩培養(yǎng)1小時，加入100mlSB(氨芐青霉素100μg/ml)，37℃1小時后，加入輔助噬菌體VCSM13 1ml，37℃振蕩培養(yǎng)2小時，加入卡那霉素(終濃度70μg/ml)，37℃培養(yǎng)過夜。如此反復(fù)篩選4-5次。
實(shí)例5，人IgGFab抗體可溶性表達(dá)產(chǎn)物的制備將帶有陽性抗體輕重鏈基因插入的陽性克隆擴(kuò)增后按常規(guī)方法提取質(zhì)粒DNA，用SpeI和NheI切除載體中的gIII，變FdgIII融合蛋白為獨(dú)立表達(dá)的蛋白，連接后轉(zhuǎn)化XL1-Blu菌，從過夜生長的氨芐碟子中挑取單個菌落，接種SB或TB細(xì)菌培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)菌長至OD600＝0.2-0.3，加入1mM IPTG，在30℃誘導(dǎo)表達(dá)10-12小時。收獲細(xì)菌，離心后加入原培養(yǎng)液1/10體積的PBS(0.02 M pH7.4)重懸，反復(fù)凍融三次，4℃10000rpm離心10分鐘，上清即為表達(dá)的Fab抗體。備用于進(jìn)一步的檢測和鑒定。陰性對照為載體pComb3轉(zhuǎn)化菌按同樣方法制備的細(xì)菌裂解液。
實(shí)例6，人源抗狂犬病毒中和性基因工程全抗體基因的克隆重組將通過噬菌體表面呈現(xiàn)系統(tǒng)獲得的抗狂犬病毒中和抗體Fab基因克隆入本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的桿狀病毒IgG表達(dá)載體中。其中，輕鏈基因以SacI和EcoRV克隆入pAc-L-Fc中，置于p10啟動子控制之下，獲得中間載體pAc-HA-L，重鏈Fd基因以XhoI和SpeI克隆入pAc-HA-L中，置于多角體啟動子控制之下；獲得帶有抗甲肝抗體輕，重鏈全抗體基因的表達(dá)載體pAc-HA-HL。此載體質(zhì)粒DNA經(jīng)柱層析純化后用于轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒。用重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后，獲得全人源IgG抗體的表達(dá)。
實(shí)例7人IgGFab抗體RVG10的可變區(qū)基因的核酸序列分析用Qiagen MiniprepKit(美國Qiagen)制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸序列分析。測序?yàn)樽詣訙y序。至少3個克隆被用于確定同一相同的序列。所獲序列均用DNA Strider(美國微軟公司)序列分析軟件進(jìn)行分析處理，并比較Internet網(wǎng)絡(luò)上基因庫中的IgG序列。證實(shí)人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體HAFab16基因由人IgGγ鏈Fd和λ鏈組成，其基因特征由VH和VL結(jié)構(gòu)域中的6個CDR區(qū)的特異性核甘酸序列和氨基酸構(gòu)成，序列資料如圖9，是人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列。
實(shí)例8從狂犬病毒免疫供體血液中分離淋巴細(xì)胞，用PCR技術(shù)擴(kuò)增了人源IgG Fab抗體基因，建立了噬菌體抗體基因庫，用噬菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選并從富集篩選后獲得的Fab陽性克隆中，最后選出三株陽性克隆，其中兩株為Fab抗體RVG10和RVB2，RVG10來源于純化抗原的篩選，RVB2則來源于單抗捕捉狂犬病毒抗原的篩選。將表達(dá)的菌體細(xì)胞裂解上清同時檢測其對抗人Fab抗體的結(jié)合活性及對狂犬病毒純化抗原的抗原結(jié)合活性。ELISA結(jié)果表明獲得3株單抗不僅被抗人IgGFab抗體所識別，同樣也識別結(jié)合上述純化狂犬病毒顆?？乖?。如

圖1，是人源抗狂犬病毒基因工程Fab抗體與抗人Fab抗體和純化狂犬病毒抗原ELISA結(jié)合。將單抗RVG10與已有的一株鼠源抗狂犬病毒糖蛋白中和單抗進(jìn)行了競爭，結(jié)果表明，鼠單抗可以封閉糖蛋白上G10單抗的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如圖2所示。表明這株抗體針對對狂犬病毒糖蛋白。
實(shí)例9，將RVG10株抗體Fab基克隆入全抗體表達(dá)載體pAc-K-Fc，構(gòu)建成pAC-H(κ)-G10昆蟲細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。將RVG10桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SF9細(xì)胞，5天后收獲轉(zhuǎn)染上清，細(xì)胞用FITC標(biāo)記的抗人Fab抗體和抗人IgG抗體分別檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中有Fab和IgG的表達(dá)，而空白細(xì)胞中沒有，G10表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，全抗體在細(xì)胞中得到有效表達(dá)。如圖3所示，是RVG10全抗體基因在昆蟲細(xì)胞SF9細(xì)胞中的表達(dá)。標(biāo)記抗體為抗人IgG熒光抗體。
實(shí)例10，抗體純化將收獲的上清先用0.45μm的濾膜過濾除去殘余的雜質(zhì)，用1ml純化柱(Hitrap1ml Protein G)進(jìn)行純化，并洗脫除去純化抗體中的鹽成分，然后測定純化蛋白的含量。取3-5μg的純化抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。如圖4為純化RVG10全抗體分子的蛋白電泳圖。將定量的抗體進(jìn)行親和力測定，結(jié)果表明0.4μg/ml的抗體即可結(jié)合aG株純化抗原，故所獲全抗體的親和力為2.67×10-9M。同時與鼠抗狂犬病毒糖蛋白單抗競爭結(jié)合，這種特異性結(jié)合可被鼠單抗所競爭抑制。如圖5，是RVG10全抗體與鼠抗狂犬病毒糖蛋白單抗對純化狂犬病毒抗原的競爭抑制ELISA分析。
實(shí)例11，體外中和實(shí)驗(yàn)利用G10單抗中和aG株病毒，從而使病毒不再感染細(xì)胞或感染后的癥狀減輕。固定抗體量(100μg/ml)，將病毒進(jìn)行系列對數(shù)稀釋，體外中和病毒30～60分鐘后，感染新傳代的Vero細(xì)胞(24孔板，Costar)，將細(xì)胞在33℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，一周后收獲感染后的細(xì)胞上清，換成維持液，并繼續(xù)培養(yǎng)觀察。病毒感染細(xì)胞三周后，觀察細(xì)胞的形態(tài)，同時收獲感染的病毒上清，細(xì)胞用熒光法檢測狂犬病毒感染狀況。如圖6所示，是狂犬病毒感染的Vero細(xì)胞病變。與未能中和病毒感染的對照抗體100 IgG相比(圖上方)，被RGV10中和抗體中和的病毒感染的細(xì)胞出現(xiàn)圓縮，折光率變差，顆粒增多，細(xì)胞脫落，并且細(xì)胞間出現(xiàn)明顯拉網(wǎng)(圖下方)。
實(shí)例12，為進(jìn)一步鑒定狂犬病毒的中和狀況，我們將兩次收獲的上清注射11～13g無菌小白鼠(檢定所提供)，30μl/只，最后用熒光法檢測感染細(xì)胞，同時檢測上清和細(xì)胞中的病毒。如圖表7所示，用感染7天后的細(xì)胞上清注射鼠腦，被G10中和后的病毒(10-1)上清注射的小鼠100％存活，而無關(guān)單抗中和的對照卻無一存活。而在21天后的上清中(7天時細(xì)胞換成維持液)，被G10中和的(10-1)的病毒上清注射的小鼠存活率為1/3，這一結(jié)果表明，病毒并沒有完全被中和，而是有少量病毒存在，經(jīng)過一段時間后，病毒又有擴(kuò)增。
為進(jìn)一步確定中和aG株病毒所需要的抗體量，我們又通過固定病毒，稀釋抗體的方法將上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)了一次，病毒感染細(xì)胞兩天后，換成維持液，33℃、為進(jìn)一步確定中和aG株病毒所需要的抗體量，我們又通過固定病毒，稀釋抗體的方法將上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)了一次，病毒感染細(xì)胞兩天后，換成維持液，33℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)7天后，收獲培養(yǎng)上清，鼠腦接種檢測上清中的病毒，同時用熒光法檢測細(xì)胞中的病毒，結(jié)果如圖表8，RVG10抗體在6ug/ml濃度下仍然可以中和狂犬病毒感染，證實(shí)RVG10是一株親和力較高的中和抗體。
權(quán)利要求
1.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10，包括Fab抗體和IgG全抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用。其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核和真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合狂犬病毒的功能性中和抗體。
2.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10，其主要特征在于抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)域(Complementarity-Determining Regions，CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列決定的，其相應(yīng)的氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，如摘要附圖。
3.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10，其主要基因特征在于特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來源于對人源抗狂犬病毒抗體基因庫的特異性富積篩選表達(dá)，其輕鏈(VL)和重鏈各自相應(yīng)的三個CDR區(qū)序列為本抗體特有的全新序列。重鏈(VH)三個CDR區(qū)的氨基酸序列包括CDR1為GGSITSHHYWS；CDR2為YHSGTTNYNPSLKSRV；CDR3為VRVTTGAFNL。輕鏈(VL)三個CDR區(qū)的氨基酸序列包括CDR1為RASQSVSSNLA；CDR2為ASTRAA；CDR3為QQYNTWPPYT。
4.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10Fab抗體，其特征在于為一種在原核細(xì)胞中獲得穩(wěn)定有效表達(dá)的基因重組的人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程單克隆抗體Fab抗體，由重鏈Fd和Kappa鏈組成。
5.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10IgG全抗體，其特征在于由全長IgG1重鏈基因和全長lambda鏈輕鏈組成，其輕重鏈先導(dǎo)序列和重鏈Fc基因來源于載體pAc-L-Fc，已在專利申請?zhí)枮?0105698.0的專利申請中陳述。在輕鏈基因先導(dǎo)序列和VL基因之間含有SacI酶切點(diǎn)；在重鏈基因先導(dǎo)序列和VH基因之間含有XhoI酶切點(diǎn)；在重鏈Fd基因和Fc基因之間含有SpeI酶切點(diǎn)。
6.人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體RVG10，其主要功能特征在于特異性識別狂犬病毒糖蛋白蛋白，具有抗狂犬病毒感染的中和活性功能。
7.根據(jù)上述6條權(quán)利要求，人源抗甲肝病毒中和性基因工程Fab抗體的用途，其特征在于利用上述獲得的中和性抗體可變區(qū)，F(xiàn)ab或全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組病毒系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)此抗體基因或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有此抗體基因任何其他基因，獲得具有中和狂犬病毒感染的抗體產(chǎn)物，其基因表達(dá)產(chǎn)物可望在臨床上用于預(yù)防和治療由狂犬病毒引起的狂犬病。
8.根據(jù)權(quán)利要求2和3，人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)發(fā)表的抗狂犬病毒中和抗體RVG10的可變區(qū)中的CDR區(qū)特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外人工合成與此相同的抗體輕重鏈6個CDR區(qū)的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗狂犬病毒糖蛋白的中和抗體或相關(guān)蛋白或多肽產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求2，3和5，人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體基因的用途，其特征在于根據(jù)權(quán)利要求2，3中所述的CDR區(qū)氨基酸序列為本抗體專有的抗體序列，任何新的工程抗體可變區(qū)基因或相關(guān)產(chǎn)物基因不應(yīng)含有與上述任何兩種CDR區(qū)序列完全相同或僅1-2個氨基酸差易的序列。任何新的工程抗體全抗體基因不應(yīng)含有權(quán)利要求5中所述的特征。
全文摘要
人源抗狂犬病毒中和性基因工程抗體,命名RVG10,包括Fab段和IgG全抗體基因、基因產(chǎn)物及其應(yīng)用。其主要特征在于此重組抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的并在原核和真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合狂犬病毒的功能性中和抗體。其今后的可能用途在于利用此中和抗體CDR區(qū)或部分或全基因,可在原核、孝母、昆蟲和真核細(xì)胞及任何表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)此抗體,可在臨床上預(yù)防或治療狂犬病。
文檔編號A61K39/395GK1355253SQ00132570
公開日2002年6月26日 申請日期2000年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月29日
發(fā)明者梁米芳, 候云德, 張世珍 申請人:中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所