亨德拉和尼帕病毒g糖蛋白免疫原性組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了針對亨德拉（Hendra）和/或尼帕（Nipah）病毒的免疫原性組合物及其使用方法。此外，提供了用本發(fā)明的免疫原性組合物疫苗接種過的對象和被亨德拉和/或尼帕病毒感染的對象的辨別方法。
【專利說明】亨德拉和尼帕病毒G糖蛋白免疫原性組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及包含來自于亨德拉病毒（HeV)和/或尼帕病毒（NiV)的G糖蛋白的免 疫原性和疫苗組合物，以及與其相關(guān)的使用方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 最近，引起大量人類死亡的NiV的反復爆發(fā)造成問題(參見例如Butler (2000) Nature429, 7)。也已知HeV在人類和動物中造成死亡，并且它在遺傳和免疫原性上與 NiV密切相關(guān)。目前尚不存在用于預(yù)防由尼帕病毒或亨德拉病毒引起的感染或疾病的 疫苗或療法。尼帕病毒和亨德拉病毒兩者都是美國國家過敏和傳染病研究所（United States, National Institute of Allergy and Infectious Disease)C 類優(yōu)先生物防御關(guān) 注試劑。此外，由于這些病毒是人畜共患生物安全4級試劑（BSL-4)，因此安全地生產(chǎn)疫苗 和/或診斷劑是非常高成本且困難的。因此，對于允許疫苗和/或診斷劑的高通量生產(chǎn)的 尼帕病毒或亨德拉病毒疫苗或診斷劑，存在著需求。
[0003] 副黏病毒例如HeV和NiV在病毒粒子的包膜中具有兩種主要的膜錨定的糖蛋 白。一種糖蛋白為毒粒附著于宿主細胞上的受體所需，并被稱為血凝素-神經(jīng)氨酸苷酶蛋 白（HN)或血凝素蛋白（H)，另一種是糖蛋白（G)，其既沒有血凝反應(yīng)也沒有神經(jīng)氨酸苷酶活 性。附著糖蛋白是II型膜蛋白，其中分子的氨基（N)端朝向胞質(zhì)，蛋白的羧基（C)端在細 胞外。另一種主要糖蛋白是融合（F)糖蛋白，其是三聚體I類融合包膜糖蛋白，含有兩個七 肽重復（HR)區(qū)和疏水的融合肽。HeV和NiV通過它們的附著G糖蛋白和F糖蛋白在受體 結(jié)合后的協(xié)同作用，通過不依賴于PH的膜融合過程進入受體宿主細胞中以感染細胞。HeV 和NiV附著G糖蛋白的主要功能是嚙合宿主細胞表面上的適合受體，所述受體對于大多數(shù) 清楚表征的副黏病毒來說是唾液酸組成部分。HeV和NiV G糖蛋白利用宿主細胞的蛋白 受體肝配蛋白B2和/或肝配蛋白B3,并且已開發(fā)出阻斷通過G糖蛋白的病毒吸附的抗體 (W02006137931, Bishop (2008) J. Viroh 82:11398-11409)。此外，已開發(fā)出使用 G 糖蛋白 作為產(chǎn)生針對HeV和NiV感染的免疫保護性應(yīng)答的手段的疫苗（W02009117035)。
[0004] 對于Quil A在疫苗制劑中的獸藥用途和人類用途來說，劑量-位點反應(yīng)性是主 要顧慮。避免Quil A的這種毒性的一種方式是使用免疫刺激性復合物（Rajput (2007) J. Zhejiang Univ. Sci. B, 8:53-161)。這主要是由于Quil A在摻入到免疫刺激性復合物中 時反應(yīng)性降低，這是因為它與復合物中的膽固醇的結(jié)合降低了它從細胞膜提取膽固醇的能 力，因此降低了它的細胞裂解效應(yīng)。此外，為了產(chǎn)生相同水平的佐劑效應(yīng)，需要的Quil A量 更少。Qui I A皂角苷的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)以及當這些皂角苷被摻入到免疫刺激復合物中時產(chǎn)生 的其他益處，已描述在W02000041720中。
[0005] HeV和/或NiV G糖蛋白與免疫刺激復合物在單一疫苗中的組合，由于這些組分聯(lián) 合給藥時提高免疫反應(yīng)性和降低佐劑副作用的潛力，代表了在開發(fā)有效的HeV和NiV疫苗 中的進步。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 本發(fā)明涵蓋一種免疫原性組合物，其包含亨德拉和/或尼帕病毒G蛋白、免疫刺激 復合物（ISC)和一種或多種賦形劑，其量能夠在給藥于對象后，有效地引發(fā)針對亨德拉和/ 或尼帕病毒的中和抗體的產(chǎn)生。在某些實施方式中，所述免疫原性組合物包含皂角苷、磷脂 和類固醇。
[0008] 在某些實施方式中，可溶性亨德拉病毒G糖蛋白由天然亨德拉病毒G糖蛋白（SEQ ID NO :2)的73至604位氨基酸構(gòu)成。在某些實施方式中，所述可溶性亨德拉病毒G糖蛋 白由包含SEQ ID NO: 16的64至1662位核苷酸的核苷酸序列編碼。在某些實施方式中，所 述可溶性亨德拉病毒G糖蛋白以二聚體形式存在，其中每個可溶性亨德拉病毒G糖蛋白二 聚體的亞基通過一個或多個二硫鍵相連。在某些實施方式中，所述可溶性亨德拉病毒G糖 蛋白以四聚體形式存在。在某些實施方式中，所述四聚體形式作為非共價連接的和/或通 過一個或多個二硫鍵相連的二聚體的二聚體存在。在所述免疫原性組合物中，可溶性亨德 拉病毒G糖蛋白的濃度可以為約5至100 μ g/ml。
[0009] 在某些實施方式中，所述阜角苷從南美石堿木（Quillaja saponaria Molina)分 離，并且可以選自QH-A、QH-B、QH-C或QS21。在某些實施方式中，所述磷脂選自磷脂酰膽堿 (PC )、二棕櫚?；字Ｄ憠A（DPPC )、磷脂酸(磷脂酸鹽）（PA )、磷脂酰乙醇胺（PE )、磷脂酰 絲氨酸（PS)、磷脂酰肌醇（PI)、磷脂酰肌醇磷酸（PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2)、磷脂酰 肌醇三磷酸（PIP3)、磷酸膽堿（SPH)、神經(jīng)酰胺磷酸乙醇胺（Cer-PE)和神經(jīng)酰胺磷酸甘油。 在某些實施方式中，所述皂角苷是Quil A，所述磷脂是DPPC，并且所述類固醇是膽固醇，并 且所述組合物中Quil A :DPPC :膽固醇的比例以重量計為5 :1 :1。
[0010] 本發(fā)明還涵蓋了在對象中產(chǎn)生針對亨德拉和/或尼帕病毒的中和抗體應(yīng)答的方 法，所述方法包括以有效產(chǎn)生所述中和抗體應(yīng)答的量和持續(xù)時間向所述對象給藥本文中所 描述的免疫原性組合物。在某些實施方式中，所述中和抗體應(yīng)答減少亨德拉和/或尼帕病 毒在所述對象中的繁殖，并且也可以減少亨德拉和/或尼帕病毒在所述對象中的釋放。在 某些實施方式中，所述對象已暴露于亨德拉和/或尼帕病毒，而在其他實施方式中，所述對 象正患有亨德拉和/或尼帕病毒感染。在某些實施方式中，本發(fā)明涵蓋了在對象中產(chǎn)生針 對亨德拉病毒的中和抗體應(yīng)答的方法，所述方法包括以有效產(chǎn)生所述中和抗體應(yīng)答的量和 持續(xù)時間向所述對象給藥本文中所描述的免疫原性組合物。在某些實施方式中，本發(fā)明涵 蓋了在對象中產(chǎn)生針對尼帕病毒的中和抗體應(yīng)答的方法，所述方法包括以有效產(chǎn)生所述中 和抗體應(yīng)答的量和持續(xù)時間向所述對象給藥本文中所描述的免疫原性組合物。
[0011] 在某些實施方式中，所述免疫原性組合物肌肉內(nèi)給藥。在某些實施方式中，所述免 疫原性組合物以多劑量給藥，并且在第一劑量后給藥第二劑量，所述第二劑量在所述第一 劑量后至少約21天至約28天。在某些實施方式中，每劑量含有約50或約100 μ g可溶性 予德拉病毒G糖蛋白。
[0012] 本發(fā)明還涵蓋了區(qū)分用本文中所描述的免疫原性組合物疫苗接種過的對象與暴 露于亨德拉和/或尼帕病毒的對象的方法，所述方法包括在從所述對象分離的生物樣品 中，檢測針對至少一種選自下列HeV和/或NiV病毒蛋白中的任一種的抗體的存在：融合蛋 白（F)，基質(zhì)蛋白（M)，磷蛋白（P)，大蛋白（L)和核衣殼蛋白（N)。
[0013] 本發(fā)明的免疫原性組合物和方法可以被施用于例如人類、馬、牛、綿羊、豬、山羊、 雞、狗或貓的對象。
[0014] 本發(fā)明還涵蓋在人類對象中產(chǎn)生針對亨德拉和/或尼帕病毒的中和抗體應(yīng)答的 方法，所述方法包括以有效產(chǎn)生所述中和抗體應(yīng)答的量和持續(xù)時間，向所述對象給藥包含 亨德拉病毒可溶性G糖蛋白的免疫原性組合物。在某些實施方式中，所述免疫原性組合物 還包含佐劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1示出了用50或IOOyg/劑量的重組亨德拉病毒可溶性糖蛋白（sG)和250 μ g 作為佐劑的免疫刺激復合物給藥，隨后在第0天暴露于活的亨德拉病毒的馬的直腸溫度隨 時間的變化。
[0016] 圖2示出了用50或100 μ g/劑量的重組亨德拉病毒可溶性糖蛋白（sG)和250 μ g 作為佐劑的免疫刺激復合物給藥，隨后在第〇天暴露于活的亨德拉病毒的馬的心率隨時間 的變化。
[0017] 圖3示出了免疫刺激復合物的制備示意圖。
[0018] 圖4示出了 sGHeV疫苗接種和NiV激惹時間表的示意圖。sGHeV疫苗接種、NiV激 惹和安樂死的日期用箭頭指示。正如標出的（*)，在激惹后第_42、_7、0、3、5、7、10、14、21和 28天收集血液和拭子樣本。灰色文本表示激惹時間線(上排）；黑色文本表示疫苗接種時間 線(下排)。示出了每個疫苗劑量組中對象非洲綠猴(AGM)的數(shù)量和一個對照對象。
[0019] 圖5示出了 NiV感染的對象的存活曲線。使用來自于對照對象（n=2)和sGHeV疫 苗接種過的對象（n=9)的數(shù)據(jù)來產(chǎn)生Kaplan-Meier存活曲線。對照包括來自于一個其他 歷史對照對象的數(shù)據(jù)。疫苗接種的對象接受皮下給藥10 μ g、50 μ g或100 μ g的sGHeV兩 次。在對照對象中到達疾病末期的平均時間是11天，而所有疫苗接種過的對象存活到研究 結(jié)束時的安樂死。
[0020] 圖6示出了疫苗接種過的對象中的NiV-和HeV-特異性免疫球蛋白（Ig)。從疫苗 接種過的對象收集血清和鼻拭子，并使用sGHeV和sGNiV多路微球測定法評估IgG、IgA和 IgM應(yīng)答。單個地測定來自于同一疫苗劑量組中的對象（n=3)的血清或拭子，并計算微球中 值熒光強度（M.F.I.)的平均值，其示出在Y-軸上。誤差線表示平均值的標準誤差。血清 sG-特異性Ig用黑色符號顯示（sGHeV (空心三角形)、sGNiV (實心三角形)），粘膜sG-特異 性IgA用灰色符號顯示（sGHeV (空心三角形），sGNiV (實心三角形)）。
[0021] 發(fā)明描述
[0022] 疫苗和免疫原性組合物
[0023] 本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物在已給藥所述組合物的對象中誘導許多體液免 疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答中的至少一種，或有效地增強針對至少一種HeV和/或NiV毒株的 至少一種免疫應(yīng)答，使得所述給藥適合于疫苗接種目的和/或預(yù)防由一種或多種HeV和/ 或NiV毒株引起的HeV和/或NiV感染。本發(fā)明的組合物向需要的對象遞送來自于HeV和 /或NiV的G糖蛋白、包括可溶性G糖蛋白，以及起到佐劑作用的免疫刺激復合物（ISC)。 在某些實施方式中，G糖蛋白的量包括但不限于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、 150、200 或 250μ g/ml，其還可以包含 100、125、150、175、200、225、250、275 或 300μ g/ml 的 ISC。在某些實施方式中，G糖蛋白的量為5、50或100 μ g/ml，ISC的量為250 μ g/ml。
[0024] A. HeV 和 NiV G 蛋白
[0025] 在某些實施方式中，疫苗和免疫原性組合物包含本文中描述的一種或多種HeV和 /或NiV G糖蛋白。術(shù)語蛋白在本文中被廣義使用，包括多肽或其片段。例如但不是限制性 的，HeV G糖蛋白可以采取可溶性形式，并包含Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979 (也參 見Yu (1998) Virology251，227-233)中HeV G糖蛋白的氨基酸序列的73-604位氨基酸。 此外，例如但不是限制性的，NiV G糖蛋白可以采取可溶性形式，并且包含Harcourt (2000) Virology271:334-349, 2000 (也參見 Chua (2000) Science, 288, 1432-1)中 NiV G 糖蛋白 的氨基酸序列的71-602位氨基酸。
[0026] 一般來說，HeV和NiV G糖蛋白的可溶性形式包含HeV或NiV的G糖蛋白的全部或 一部分胞外結(jié)構(gòu)域(例如細胞外的)，并且一般通過缺失G糖蛋白的全部或一部分跨膜結(jié)構(gòu) 域或G糖蛋白的全部或一部分細胞質(zhì)尾區(qū)來產(chǎn)生。例如，可溶性G糖蛋白可以包含HeV或 NiVG糖蛋白的完整胞外結(jié)構(gòu)域。此外，例如但不是限制性的，可溶性G糖蛋白可以包含HeV 或NiV G糖蛋白的全部或一部分胞外結(jié)構(gòu)域和部分跨膜結(jié)構(gòu)域。
[0027] 本發(fā)明的可溶性HeV或NiV G糖蛋白一般保留相應(yīng)的天然病毒糖蛋白的一種或多 種特性，例如與病毒宿主細胞受體相互作用或結(jié)合的能力，可以以寡聚體形式生產(chǎn)，或者引 發(fā)能夠識別天然G糖蛋白的抗體(包括但不限于病毒中和抗體)的能力。其他特性的實例包 括但不限于阻斷或阻止宿主細胞感染的能力?？梢允褂贸Ｒ?guī)方法來評估可溶性HeV或NiV G糖蛋白的一種或多種特性。
[0028] 例如但不是限制性的，編碼可溶性HeV G糖蛋白的多核苷酸，可以包含編碼Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979 中 HeV G 糖蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO :2)的 73-604 位 附近氨基酸的多核苷酸序列。此外，例如但不是限制性的，編碼可溶性HeV G糖蛋白的多 核苷酸，可以包含Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979中HeV G糖蛋白的多核苷酸序列的 9129至10727位核苷酸。此外，也可以使用編碼HeV G糖蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)的73-604位附近氨基酸的、密碼子優(yōu)化過的多核苷酸序列。在某些實施方式中，這些密 碼子優(yōu)化過的序列包含SEQ ID NO : 16的64至1662位核苷酸或由其構(gòu)成。在其他實施方 式中，所述密碼子優(yōu)化過的序列包含SEQ ID NO :16,或由其構(gòu)成，SEQ ID NO :16包括編碼 IgK前導序列的核苷酸。
[0029] 例如但不是限制性的，NiV G糖蛋白可以采取可溶形式，并包含Harcourt (2000) Virology271，334-349中NiV G糖蛋白的氨基酸序列的71-602位氨基酸?？捎糜跇?gòu)建可 溶性NiV G糖蛋白的序列的非限制性實例，可以在Harcourt (2000)Virology271, 334-349 中找到?？偟膩碚f，可以使用來自于任何尼帕病毒分離株或毒株的G糖蛋白序列來產(chǎn)生本 發(fā)明的多核苷酸和多肽。
[0030] 例如但不是限制性的，編碼可溶性NiV G糖蛋白的多核苷酸，可以包含編碼 Harcourt (2000)Virology271, 334-349中NiV G糖蛋白的氨基酸序列的71-602位附近氨 基酸的多核苷酸序列。此外，例如但不是限制性的，編碼可溶性NiV G糖蛋白的多核苷酸可 以包含 Harcourt (2000)Virology271, 334-349 中 NiV G 糖蛋白的多核苷酸序列（SEQ ID NO :4)的234-2042位。此外，也可以使用編碼NiV G糖蛋白的氨基酸序列的71-602位附 近氨基酸的、密碼子優(yōu)化過的多核苷酸序列。
[0031] 在本發(fā)明的免疫原性和疫苗組合物中可以使用這些G糖蛋白的功能等同物。例如 但不是限制性的，功能上等同的多肽具有一種或多種下列特性：能夠與病毒宿主細胞受體 相互作用或結(jié)合的能力，能夠以二聚體或四聚體形式生產(chǎn)，引發(fā)能夠識別天然G糖蛋白的 抗體(包括但不限于HeV和/或NiV病毒中和抗體)的能力和/或阻斷或阻止宿主細胞感染 的能力。
[0032] 在某些實施方式中，G糖蛋白可以采取二聚體和/或四聚體形式。這樣的二聚體 依賴于在G糖蛋白中的半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵的形成。這樣的二硫鍵可以與當在 HeV或NiV表面中表達時天然G糖蛋白中形成的二硫鍵相對應(yīng)(例如半胱氨酸的位置保持不 變)，或者所述二硫鍵在G糖蛋白中的存在或位置(例如通過改變氨基酸序列中半胱氨酸的 位置)可以被改變，以便形成抗原性增強的不同的G糖蛋白二聚體和/或四聚體形式。此外， 非二聚體化和四聚體化的形式也在本發(fā)明之內(nèi)，同樣還考慮到G糖蛋白存在大量構(gòu)象依賴 性表位（即由三級三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的)，并且為了提供中和抗體應(yīng)答，保留大量這樣的天然表 位是高度優(yōu)選的。
[0033] 本發(fā)明的HeV免疫原性和疫苗組合物可以含有長度可變但包括SEQ ID NO :2的73 至604位氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的包膜蛋白與SEQ ID NO :2的HeV糖蛋白（包括73至604位氨基酸）具有至少約85、90、91、92、93、94、95、96、97、 98或99%的同一性。因此，本發(fā)明的HeV G糖蛋白包含天然HeVG糖蛋白的具有足以產(chǎn)生 構(gòu)象表位的數(shù)量的氨基酸的免疫原性片段。免疫原性片段的非限制性實例包括長度可以為 至少530、531、532、533、534或535個或更多個氨基酸的氨基酸序列。在某些實施方式中， HeVG糖蛋白包含SEQ ID NO :2或由其構(gòu)成，或者包含進一步包含Ig κ前導序列（SEQ ID NO : 15)的合成構(gòu)建物或由其構(gòu)成。
[0034] 本發(fā)明的NiV免疫原性和疫苗組合物可以含有長度可變但包括SEQ ID NO :4的71 至602位氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一種實施方式中，本發(fā)明的包膜蛋白與SEQ ID NO :4的NiV糖蛋白（包括71至602位氨基酸）具有至少約85、90、91、92、93、94、95、96、97、 98或99%的同一性。因此，本發(fā)明的NiV G糖蛋白包含天然NiVG糖蛋白的具有足以產(chǎn)生 構(gòu)象表位的數(shù)量的氨基酸的免疫原性片段。免疫原性片段的非限制性實例包括長度可以為 至少528、529、530、531、532或533個或更多個氨基酸的氨基酸序列。在某些實施方式中， NiVG糖蛋白包含SEQ ID NO :4或由其構(gòu)成，或者包含進一步包含前導序列的合成構(gòu)建物或 由其構(gòu)成。
[0035] 本文中描述的免疫原性片段含有至少一個抗原表位并表現(xiàn)出HeV和/或NiV抗原 性，并且當出現(xiàn)在適合的構(gòu)建物中，例如當與其他HeV和/或NiV抗原融合或存在于載體上 時，能夠引起免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答針對天然抗原。在本發(fā)明的一種實施方式中，免疫原 性片段含有來自于HeV和/或NiV抗原的至少20個連續(xù)氨基酸，例如來自于HeV和/或 NiV抗原的的至少50、75或100個連續(xù)氨基酸。
[0036] HeV和NiV G糖蛋白的實施方式還包括分離的多肽，其包含與天然HeV或NiV G糖 蛋白具有至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的同一性的氨基酸序列，其中 所述多肽序列可以與天然HeV或NiV G糖蛋白的氨基酸序列相同，或者與天然HeV或NiVG 蛋白的氨基酸序列相比可以包括或多達一定整數(shù)的氨基酸改變，其中所述改變選自至少一 個氨基酸缺失、替換包括保守和非保守替換、或插入，并且其中所述改變可以發(fā)生在參比多 肽序列的氨基或羧基端位置或那些末端位置之間的任何位置處，單個地散布在參比序列中 的氨基酸之間，或作為一個或多個連續(xù)組散布在天然HeV或NiV G糖蛋白氨基酸序列內(nèi)。
[0037] 在氨基酸序列水平上的序列同一性或同源性，可以使用被定制用于序列相似性搜 索的程序 blastp、blastn、blastx、tblastn 和 tblastx (Altschul (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 和 Karlin (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA87, 2264-2268)所采用的算 法，通過BLAST (基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool))分析來 確定。BLAST程序使用的方法是首先考慮查詢序列與數(shù)據(jù)庫序列之間的帶有間隙(不連續(xù)） 和不帶間隙(連續(xù)）的相似區(qū)段，然后評估鑒定到的所有匹配的統(tǒng)計學顯著性，最后僅僅總 結(jié)那些滿足預(yù)先選擇的顯著性閾值的匹配。對于序列數(shù)據(jù)庫的相似性搜索的基本問題的討 論，參見Altschul (1994)Nature Genetics6，119_129。用于柱狀圖、描述、比對、預(yù)期（即 用于報告針對數(shù)據(jù)庫序列的匹配的統(tǒng)計學顯著性閾值)、截止值、矩陣和過濾器(低復雜度） 的搜索參數(shù)，為缺省設(shè)定。Blastp、blastx、tblastn和tblastx所使用的缺省評分矩陣是 BL0SUM62 矩陣（Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89, 10915-10919)，其被推薦用 于長度超過85個氨基酸的查詢序列。
[0038] 本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物還可以包含來自于不同毒株的其他HeV和/或 NiV G蛋白，其可以進一步增強本發(fā)明的免疫接種方法的效能。
[0039] B.免疫刺激復合物
[0040] 總的來說，本發(fā)明提供了包含可溶形式的HeV和/或NiV G糖蛋白包膜蛋白與免 疫刺激復合物（ISC)的組合的免疫原性組合物、包括疫苗組合物，并涉及使用這些組合物在 對象中預(yù)防和治療HeV和/或NiV感染的方法。在本發(fā)明中，疫苗和/或免疫原性組合物 包含起到佐劑作用的免疫刺激復合物。當在本文中使用時，"佐劑"是指盡管本身沒有任何 特異性抗原性效應(yīng)，但可以刺激免疫系統(tǒng)，提高對抗原的應(yīng)答的試劑。
[0041] ISC具有許多使其成為某些應(yīng)用的理想佐劑的特點：
[0042] 抗原節(jié)?。篒H如在例如 Wee (2008) Mucosal Immunol. 1，489-496 中注意到的，在 抗原可獲得性受限或抗原成本高的情形中，已顯示ISC允許將抗原節(jié)省多達10至100倍。 這最可能是因為與其他佐劑相比更高的效率或更適合的作用機制的組合。
[0043] 奪叉旱遞:正如在例如 Schnurr (2009) J. Immunol. 182, 1253-1259 中注意到的， 由抗原呈遞細胞（APC)進行的抗原呈遞通常遵從兩條途徑之一。外來抗原通常被APC吞 食，然后在II類主要組織相容性復合體（MHC)分子的背景中被加工并重新表達在APC表面 上。然后它們能夠被淋巴細胞發(fā)現(xiàn)，并且如果存在正確的輔助刺激因子/信號，能夠視情況 而定產(chǎn)生對其做出的應(yīng)答。自身或癌抗原和病毒抗原通常在I類分子的背景中被加工和表 達，因為它們存在于APC的細胞質(zhì)中。對癌癥和病毒抗原的有效免疫需要進入I類途徑。這 在病毒感染或細胞穩(wěn)態(tài)（內(nèi)部抗原的細胞周轉(zhuǎn)）期間自然地發(fā)生。作為疫苗導入的抗原(病 毒或自身抗原)需要找到從細胞外部通往細胞的抗原加工機構(gòu)的道路和II類途徑中通往I 類途徑的入口。這可以在樹突狀細胞（DC--特化的APC)中自然發(fā)生，或者可以通過用與 佐劑ISC混合的抗原進行疫苗接種來實現(xiàn)。這種外部來源的抗體找到其進入抗原呈遞的I 類途徑的道路的過程，被稱為交叉呈遞。ISC實現(xiàn)抗原的交叉呈遞的準確機制尚未被完全闡 明，但是可能依賴于ISC組分的膜擾亂。
[0044] 體液應(yīng)答和細胞介導的應(yīng)答：IH如在例如Maraskovsky (2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376中提到的，利用ISC的作用機制，使適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的體液和細胞兩條支 路接合。在某些物種中，這與使用這種佐劑的疫苗接種所刺激的細胞因子分布情況并行。1 型免疫應(yīng)答的特征在于白介素-2和IFN-γ的表達和針對細胞內(nèi)病原體(細菌、原生動物和 病毒）的保護，2型應(yīng)答的特征在于白介素-4的表達和用于抗毒素和抗病原體相關(guān)免疫的 中和抗體的產(chǎn)生。ISC在這兩個極端之間提供了平衡的細胞因子分布情況，允許更加廣泛的 免疫應(yīng)答。此外，許多研究顯示，如果疫苗通過鼻內(nèi)遞送，ISC可能是有效的。這允許使粘 膜表面敏化，從而在病原體進入的位點處提供了在這種情況下(粘膜免疫）特別相關(guān)的相關(guān) 免疫，也參見 Sjiilander (2001) Vaccinel9, 4072-4080。
[0045] 可無菌討濾目.一致的制誥標準:ISC粒子的尺寸一般為直徑40nm，使其可以通過 晚些時候在配制中用于對制劑進行除菌的濾器。此外，在Quil A中發(fā)現(xiàn)的三萜類皂角苷與 膽固醇和磷脂結(jié)合的天然趨勢，已被利用在開發(fā)ISC的制造方法中。不形成ISC粒子的Quil A物質(zhì)從最終產(chǎn)品中被透析掉。通過控制組分的比例，從不均勻Quil A皂角苷譜產(chǎn)生一致 的產(chǎn)品。該比例是重要的，因為偏差會產(chǎn)生非特征性40nm粒子的結(jié)構(gòu)(螺旋、片層等)。ISC 膠體自由流動的本性及其可被透射電子顯微術(shù)、HPLC和其他技術(shù)進行測量的能力，使得這 種佐劑適合于釋放測定法和其他質(zhì)量測定法的開發(fā)。
[0046] 因此，根據(jù)上述，在某些實施方式中，免疫刺激復合物與最適量G糖蛋白的制劑包 括皂角苷、磷脂和類固醇分子。在某些實施方式中，皂角苷、磷脂、類固醇分子的摩爾比為5 : 1 :1的比例。免疫刺激復合物可以含有例如5至10重量％的皂角苷、1至5%的類固醇分子 和磷脂，其余部分包含G糖蛋白。G糖蛋白可以直接地，或者通過化學偶聯(lián)于載體蛋白（例 如嵌合或融合蛋白）并在將蛋白摻入到免疫刺激復合物中之后，摻入到免疫刺激復合物中。 對免疫刺激復合物的指稱應(yīng)該被理解為包括對其衍生物、化學等同物和類似物的指稱。在 某些實施方式中，將ISC與HeV和/或NiV G糖蛋白分開進行混合，然后將G糖蛋白與ISC 混合。在某些實施方式中，將G糖蛋白與皂角苷、磷脂和類固醇分子直接混合。
[0047] 在某些實施方式中，在本發(fā)明中使用的皂角苷是Quil A和/或其衍生物。Quil A是從南美樹木石堿木（Quillaja saponaria Molina)分離的阜角苷制備物，并且首先 被 Dalsgaard (1974) "阜角苷佐劑"（Saponin adjuvants)，Archiv. fiir die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, ρρ· 243-254描述為具有佐劑活性。已通過HPLC 分離到Quil A的保留佐劑活性而沒有與Quil A相關(guān)的毒性的純化片段（ΕΡ0362278)，例 如QS7和QS21 (也稱為QA7和QA21)。QS21是源自于南美石堿木的樹皮的天然皂角苷，其 誘導⑶8+細胞毒性T細胞（CTL)、Thl細胞和顯著的IgG2a抗體應(yīng)答，并且是在本發(fā)明的 情形中使用的皂角苷。適合在ISC中使用的其他皂角苷包括但不限于Quil A的次級級分 QH-A、QH-B和QH-C，來自于皂皮樹（Quillaja saponaria)之外的物種的皂角苷，例如來自 于人參屬（Panax)(人參)、黃苗屬（Astragalus)、牛膝屬（Achyranthes)、大豆屬、金合歡屬 (Acacia)和黨參屬（Codonopsis)的物種。在某些實施方式中，阜角苷從阜皮樹之外的物種 分離。
[0048] 在本發(fā)明的免疫原性和疫苗組合物中使用的磷脂的非限制性實例，包括具有二酰 基甘油酯結(jié)構(gòu)的分子和鞘磷脂類。具有二?；视王ソY(jié)構(gòu)的磷脂的非限制性實例包括磷脂 酸(磷脂酸鹽）（PA )、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂）（PE )、磷脂酰膽堿(卵磷脂）（PC )、二棕櫚?；?脂酰膽堿（DPPC)或磷脂酰絲氨酸（PS)。具有二?；视王ソY(jié)構(gòu)的磷脂的其他非限制性實 例包括磷酸肌醇類。示例性的磷酸肌醇類包括但不限于磷脂酰肌醇（PI )、磷脂酰肌醇磷酸 (PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2)或磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3)。鞘磷脂類的非限制性實例 包括神經(jīng)酰胺磷酸膽堿(神經(jīng)鞘磷脂）（SPH)、神經(jīng)酰胺磷酸乙醇胺(神經(jīng)鞘磷脂）（Cer-PE) 或神經(jīng)酰胺磷酸甘油。
[0049] 在本發(fā)明的免疫原性和疫苗組合物中使用的類固醇分子，包括包含類固醇作為其 結(jié)構(gòu)的一部分的分子。類固醇分子的非限制性實例包括膽固醇、孕烯醇酮、17-α-羥基孕烯 醇酮、脫氫表雄酮、雄烯二醇、孕酮、17-α-羥基孕酮、雄烯二酮、睪酮、二羥基睪酮、去氧皮 質(zhì)甾酮、11-去氧皮質(zhì)留酮、皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、醛留酮、雌酮、雌二醇或雌三醇。
[0050] 在某些實施方式中，免疫刺激復合物通常但不限于是直徑30-40nm的小籠狀結(jié) 構(gòu)。在某些實施方式中，免疫刺激復合物的形成具有比例為5 :1 :1的Quil A、膽固醇、磷脂 酰膽堿和G糖蛋白的摩爾比。例如，免疫刺激復合物可以含有5至10重量％的Quil AU 至5%的膽固醇和磷脂，其余部分包含G糖蛋白。G糖蛋白可以直接地，或者通過偶聯(lián)于載體 蛋白（例如嵌合或融合蛋白）并在將蛋白摻入到免疫刺激復合物中之后，摻入到免疫刺激復 合物中。對免疫刺激復合物的指稱應(yīng)該被理解為包括對其衍生物、化學等同物和類似物的 指稱。例如，對免疫刺激復合物的衍生物的指稱，包括對如下免疫刺激復合物的指稱：所述 免疫刺激復合物中，QuiI A、膽固醇、磷脂酰膽堿或蛋白中的一種或多種被例如刪除、替換， 或者向所述復合物中添加除Quil A、膽固醇、磷脂酰膽堿或蛋白之外的組分。免疫刺激復合 物的功能等同物，可以是其中四種組分中的一種或多種被功能等同物代替的免疫刺激復合 物。在本發(fā)明的某些實施方式中，免疫刺激復合物的G糖蛋白組分被刪除。這種類型的免 疫刺激復合物在本文中被稱為無蛋白免疫刺激復合物。
[0051] 在某些實施方式中，本發(fā)明包括但不限于下述免疫原性組合物，其包含分離的HeV 或NiV G蛋白以及佐劑，所述G蛋白能夠誘導產(chǎn)生在體外針對多種HeV和/或NiV毒株的 交叉反應(yīng)性中和抗血清，以及所述佐劑包含Quil A、DPPC和膽固醇，例如，其中所述組合物 含有5、50或IOOyg的可溶性HeV或NiV G蛋白，以及適合量的Quil A、DPPC和膽固醇。 免疫刺激復合物及其制備的其他示例性實施方式，描述在EP0242380B1和EP0180564B1以 及TO2000041720中（參見例如其中的第3和9頁，參考：Cox&Coulter (1992)《佐劑技術(shù)進 展以及在動物寄生蟲控制利用性生物技術(shù)中的應(yīng)用》（Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology),第 4 章， Yong (ed·)，CRC Press ;Dalsgard (1974) Gesamte Virusforsch, 44, 243-254;澳大利亞 專利
【發(fā)明者】馬丁·艾萊, 克里斯多佛·C·布勒德, 黃金安 申請人:碩騰有限公司, 亨利·M·杰克遜軍事醫(yī)學促進基金會