專利名稱：一種多糖和蛋白的偶聯物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種多糖和蛋白的偶聯物。
背景技術：
霍亂是一種烈性腸道傳染病，由革蘭氏陰性霍亂弧菌引起。人類是霍亂弧菌的天然宿主，通過食入被霍亂弧菌污染的水或食物而感染。在感染人群中病死率可在20 %以上， 全球每年約有12萬人死于霍亂。它的流行特點是爆發(fā)式，歷史上爆發(fā)過7次霍亂大流行。 開始在數個不同地點同時發(fā)生，然后迅速傳播流行可累及許多國家并持續(xù)多年，尤其在非洲、亞洲和拉丁美洲等一些發(fā)展中國家較為嚴重。而控制它的有效途徑之一就是免疫預防接種，因此尋求研制一種適用于各種人群的有效的霍亂疫苗極其重要。目前致病的霍亂弧菌有01和0139血清型兩種。這兩種血清型的霍亂弧菌均產生霍亂毒素(CT)，并且其蛋白質分子組成和致病機制均一致。但是，在菌體表面抗原、脂多糖構成、O抗原成分和表層結構有無莢膜等方面，這兩種血清型有所不同。目前已有分別針對01和0139霍亂的重組霍亂毒素B亞單位/全菌體(rBS-WC)疫苗和減毒活疫苗。雖然 rBS-WC苗具有較好的安全性和穩(wěn)定性，但存在需給以2次服菌并且對小于2歲的兒童保護力弱的缺點。而減毒活疫苗最大的特點是僅需口服I次，但存在著致腹瀉副反應以及潛在的通過基因突變重新獲得霍亂毒素與其它毒力基因的可能的弱點。并且研究認為，霍亂保護性免疫主要是由腸道粘膜局部產生和分泌到腸粘膜表面的SlgA抗體介導的，這些抗體通過抑制細菌的定居和繁殖、封閉腸毒素的活性而起保護作用。已證實霍亂弧菌細胞壁上的脂多糖(LPS)即菌體抗原(O抗原)既是毒力因子又是重要的保護性抗原，能誘導機體產生殺弧菌抗體。但是LPS分子量較小，免疫原性弱，且再次免疫后不能產生免疫加強效應。而CTB是霍亂毒素無毒的B亞單位部分,具有良好的免疫原性，能產生重要的抗毒抗體。并且已經證實CTB是一種很好的粘膜佐劑，能夠誘導機體產生粘膜免疫反應。因此，利用LPS和CTB研制新霍亂疫苗成為一個新的研究方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種多糖和蛋白的偶聯物。本發(fā)明提供的多糖和蛋白的偶聯物，名稱為LPS-CTB，是由霍亂弧菌脂多糖和霍亂毒素無毒亞單位蛋白偶聯而成。上述偶聯物中，所述霍亂弧菌脂多糖來自霍亂弧菌0139。上述偶聯物中，所述霍亂弧菌脂多糖具有如下至少一種的特征I)所述霍亂弧菌脂多糖中蛋白含量不大于2% (質量百分含量)；2)所述霍亂弧菌脂多糖的核酸含量不大于5% (質量百分含量)；3)所述霍亂弧菌脂多糖的單體分子量為8Kd。上述偶聯物中，所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的氨基酸序列為序列表中序列I。
上述偶聯物中所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比為5-40,所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比具體為7. 636、
10.833,26.034 或 20. 300。上述偶聯物中的霍亂弧菌脂多糖采用苯酚法提取，所述苯酚法提取包括如下步驟I)將所述霍亂弧菌0139用苯酚水溶液萃取，離心取有機相；2)先將步驟I)得到的有機相加入無水乙醇至乙醇終濃度為70%、然后依次進行靜置、離心取沉淀、沉淀溶于PH值為7. 6的2mM MgS04-50mM Tris緩沖液、消化，得到消化后廣物；3)將步驟2)得到的消化后產物依次進行透析、透析后溶液一次離心取上清、上清液再次離心收集沉淀，得到霍亂弧菌脂多糖。上述苯酚法提取的提取方法中，步驟I)中，所述苯酚水溶液為體積百分含量為 95%的苯酚水溶液；所述萃取溫度為65°C -68°C，所述萃取時間為25min-35min，所述萃取溫度具體為68°C,所述萃取時間具體為30min,所述離心的離心力為7000g_7500g，所述離心的時間為O. 8小時-I. 2小時，所述離心的溫度為0°c -IO0C ；所述離心的離心力具體為7300g，所述離心的時間具體為I小時，所述離心的溫度具體為10 °c ；步驟2)中，所述靜置的溫度為0°C -4°C，所述靜置的時間為8小時-12小時，所述靜置的溫度具體為4°C，所述靜置的時間具體為12小時；所述離心的離心力為7000g_7500g，所述離心的時間為O. 8小時-I. 2小時，所述離心的溫度為0°c -IO0C ；所述離心的離心力具體為7300g，所述離心的溫度具體為4°C，所述離心時間具體為I小時；所述消化為先加入DNA酶和RNA酶在37°C消化8小時-12小時，再加入蛋白酶K 在37°C溫度消化24小時；所述消化具體為先加入DNA酶和RNA酶在37°C消化12小時，再加入蛋白酶K在 37°C溫度消化24小時；步驟3)中，所述透析為先在37°C以2mM MgS04-50mM Tris緩沖液為透析液進行24 小時的截留分子量為3500道爾頓的透析，再在4°C以水為透析液進行48小時的截留分子量為3500道爾頓的透析，所述一次離心的離心力為4800g_5200g，所述一次離心的溫度為0°C _4°C，所述一次離心的時間為25分鐘-35分鐘；所述一次離心的離心力具體為5000g，所述一次離心的溫度具體為4°C，所述一次離心的時間具體為30分鐘；所述再次離心的離心力為63000g_65000g，所述再次離心的溫度為(TC -10°C，所述再次離心的時間具體為4. 5小時-5. 5小時；所述再次離心的離心力具體為64000g，所述再次離心的溫度具體為10°C，所述再次離心的時間具體為5小時。上述苯酚法提取的提取方法中，PH值為7. 6的濃度為2mM MgS04-50mM Tris緩沖液的制備方法如下Tris :購自 amresco 公司(Solon Ohio, USA),貨號0497_lkg.分子量121. I.IM Tris (pH8. 0)的配制取121. I克Tris，溶于900ml去離子水中，使用濃鹽酸調節(jié)pH到8.0，然后加水至1000ml。MgSO4 :購自北京化學試劑公司(北京市東四南大街160號)，貨號7487_88_9.分子量120. 37.20mM MgSO4的配制取無水MgSO4 2. 4074克，溶入900ml去離子水中，然后加水定容至 IOOOml02mM MgS04_50mM Tris緩沖液配方:取 IM Tris (pH8. 0)20ml,20mM MgSO4 100ml，使用鹽酸調節(jié)pH到7. 6，加水定容至1000ml。上述偶聯物中，所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的氨基酸序列為序列表中序列I。上述偶聯物中，所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比為5-40,所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比具體為7. 636、
10.833,26.034 或 20. 300。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述的偶聯物的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將上述偶聯物中的所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白偶聯，得到偶聯物；所述偶聯物中所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比具體為5-40，所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比進一步具體為 7.636、10.833,26. 034 或 20. 300。本發(fā)明的第三個目的是提供一種霍亂疫苗。本發(fā)明提供了一種霍亂疫苗，其活性成分為上述的偶聯物；本發(fā)明的第四個目的是提供一種激發(fā)機體產生IgA和/或IgG產品。本發(fā)明提供的一種激發(fā)機體產生IgA和/或IgG產品，其活性成分為上述的偶聯物。上述的偶聯物在制備霍亂疫苗中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；或上述的偶聯物在制備激發(fā)機體產生IgA和/或IgG產品中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的實驗證明與目前常用的rBS-WC疫苗相比，該多糖和蛋白的偶聯物免疫產生的抗CTB抗體IgA明顯高于rBS-WC疫苗免疫產生的抗體IgA，抗CTB抗體IgG與rBS-WC 疫苗免疫產生的抗體IgG相當；該偶聯物產生了抗LPS抗體IgA和IgG，其中，抗體IgA的抗體滴度能達抗體IgG的4倍，且在多次免疫后，抗體IgA和IgG顯著升高。與單一的LPS 疫苗或CTB疫苗相比，該偶聯物產生的抗體水平有顯著性提高。因此，本發(fā)明提供的多糖和蛋白的偶聯物的免疫效果高于常用的rBS-WC疫苗、單一的LPS疫苗或單一的CTB疫苗，其既能增強LPS的免疫原性，使其由T細胞非依賴抗原成為T細胞依賴抗原，使誘導的免疫反應具有免疫記憶和加強效應，產生大量的殺菌抗體，適用于各種人群；又能引發(fā)機體的粘膜
6免疫，使腸分泌液和膽汁中大量存在IgA抗體(腸分泌液和膽汁中的IgA抗體會出現在糞便中，因此，檢測了小鼠的糞便，來說明IgA抗體的存在)。


圖I為聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測LPS的電泳2為BCA法檢測蛋白含量標準曲線圖3為層析紫外吸光監(jiān)測4為層析組分SDS-PAGE電泳圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、多糖和蛋白的偶聯物的制備I、脂多糖(LPS)的提取和純化一、LPS 的提取LPS的提取方法記載在秦敏，楊國友，周富昌等，甲型副傷寒沙門氏菌LPS提取和
O-SP純化.微生物學免疫學進展，2005，33 (01)，27-31，具體如下每次取約30g霍亂弧菌0139(購自中國食品藥品檢定研究院)加入300mL 95%的苯酚水溶液,再加入水至混合物總體積為600mL。將混合的溶液置于68°C水浴震搖30分鐘， 冰浴冷卻，然后于7300 X g、10°C離心I小時。取上清液，剩余溶液再加入水至總體積600mL， 重復如前所述的68°C水浴和離心步驟。重復操作兩次，所取上清液與前一次上清液混合?；旌系纳锨逡涸儆?300Xg、4°C離心I小時，收集上清液后加入無水乙醇至乙醇終濃度為70% (乙醇的作用使蛋白、核酸、脂多糖溶解度降低，易形成沉淀)，置于 40C 12小時。然后混合液于7300Xg、4°C離心I小時，倒掉上清液，將沉淀溶于45mL 2mM MgS04-50mMTris(pH7. 6)緩沖液。在溶液中加入 Dnase (購自 Sigma, cat#D-5025_100mg) 和Rnase (購自北京欣經科，目錄號6052_100mg)各7. 5mg，置于37°C溫箱中12小時。然后加入15mg蛋白酶K(Proteinase K，購自Roche, cat#14059725)在37度消化24小時，將溶液轉入透析袋(3500道爾頓)內置于37°C透析24小時，透析時采用的透析液為上述2mM MgS04-50mMTris(pH7. 6)緩沖液。然后將透析袋放入2L水中，置于4°C透析2天，每12小時換一次水。透析后的溶液于5000Xg、4°C離心30分鐘。取上清液，于64000Xg、10°C離心5小時，倒掉上清液，將沉淀溶于少量的水中，凍干保存，即為LPS。PH值為7. 6的濃度為2mM MgS04_50mM Tris緩沖液的制備方法如下Tris :購自 amresco 公司(Solon Ohio, USA),貨號0497_lkg.分子量121. I.IM Tris (pH8. 0)的配制取121. I克Tris，溶于900ml去離子水中，使用濃鹽酸調節(jié)pH到8.0，然后加水至1000ml。MgSO4 :購自北京化學試劑公司(北京市東四南大街160號)，貨號7487_88_9.分子量120. 37.20mM MgSO4的配制取無水MgSO4 2. 4074克，溶入900ml去離子水中，然后加水定容至 IOOOml0
2mM MgS04_50mM Tris緩沖液配方:取 IM Tris (pH8. 0)20ml,20mM MgSO4 100ml，使用鹽酸調節(jié)pH到7. 6，加水定容至1000ml。二、LPS的指標檢測將上述獲得的LPS進行如下檢測I、LPS分子量檢測采用14%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳檢測上述步驟獲得的LPS，并采用LPS 銀染法顯色。結果如圖I所示，O-SP是O-特異性多糖，LPS的電泳圖譜呈現不均一的梯形條帶，條帶的顏色深淺與LPS含量呈正相關性?；魜y弧菌0139LPS單體分子量的大小約為8Kd。2、LPS的總核酸檢測用吸紫外分光光度計(型號DU650，購自美國BECKMAN公司。)檢測LPS的總核酸，使用純凈水做參照，測定在OD26tl的吸光值，結果顯示2mg/mL的脂多糖樣品吸光值為 O. 8528，則經過換算 DNA(10D 為 50 μ g/ml)含量約為 O. 8528*50 = 42. 64 μ g/mL, BP 2. 1%； RNA(10D 為 40μ g/ml)含量約為 O. 8528*40 = 34 μ g/mL，即 I. 7% oLPS 的總核酸含量彡 5%。3、LPS中蛋白質含量檢測采用BCA法測定，BCA法蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司， cat#PP1001。具體操作步驟如下I)將Solution A搖晃均勻，根據樣品數量，按50體積Solution A加I體積 Solution B (50 I)配制適量BCA工作液，充分混勻。2)完全溶解蛋白標準品(5mg/ml BSA)，取10 μ I稀釋至100 μ 1，使終濃度為 0. 5mg/ml。3)將稀釋后標準品(0. 5mg/ml BSA)按 0，I，2，4，8，12，16，20 μ I 分別加到 96 孔板中，加標準品稀釋液將所有標準品補足到20 μ I。4)加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標準品稀釋液到20 μ I。5)各孔加入200 μ I BCA工作液，輕輕用加樣槍吹打均勻，室溫放置2小時。6)用酶標儀測定Α562。7)根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。結果顯示標準曲線y = 0. OOllx+O. 0233，R2 = 0. 9929(圖 2 所示)。2mg/mL 的 LPS樣品A562為0. 048，經計算，樣品中的蛋白含量為22. 45g/mL, LPS中殘余的蛋白含量
(2%。II、重組霍亂毒素B亞單位(CTB)獲得重組霍亂毒素B亞單位(CTB)購自Sigma公司，目錄C9903_2MG,其氨基酸序列為序列表中的序列I。III、LPS-CTB 的制備一、LPS與CTB的偶聯和純化在由步驟I獲得的2mL LPS (10mg/mL,溶劑為水)中加入60 μ I 100mg/mL的
I-氰-4- 二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)溶液(用乙腈將CDAP配成100mg/mL的溶液， CDAP購自 sigma，cat#C2776-500mg)，控制ρΗ5· 8，反應 30 秒。然后加入 140 μ I 三乙胺(TEA) (購自北京化學試劑公司)水溶液至PH7. O,反應2分鐘。再加入2mLlmg/ml CTB溶液，用O. IM的NaOH調pH8. 0，4°C反應8小時。最后加入IOOul乙醇胺溶液終止反應。將反應產物通過Superdex 200凝膠過濾層析柱(GE Healthcare,目錄號 17-1043-02)進行純化，洗脫液為O. 2M NaCl (洗脫液的流速I. 5ml/min)。檢測紫外280nm 處的吸光值，收集各洗脫峰對應的物質，結果如圖3所示，洗脫下來3個峰，將收集有峰I、 2、3的收集管中的樣品進行SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖4所示，收集管14(收集峰2)、 18 (收集峰2)含有較多13Kd的目的蛋白條帶，說明含有CTB，將含有CTB的物質命名為 LPS-CTBl (CTB蛋白的理論分子量為13875. 08道爾頓，故用蛋白分子量標準進行標注)。根據LPS-CTBl的制備方法，另外生產制備了 3批LPS-CTB，分別命名為LPS-CTB2、 LPS-CTB3 和 LPS-CTB4。二、LPS-CTB 的檢測將由上述步驟獲得的偶聯物LPS-CTBI、LPS-CTB2、LPS-CTB3和LPS-CTB4，進行蛋白質含量及多糖含量的測定。I、采用BCA法測定偶聯物中的蛋白質含量BCA法蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司，cat#PP1001。具體操作同實施例I中的BCA檢測蛋白法。2、采用苯酚-硫酸法測定偶聯物中的多糖含量具體測定方法如下I)取250mg葡萄糖溶于250ml水中，制成lmg/ml的葡萄糖標準溶液。2)分別取10，20，30，40，60，80，100，120,140 μ I上述標準溶液于9個試管中，加水將所有標準溶液補足2ml。3)分別取上述糖溶液O. 5ml于9個試管中。4)加適當體積待測樣品于空試管中，加水稀釋到O. 5ml。5)各試管中加入O. 5ml 6%的苯酹溶液,混勻。6)各試管中加入5ml的濃硫酸。7)冷卻后各取200 μ I加入96孔板中，測定Α490。8)根據標準曲線計算出樣品中的多糖濃度。經檢測，四種LPS-CTB偶聯物的多糖和CTB含量的化學組成測定結果如表I所示， 偶聯比為多糖含量和CTB含量的摩爾比。表I四種LPS-CTB偶聯物的化學組成測定結果
偶聯產物多糖(pg/ml) 蛋白(pg/ml) 偶聯比(mol/mol)_
LPS-CTBl22.7647.636
LPS-CTB27.11410.833
LPS-CTB340.83426.034
LPS-CTB49.61020.300
9
實施例2、動物免疫實驗I、免疫選取5周齡大的BALB/c小鼠(BALB/C小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。雌性。)隨機分為2大組，即腹腔注射組和鼻腔滴注組。每大組又分為5小組，即生理鹽水對照組(生理鹽水濃度為O. 9% (質量百分含量))、LPS (由實施例I獲得)免疫組、 CTB (由實施例I獲得)免疫組、rBS-WC疫苗免疫組(rBS-WC疫苗購自上海聯合賽爾生物工程有限公司)和LPS-CTB3(由實施例I獲得，記作L-C)免疫組，每小組6只小鼠。每組小鼠共免疫3次，分別于第1、15和29天(將第一次免疫記作第I天)進行免疫。腹腔注射組每只小鼠每針次注射體積為O. Iml，鼻腔免疫組每只小鼠每次滴注體積為 IOul0除生理鹽水對照組外，其它組別的每只小鼠進行相應的免疫劑量分別為2. 5μ g多糖LPS、2. 5 μ g的CTB、含有2. 5 μ g rBS的rBS-WC疫苗(溶劑為水)和含有2. 5 μ g多糖的 LPS-CTB (溶劑為水)。分別于第8、22、36和57天(第8、22、36和57天分別為一免后I周、二免后I周、 三免后I周、三免后4周)取小鼠尾靜脈血(血清分離后于_70°C保存)。2、血清學檢測用間接ELISA法測定各組小鼠血清中抗LPS和抗CTB的IgG和IgA抗體水平包被抗原分別為100 μ I由實施例I獲得的LPS (10 μ g/ml，溶劑為水)和100 μ I由實施例I獲得的CTB (5 μ g/ml，溶劑為水)。二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG和IgA (羊抗鼠IgG (HRP標記) 購自 Santa Cruz, cat#sc-2005 ;羊抗鼠 IgA(HRP 標記)購自 Santa Cruz, cat#sc_3791)。 將各組小鼠血清從I : 20開始進行倍比稀釋，檢測顯色后測定A450nm值。以生理鹽水對照組小鼠血清OD值作為陰性對照，以免疫組OD值大于陰性對照2倍時的最大稀釋倍數記為血清抗體滴度。間接ELISA 法I.包被用O. 05M PH9. O碳酸鹽包被緩沖液將包被抗原稀釋至上述濃度。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加O. Iml上述稀釋后的包被抗原，4°C 12小時。次日，棄去孔內溶液， 用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。2.加樣加一定稀釋梯度的待檢血清O. Iml于上述已包被之反應孔中，置37°C孵育1.5小時。然后洗滌。(同時做空白孔(去離子水)，陰性對照孔(生理鹽水組小鼠血清))。3.加酶標抗體于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體O. Iml0 37°C孵育I小時，洗滌。4.加底物液顯色于各反應孔中加入臨時配制的TMB(可溶型單組分TMB底物溶液購自天根，cat#PA107-01)底物溶液O. Iml, 37°C 10 30分鐘。5.終止反應于各反應孔中加入2M硫酸O. 05ml。6.結果判定在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調零后測各孔OD值， 若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2倍，即為陽性。試劑(I)包被緩沖液(PH9. 60. 05M 碳酸鹽緩沖液)=Na2CO3 I. 59 克，NaHCO3 2. 93 克，加蒸餾水至1000ml。
(2)洗滌緩沖液(PH7. 4PBST) KH2P04 0 . 24 克，Na2HP04 12H20 3. 58 克，NaC18. 0 克，KC1 0. 2 克，Tween-20 0. 5ml，加蒸餾水至 1000ml。(3)稀釋液牛血清白蛋白(BSA) 1克加洗滌緩沖液至100ml配成1 %溶液使用。(4)終止液(2M H2S04):蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7ml。下面的表2-7中的“/”表示在血清原液未檢測到相應抗體。用間接ELISA法檢測免疫小鼠后血清抗LPS的IgG和IgA抗體水平，分別如表2、3 所示。表中結果顯示，僅腹腔注射免疫能誘導血清中產生抗LPS的抗體，而鼻腔滴注免疫采 用血清原液也幾乎檢測不到抗LPS的抗體。腹腔注射免疫組中，單一的LPS免疫小鼠后誘 導產生的血清抗IgG和IgA兩種抗體水平均沒有LPS-CTB偶聯物免疫產生的抗體水平高， rBS-wc免疫幾乎不產生LPS的抗體，并且只有LPS-CTB偶聯物的免疫能產生免疫加強反應， 即第二次免疫后與第一次免疫后、第三次免疫后與第二次免疫后相比，血清中抗LPS的IgG 和IgA抗體水平均有顯著性升高。此外，可以看出LPS-CTB免疫后，血清中抗LPS的IgA抗 體水平明顯高于IgG。表2小鼠免疫后血清抗LPS的IgG抗體滴度(腹腔免疫組)
權利要求
1.一種多糖和蛋白的偶聯物，由霍亂弧菌脂多糖和霍亂毒素無毒亞單位蛋白偶聯而成。
2.根據權利要求I所述的偶聯物，其特征在于所述霍亂弧菌脂多糖來自霍亂弧菌 0139。
3.根據權利要求I或2所述的偶聯物，其特征在于所述霍亂弧菌脂多糖具有如下至少一種的特征1)所述霍亂弧菌脂多糖中蛋白含量不大于2%(質量百分含量)；2)所述霍亂弧菌脂多糖的核酸含量不大于5%(質量百分含量)；3)所述霍亂弧菌脂多糖的單體分子量為8Kd。
4.根據權利要求1-3中任一所述的偶聯物，其特征在于所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的氨基酸序列為序列表中序列I。
5.根據權利要求1-4中任一所述的偶聯物，其特征在于所述偶聯物中的所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比為5-40，所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比具體為7. 636、10. 833,26. 034或20. 300。
6.根據權利要求1-5中任一所述的偶聯物，其特征在于所述霍亂弧菌脂多糖采用苯酚法提?。凰霰椒臃ㄌ崛【唧w包括如下步驟1)將所述霍亂弧菌0139用苯酚水溶液萃取，離心取有機相；2)先將步驟I)得到的有機相加入無水乙醇至乙醇終濃度為70%、然后依次進行靜置、 離心取沉淀、沉淀溶于PH值為7.6的2mM MgS04-50mM Tris緩沖液、消化，得到消化后產物；3)將步驟2)得到的消化后產物依次進行透析、透析后溶液一次離心取上清、上清液再次離心收集沉淀，得到霍亂弧菌脂多糖。
7.根據權利要求1-6中任一所述的偶聯物，其特征在于步驟I)中，所述苯酚水溶液為體積百分含量為95%的苯酚水溶液；所述萃取溫度為65°C _68°C，所述萃取時間為25min-35min，所述萃取溫度具體為68°C,所述萃取時間具體為30min,所述離心的離心力為700(^-750(^，所述離心的時間為0.8小時-1.2小時，所述離心的溫度為0°C -IO0C ；所述離心的離心力具體為7300g，所述離心的時間具體為I小時，所述離心的溫度具體為 IO0C ；步驟2)中，所述靜置的溫度為0°C -4°C，所述靜置的時間為8小時-12小時，所述靜置的溫度具體為4°C，所述靜置的時間具體為12小時；所述離心的離心力為700(^-750(^，所述離心的時間為0.8小時-1.2小時，所述離心的溫度為0°C -IO0C ；所述離心的離心力具體為7300g，所述離心的溫度具體為4°C，所述離心時間具體為I 小時；所述消化為先加入DNA酶和RNA酶在37°C消化8小時-12小時，再加入蛋白酶K在 37°C溫度消化24小時；所述消化具體為先加入DNA酶和RNA酶在37°C消化12小時，再加入蛋白酶K在37°C溫度消化24小時；步驟3)中，所述透析為先在37°C以2mM MgS04-50mM Tris緩沖液為透析液進行24小時的截留分子量為3500道爾頓的透析，再在4°C以水為透析液進行48小時的截留分子量為 3500道爾頓的透析，所述一次離心的離心力為4800g-5200g，所述一次離心的溫度為0°C _4°C，所述一次離心的時間為25分鐘-35分鐘；所述一次離心的離心力具體為5000g，所述一次離心的溫度具體為4°C，所述一次離心的時間具體為30分鐘；所述再次離心的離心力為63000g-65000g，所述再次離心的溫度為(TC _10°C，所述再次離心的時間具體為4. 5小時-5. 5小時；所述再次離心的離心力具體為64000g，所述再次離心的溫度具體為10°C，所述再次離心的時間具體為5小時。
8.一種制備權利要求1-7中任一所述的偶聯物的方法，包括如下步驟將權利要求1-7中任一所述偶聯物中的所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白偶聯，得到偶聯物；所述偶聯物中所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比具體為 5-40，所述霍亂弧菌脂多糖和所述霍亂毒素無毒亞單位蛋白的偶聯比進一步具體為7. 636、 10.833,26. 034 或 20. 300。
9.一種霍亂疫苗，其活性成分為權利要求1-7中任一所述的偶聯物；或一種激發(fā)機體產生IgA和/或IgG產品，其活性成分為權利要求1-7中任一所述的偶聯物。
10.權利要求1-7中任一所述的偶聯物在制備霍亂疫苗中的應用；或權利要求1-7中任一所述的偶聯物在制備激發(fā)機體產生IgA和/或IgG產品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多糖和蛋白的偶聯物。上述多糖和蛋白的偶聯物，是由霍亂弧菌脂多糖和霍亂毒素無毒亞單位蛋白偶聯而成。所述霍亂弧菌脂多糖來自霍亂弧菌0139。所述霍亂弧菌脂多糖中蛋白含量不大于2％，核酸含量不大于5％，所述霍亂弧菌脂多糖的分子量為8Kd。本發(fā)明提供的多糖和蛋白的偶聯物的免疫效果高于常用的rBS-WC疫苗、單一的LPS疫苗或單一的CTB疫苗，其即能增強LPS的免疫原性，使誘導的免疫反應具有免疫記憶和加強效應，產生大量的殺菌抗體，適用于各種人群；又能引發(fā)機體的粘膜免疫，使腸分泌液和膽汁中大量存在IgA抗體。
文檔編號A61P31/04GK102580073SQ20121003975
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月20日 優(yōu)先權日2012年2月20日
發(fā)明者劉萱, 曹誠, 王遠, 靳彥文 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所