凝血因子viii聚合物偶聯(lián)物的制作方法
【專利說(shuō)明】凝血因子Vl I I聚合物偶聯(lián)物
[0001] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年7月29日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980130950. 3(國(guó)際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/US2009/052103)、名稱為凝血因子VIII聚合物偶聯(lián)物的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 本申請(qǐng)為于2007年3月29日申請(qǐng)的美國(guó)專利申請(qǐng)11/729,625的部分后續(xù)申請(qǐng)， 美國(guó)專利申請(qǐng)11/729,625要求分別在2006年6月6日及2006年3月21日申請(qǐng)的美國(guó)臨 時(shí)專利申請(qǐng)60/790, 239及60/787, 968的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及一種包含與至少一種水溶性聚合物（包括聚環(huán)氧烷，例如聚乙二醇） 相結(jié)合的凝血因子Vin(FVIII)的蛋白質(zhì)構(gòu)建體。此外，本發(fā)明還涉及用于延長(zhǎng)患有與 FVIII功能缺陷或缺乏相關(guān)的出血性疾病的哺乳動(dòng)物的血液中FVIII的體內(nèi)半衰期的方 法。
【背景技術(shù)】
[0004] 血漿中的凝血因子VIII (FVIII)以很低的濃度循環(huán)并且非共價(jià)地結(jié)合于馮威勒 布蘭特因子（von Willebrand factor，VWF)。在止血期間，F(xiàn)VIII與VWF分開，并作為協(xié)同 因子，在鈣和磷脂或者細(xì)胞膜存在的情況下，通過(guò)提高活化速度，用于受被活化的凝血因子 IX(FIXa)調(diào)節(jié)的凝血因子X(jué)(FX)的活化。
[0005] FVIII被合成為具有結(jié)構(gòu)域A1-A2-B-A3-C1-C2的大約270-330kD的單鏈前體。當(dāng) FVIII被從血漿中純化時(shí)（比如是"來(lái)源于血漿的"或者"血漿的")，F(xiàn)VIII由重鏈（A1-A2-B) 和輕鏈（A3-C1-C2)組成。輕鏈分子量是80kD，然而由于B結(jié)構(gòu)域內(nèi)的蛋白質(zhì)水解，重鏈分 子量在90-220kD的范圍內(nèi)。
[0006] FVIII也可被合成為重組蛋白質(zhì)用于出血性疾病的治療使用。已經(jīng)設(shè)計(jì)了不同的 體外試驗(yàn)來(lái)確定重組體FVIII (rFVIII)作為治療藥物的潛在有效性。這些試驗(yàn)?zāi)M內(nèi)源性 FVIII的體內(nèi)效果。正如體外分析所測(cè)定的那樣，F(xiàn)VIII的體外凝血酶處理導(dǎo)致它的促凝血 活性急劇增加和隨后的減少?；罨褪Щ钆c重鏈和輕鏈兩者中的特異的限制性蛋白質(zhì)水解 一致，限制性蛋白質(zhì)水解可改變FVIII中的不同結(jié)合表位的可用性，比如允許FVIII與VWF 分離并且結(jié)合至磷脂表面、或者改變與某些單克隆抗體的結(jié)合能力。
[0007] FVIII的缺乏或者功能障礙與最常見(jiàn)的出血性疾病即甲型血友病相關(guān)。甲型血友 病的治療手段選擇是采用來(lái)源于血漿的濃縮物或者rFVIII濃縮物的替代療法。FVIII水平 低于1%的重癥甲型血友病患者通常采用預(yù)防性療法，目的是在給藥之間保持FVIII在1% 以上。考慮到血液循環(huán)中不同的FVIII產(chǎn)物的平均半衰期，該目的通常通過(guò)每周給藥兩至 三次FVIII來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0008] 在市場(chǎng)上有許多濃縮物用于甲型血友病的治療。這些濃縮物之一是重組體產(chǎn)物 Advate?:,其在CHO細(xì)胞中被生產(chǎn)出來(lái)，并且由巴克斯特保健公司制造。在細(xì)胞培養(yǎng)工藝、 純化、或該產(chǎn)品的最終配制中沒(méi)有加入人或動(dòng)物血漿蛋白或者白蛋白。
[0009] 目前許多FVIII濃縮物和治療性多肽類藥物的制造商的目標(biāo)是開發(fā)下一代產(chǎn)品， 該產(chǎn)品具有增強(qiáng)的藥效和藥物動(dòng)力學(xué)特性，同時(shí)保持所有其他的產(chǎn)品特征。
[0010] 治療性多肽類藥物可被蛋白水解酶快速降解并被抗體中和。這降低了它們的半 衰期和循環(huán)時(shí)間，因此限制了它們的療效。已經(jīng)有研宄顯示，添加可溶性聚合物或者碳水 化合物至多肽可以抑制降解并延長(zhǎng)多肽的半衰期。例如，將多肽類藥物聚乙二醇化可保護(hù) 它們并且增強(qiáng)它們的藥效和藥物動(dòng)力學(xué)特性（Harris J M et Chess R B, Nat Rev Drug Discov2003;2:214-21)。聚乙二醇化方法可將聚乙二醇（PEG)的重復(fù)單元連接至多肽藥 物。分子的聚乙二醇化可以導(dǎo)致藥物對(duì)酶降解的抗性增加、體內(nèi)半衰期增加、給藥頻率降 低、免疫原性降低、物理和熱穩(wěn)定性增加、溶解性增加、液體穩(wěn)定性增加和凝聚減少。
[0011] 因此，比如通過(guò)聚乙二醇化，添加可溶性聚合物是提高FVIII產(chǎn)物性能的一種方 法?，F(xiàn)有技術(shù)狀況已有不同的專利和專利申請(qǐng)記載：
[0012] 美國(guó)專利申請(qǐng)6, 037, 452描述了聚（環(huán)氧烷）FVIII或者FIX偶聯(lián)物，其中蛋白質(zhì) 通過(guò)所述FVIII的羰基被共價(jià)連接至聚（環(huán)氧烷）上。
[0013] EP1258497B1描述了一種制備FVIII與生物相容性聚合物的偶聯(lián)物的方法。該專 利被R5i；Un等人的出版物（Bioconj Chem 2000 ;11:387-96)進(jìn)行了補(bǔ)充。偶聯(lián)物包括被刪 除的且被單甲氧基聚乙二醇修飾的重組FVIII。偶聯(lián)物降低了 FVIII功能，并且促凝血活性 隨著修飾度的增加而快速地降低。
[0014] WO 4075923 A3描述了一種共聚物-FVIII分子偶聯(lián)物，其包含多個(gè)偶聯(lián)物，其中 每個(gè)偶聯(lián)物都有一至三個(gè)被共價(jià)連接至FVIII分子上的水溶性聚合物。該FVIII分子的B 結(jié)構(gòu)域已被刪除。
[0015] 美國(guó)專利4, 970, 300描述一種被修飾的FVIII，其中包含具有FVIII活性的蛋白質(zhì) 的不溶性偶聯(lián)物被共價(jià)連接至無(wú)抗原性配體。
[0016] 美國(guó)專利6, 048, 720描述了多肽和生物相容性聚合物的偶聯(lián)物。
[0017] W094/15625描述了連接于聚乙二醇的FVIII，該聚乙二醇具有不超過(guò)5000道爾頓 的優(yōu)選分子量。
[0018] 仍需要一種含有被連接的可溶性聚合物以便延長(zhǎng)FVIII體內(nèi)半衰期的FVIII，比 如聚乙二醇化的FVIII，如含有被偶聯(lián)的大于10000道爾頓的PEG的全長(zhǎng)FVIII，與非聚乙 二醇化的FVIII相比，其保留了功能活性同時(shí)提供延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含經(jīng)由凝血因子VIII中的碳水化物部分而 偶聯(lián)至水溶性聚合物的凝血因子VIII分子。本發(fā)明還涉及其制備方法。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種將水溶性聚合物偶聯(lián)至FVIII中被氧化的 碳水化物部分的方法，包括在允許偶聯(lián)的條件下將被氧化的碳水化物部分與被活化的水溶 性聚合物相接觸。在一個(gè)相關(guān)的方面，所述水溶性聚合物選自下組：PEG、PSA和葡聚糖。在 另一方面，所述被活化的水溶性聚合物選自下組：PEG-酰肼、PSA-肼和醛活化的葡聚糖。在 本發(fā)明的另一方面，所述碳水化物部分是通過(guò)在包含NaIO 4的緩沖液中溫育被氧化的。而 在另一方面，所述FVIII中被氧化的碳水化物部分位于FVIII的B結(jié)構(gòu)域。
[0021] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供根據(jù)如上所述方法中的任一方法所產(chǎn)生的被 修飾的FVIII。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含：(a)凝血因子VIII 分子；和（b)至少一個(gè)連接至所述凝血因子VIII分子的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚 合物通過(guò)一個(gè)以上位于凝血因子VIII的B結(jié)構(gòu)域中的碳水化物部分而被連接于凝血因子 VIII。在本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)的方面，所述水溶性聚合物選自下組：PEG、PSA和葡聚糖。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1顯示用SDS-PAGE及隨后的免疫印跡法測(cè)定的rFVIII與PEG偶聯(lián)后的條帶變 寬和質(zhì)量增加。
[0023] 圖2顯示在血友病小鼠中PEG-rFVIII偶聯(lián)物與未偶聯(lián)FVIII相比的藥物動(dòng)力學(xué)。 空心正方形：PEGrFVIII，200IU FVIII/kg 劑量。實(shí)心菱形：天然 rFVIII，200IU FVIII/kg 劑量。
[0024] 圖3顯示通過(guò)使用不同抗FVIII抗體的SDS-PAGE進(jìn)行的聚乙二醇化位點(diǎn)的詳細(xì) 分析。
[0025] 圖4顯示凝血酶誘導(dǎo)的天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的活化和失活。
[0026] 圖5顯示表示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的結(jié)構(gòu)域的條帶。
[0027] 圖6顯示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的不同結(jié)構(gòu)域的聚乙二醇化程度。
[0028] 圖7顯示天然rFVIII和聚乙二醇化rFVIII的凝血酶失活速度。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明是一種蛋白質(zhì)構(gòu)建體，其包含含有至少一部分完整B結(jié)構(gòu)域的FVIII分 子，該FVIII分子連接至水溶性聚合物上，水溶性聚合物包括：聚環(huán)氧烷、聚乙烯基吡咯 烷酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯?；鶈徇蛘咛妓衔锶缇弁僖核幔≒SA)或者葡聚 糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，水溶性聚合物是分子量大于10000道爾頓的聚乙二醇分 子。在另一個(gè)實(shí)施方式中，水溶性聚合物的分子量從大于10000道爾頓至大約125000道爾 頓，大約15000道爾頓至20000道爾頓，或者大約18000道爾頓至大約25000道爾頓。在 一個(gè)實(shí)施方式中，構(gòu)建體保留了標(biāo)準(zhǔn)的治療性FVIII產(chǎn)品的全部功能活性，并且與標(biāo)準(zhǔn)治 療性FVIII產(chǎn)品相比較，體內(nèi)半衰期得到延長(zhǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，相對(duì)于天然凝血因 子 VIII，構(gòu)建體保留至少 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、1