專利名稱：特布他林的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種β-興奮劑類的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用，尤其涉及一種特布他林(terbutaline)的偶聯(lián)物及其制備方法與應(yīng)用。屬β-興奮劑免疫檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及的下列名稱適用于整個說明書和權(quán)利要求書牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin，簡稱BSA)Sigma公司產(chǎn)品卵清蛋白(簡稱OVA)Sigma公司產(chǎn)品磷酸緩沖液(Phosphate Buffered Saline，簡稱PBS)(0.01M，pH＝7.40)透析膜bioshorp公司產(chǎn)品硫酸特布他林中國藥品生物制品檢定所1，4-丁二醚(1，4-Butanediol diglycidyl ether，簡稱BDE)Sigma公司產(chǎn)品羥基琥珀酰亞胺(簡稱NHS)Sigma公司產(chǎn)品乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亞胺(簡稱EDC)Sigma公司產(chǎn)品對氨基苯甲酸(4-aminobenzoic acid)Fluka公司產(chǎn)品β-興奮劑是一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類衍生物，20世紀(jì)80年代至今，人工合成的β-興奮劑主要有克倫特羅(clenbuterol)、卡布特羅(carbuterol)、萊克多巴胺(ractopamine)、沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)等十余種。β-興奮劑作用機(jī)理和腎上腺素、去甲腎上腺素相同，可影響營養(yǎng)物質(zhì)在動物體內(nèi)的流向和重新分配，有效促進(jìn)肌肉組織生長，降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率和增加瘦肉產(chǎn)量，因而曾在歐美廣泛使用。但另一方面，β-興奮劑具有類似腎上腺素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能與細(xì)胞表面的β-受體結(jié)合而產(chǎn)生明顯的生理作用，如心悸、頭疼、目眩、惡心、嘔吐、戰(zhàn)栗、神經(jīng)過敏、血管擴(kuò)張、心率加快等，而且這類化合物具有口服活性，如果違法超量使用就會對人與動物的肝腎等內(nèi)臟器官產(chǎn)生一定的毒副作用。1992年，西班牙發(fā)生40多人食用含β2-興奮劑的畜產(chǎn)品中毒事件；1997年，香港發(fā)生進(jìn)食大陸供港豬的內(nèi)臟引起人中毒事件；2006年9月上海發(fā)生鹽酸克倫特羅中毒事件。現(xiàn)在歐美各國均禁止其在畜牧生產(chǎn)上的應(yīng)用，美國規(guī)定只能用于科研，我國農(nóng)業(yè)部也正式發(fā)文嚴(yán)禁作為添加劑使用。但是由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，在畜牧生產(chǎn)中違法使用現(xiàn)象較為普遍，致使藥物在動物體內(nèi)殘留量過高，難以達(dá)到發(fā)達(dá)國家的要求，畜禽產(chǎn)品出口屢遭綠色壁壘，使貿(mào)易受阻，給整個產(chǎn)業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。為了應(yīng)對藥物殘留給整個產(chǎn)業(yè)發(fā)展和食品安全保障所帶來的挑戰(zhàn)，我國政府和相關(guān)部門，已加大了對藥物添加劑的檢測力度，修訂和頒布了更為嚴(yán)格的法律和規(guī)范。對畜產(chǎn)品生產(chǎn)過程進(jìn)行監(jiān)控和執(zhí)法，一是制定最高殘留限量的標(biāo)準(zhǔn)，二是改進(jìn)殘留分析方法和技術(shù)，發(fā)展快速、準(zhǔn)確和高靈敏度的檢測手段。
在β-興奮劑藥物殘留的檢測中，常用的方法有儀器法如高效液相色譜法、氣相色譜法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用法等。這些方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可以作為標(biāo)準(zhǔn)方法。但儀器法價格昂貴，費時較長，且造成有機(jī)溶劑污染，需要大型儀器設(shè)備，需要專門的技術(shù)人員，所以難于用于現(xiàn)場操作。酶聯(lián)免疫法(ELISA)具有靈敏、快速、特異性好、樣品量少，不需要專門人員操作等優(yōu)點，這使得ELISA法成為一種理想的、可用于常規(guī)掃描的檢測方法。但是酶聯(lián)免疫檢測法需要高質(zhì)量的抗體，β-興奮劑都是小分子有機(jī)化合物，不具有免疫原性，稱之為半抗原。所以必須把這些化合物轉(zhuǎn)變成能引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)?？藗愄亓_是作為促生長劑最常使用的一種藥物，但隨著對鹽酸克倫特羅檢測力度的加大，非法使用者開始使用其它代替品，由于特布他林與鹽酸克倫特羅的促生長作用相似，特布他林成為繼鹽酸克倫特羅之后的主要的代替品之一，國內(nèi)外對特布他林的研究還比較少，因此研究特布他林的免疫原的合成及抗體制備就顯得十分必要。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種能引發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對特布他林有特異反應(yīng)的抗體的免疫原，即特布他林(terbutaline)的偶聯(lián)物及其制備方法。同時，本發(fā)明還提供了所述的特布他林的偶聯(lián)物作為免疫原在制備特布他林特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述特布他林的偶聯(lián)物，由特布他林半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。
其中上述產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)優(yōu)選是牛血清蛋白。
本發(fā)明所述的特布他林的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的特布他林的分子數(shù)，所述n為整數(shù)1～15，cBSA為活化牛血清蛋白(Cationized Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是66KDa～69KDa；上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜276nm。
在上述的特布他林的偶聯(lián)物中，所述n優(yōu)選為整數(shù)1～10，活化牛血清蛋(cBSA)分子量范圍優(yōu)選是67KDa～68KDa。
上述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法是將特布他林與產(chǎn)生免疫原的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
上述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法，具體由如下步驟完成1)溶液A的制備將活化的牛血清蛋白溶在pH＝10.5±0.6、濃度為50mM碳酸鹽緩沖液中，同時按牛血清蛋白與1，4-丁二醚摩爾比為1∶90～150的比例量取1，4-丁二醚也加入該溶液中，室溫反應(yīng)22±2小時，得無色澄清溶液A，備用；2)溶液B的制備按特布他林與1，4-丁二醚的摩爾比為2∶1-1∶1的比例稱取特布他林溶在pH＝10.5±0.6、濃度為50mM碳酸鹽緩沖液中，然后把配好的特布他林溶液滴加到通入氮氣的A溶液中，室溫反應(yīng)22±2小時，得無色澄清溶液B。
3)用pH為7.30-7.50，濃度為0.01M-0.02M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B 70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；4)凍干透析后的溶液，得到白色的特布他林的偶聯(lián)物。
在上述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法中步驟1)所述牛血清蛋白與1，4-丁二醚的摩爾比優(yōu)選為1∶99。
在上述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法中步驟2)所述特布他林與1，4-丁二醚的摩爾數(shù)比優(yōu)選為1.5∶1。
在上述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法中步驟3)所述磷酸溶液的pH優(yōu)選為7.4，濃度優(yōu)選為0.01M。
本發(fā)明所述的特布他林的偶聯(lián)物作為免疫原在制備特布他林特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
利用本發(fā)明的技術(shù)方案可以成功地把半抗原特布他林與載體蛋白特別是牛血清蛋白偶聯(lián)起來，從而合成了能夠在動物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體的完全免疫原——特布他林的偶聯(lián)物。
利用本發(fā)明所述的特布他林的偶聯(lián)物作為免疫原免疫新西蘭大白兔，成功地獲得了對半抗原特布他林有特異反應(yīng)的抗體。經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測實驗鑒定，利用本發(fā)明所述的特布他林的偶聯(lián)物作為免疫原制備的特布他林特異反應(yīng)抗體，其抗血清效價達(dá)到1∶50,000以上，其最低檢測限為0.3ppb，IC50為9.25ppb。
上述的特布他林的偶聯(lián)物以及高效價的特布他林特異反應(yīng)抗體的制備成功，為制備特布他林的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒提供了基礎(chǔ)。在實際應(yīng)用中，把所述制備的特布他林特異反應(yīng)抗體鍍在微孔盤內(nèi)，就可以用來檢驗動物源食品中特布他林的殘留。由于本發(fā)明所述方法具有簡易，快速，特異，準(zhǔn)確的特點，所以可以用于食品檢驗檢疫中的初步掃描檢測之用。這樣不但可以節(jié)省大量的檢驗時間，還可以用于現(xiàn)場操作，從而彌補了儀器法費時較長，需要大型儀器設(shè)備支持，需要專門的技術(shù)人員操作，難于用于現(xiàn)場的不足。所以，半抗原特布他林與載體蛋白特別是牛血清蛋白偶聯(lián)物的合成及抗血清的成功制備為這種快速檢驗法奠定了基礎(chǔ)。


圖1紫外吸收光譜圖
其中1硫酸特布他林2cBSA 3特布他林的偶聯(lián)物具體實施方式
實施例1(1)溶液A的制備稱取50mg cBSA(0.735μmol)溶在3mL 50mM碳酸鹽(pH＝10.7)緩沖液中，然后向溶液中加入13.8μL(72.9μmol)的1，4-丁二醚(BDE)，室溫反應(yīng)20小時，得無色澄清溶液A，備用；(2)溶液B的制備稱取30mg(109.4μmol)硫酸特布他林溶在1.5mL 50mM碳酸鹽(pH＝10.7)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將硫酸特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應(yīng)20小時，得無色澄清溶液B。
(3)用pH為7.40，濃度為0.01M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；(4)凍干透析好的溶液，得到白色的特布他林的偶聯(lián)物。
通過紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的吸收峰位于276nm。
實施例2(1)溶液A的制備稱取50mg cBSA(0.735μmol)溶在3mL 50mM碳酸鹽(pH＝11.1)緩沖液中，然后向溶液中加入16.7μL(88.2μmol)的BDE，室溫反應(yīng)22小時，得無色澄清溶液A，備用；(2)溶液B的制備稱取25mg(91.2μmol)硫酸特布他林溶在1.0mL 50mM碳酸鹽(pH＝11.1)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將硫酸特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應(yīng)24小時，得無色澄清溶液B。
(3)用pH為7.50，濃度為0.01M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；(4)凍干透析好的溶液，得到白色的特布他林的偶聯(lián)物，通過紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的吸收峰位于276nm。
實施例3(1)溶液A的制備稱取60mg cBSA(0.882μmol)溶在4mL 50mM碳酸鹽(pH＝10.9)緩沖液中，然后向溶液中加入25.0μL(132.3μmol)的BDE，室溫反應(yīng)24小時，得無色澄清溶液A，備用；(2)溶液B的制備稱取40mg(146μmol)硫酸特布他林溶在3mL 50mM碳酸鹽(pH＝10.9)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將硫酸特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應(yīng)24小時，得無色澄清溶液B。
(3)用pH為7.30，濃度為0.02M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；(4)凍干透析好的溶液，得到白色的特布他林的偶聯(lián)物，通過紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的吸收峰位于276nm。
實施例4抗體的制備純化及檢測1.抗體的制備選擇上述實施例1所制備的特布他林的偶聯(lián)物作為免疫原進(jìn)行動物免疫實驗以制備抗體。
取1mg/mL的特布他林的偶聯(lián)物的溶液1mL，加入等體積的弗氏完全佐劑，充分乳化后，經(jīng)皮下多點注射給四只體重2kg的雄性健康新西蘭大白兔，1mL/只，15天后以同量抗原與弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行二免，二免以后，每隔15天加強免疫一次，抗原量減半，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心臟采血，室溫靜置1小時，0-4℃過夜，13000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集血清，-20℃保存，備用。
2.抗體的純化攪拌狀態(tài)下向上述制備的抗血清中加入飽和硫酸銨至硫酸銨溶液的終濃度為體積百分比是50％，0-4℃放置過夜，有沉淀物析出；以13000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH 7.4的PBS至沉淀溶解，然后加入飽和硫酸銨溶液至硫酸銨溶液的終濃度為體積百分比是33％，0-4℃放置過夜，有沉淀物析出；以13000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，棄上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH 7.4的PBS至沉淀溶解。將上述純化物用0.01M、pH 7.4的PBS，0-4℃透析，換透析液3次，然后加入質(zhì)量體積百分比為0.02％的疊氮化鈉，-20℃保存，備用。
3.抗體的酶聯(lián)免疫檢測(1)效價測定方法采用常規(guī)的間接酶聯(lián)免疫吸附檢測法在96孔的酶標(biāo)板上，用100μL/孔的特布他林與卵清蛋白的偶聯(lián)物(2.5μg/mL)包被，0-4℃放置過夜，然后用PBST(1000mL pH 7.4、濃度0.01M的PBS+體積百分比是0.05％Tween20)洗板四次；用250μL/孔封閉液(1000mL PBST+質(zhì)量體積百分比是1％卵清蛋白)封閉，室溫放置3小時，洗板；在洗去封閉液后，加100μL/孔的抗血清，室溫放置2小時，洗板；在洗去抗血清以后，每孔加入1∶1000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 100μL，室溫放置1小時，洗板；加入底物鄰苯二胺顯色，室溫放置10min，再加入2M HCl終止。酶標(biāo)儀A492nm檢測。
經(jīng)測定本發(fā)明所述特布他林的偶聯(lián)物抗體效價達(dá)1∶51，200。
效價的判定以P/N大于2∶1的血清最高稀釋倍數(shù)為該抗體的酶聯(lián)免疫檢測效價。
其中P為代測血清在某一稀釋倍數(shù)測定的吸光度值，N為陰性對照在相應(yīng)稀釋倍數(shù)測定的吸光度值。
(2)特異性測定測定步驟與效價測定類似，在上述最佳的包被抗原與抗體濃度條件下，加抗體的同時加入特布他林溶液(從0.2ppb-2000ppb)，與包被抗原競爭結(jié)合有限的抗體，特布他林藥的濃度越高，抗體與包被抗原就結(jié)合得越少，從而顯色越淺，吸光度值越低。再與空白對照(只加抗體，未加特布他林藥的吸光度值)相比較，以確定抗體特異性。
通過測定抗體特異性較好，其最低檢測限可達(dá)到0.3ppb，IC50為9.25ppb。
實施例5(1)溶液A的制備稱取31.3mg(0.723μmol)OVA溶在3mL 50mM碳酸鹽(pH＝11.08)緩沖液中，然后向溶液中加入11.04μL(58.32μmol)的BDE，室溫反應(yīng)24小時，得無色澄清溶液A，備用；(2)溶液B的制備稱取24mg(87.49μmol)硫酸特布他林溶在1mL 50mM碳酸鹽(pH＝11.08)緩沖液中，把溶液A通入氮氣，隨后將硫酸特布他林溶液逐滴加入A溶液中，室溫反應(yīng)20小時，得無色澄清溶液B。
(3)用pH為7.4，濃度為0.01M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；(4)凍干透析好的溶液，得到白色的特布他林的偶聯(lián)物，通過紫外吸收光譜確定產(chǎn)物的吸收峰位于276nm，其結(jié)構(gòu)圖如下 其中上述n為與一個卵清蛋白分子結(jié)合的特布他林的分子數(shù)，所述n為整數(shù)1～15。
權(quán)利要求
1.一種特布他林的偶聯(lián)物，由特布他林半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的特布他林的偶聯(lián)物，其中所述產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)是牛血清蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的特布他林的偶聯(lián)物，其結(jié)構(gòu)通式如(I) 其中 n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的特布他林的分子數(shù)，所述n為整數(shù)1～15，cBSA為活化牛血清蛋白(Cationized Bovine Serum Albumin)，分子量范圍是66KDa～69KDa；上述偶聯(lián)物顯示出如下物化特征(1)外觀白色粉末固體；(2)紫外吸收光譜276nm。
4.如權(quán)利要求3所述特布他林的偶聯(lián)物，其特征是所述n為整數(shù)1～10，活化牛血清蛋白分子量范圍是67KDa～68KDa。
5.權(quán)利要求1～4中任一項所述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是將特布他林與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物，并保持該偶聯(lián)物的生物活性不變。
6.如權(quán)利要求5所述特布他林的偶聯(lián)物的制備方法，由如下步驟完成1)溶液A的制備將活化的牛血清蛋白溶在pH＝10.5±0.6、濃度為50mM碳酸鹽緩沖液中，同時按牛血清蛋白與1，4-丁二醚摩爾比為1∶90～150的比例量取1，4-丁二醚也加入該溶液中，室溫反應(yīng)22±2小時，得無色澄清溶液A，備用；2)溶液B的制備按特布他林與1，4-丁二醚的摩爾比為2∶1-1∶1的比例稱取特布他林溶在pH＝10.5±0.6、濃度為50mM碳酸鹽緩沖液中，然后把配好的特布他林溶液滴加到通入氮氣的A溶液中，室溫反應(yīng)22±2小時，得無色澄清溶液B；3)用pH為7.30-7.50，濃度為0.01M-0.02M的磷酸緩沖液在0-4℃下，攪拌透析溶液B 70～80小時，然后改用蒸餾水透析20～30小時，每6小時更換一次透析液；4)凍干透析后的溶液，得到白色的特布他林的偶聯(lián)物。
7.如權(quán)利要求6所述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是步驟1)所述牛血清蛋白與1，4-丁二醚的摩爾比為1∶99。
8.如權(quán)利要求6所述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是步驟2)所述特布他林與1，4-丁二醚的摩爾數(shù)比為1.5∶1。
9.如權(quán)利要求6所述的特布他林的偶聯(lián)物的制備方法，其特征是步驟3)所述磷酸溶液的pH為7.4，濃度為0.01M。
10.權(quán)利要求1～4中任一項所述的特布他林的偶聯(lián)物作為免疫原在制備特布他林特異反應(yīng)抗體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通式(I)的特布他林的偶聯(lián)物，由特布他林半抗原與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)牛血清蛋白或卵清蛋白偶聯(lián)構(gòu)成。其中n為與一個牛血清蛋白分子結(jié)合的特布他林的分子數(shù)，所述n為整數(shù)1～15；cBSA為活化的牛血清蛋白，分子量范圍是66KDa～69KDa。本發(fā)明還公開了所述的偶聯(lián)物的制備方法，即將特布他林與產(chǎn)生免疫原性的載體物質(zhì)連接起來，結(jié)合為具有誘發(fā)動物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的偶聯(lián)物。本發(fā)明的特布他林的偶聯(lián)物通過免疫新西蘭大白兔，制備了效價達(dá)1∶50,000以上的抗血清，其最低檢測限為0.3ppb，IC
文檔編號G01N33/53GK101078725SQ20071001499
公開日2007年11月28日 申請日期2007年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月28日
發(fā)明者郗日沫, 張玉蘭, 盧圣欣, 劉圍, 趙承彪 申請人:山東大學(xué)