專利名稱：Hip/pap重組腺病毒及其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于潰瘍性結(jié)腸炎的治療技術(shù)領(lǐng)域，涉及HIP/PAP重組腺病毒及其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)為原因不明的以黏膜壞死和炎癥為主要病理表現(xiàn)的疾病，其發(fā)病率在中國(guó)逐年上升，而且呈現(xiàn)重癥患者越來(lái)越多的趨勢(shì)。目前臨床上對(duì)UC的治療主要以氨基水楊酸和激素制劑為主，但是對(duì)部分UC尤其是重癥患者效果差。 近年來(lái)在臨床上應(yīng)用生物制劑包括抗腫瘤壞死因子、α4β7整合素、⑶Μ等單克隆抗體治療 UC，但也只對(duì)部分患者有效，同時(shí)其應(yīng)用后的副作用也限制了患者的使用，所以迫切需要研制出安全、良效的新的UC治療藥物和方法。肝腫瘤-腸道-胰腺基因(ΗΙΡ/ΡΑΡ)，是新近發(fā)現(xiàn)的一種在炎癥組織和腫瘤組織中表達(dá)的分泌蛋白，結(jié)構(gòu)上屬于血凝素家族。具有抑制炎癥、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用。在炎癥性腸病發(fā)生過(guò)程中，ΗΙΡ/ΡΑΡ在早期階段即表達(dá)上調(diào)，具有與IL-10類似的抗炎作用，是一種強(qiáng)有力的抗炎因子，對(duì)TNF- α亦具有強(qiáng)大的抑制作用。ΗΙΡ/ΡΑΡ在胃腸道由潘氏細(xì)胞分泌，能誘導(dǎo)細(xì)菌聚集防止細(xì)菌擴(kuò)散，從這個(gè)角度來(lái)說(shuō)ΗΙΡ/ΡΑΡ是一種保護(hù)性蛋白， 在組織炎癥及損傷等易致細(xì)菌感染的情況下，能保護(hù)組織免受細(xì)菌的侵襲。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種ΗΙΡ/ΡΑΡ重組腺病毒及其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的應(yīng)用，通過(guò)重組病毒介導(dǎo)使ΗΙΡ/ΡΑΡ在腸道病變局部高效表達(dá)，起到加快潰瘍性結(jié)腸炎愈合的效果。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種ΗΙΡ/ΡΑΡ重組腺病毒，其基因組中克隆有如SEQ. ID. NO. 1所示的ΗΙΡ/ΡΑΡ基因。所述的重組腺病毒是將ΗΙΡ/ΡΑΡ基因克隆入腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后進(jìn)行腺病毒包裝而得到。所述的腺病毒表達(dá)載體為重組腺病毒載體pAd-HIP/PAP，所述的宿主細(xì)胞為 AD293細(xì)胞；將HIP/PAP 基因克隆入 pShuttle-CMV 載體后得到 pShuttle-CMV-HIP/PAP 載體， 再將其轉(zhuǎn)化入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組后得到重組腺病毒載體pAd-HIP/PAP。HIP/PAP分子應(yīng)用于抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物的制備。所述是促潰瘍性結(jié)腸炎引發(fā)的TNF-α及IL_6表達(dá)下調(diào)的藥物的制備。所述是減少結(jié)腸黏膜氧化損害的藥物的制備。所述是促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖的藥物的制備。
所述的HIP/PAP分子是通過(guò)包含HIP/PAP基因的外源性表達(dá)載體在炎癥局部的表達(dá)而產(chǎn)生。所述的包含HIP/PAP基因的外源性表達(dá)載體是構(gòu)建于腺病毒基因組中，由重組腺病毒進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。所述的包含HIP/PAP基因的外源性表達(dá)載體為重組腺病毒載體pAd-HIP/PAP，將 HIP/PAP基因克隆入pShuttle-CMV載體后得到pShuttle-CMV-HIP/PAP載體，再將其轉(zhuǎn)化入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組后得到。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明公開了一種可用于治療潰瘍性結(jié)腸炎的新分子HIP/PAP，成功構(gòu)建了表達(dá) HIP/PAP的重組腺病毒Ad-HIP/PAP，通過(guò)重組腺病毒灌腸的方法使HIP/PAP在大鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)高效表達(dá)。結(jié)果表明，HIP/PAP表達(dá)上調(diào)后，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重減輕不明顯，便血及腹瀉情況較對(duì)照組相比明顯緩解，處死大鼠后觀察結(jié)腸黏膜潰瘍及炎癥明顯減輕，促炎因子表達(dá)顯著下調(diào)，結(jié)腸黏膜氧化損害明顯減輕，此外，HIP/PAP亦可促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)，加速潰瘍愈合，對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有顯著的治療作用。目前臨床上對(duì)UC的治療主要以氨基水楊酸和激素制劑為主，需長(zhǎng)期服藥，對(duì)部分 UC尤其是重癥患者效果差。近年來(lái)在臨床上應(yīng)用生物制劑包括抗腫瘤壞死因子、α4β7整合素、OTm等單克隆抗體治療UC，但這些生物制劑都只針對(duì)與UC發(fā)生發(fā)展相關(guān)的某個(gè)分子，也只對(duì)部分患者有效，同時(shí)其應(yīng)用后的副作用也限制了患者的使用。抗炎與促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)是治療UC的兩個(gè)主要入手點(diǎn)，現(xiàn)有治療方法多局限于其中一點(diǎn)而不能二者兼顧，而 HIP/PAP在本身具有抗炎、促進(jìn)損傷結(jié)腸黏膜上皮再生作用的同時(shí)可明顯下調(diào)多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，上調(diào)IL-10等抗炎因子的表達(dá)，從多個(gè)角度發(fā)揮治療作用。


圖1為pAd-HIP/PAP重組腺病毒載體的酶切鑒定結(jié)果圖；圖2為各實(shí)驗(yàn)組的大鼠體重變化圖；圖3為為各實(shí)驗(yàn)組的大鼠DAI評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；圖4-1為各實(shí)驗(yàn)組大鼠的結(jié)腸大體形態(tài)圖，圖6-2為各實(shí)驗(yàn)組大鼠的結(jié)腸形態(tài)評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；圖5-1為各組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織切片H&E染色結(jié)果如圖，圖5-2為各組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；圖6為Western-blot檢測(cè)HIP/PAP表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果；圖7為定量分析HIP/PAP表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果圖；圖8-1 圖8-3分別為各組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸黏膜MPO活性、MDA含量及SOD活性檢測(cè)的結(jié)果圖；圖9-1為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HIP/PAP對(duì)H2A誘導(dǎo)的SW480和LoVo細(xì)胞凋亡的抑制結(jié)果圖，圖9-2為SW480和LoVo細(xì)胞凋亡率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；圖10-1 圖10-2分別為TNF- α及IL-6的Western-blot檢測(cè)結(jié)果圖；圖11-1 圖11-2分別為TNF-α及IL-6的定量分析結(jié)果圖；圖12為各組實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)腸組織切片PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果；
圖13-1 圖13-2分別為HIP/PAP高表達(dá)對(duì)SW480及LoVo細(xì)胞增殖的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種通過(guò)在結(jié)腸黏膜表達(dá)HIP/PAP分子治療潰瘍性結(jié)腸炎的新用途和新方法，成功構(gòu)建了表達(dá)HIP/PAP的重組腺病毒Ad-HIP/PAP，通過(guò)重組腺病毒灌腸的方法使HIP/PAP在大鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)高效表達(dá)。體內(nèi)體外檢測(cè)結(jié)果表明HIP/PAP能緩解潰瘍性結(jié)腸炎的便血及腹瀉，明顯減輕結(jié)腸黏膜炎癥，顯著下調(diào)促炎因子表達(dá)，減輕結(jié)腸黏膜氧化損害，促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)，加速潰瘍愈合。下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。1、目的基因HIP/PAP的擴(kuò)增取潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸粘膜組織，Trizol (invitrigen公司)法提取總RNA，一步法RT-PCR (TaKaRa公司)合成HIP/PAP，所擴(kuò)增的從第62bp到第589bp的長(zhǎng)度為52^ρ 的HIP/PAP閱讀框序列與Genbank —致。參考GenBank人HIP/PAP基因序列，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)如下的擴(kuò)增引物F :5，-GGGGTACCAT GCTGCCTCCC ATGGCCR5' -CGGCTCGAGC TAGTGGTGGT GGTGGTGGTG GTCAGTGAACTTGCAGAC分別在上游引物5’端和下游引物3’端引入KpnI和B10I的酶切位點(diǎn)，下游引物加入6XHis標(biāo)簽，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為552bp ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段大小約^2bp，HIP/PAP基因擴(kuò)增成功。2、腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pShuttle-CMV-HIP/PAP的構(gòu)建(1)將PCR擴(kuò)增的HIP/PAP基因片段經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收試劑盒回收；(2)將pShuttle-CMV載體和HIP/PAP基因片段分別用KpnI和XhoI雙酶切，分別膠回收后T4連接酶(TaKaRa) 16°C過(guò)夜連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ToplO感受態(tài)細(xì)菌。具體步驟如下1)取ToplO感受態(tài)細(xì)菌1支，置于冰上，加入連接產(chǎn)物5 μ 1，混勻，冰浴45min ；》42°C熱休克2min，再次冰浴^iiin后加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基400 μ 1，放入 37 °C水浴箱水浴1小時(shí)；3)取300 μ 1鋪卡那霉素固體LB平板，37°C溫箱正置1小時(shí)后倒置培養(yǎng)過(guò)夜；4)第二日挑取較小單菌落，卡那霉素液體LB培養(yǎng)基37°C震蕩培養(yǎng)。待菌液渾濁， OD值在1. 6-1. 8左右時(shí)提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，正確克隆命名為pSiuttle-CMV-HIP/PAP。3、重組腺病毒載體pAd-HIP/PAP的構(gòu)建和鑒定(1)取pShuttle-CMV-HIP/PAP質(zhì)粒15 μ 1，經(jīng)RneI酶切完全線形化，牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)去磷酸化后，瓊脂糖凝膠回收。PmeI酶切線形化體系pShuttle-CMV-HIP/PAP 15 μ 1PmeI 1. 5μ 1IOXbuffer 3μ 1IOXBSA 3μ 1
加水至30 μ 1CIAP去磷酸化體系PmeI酶切線形化質(zhì)粒30 μ 1CIAP 1 μ 1IOXbuffer 4μ 1加水至40 μ 1(2)腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι轉(zhuǎn)化E. coli BJ5183感受態(tài)細(xì)胞1)取BJ5183感受態(tài)細(xì)菌1支，置于冰上，加入腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-ΙΙμ 1，混勻，冰浴90min ；》42°C熱休克2min，再次冰浴^iiin后加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基400 μ 1，放入 37 °C水浴箱水浴1小時(shí)；3)取300 μ 1鋪氨芐青霉素抗性固體LB平板，37°C溫箱正置1小時(shí)后倒置培養(yǎng)過(guò)夜；4)第二日挑取較小單菌落，氨芐青霉素抗性液體LB培養(yǎng)基37°C震蕩培養(yǎng)。待菌液渾濁，OD值在1. 6-1. 8左右時(shí)提取質(zhì)粒并跑膠鑒定。(3)含pAdeasy-Ι的感受態(tài)BJ5183菌的制備1)取含pAdeasy-Ι的BJ5183菌30 μ 1加入3ml含氨芐青霉素和鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過(guò)夜；2)第二日再取30 μ 1上述菌液加入3ml含氨芐青霉素和鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩2小時(shí)，待OD值至0. 6-0. 8左右停止活化；3)將1. 5ml離心管置于冰上，倒入菌液，冰浴lOmin，4°C離心，8000rpm，5min，重復(fù)
上述過(guò)程一次以收集更多細(xì)菌，盡量倒掉上清；4)加入400 μ 1冰預(yù)冷的0. ImolCacl2，重懸細(xì)菌，4°C離心，8000rpm，5min，倒掉上清；5)加入50 μ 1冰預(yù)冷的CaCl2重懸細(xì)菌，放入4°C過(guò)夜，第二日轉(zhuǎn)化。(4)重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-HIP/PAP和腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1 在E. coli BJ5183感受態(tài)細(xì)菌中進(jìn)行同源重組將克隆了 HIP/PAP基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒 pShuttle-CMV-HIP/PAP與攜帶了腺病毒大部分基因組的質(zhì)粒pAdeasy-Ι共轉(zhuǎn)化RecA+細(xì)菌，在細(xì)菌RecA重組酶作用下，通過(guò)原核ORI與另一個(gè)同源臂重組的方式在細(xì)菌中獲得重組腺病毒基因組質(zhì)粒，再經(jīng)抗性篩選獲得重組腺病毒基因組質(zhì)粒，具體為1)取BJ5183感受態(tài)細(xì)菌1支，置于冰上，加入RiieI酶切完全線性化去磷酸化的 pShuttle-CMV-HIP/PAP 5 μ 1，混勻后冰浴 90min ；2)熱休克2min，再次冰浴^iiin后加入無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基400 μ 1，放入37°C水浴箱水浴1小時(shí)；3)離心后吸出上清200 μ 1，余菌液混勻后鋪卡那霉素固體LB平板，37°C溫箱正置 1小時(shí)后倒置培養(yǎng)過(guò)夜；4)第二日挑取較小光滑單菌落，卡那霉素液體LB培養(yǎng)基37°C震蕩培養(yǎng)。待菌液渾濁，OD值在1.6-1. 8左右時(shí)提取質(zhì)粒，注意重組腺病毒質(zhì)粒較大，提取時(shí)輕柔防止基因組斷裂。
(5)提取質(zhì)粒I^acI酶切鑒定DI^acI 酶切體系重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HIP/PAP 1 μ 1限制性內(nèi)切酶I^acI 0. 5 μ 1IOXBuffer 1 μ 1100 X BSA 0. 1 μ 1加去離子水至總體積10 μ 12)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察，具體結(jié)果如圖1所示，可見酶切后出現(xiàn) 30kb左右及4. 5kb左右兩條帶的質(zhì)粒確定為陽(yáng)性重組子，重組質(zhì)粒命名為pAd-HIP/PAP，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 α，大量抽提質(zhì)粒備用。采取pAdTrack-CMV-GFP作為對(duì)照載體，同樣條件包裝含GFP的腺病毒為對(duì)照組。4、重組腺病毒的包裝與擴(kuò)增(1)AD293細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1)AD293細(xì)胞的復(fù)蘇將細(xì)胞株A^93從_196°C的液態(tài)氮中迅速取出，置入已經(jīng)預(yù)熱好的37°C水浴箱中解凍，并不斷搖晃，使管中的液體迅速融化，約1 aiiin后，觀察管中液體已完全溶解，取酒精棉球擦拭凍存管外壁，移入超凈臺(tái)中并將懸浮液轉(zhuǎn)移至已加入5ml 高糖DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置入37°C和5% CO2孵育箱中培養(yǎng)。》AD293細(xì)胞的傳代培養(yǎng)AD293細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶貼壁長(zhǎng)滿80%后，棄培養(yǎng)基， 用經(jīng)37°C預(yù)熱的含0.5%胰酶(含0. 03% EDTA)消化，棄去消化液，加入新鮮培養(yǎng)基20ml， 輕輕吹打，使細(xì)胞成為單細(xì)胞懸液，吸出分到新培養(yǎng)瓶中，每瓶5ml。通常按1 4比例傳代，在37°C和5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。每2 3天更換一次培養(yǎng)基。(2)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞1)將復(fù)蘇后的AD293細(xì)胞傳代至六孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，長(zhǎng)滿50% 70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染；2)分別將I^cI酶切線性化后的重組腺病毒pAd-HIP/PAP 6 μ 1力Π入100 μ 1無(wú)血清、無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)液中充分混勻，6 μ 1的Sofast轉(zhuǎn)染試劑加入100 μ 1無(wú)血清、無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)液中充分混勻，將兩種懸液混合后室溫孵育15min ；3)此時(shí)棄去AD293細(xì)胞的高糖DMEM完全培養(yǎng)液，用4ml DMDM溶液小心洗細(xì)胞一次(不要吹打)；加入anl DMEM完全培養(yǎng)液；4) Sofast-DNA的復(fù)合溶液室溫作用15min后，用吸管一滴滴加入細(xì)胞瓶中，置 37°C,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；逐日觀察細(xì)胞；5)同樣條件處理pAdTrack-CMV-GFP對(duì)照組。(3)收獲病毒 Ad-HIP/PAP7 14天后，倒置顯微鏡下觀察見293細(xì)胞逐步出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變圓、細(xì)胞聚集形成串珠狀或者細(xì)胞團(tuán)，并且從貼壁狀態(tài)脫落下來(lái)等，將細(xì)胞用細(xì)胞刮子刮下后，離心收集細(xì)胞，用Iml原上清重懸細(xì)胞，其余上清-20°C凍存，重懸細(xì)胞反復(fù)凍融三次，使細(xì)胞完全破碎后離心。收集含病毒的上清，命名為Ad-HIP/PAP，于_80°C保存待用。同樣條件包裝含有GFP基因的腺病毒Ad-GFP。(4)重組腺病毒滴度的測(cè)定Quantitative Real-time PCR(qPCR)法測(cè)定重組腺病毒滴度CMV 引物上游 5 ‘ -GCGTGGATAGCGGTTTGACT-3 ‘下游 5 ‘ -CAATGGGGCGGAGTTGTT-3 ‘產(chǎn)物片段約12!3bp。qPCR反應(yīng)體系1)子水 9. 5 μ L、2Xbuffer 12. 5 μ 1.R0X 0. 5 μ l.SYBRGreen I 1口1、模板1口1、 上游引物0. 25 μ 1、下游引物0. 25μ 1 ；2)制7管反應(yīng)體系，計(jì)算重組質(zhì)粒pAd-HIP/PAP拷貝數(shù)，稀釋至IO7拷貝數(shù)、IO6拷貝數(shù)、IO5拷貝數(shù)、IO3拷貝數(shù)。模板分別為重組質(zhì)粒pAd-HIP/PAPIO7拷貝數(shù)、IO6拷貝數(shù)、IO5 拷貝數(shù)、IO3拷貝數(shù)、水、病毒基因組Ad-HIP/PAP和Ad-GFP ；3)勻，按一定順序放于Real-Time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增；4)應(yīng)條件95°C預(yù)變性10s、95°C變性5s、50°C退火15s、72°C延伸23s并收集熒光。溶解曲線開始溫度60°C、結(jié)束溫度90°C、升溫速度1°C /s、保持IOs ；5)標(biāo)準(zhǔn)曲線及溶解度曲線，計(jì)算得到種病毒滴度分別為Ad-HIP/PAP 9. 8 XlO9V. g/ml ；Ad-GFP 4. 9X 109v. g/ml。5、重組腺病毒對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎療效檢測(cè)由于腺病毒感染機(jī)體后外源蛋白表達(dá)量是一個(gè)逐漸升高的過(guò)程，感染后48小時(shí)為蛋白表達(dá)高峰期，因此中采用先感染后造模的方式。(1)選擇清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200士40g。將大鼠隨機(jī)分為4組，后三組為5%葡聚糖硫酸鈉潰瘍性結(jié)腸炎造模大鼠，命名為正常對(duì)照組(10只)、 PBS+DSS 組(10 只)、Ad-GFP+DSS 組(10 只)、Ad-HIP/PAP+DSS 組(11 只)。4 組大鼠體質(zhì)量間有可比性，各組大鼠麻醉后按下述方案實(shí)驗(yàn)。1)正常對(duì)照組500 μ 1 PBS灌腸；2) PBS+DSS 組給予 500 μ 1 PBS 灌腸;3) Ad-GFP+DSS 組注入給予溶有 4. 9 X 109v. g/ml 腺病毒 Ad-GFP 的 500 μ 1 PBS 灌腸；4) Ad-HIP/PAP+DSS 組注入給予溶有 4. 9 X 109v. g/ml 重組腺病毒 Ad-HIP/PAP 的 500 μ 1 PBS 灌腸。( UC大鼠模型的制備葡聚糖硫酸鈉(DSQ模型將PBS+DSS組、Ad-GFP+DSS組、Ad-HIP/PAP+DSS組大鼠構(gòu)建成急性期潰瘍性結(jié)腸炎模型各組大鼠灌腸M小時(shí)后，給予5% DSS溶液自由飲用7天，2天后可見典型潰瘍性結(jié)腸炎臨床表現(xiàn)，如大便松散，糞便隱血試驗(yàn)陽(yáng)性，體重不增。(3)大鼠體重及DAI評(píng)分稱取的大鼠體重，并根據(jù)大鼠體重減輕情況，便血情況以及大便性狀評(píng)估各實(shí)驗(yàn)組大鼠DAI評(píng)分，評(píng)分依據(jù)如表1所示。糞便隱血測(cè)定方法1)挑取標(biāo)本用竹簽挑取少量新鮮糞便涂于干凈濾紙上；2)加試劑滴加10g/L的鄰聯(lián)甲苯胺冰乙酸溶液及3%的過(guò)氧化氫1 2滴于新鮮糞便上；3)判斷結(jié)果a、加試劑后aiiin仍不顯色，為陰性；b、加試劑后^iin內(nèi)顯藍(lán)色，即為陽(yáng)性。表IDAI評(píng)分依據(jù)
權(quán)利要求
1.一種HIP/PAP重組腺病毒，其特征在于，其基因組中克隆有如SEQ. ID. NO. 1所示的 HIP/PAP 基因。
2.如權(quán)利要求1所述的HIP/PAP重組腺病毒，其特征在于，是將HIP/PAP基因克隆入腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后進(jìn)行腺病毒包裝而得到。
3.如權(quán)利要求2所述的HIP/PAP重組腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒表達(dá)載體為重組腺病毒載體pAd-HIP/PAP，所述的宿主細(xì)胞為AD293細(xì)胞；將HIP/PAP基因克隆入pShuttle-CMV載體后得到重組穿梭質(zhì)粒pShuttIe-CMV-HIP/ PAP,并將其轉(zhuǎn)化入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組后得到重組腺病毒載體pAd-HIP/PAP。
4.HIP/PAP分子應(yīng)用于抗?jié)冃越Y(jié)腸炎藥物的制備。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于促由潰瘍性結(jié)腸炎引發(fā)的TNF-α及 IL-6表達(dá)下調(diào)的藥物的制備。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于減少結(jié)腸黏膜氧化損害的藥物的制備。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖的藥物的制備。
8.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的HIP/PAP分子是通過(guò)包含HIP/PAP基因的外源性表達(dá)載體在炎癥局部的表達(dá)而產(chǎn)生。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的包含HIP/PAP基因的外源性表達(dá)載體是構(gòu)建于腺病毒基因組中，由重組腺病毒進(jìn)行介導(dǎo)轉(zhuǎn)染。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的包含HIP/PAP基因的外源性表達(dá)載體為重組腺病毒載體pAd-HIP/PAP，將HIP/PAP基因克隆入pShuttle-CMV載體后得到 pSiuttle-CMV-HIP/PAP載體，再將其轉(zhuǎn)化入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-Ι的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行同源重組后得到。
全文摘要
本發(fā)明公開了HIP/PAP重組腺病毒及其抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的應(yīng)用，構(gòu)建了表達(dá)HIP/PAP的重組腺病毒Ad-HIP/PAP，通過(guò)重組腺病毒灌腸的方法使HIP/PAP在大鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)高效表達(dá)。HIP/PAP表達(dá)上調(diào)后，潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體重減輕不明顯，便血及腹瀉情況較對(duì)照組相比明顯緩解，處死大鼠后觀察結(jié)腸黏膜炎癥明顯減輕，促炎因子表達(dá)顯著下調(diào)，結(jié)腸黏膜氧化損害明顯減輕，此外，HIP/PAP亦可促進(jìn)結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)結(jié)腸黏膜修復(fù)，加速潰瘍愈合，對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有顯著的治療作用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102559759SQ20111044492
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者呂頤菲, 李爽, 楊小飛, 殷燕, 田筱青, 蘇厚強(qiáng), 蔣會(huì)平, 郝志明 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院