人3型腺病毒展示人14型腺病毒中和抗原表位疫苗候選株的制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及重組病毒基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人3型腺病毒展示人14型 腺病毒中和抗原表位疫苗候選株的制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒首次發(fā)現(xiàn)于1953年，能夠引起許多疾病，包括急性呼吸道疾?。ˋRD)，肺 炎，流行性角結(jié)膜炎、急性腸胃炎。根據(jù)其基因組DNA的同源性及差異，人腺病毒（HAdVs) 分為七大類（A-G)，超過65種血清型，不同的腺病毒可以引起不同的疾病。腺病毒14型(也 被稱為"agentdeWit"或者HAdV-14p)最早發(fā)現(xiàn)于1955年，是在荷蘭爆發(fā)急性呼吸道疾 病的軍營中分離得到。隨后相繼在英國（1955年)、烏茲別克斯坦（1962年)、捷克斯洛伐克 ( 1963年)等地發(fā)現(xiàn)。腺病毒14型屬于B2亞種腺病毒，截止于上個世紀90年代，主要發(fā)現(xiàn) 于歐洲和亞洲部分地區(qū)，在西半球未有報道，且未引發(fā)嚴重的呼吸系統(tǒng)疾病，如住院或者死 亡病例。然而，在2006-2007年，腺病毒14型在美國引起了嚴重的下呼吸道疾病，在紐約， 俄勒閃州，華盛頓和得克薩斯州導(dǎo)致至少10人死亡，140例病例。研究表明，重新爆發(fā)的該 腺病毒14型屬于新的基因型HAdV-14pl(也被稱為HAdV-14a)，與原型差異最大的地方在 于纖毛基因存在6個堿基對的缺失。由于大多數(shù)人群對此變異毒株并無抗體，且該毒株具 高致病性，相對死亡率較高，目前沒有有效的治療藥物和方法，故疫苗接種無疑是預(yù)防腺病 毒14型感染的最佳途徑。
[0003] 腺病毒（Adenovirus;ADV)是一個二十面體的對稱結(jié)構(gòu)，殼體由252個殼體亞單位 組成，其中位于二十面體的12個頂角的是五鄰體蛋白及一條長度為10-30nm的纖維突起， 另外240個非頂角顆粒是由六鄰體三聚體構(gòu)成，能刺激機體產(chǎn)生中和抗體以及組和型特異 性抗體。不同型別腺病毒的六鄰體蛋白的氨基酸序列有很高的同源性，其差異主要集中在 暴露于病毒六鄰體表面的高變（HypervariableRegions;HVRs)，而型特異性中和抗體的識 別位點就集中在這些高變區(qū)上。腺病毒的高變區(qū)包含了主要的中和性抗原表位，能刺激機 體產(chǎn)生高滴度的保護性中和抗體，是腺病毒亞單位疫苗的最重要的蛋白。近年來已經(jīng)有很 多獨特的表位已經(jīng)被鑒定出來并應(yīng)用于傳染病、癌癥和自身免疫性疾病的疫苗研究。然而 單獨的表位肽免疫原性弱，不能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和免疫記憶，因而近年來發(fā)展了很多方法，如 新型佐劑、脂肽偶聯(lián)、應(yīng)用通用T細胞表位、多抗原肽、納米呈遞系統(tǒng)及病毒載體等，促進了 表位疫苗的發(fā)展。
[0004] 接種腺病毒疫苗是預(yù)防14型腺病毒感染最有效的方法之一，但是目前臨床上并 無疫苗上市。病毒載體可以有些誘導(dǎo)體液和細胞免疫應(yīng)答，因此廣泛應(yīng)用于癌癥預(yù)防和治 療以及感染性疾病的疫苗，包括鼻病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、麻疹病毒載體、慢病 毒載體、流感病毒載體等。其中腺病毒載體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥和感染性疾病的基因治療 和疫苗研究中。研究結(jié)果表明，在不影響病毒的復(fù)制、感染性及穩(wěn)定性的前提下，可以將短 肽直接替換或插入到人3型六鄰體的某些高變區(qū)中，產(chǎn)生具有新的抗原特異性的病毒粒 子。這種基于腺病毒的抗原表位呈示系統(tǒng)有非常多的優(yōu)點：第一，腺病毒分子量大，其本身 是一種極好的免疫佐劑，有效地刺激機體產(chǎn)生特異性的細胞免疫和體液免疫。第二，六鄰體 是腺病毒殼體上最豐富的免疫原，在六鄰體蛋白中插入一個外源抗原表位，則每個腺病毒 就可以展現(xiàn)720個抗原表位，抗原表位可得以充分表達。第三，目的抗原肽插入六鄰體后是 暴露于病毒殼體的表面，能有效地刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，不需要進行轉(zhuǎn)基因表達，克服了 腺病毒轉(zhuǎn)基因載體的缺點。第四，腺病毒載體疫苗具有高安全性、高產(chǎn)量，并且易于生產(chǎn)。疫 苗病毒株構(gòu)建成功后可以進一步改構(gòu)成復(fù)制缺陷型提高其安全性。第五，腺病毒六鄰體上 有多個抗原表位可被置換，可以構(gòu)建針對多種病毒型別的多價疫苗重組病毒株。
[0005] 因此，利用人3型腺病毒衣殼展示人14型腺病毒中和抗原表位，將HAdvl4的兩個 中和性抗原表位A14R2和A14R4 (氨基酸序列分別為"LEVPAE⑶P"和"TEEAGNIEY"）分別插 入3型腺病毒六鄰體衣殼蛋白，同時保留人3型腺病毒主要抗原的重組人14型腺病毒-人 3型腺病毒疫苗候選株有望用于同時預(yù)防HAdvl4感染和HAdv3感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種重組人3型 腺病毒及其制備方法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種重組人3型腺病毒，所述重組人3型腺病毒的六鄰體中嵌入 了兩種HAdvl4中和表位A14R2和A14R4,所述HAdvl4中和表位A14R2的氨基酸序列為 LEVPAE⑶P，所述HAdvl4中和表位A14R4的氨基酸序列為TEEAGNIEY。
[0008] 優(yōu)選的，所述HAdvl4的中和表位A14R2的替換區(qū)為所述HAdv3六鄰體HVR2區(qū)，所 述HAdvl4的中和表位A14R4的替換區(qū)為所述HAdv3六鄰體的HVR4區(qū)。
[0009] 更為優(yōu)選的，所述HAdvl4中和表位A14R2替換的氨基酸序列為HAdv3六鄰體HVR2 區(qū)的KDITTTEGEE，所述HAdvl4中和表位A14R4替換的氨基酸序列為HAdv3六鄰體HVR4區(qū) 的PTTEGGVETEEP。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種人3型腺病毒-人14型腺病毒的雙價疫苗候選株，所述雙價 疫苗候選株含有權(quán)利要求1-3任一項所述的重組人3型腺病毒。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種載體，所述載體包含權(quán)利要求1-3任一項所述的重組人3型 腺病毒。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種重組人3型腺病毒的制備方法，包括如下步驟： 在人3型腺病毒六鄰體上嵌入了兩個HAdvl4中和表位A14R2和A14R4 ;其中， 所述HAdvl4中和表位A14R2的氨基酸序列為LEVPAE⑶P，所述HAdvl4中和表位A14R4 的氨基酸序列為TEEAGNIEY; 所述HAdv14中和表位A14R2替換的氨基酸序列為HAdv3六鄰體HVR2區(qū)的KDITTTEGEE， 所述HAdvl4中和表位A14R4替換的氨基酸序列為HAdv3六鄰體HVR4區(qū)的PTTEGGVETEEP。
[0013] 本發(fā)明所提供的重組人3型腺病毒，允許HAdvl4中和表位個別氨基酸的缺失、替 換或添加，但需要保持中和表位的免疫原性；允許被置換的HVR2區(qū)和HVR4區(qū)序列個別氨基 酸的缺失、替換或添加，但需要保持腺病毒的穩(wěn)定性，同時保證外源表位的免疫活性；本發(fā) 明中嵌入的HAdvl4中和表位并不限于A14R2和A14R4,也可以是其它的保護性T細胞表位 或B細胞表位，但需要保持腺病毒的穩(wěn)定性和保證外源表位的免疫原性。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明中，在六鄰體衣殼上同時展示HAdvl4的兩種主要 中和表位，產(chǎn)生強烈的抗HAdvl4感染的保護性免疫應(yīng)答，多次注射能加強免疫。同時，本發(fā) 明的重組人3型腺病毒保留了HAdv3的主要抗原活性，該重組病毒可以同時用于預(yù)防HAdv3 的感染。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明重組人3型腺病毒的六鄰體修飾的重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖。其中， Μ為DL15000,1-2 均為pAdΛE3GFPA14R2、3-4 均為pAdΛE3GFPA