一種重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括以下步驟：工程菌發(fā)酵、工程菌破碎、包涵體洗滌、重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化、變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性、復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置、重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離。本發(fā)明的方法，工程菌發(fā)酵過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)在較高菌體濃度下達(dá)到高效誘導(dǎo)表達(dá)，并在變性重組人血管內(nèi)皮抑素復(fù)性過(guò)程中達(dá)到較高的復(fù)性率，由此實(shí)現(xiàn)了重組人血管內(nèi)皮抑素大規(guī)模生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于重組蛋白的提取純化領(lǐng)域，具體涉及一種重組人內(nèi)皮抑素的提取純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人血管內(nèi)皮抑素，是目前作用最強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)效果最好的腫瘤血管生成抑制劑。實(shí)驗(yàn)表明，內(nèi)皮抑素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、生長(zhǎng)的血管可產(chǎn)生抑制作用，可對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起到較好的抑制作用。從其作用機(jī)理來(lái)講，人血管內(nèi)皮抑素是通過(guò)抑制人體內(nèi)腫瘤組織的血液供應(yīng)使腫瘤缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣而停止生長(zhǎng)、進(jìn)而逐步萎縮直至死亡的，相較于目前臨床普遍使用的化療藥物，具有無(wú)明顯毒副作用的優(yōu)點(diǎn)，因而受到了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。
[0003]目前，人血管內(nèi)皮抑素主要是先通過(guò)基因重組技術(shù)獲得攜帶人血管內(nèi)皮抑素基因的工程菌，再將工程菌表達(dá)目標(biāo)蛋白經(jīng)提取純化而制備得到的。在重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化過(guò)程中，由于重組人血管內(nèi)皮抑素工程菌的特性以及人血管內(nèi)皮抑素結(jié)構(gòu)的特殊性，在重組人血管內(nèi)皮抑素的工業(yè)生產(chǎn)上，普遍存在目標(biāo)產(chǎn)物得率低的問(wèn)題。
[0004]具體而言，造成重組人血管內(nèi)皮抑素產(chǎn)量低的原因主要有以下兩方面:(I)為使工程菌表達(dá)重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，需在工程菌發(fā)酵時(shí)，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的操作。而現(xiàn)有的誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)在進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，為保證較高的誘導(dǎo)表達(dá)量，通常需要耗費(fèi)大量的培養(yǎng)基、培養(yǎng)液，以保持菌液的菌體濃度處于較低水平，而提高菌體濃度，并同步提高誘導(dǎo)劑用量時(shí)，則不僅會(huì)由于重組人血管內(nèi)皮抑素的工程菌對(duì)誘導(dǎo)劑的耐受性迅速上升、敏感性顯著下降，進(jìn)而不可避免的出現(xiàn)誘導(dǎo)重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)量下降的現(xiàn)象，無(wú)法獲得較高的誘導(dǎo)表達(dá)量，同時(shí)，高濃度的菌體濃度下，也需要濃度較高的培養(yǎng)基、培養(yǎng)液，而菌體在這種環(huán)境下必然生長(zhǎng)較快，養(yǎng)分易過(guò)早耗盡，進(jìn)而造成菌體過(guò)早衰老而自溶，無(wú)法獲得理想的表達(dá)量。無(wú)論哪一種情況，均意味著大規(guī)模生產(chǎn)中重組人血管內(nèi)皮抑素的生產(chǎn)效率極低，會(huì)造成大量的原料耗費(fèi)，因而造成最終的目標(biāo)蛋白收率較低；(2)由于工程菌表達(dá)的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白以包涵體形式存在，所以通常需經(jīng)過(guò)復(fù)性才能變成有生物活性的內(nèi)皮抑素。在復(fù)性過(guò)程中，重組人血管內(nèi)皮抑素的二硫鍵重新形成，其伸展的多肽肽鏈會(huì)由二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊成三級(jí)結(jié)構(gòu)的天然構(gòu)象，從而使生物活性得以恢復(fù)。然而，由于人血管內(nèi)皮抑素的自然折疊率低，大部分二硫鍵均需要在復(fù)性的過(guò)程中形成，而人血管內(nèi)皮抑素又具有兩對(duì)二硫鍵，兩對(duì)二硫鍵均需正確配對(duì)，才能復(fù)性為有生物活性的內(nèi)皮抑素，加之蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)本身具有可變性，形成正確的二硫鍵并不容易，錯(cuò)誤折疊和聚合往往會(huì)造成復(fù)性收率較低，因此,實(shí)現(xiàn)高的復(fù)性收率具有較大的難度。同時(shí)，內(nèi)皮抑素本身呈偏酸性，在中性和堿性環(huán)境下活性和溶解性均不穩(wěn)定、易失活，對(duì)環(huán)境的敏感性也在一定程度上增加了重組人血管內(nèi)皮抑素的實(shí)現(xiàn)高復(fù)性收率的難度，使重組人血管內(nèi)皮抑素目標(biāo)產(chǎn)物收率較低。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可適用于重組人血管內(nèi)皮抑素大規(guī)模生產(chǎn)，工程菌發(fā)酵過(guò)程中可實(shí)現(xiàn)在較高菌體濃度下達(dá)到高效誘導(dǎo)表達(dá)、在變性重組人血管內(nèi)皮抑素復(fù)性過(guò)程中達(dá)到較高的復(fù)性收率的重組人血管內(nèi)皮抑素提取純化方法。
[0006]本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括以下步驟:
[0007](I)工程菌發(fā)酵:將工程菌發(fā)酵至發(fā)酵液OD6tltl值為10-15，加入誘導(dǎo)劑IPTG、碳源物質(zhì)以及氮源物質(zhì)，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為0.2-0.4mmol/L，在30-37°C下，對(duì)工程菌培養(yǎng)2.5-3.5h，再向其中加入誘導(dǎo)劑IPTG，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為0.1-0.3mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 3-5h ；
[0008]需要說(shuō)明的是，所述碳源與氮源物質(zhì)，其選擇并不唯一，可提供菌體發(fā)酵過(guò)程中所需的碳、氮的物質(zhì)均可。本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述碳源物質(zhì)為葡萄糖；所述氮源物質(zhì)為酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一種或多種。進(jìn)一步優(yōu)選的，所述葡萄糖的濃度為12-15g/L ;所述酵母提取物的濃度為4-6g/L ;所述胰蛋白胨的濃度為10_20g/L ;所述水解酪蛋白的濃度為10-20g/L。
[0009]所述工程菌的發(fā)酵還包括:取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，按發(fā)酵體積的5-8%接種量，接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，再發(fā)酵至0D_值10-15。其中，所述LB培養(yǎng)基包括:胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉5g/L。
[0010](2)工程菌破碎:對(duì)步驟I)中得到的發(fā)酵液進(jìn)行洗滌、離心，留沉淀物，向發(fā)酵液中加入溶菌酶，在2-8°C下，攪拌均勻，破碎至細(xì)菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；[0011 ] 洗滌細(xì)菌采用的洗滌液可以是緩沖液，具體的，可以是pH值為8.0的20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液。
[0012]破碎可采用勻質(zhì)機(jī)在壓力200-500pa下破碎，也可采用超聲波進(jìn)行破碎。破碎后，可采用鏡檢檢測(cè)細(xì)菌破碎率。
[0013](3)包涵體洗滌:將破碎后的菌液離心，留沉淀物，將沉淀物用含有緩沖劑的洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌；
[0014]所述緩沖劑為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸。緩沖液的pH值優(yōu)選為8.0。
[0015](4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化:采用變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為8-10mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液；
[0016]優(yōu)選的，所述步驟(4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化具體包括，
[0017](4a)第一次變性純化:采用第一變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，稀釋所述第一變性緩沖液，再將析出的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白離心，得到一次變性沉淀物；
[0018](4b)第二次變性純化:將所述一次變性沉淀物用第二變性緩沖液溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為8-10mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液。所述第一次變性純化，以鹽酸胍作為變性劑，采用的所述第一變性緩沖液為采用鹽酸胍濃度為5-7mol/L的pH值為7.0-9.0的緩沖液；所述第二次變性純化，以尿素作為變性劑，采用的所述第二變性緩沖液為尿素濃度為6-8mol/L的pH值為7.0-9.0的緩沖液。
[0019](5)變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性:將蛋白濃度為8-10mg/ml的變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液加入復(fù)性液中，混合均勻，2-8°C下靜置至少10h，除去所述復(fù)性液，得到復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素；
[0020]優(yōu)選的，每IL的所述復(fù)性液包括以下組分:鹽酸胍l-2mol ;還原型谷胱甘肽2-3mmol ;氧化型谷胱甘肽0.2-0.3mmol ;絡(luò)合劑2-8mmol ;所述復(fù)性液的pH值為4.0-5.0。
[0021]需要說(shuō)明的是，在上述組方中，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際情況，還可選擇性的添加三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、二硫蘇糖醇(DTT)等成分。
[0022]進(jìn)一步的,每IL所述復(fù)性液還包括pH調(diào)節(jié)劑10_20mmol ;優(yōu)選的,每IL所述復(fù)性液中，包括pH調(diào)節(jié)劑IOmmol。
[0023]所述絡(luò)合劑為EDTA ;所述pH調(diào)節(jié)劑為HAc-NaAc ;當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際情況，適宜性的選擇其他絡(luò)合劑，以達(dá)到使蛋白溶液中的金屬離子形成絡(luò)合離子的目的；同樣的，所述PH調(diào)節(jié)劑也不限于HAc-NaAc，還可以是其他弱酸及其鹽形成的pH緩沖體系。
[0024]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述還原型谷胱甘肽與所述氧化型谷胱甘肽的摩爾比為8:1。
[0025]使用時(shí)，所述變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液與所述復(fù)性液的體積比為I:(100~200)為宜。
[0026](6)復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度23-27 °C下放置5-8天；
[0027]上述放置條件進(jìn)一步優(yōu)選的，在所述步驟(6)中，溫度為25°C，放置時(shí)間為6天。
[0028](7)重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離:將步驟6)中的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素層析洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，即得。
[0029]所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離可采用離子交換層析與分子篩層析結(jié)合的方式。具體為:將復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素采用陽(yáng)離子交換層析柱梯度洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白；然后，采用凝膠層析柱對(duì)離子層析后得到的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素的蛋白峰，即得。
[0030]本發(fā)明的上述技術(shù)方案，相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0031](I)本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括工程菌發(fā)酵、工程菌破碎、包涵體洗滌、重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化、變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性、復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置、重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離的步驟；
[0032]其中，在工程菌發(fā)酵的步驟中，本發(fā)明所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的誘導(dǎo)表達(dá)方法，在工程菌發(fā)酵至OD6tltl值10-15后，加入誘導(dǎo)劑IPTG，在30-37°C下，培養(yǎng)2.5-3.5h后，再加入誘導(dǎo)劑IPTG。將現(xiàn)有技術(shù)中的誘導(dǎo)劑一次性添加改為了分兩次添加，可有效的避免由于菌體對(duì)誘導(dǎo)劑耐受性上升、敏感性下降而造成的重組人血管內(nèi)皮抑素的表達(dá)量下降。尤其是，IPTG誘導(dǎo)劑在上述兩個(gè)時(shí)機(jī)分別以0.2-0.4mmol/L發(fā)酵液以及0.1-0.3mmol/L發(fā)酵液的用量加入，有效地改善了其誘導(dǎo)效果，同時(shí)，結(jié)合在第一次加入誘導(dǎo)劑后加入碳源物質(zhì)及氮源物質(zhì)，可避免在發(fā)酵初期采用高濃度培養(yǎng)基、培養(yǎng)液而造成的菌體過(guò)早衰老，也及時(shí)補(bǔ)充了菌體所需的養(yǎng)分，保證了兩次的誘導(dǎo)劑加入均能實(shí)現(xiàn)良好的誘導(dǎo)效果。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，采用上述方法，可在0D_ 值為10-15的高菌體密度下，實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)重組人血管內(nèi)皮抑素的總表達(dá)量達(dá)30%以上，滿(mǎn)足了重組人血管內(nèi)皮抑素的大規(guī)模生產(chǎn)要求。
[0033]在復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置的步驟中，將復(fù)性后的重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度23-27°C下放置5-8天，可更好的使重組人血管內(nèi)皮抑素形成正確的二硫鍵，使分子折疊還原為天然正常的空間構(gòu)象的幾率大大提高，大大增加了層析分離后蛋白的獲取量；[0034]采用上述方法，可實(shí)現(xiàn)毫克級(jí)別的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的方法可在350L發(fā)酵液的規(guī)模下，制備得到34g以上的重組人血管內(nèi)皮抑素，實(shí)現(xiàn)90mg/L以上的重組人血管內(nèi)皮抑素的產(chǎn)量。
[0035](2)本發(fā)明的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，在變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性過(guò)程中,采用的復(fù)性液為:每IL所述復(fù)性液，包括l-2mol的鹽酸胍、2-3mmol的還原型谷胱甘肽、0.2-0.3mmol的氧化型谷胱甘肽、2-8mmol的絡(luò)合劑、10-20mmol的pH調(diào)節(jié)劑，其PH值為4.0-5.0。在上述組分中，對(duì)于鹽酸胍的含量控制最為嚴(yán)格，鹽酸胍為強(qiáng)變性劑，通常認(rèn)為不應(yīng)加入復(fù)性液中，而鹽酸胍含量過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致復(fù)性液功能上趨近于變性液，待復(fù)性的重組人血管內(nèi)皮抑素在其中即使復(fù)性，也僅能以極為微量的速度復(fù)性。本發(fā)明創(chuàng)造性的在復(fù)性液中加入了鹽酸胍，反向利用了鹽酸胍在l-2mol/L的用量下，可起到維持及穩(wěn)定重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的作用，增大了內(nèi)皮抑素的兩個(gè)二硫鍵正確配對(duì)的機(jī)會(huì)，并且，可顯著促進(jìn)不溶于水的重組人血管內(nèi)皮抑素的包涵體蛋白在復(fù)性液中的溶解，有助于加快復(fù)性的進(jìn)度；與此同時(shí)，保證還原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽在本發(fā)明的用量范圍內(nèi)，可較好的催化二硫鍵的形成，與鹽酸胍的維持、穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)作用相配合，可較好的實(shí)現(xiàn)兩對(duì)二硫鍵的正確配對(duì)，顯著提高復(fù)性收率，可更好的保證重組人血管內(nèi)皮抑素的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0036]更為優(yōu)選的，保證所述還原型谷胱甘肽與所述氧化型谷胱甘肽的用量比為8:1，其催化二硫鍵形成的效果更為理想。與鹽酸胍及其他組分相互配合，可得到優(yōu)越的復(fù)性效果。
【具體實(shí)施方式】
[0037]實(shí)施例1
[0038]本實(shí)施的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括以下步驟:
[0039](I)工程菌發(fā)酵:取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，按發(fā)酵體積的6%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液體積為44L，發(fā)酵至OD6tltl值為12.5，然后，向其中加入3.75g的誘導(dǎo)劑IPTG、13g/L的碳源物質(zhì)葡萄糖、以及5g/L的氮源物質(zhì)酵母提取物，在30°C下，培養(yǎng)2.5h，再加入2.4g的誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
[0040]其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由10g/L胰蛋白胨、20g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、lg/LKH2P04、10g/L葡萄糖組成。
[0041](2)工程菌破碎:將步驟I)中得到的菌液用pH值為8.0的20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液洗滌，離心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同時(shí)加入50mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA、pH值為8.0的緩沖液，于溫度4°C下攪拌，用勻質(zhì)機(jī)在壓力500pa下破碎至鏡檢細(xì)菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0042](3)包涵體洗滌:將破碎后的菌液離心后，留沉淀物，將沉淀物用含有20mmol三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)的洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌；
[0043]在本實(shí)施例中，采用該洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌的具體方法為:采用組分為20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA, pH 值為 8.0 的緩沖液，組分為 20mmol/L Tris-HCl,IOmmoI/L EDTA、2mmoI/L2-ME ( 二巰基乙醇)、0.5v % 的曲通 X-100、pH 值為 8.0 的緩沖液，組分為 2mol/L 尿素、20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、pH 值為 8.0 的緩沖液，組分為 70v%的異丙醇、20mmol/L Tris-HCl, pH值為8.0的緩沖液，組分為20mmol/LTris-HCl、pH值為8.0的緩沖液，分別對(duì)沉淀物進(jìn)行充分?jǐn)嚢柘礈欤?br> [0044](4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化:按照以下組分配制第一變性緩沖液、第二變性緩沖液以及稀釋緩沖液，備用；
[0045]所述第一變性緩沖液:由6mol/L鹽酸胍、10mmol/L 二硫蘇糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA, IOmmoI/L Tris-HCl 組成，其 pH 值為 7.0 ；
[0046]所述第二變性緩沖液:由7mol/L尿素、100mmol/L 二巰基乙醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L NaAc 組成，其 pH 值為 7.0 ；
[0047]所述稀釋緩沖液:由10mmol/L 二硫蘇糖醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl 組成，其pH值為8.0 ；
[0048](4a)第一次變性純化:采用第一變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，向其中加入所述稀釋緩沖液，稀釋至變性劑鹽酸胍濃度為2-3mol/L，再將析出的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白離心，得到一次變性沉淀物；
[0049](4b)第二次變性純化:將所述一次變性沉淀物用第二變性緩沖液溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為8mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液。
[0050](5)變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性:配制15L復(fù)性液待用，該復(fù)性液的組成，以IL計(jì)，由1.5mol鹽酸胍、2mmol還原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc 組成，pH 值為 5.0。
[0051]將蛋白濃度為8mg/ml的變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液100mL以8ml/min的速度加所述入復(fù)性液中，混合均勻，于4°C下靜置18h，除去所述復(fù)性液，得到復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素；
[0052](6)復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度27 °C下放置5天；
[0053](7)重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離:將步驟(6)中的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素采用陽(yáng)離子交換層析柱梯度洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白；然后，采用凝膠層析柱對(duì)離子交換得到的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，即得。
[0054]實(shí)施例2
[0055]本實(shí)施的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括以下步驟:
[0056](I)工程菌發(fā)酵:首先取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，按發(fā)酵體積的5%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液體積為44L，發(fā)酵至0D_值為10，然后，加入2.49g的誘導(dǎo)劑IPTG、15g/L的碳源物質(zhì)葡萄糖、以及6g/L的氮源物質(zhì)酵母提取物，在34°C下，培養(yǎng)3h，再加入3.75g的誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3h。
[0057]其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L水解酶蛋白、9g/LKH2P04、20g/L 葡萄糖組成。
[0058](2)工程菌破碎:將步驟I)中得到的菌液用pH值為8.0的20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液洗滌，離心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同時(shí)加入50mmol/L Tris-HCl、pH值為8.0的緩沖液，于溫度2°C下攪拌，用超聲波破碎至鏡檢細(xì)菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0059](3)包涵體洗滌:將破碎后的菌液離心后，留沉淀物，將沉淀物用含有20mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)的洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌；[0060]在本實(shí)施例中，采用該洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌的具體方法為:采用組分為20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA, pH值為8.0的緩沖液，對(duì)沉淀物進(jìn)行充分?jǐn)嚢柘礈欤?br> [0061](4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化:按照以下組分配制第一變性緩沖液、第二變性緩沖液以及稀釋緩沖液，備用；
[0062]所述第一變性緩沖液:由5mol/L鹽酸胍、10mmol/L 二硫蘇糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA, IOmmoI/L Tris-HCl 組成，其 pH 值為 7.0 ；
[0063]所述第二變性緩沖液:由8mol/L尿素、100mmol/L 二巰基乙醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L NaAc 組成，其 pH 值為 7.0 ；
[0064]所述稀釋緩沖液:由lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl 組成，其 pH 值為 8.0 ；
[0065](4a)第一次變性純化:采用第一變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，向其中加入所述稀釋緩沖液，稀釋至變性劑鹽酸胍濃度為2-3mol/L，再將析出的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白離心，得到一次變性沉淀物；
[0066](4b)第二次變性純化:將所述一次變性沉淀物用第二變性緩沖液溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為10mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液。
[0067](5)變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性:配制12.5L復(fù)性液待用，該復(fù)性液的組成，以IL計(jì)，由1.5mol鹽酸胍、3mmol還原型谷胱甘肽、0.2mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc 組成，pH 值為 5.0。
[0068]將蛋白濃度為10mg/ml的變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液125ml以8ml/min的速度加入12.5L的復(fù)性液中，混合均勻，于8°C下靜置24h，采用超濾平衡除去所述復(fù)性液，得到復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素。
[0069](6)復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度23 °C下放置8天；
[0070](7)重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離:將步驟(6)中的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素采用陽(yáng)離子交換層析柱梯度洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白；然后，采用凝膠層析柱對(duì)離子交換得到的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，即得。
[0071]實(shí)施例3
[0072]本實(shí)施的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括以下步驟:
[0073](I)工程菌發(fā)酵:取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，按發(fā)酵體積的8%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液體積為44L，發(fā)酵至OD6tltl值為15，然后，向其中加入4.99g的誘導(dǎo)劑IPTG、12g/L碳源物質(zhì)葡萄糖、以及4g/L氮源物質(zhì)酵母提取物，在37°C下，培養(yǎng)3.5h，再加入1.25g的誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5h，即可。
[0074]其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由15g/L胰蛋白胨、15g/L酵母提取物、17.5g/L水解酶蛋白、5g/LKH2P04、15g/L葡萄糖組成。
[0075](2)工程菌破碎:將步驟I)中得到的菌液用pH值為8.0的20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)溶液洗滌，離心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同時(shí)加入50mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA、pH值為8.0的緩沖液，用勻質(zhì)機(jī)在壓力200pa下破碎至鏡檢細(xì)菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0076](3)包涵體洗滌:將破碎后的菌液離心后，留沉淀物，將沉淀物用含有20mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)的洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌；[0077]在本實(shí)施例中，采用該洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌的具體方法為:采用組分為20mmol/L Tris-HCl、IOmmoI/L EDTA、2mmol/L2_ME (二巰基乙醇)、0.5v% 曲通 X-100、pH 值為8.0的緩沖液，對(duì)沉淀物進(jìn)行充分?jǐn)嚢柘礈欤?br> [0078](4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化:按照以下組分配制第一變性緩沖液、第二變性緩沖液以及稀釋緩沖液，備用；
[0079]所述第一變性緩沖液:由8mol/L鹽酸胍、10mmol/L 二硫蘇糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA、IOmmoI/L Tris-HCl 組成，其 pH 值為 7.0 ；
[0080]所述第二變性緩沖液:由6mol/L尿素、100mmol/L 二巰基乙醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L NaAc 組成，其 pH 值為 7.0 ；
[0081]所述稀釋緩沖液:由10mmol/L 二硫蘇糖醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl 組成，其pH值為8.0 ；
[0082](4a)第一次變性純化:采用第一變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，向其中加入所述稀釋緩沖液，稀釋至變性劑鹽酸胍濃度為2-3mol/L，再將析出的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白離心，得到一次變性沉淀物；
[0083](4b)第二次變性純化:將所述一次變性沉淀物用第二變性緩沖液溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為9mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液。
[0084](5)變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性:配制15L復(fù)性液待用，該復(fù)性液的組成，以IL計(jì)，由1.5mol鹽酸胍、2mmol還原型谷胱甘肽、0.3mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、10mmol HAc-NaAc 組成，pH 值為 5.0。
[0085]將蛋白濃度為9mg/ml的變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液100mL以8ml/min的速度加入15L的復(fù)性液中，混合均勻，于5°C下靜置100h，采用pH值為4.0的濃度10mmol/L的NaAc溶液為緩沖液，透析除去所述復(fù)性液，得到復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素；
[0086](6)復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度25 °C下放置6天；
[0087](7)重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離:將步驟(6)中的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素采用陽(yáng)離子交換層析柱梯度洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白；然后，采用凝膠層析柱對(duì)離子交換得到的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，即得。
[0088]實(shí)施例4
[0089]本實(shí)施的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括以下步驟:
[0090](I)工程菌發(fā)酵:首先取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，按發(fā)酵體積的6%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵至OD6c?值為12.5，然后，向其中加入誘導(dǎo)劑IPTG、13g/L的碳源物質(zhì)葡萄糖、以及15g/L的氮源物質(zhì)胰蛋白胨，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為0.3mmol/L，在33°C下，培養(yǎng)2.5h，再加入誘導(dǎo)劑IPTG，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為
0.2mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)5h，即可。
[0091]其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L水解酶蛋白、9g/LKH2P04、18g/L 葡萄糖組成。
[0092](2)工程菌破碎:將步驟I)中得到的菌液用pH值為8.0的20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、2mmol/L EDTA溶液洗滌，離心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同時(shí)加入50mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA、pH值為8.0的緩沖液，于溫度4°C下攪拌，用勻質(zhì)機(jī)在壓力350pa下破碎至鏡檢細(xì)菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0093](3)包涵體洗滌:將破碎后的菌液離心后，留沉淀物，將沉淀物用含有20mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)的洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌；
[0094]在本實(shí)施例中，采用該洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌的具體方法為:采用組分為2mol/L尿素、20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA、pH值為8.0的緩沖液，對(duì)沉淀物進(jìn)行充分?jǐn)嚢柘礈欤?br> [0095](4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化:按照以下組分配制第一變性緩沖液、第二變性緩沖液以及稀釋緩沖液，備用；
[0096]所述第一變性緩沖液:由6mol/L鹽酸胍、10mmol/L 二硫蘇糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA、20mmol/L NaAc 組成，其 pH 值為 7.0 ；
[0097]所述第二變性緩沖液:由7mol/L尿素、100mmol/L 二巰基乙醇、lmmol/L EDTA、IOmmoI/L Tris-HCl 組成，其 pH 值為 7.0 ；
[0098]所述稀釋緩沖液:由12mmol/L 二硫蘇糖醇、lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris-HCl 組成，其pH值為8.0 ；
[0099](4a)第一次變性純化:采用第一變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，向其中加入所述稀釋緩沖液，稀釋至變性劑鹽酸胍濃度為3mol/L，再將析出的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白離心，得到一次變性沉淀物；
[0100](4b)第二次變性純化:將所述一次變性沉淀物用第二變性緩沖液溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為9mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液。
[0101](5)變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性:配制20L復(fù)性液待用，該復(fù)性液的組成，以IL計(jì)，由1.2mol鹽酸胍、3mmol還原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA、15mmol HAc-NaAc 組成，pH 值為 4.5。
[0102]將蛋白濃度為9mg/ml的變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液100mL以8ml/min的速度加入20L的復(fù)性液中，混合均勻，再于2°C下靜置160h，采用超濾平衡除去所述復(fù)性液，得到復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素；
[0103](6)復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度25 °C下放置7天；
[0104](7)重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離:將步驟(6)中的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素采用陽(yáng)離子交換層析柱梯度洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白；然后，采用凝膠層析柱對(duì)離子交換得到的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，即得。
[0105]實(shí)施例5
[0106]本實(shí)施的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括以下步驟:
[0107](I)工程菌發(fā)酵:取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，按發(fā)酵體積的6%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵至0D_值為12.5，然后，向其中加入誘導(dǎo)劑IPTG、13g/L的碳源物質(zhì)葡萄糖、以及20g/L的氮源物質(zhì)水解酪蛋白，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為0.2mmol/L,在33°C下，培養(yǎng)2.5h，再加入誘導(dǎo)劑IPTG，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為
0.lmmol/L，繼續(xù)培養(yǎng) 5h。
[0108]其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由5g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、7.5g/L水解酶蛋白、9g/LKH2P04、18g/L 葡萄糖組成。
[0109](2)工程菌破碎:將步驟I)中得到的菌液用pH值為8.0的20mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、lmmol/L EDTA溶液洗滌，離心，留沉淀物，按每克工程菌加入溶菌酶5mg，加入溶菌酶的同時(shí)加入50mmol/L Tris-HCl、pH值為8.0的緩沖液，于溫度4°C下攪拌，用勻質(zhì)機(jī)在壓力500pa下破碎至鏡檢細(xì)菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0110](3)包涵體洗滌:將破碎后的菌液離心后，留沉淀物，將沉淀物用20mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)的洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌；
[0111](4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化:采用含6mol/L鹽酸胍、10mmol/L Tris-HCl的第一變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，向其中加入含2 Ommo I /LTris-HCl的稀釋緩沖液，稀釋至變性劑鹽酸胍濃度為2mol/L，離心，取沉淀物；將得到的沉淀物采用含8mol/L尿素、lOOmmol/L 二巰基乙醇的第二變性緩沖液溶解，離心，除去不溶物，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為8mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液；
[0112](5)變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性:配制12.5L復(fù)性液待用，該復(fù)性液的組成，以IL計(jì)，由2mol鹽酸胍、2.5mmol還原型谷胱甘肽、0.2mmol氧化型谷胱甘肽、8mmol EDTA、20mmol HAc-NaAc 組成，pH 值為 4.0。
[0113]將蛋白濃度為8mg/ml的變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液125ml以8ml/min的速度加入12.5L的復(fù)性液中，混合均勻，再于8°C下靜置24h，采用超濾平衡除去所述復(fù)性液，得到復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素；
[0114](6)復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度23 °C下放置5天；
[0115](7)重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離:將步驟(6)中的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素采用陽(yáng)離子交換層析柱梯度洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白；然后，采用凝膠層析柱對(duì)離子交換得到的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素的蛋白峰，即得。
[0116]實(shí)施例6
[0117]本實(shí)施的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，包括以下步驟:
[0118](I)工程菌發(fā)酵:首先將工程菌在培養(yǎng)基中發(fā)酵至0D_值為12.5，然后，向其中加入誘導(dǎo)劑IPTG、13g/L的碳源物質(zhì)葡萄糖、以及4g/L的氮源物質(zhì)酵母提取物、20g/L的氮源物質(zhì)胰蛋白胨和10g/L的氮源物質(zhì)水解酪蛋白，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為0.4mmol/L，在30°C下，培養(yǎng)2.5h，再加入誘導(dǎo)劑IPTG，使發(fā)酵液中IPTG的濃度0.2mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)5h ；
[0119](2)工程菌破碎將步驟I)中得到的菌液洗滌、離心，留沉淀物，加入溶菌酶，于溫度4°C下，攪拌均勻，破碎至細(xì)菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液；
[0120](3)包涵體洗滌:將破碎后的菌液離心后，留沉淀物，將沉淀物用20mmol三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)的洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌；
[0121](4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化:配制變性緩沖液,待用，該變性緩沖液由6mol/L 鹽酸狐、10mmol/L 二硫蘇糖醇(DDT)、lmmol/LEDTA、10mmol/L Tris-HCl 組成，其 pH值為7.0 ;
[0122]采用變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為8mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液；[0123](5)變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性:配制30L復(fù)性液待用，該復(fù)性液的組成，以IL計(jì)，由Imol鹽酸胍、2mmol還原型谷胱甘肽、0.3mmol氧化型谷胱甘肽、2mmol EDTA、IOmmol HAc-NaAcUOmmol DTT 組成，pH 值為 5.0。
[0124]將蛋白濃度為8mg/ml的變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液100mL加入上述復(fù)性液中，混合均勻，5°C下靜置12h，除去所述復(fù)性液，得到復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素；
[0125](6)復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度27 °C下放置8天；
[0126](7)重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離:將步驟6)中的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素層析洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，即得。
[0127]對(duì)比例I
[0128]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(1)為:首先取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后,按發(fā)酵體積的6%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液體積為44L，發(fā)酵至0D_值為12.5，然后，然后，一次性向其中加入6.15g誘導(dǎo)劑IPTG，在30°C下，培養(yǎng)5h。所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括:20g/L胰蛋白胨、25g/L酵母提取物、12.5g/L水解酶蛋白、9g/LKH2P04、23g/L葡萄糖。
[0129]步驟(2)-(7)均與實(shí)施例1相同。
[0130]對(duì)比例2
[0131]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(1)為:首先取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后,按發(fā)酵體積的6%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液體積為44L，發(fā)酵至0D_值為12.5，然后，一次性加入6.15g誘導(dǎo)劑IPTG，13g/L的碳源物質(zhì)葡萄糖、以及5g/L的氮源物質(zhì)酵母提取物，在30°C下，培養(yǎng)5h。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分用量均與實(shí)施例1相同。
[0132]步驟(2)-(7)均與實(shí)施例1相同。
[0133]對(duì)比例3
[0134]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(1)為:先取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后，按發(fā)酵體積的6%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液體積為44L，發(fā)酵至0D_值為12.5，然后，向其中加入3.75g的誘導(dǎo)劑IPTG，在30°C下，培養(yǎng)2.5h，再加入2.4g的誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5h。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分用量均與實(shí)施例1相同。
[0135]步驟(2)-(7)均與實(shí)施例1相同。
[0136]對(duì)比例4
[0137]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(1)為:首先取工程菌在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增后,按發(fā)酵體積的6%接種量，接種至規(guī)格為50L的發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵液體積為44L，發(fā)酵至OD6tltl值為12.5，然后，加入3.75g的誘導(dǎo)劑IPTG，在30°C下，培養(yǎng)1.5h,加入13g/L的 葡萄糖作為碳源物質(zhì)、以及5g/L的酵母提取物作為氮源物質(zhì),培養(yǎng)Ih,再加入2.4g的誘導(dǎo)劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)5h。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及各組分用量均與實(shí)施例I相同。
[0138]步驟(2)-(7)均與實(shí)施例1相同。[0139]對(duì)比例5
[0140]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(5)中，采用的所述復(fù)性液，以IL計(jì)，由Immol還原型谷胱甘肽、0.1mmol氧化型谷胱甘肽、lmmol EDTA、20mmolHAc-NaAc組成，pH值為5.0。其余均與實(shí)施例1相同。
[0141]對(duì)比例6
[0142]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(5)中，采用的所述復(fù)性液，以IL計(jì)，由2mmol還原型谷胱甘肽、0.33mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA>IOmmolHAc-NaAc組成，pH值為5.0。其余均與實(shí)施例1相同。
[0143]對(duì)比例7
[0144]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(5)中，采用的所述復(fù)性液，以IL計(jì)，由2mmol還原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmol EDTA>IOmmolHAc-NaAc組成，pH值為5.0。以重量記，還原型谷胱甘肽0.61g、氧化型谷胱甘肽0.15g、EDTA1.85g。其余均與實(shí)施例1相同。
[0145]對(duì)比例8
[0146]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(5)中，采用的所述復(fù)性液，以IL計(jì)，由6mol鹽酸胍、2mmol還原型谷胱甘肽、0.35mmol氧化型谷胱甘肽、5mmolEDTAUOmmol HAc-NaAc組成，pH值為5.0。其余均與實(shí)施例1相同。
[0147]對(duì)比例9
[0148]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(5)中，采用的所述復(fù)性液，以IL計(jì)，由0.5mol鹽酸胍、2mmol還原型谷胱甘肽、0.25mmol氧化型谷胱甘肽、5mmolEDTAUOmmol HAc-NaAc組成，pH值為5.0。其余均與實(shí)施例1相同。
[0149]對(duì)比例10
[0150]本對(duì)比例的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，步驟(6)具體為:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度4°C下放置7天。其余均與實(shí)施例1相同。
[0151]效果實(shí)驗(yàn)例
[0152]為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)效果，在采用實(shí)施例1-6及對(duì)比例1-10中的方法進(jìn)行操作的過(guò)程中，對(duì)以下指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定:
[0153]1、發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)效果的測(cè)定
[0154]1.1實(shí)驗(yàn)方法:
[0155]采用實(shí)施例1-6以及對(duì)比例1-4中的方法進(jìn)行重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化，通過(guò)觀(guān)察發(fā)酵過(guò)程中菌體量隨發(fā)酵時(shí)間變化情況，評(píng)價(jià)菌體生長(zhǎng)情況，并在發(fā)酵表達(dá)結(jié)束后，采用2010版中國(guó)藥典中的聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)測(cè)定誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液中目標(biāo)蛋白重組人血管內(nèi)皮抑素占總蛋白的量，記為發(fā)酵表達(dá)量。
[0156]1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
[0157]表1實(shí)施例1-6及對(duì)比例1-4的誘導(dǎo)表達(dá)測(cè)試結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，包括以下 步驟: (1)工程菌發(fā)酵:將工程菌發(fā)酵至發(fā)酵液OD6c?值為10-15，加入誘導(dǎo)劑IPTG、碳源物質(zhì)以及氮源物質(zhì)，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為0.2-0.4mmol/L，在30-37°C下，對(duì)工程菌培養(yǎng)2.5-3.5h，再向其中加入誘導(dǎo)劑IPTG，使發(fā)酵液中IPTG的濃度為0.1-0.3mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3-5h ； (2)工程菌破碎:對(duì)步驟I)中得到的發(fā)酵液進(jìn)行洗滌、離心，留沉淀物，向發(fā)酵液中加入溶菌酶，在2-8°C下，攪拌均勻，破碎至細(xì)菌破碎率大于98%，得到破碎后的菌液； (3)包涵體洗滌:將破碎后的菌液離心，留沉淀物，將沉淀物用含有緩沖劑的洗滌緩沖液進(jìn)行攪拌洗滌； (4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化:采用變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為8-10mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液； (5)變性重組人血管內(nèi)皮抑素的復(fù)性:將蛋白濃度為8-10mg/ml的變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋 白溶液加入復(fù)性液中，混合均勻，2_8°C下靜置至少10h，除去所述復(fù)性液，得到復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素； (6)復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素的放置:將步驟5)中得到的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素在溫度23-27 °C下放置5-8天； (7)重組人血管內(nèi)皮抑素的層析分離:將步驟6)中的復(fù)性重組人血管內(nèi)皮抑素層析洗脫，收集重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟(1)中，所述碳源物質(zhì)為葡萄糖；所述氮源物質(zhì)為酵母提取物、胰蛋白胨和水解酪蛋白中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，所述葡萄糖的濃度為12_15g/L;所述酵母提取物的濃度為4-6g/L;所述胰蛋白胨的濃度為10-20g/L ;所述水解酪蛋白的濃度為10-20g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，所述緩沖劑為三羥甲基氨基甲烷-鹽酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，所述步驟(4)重組人血管內(nèi)皮抑素的變性純化具體包括， (4a)第一次變性純化:采用第一變性緩沖液將洗滌后的包涵體溶解，離心，取上清液，稀釋所述第一變性緩沖液，再將析出的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白離心，得到一次變性沉淀物； (4b)第二次變性純化:將所述一次變性沉淀物用第二變性緩沖液溶解，離心，取上清液，調(diào)整至蛋白濃度為8-10mg/ml，得到變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟(4)中，所述第一變性緩沖液為鹽酸胍濃度為5-7mol/L的pH值為7.0-9.0的緩沖液；所述第二變性緩沖液為尿素濃度為6-8mol/L的pH值為7.0-9.0的緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟(5)中，每IL的所述復(fù)性液包括以下組分: 鹽酸胍l_2mol ； 還原型谷胱甘肽2-3mmol ； 氧化型谷胱甘肽0.2-0.3mmol ； 絡(luò)合劑2-8mmol ； 所述復(fù)性液的PH值為4.0-5.0。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，每IL的所述復(fù)性液還包括pH調(diào)節(jié)劑10-20mmol。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于，在所述復(fù)性液中，所述還原型谷胱甘肽與所述氧化型谷胱甘肽的摩爾比為8:1。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于:在所述步驟(5)中，所述變性純化后的重組人血管內(nèi)皮抑素蛋白溶液與所述復(fù)性液的體積比為 I:(100 ~200)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一所述的重組人血管內(nèi)皮抑素的提取純化方法，其特征在于:在所述步驟(6)中，溫度為25°C，放置時(shí)間為6天。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK103993058SQ201410234509
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】榮志剛, 姚建林, 趙唯一, 黃佩華, 朱浩文, 陳衛(wèi), 崔志遠(yuǎn), 徐霞 申請(qǐng)人:江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司蘇州中凱生物制藥廠(chǎng)