專利名稱：金屬提取肽標(biāo)簽和相關(guān)方法
金屬提取肽標(biāo)簽和相關(guān)方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2008年5月13日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/052，918的優(yōu) 先權(quán)，其通過(guò)引用并入本申請(qǐng)中。本發(fā)明得到美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的資助(資助號(hào)P20 RR-17708)而開發(fā)。美國(guó)政 府可以擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
目前，使用金屬?gòu)慕M合物中提取多肽(如蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段)已成為常用技術(shù)。 這樣的提取是基于金屬能夠與組合物中的特異性多肽絡(luò)合，而不與組合物中的其它物質(zhì)發(fā) 生絡(luò)合。已知可使用兩種不同的基于肽的金屬結(jié)合標(biāo)簽從組合物中分離出肽。然而，這些 結(jié)合標(biāo)簽具有用于實(shí)現(xiàn)結(jié)合的特定類型氨基酸和特定數(shù)目或特定序列的氨基酸，這與本發(fā) 明所述的結(jié)合標(biāo)簽有顯著不同。例如，這兩種結(jié)合標(biāo)簽可能不結(jié)合相同類型的金屬，或者與 本發(fā)明不使用同樣的幾何構(gòu)造。有關(guān)所述第一種結(jié)合標(biāo)簽的其它信息可以從Haroon等的 美國(guó)專利US 7，208，138 B2獲得，并涉及包含序列NXEQVSP的肽。有關(guān)所述第二種結(jié)合標(biāo) 簽的信息可以從Arbogast等的美國(guó)專利申請(qǐng)公開20040018974獲得，并涉及似乎是其中所 述完整蛋白質(zhì)的標(biāo)簽序列?？梢栽谏矬w的遺傳材料中編碼、用于蛋白質(zhì)重組表達(dá)的標(biāo)簽已廣泛用于蛋白質(zhì) 產(chǎn)品的純化和鑒定。其最出名的實(shí)例是His-tag技術(shù)，該技術(shù)提供了通過(guò)使用固定化金屬 親和層析(immobilized metal affinitychromatography, IMAC)從完整細(xì)胞中有效分離帶 標(biāo)簽蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)便方法。已開發(fā)了多種其它的基于肽之標(biāo)簽用于通過(guò)使用識(shí)別該肽標(biāo)簽的 抗體來(lái)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定或細(xì)胞溶解物中的帶標(biāo)簽蛋白質(zhì)。這些技術(shù)可用于原位或體外測(cè) 定，但是它們一般不能用于體內(nèi)分析。肽標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)在于，標(biāo)簽與目的蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，而 無(wú)需另外的化學(xué)步驟標(biāo)記蛋白質(zhì)。MRI成像是研究活的動(dòng)物和人的結(jié)構(gòu)特征的常用方法。這一技術(shù)安全并且是非介 入性的。已開發(fā)了造影劑以改善該方法的靈敏度，以及用于加強(qiáng)MRI圖像中觀察到的特征。 之所以得到改善，是由于造影劑中包含改變了來(lái)自鄰近分子(通常是水)之信號(hào)的金屬。 最常用的試劑螯合Gd(III)，但是其它金屬可用于增強(qiáng)對(duì)比度。含有Gd的造影劑不能用于 患有腎功能損傷的患者，因?yàn)榭赡軙?huì)引發(fā)已知如腎源性系統(tǒng)性纖維化或腎源性纖維性皮膚 病的嚴(yán)重并發(fā)癥。需要替代性的成像劑來(lái)滿足這些患者的需求。螯合金屬的化合物還用于 PET和SPECT成像中以觀察分子水平的細(xì)節(jié)。

發(fā)明內(nèi)容
本公開內(nèi)容一般性地涉及三肽基序以及使用該基序的方法。這些肽具有結(jié)合金屬 的能力，這使得它們可用于多種應(yīng)用。特別地，本公開內(nèi)容的三肽可應(yīng)用于成像、研究、化學(xué) 療法和螯合療法。根據(jù)一些實(shí)施方案，本公開內(nèi)容提供了包含具有序列^(C1C2之三肽的組合物，其中X是使得^(C1C2能夠以平面四方形取向或四角錐形取向或兩者兼有地結(jié)合金屬的任意氨基 酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨(dú)立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。根據(jù)另一些實(shí)施方案，本公開內(nèi)容提供了包含具有序列^(C1C2之三肽和金屬的組 合物，其中所述金屬與所述三肽絡(luò)合，X是使得三肽和金屬形成具有平面四方形取向或四角 錐形取向或兩者兼有的絡(luò)合物的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨(dú) 立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。根據(jù)另一些實(shí)施方案，本公開內(nèi)容提供了包括使金屬與具有序列^(C1C2之三肽絡(luò) 合以形成金屬-XC1C2絡(luò)合物的方法，其中X是使得金屬-XC1C2絡(luò)合物具有平面四方形取向 或四角錐形取向或兩者兼有的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨(dú)立 地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在閱讀了以下實(shí)施方案的描述后，本發(fā)明的特征和優(yōu) 點(diǎn)將變得顯而易見。


參考以下描述并結(jié)合附圖可以更全面地理解本發(fā)明。圖1顯示結(jié)構(gòu)1——GGH樣金屬絡(luò)合物NGH，具有4個(gè)N配位。結(jié)構(gòu)2和結(jié)構(gòu)3—— GGH樣結(jié)構(gòu)，其包括金屬與若干去質(zhì)子化主鏈N原子發(fā)生配位。圖2顯示人PRL酶(包括PRl-l、PRL-2和PRL-3) C端部分的序列比對(duì)。PRL-1的 H166是顯示為藍(lán)色的NGH基序的一部分。PRL-I的C170和C171殘基是顯示為紅色(框) 的CaaX基序的一部分。NCC基序用粗體標(biāo)出。圖3顯示A.在pH 10下獲得的結(jié)合鎳之三肽的ESI-MS譜圖，其中所示質(zhì)量表明 鎳與肽結(jié)合。B.將樣品的pH降至5之后的ESI-MS譜圖，其顯示鎳從肽中釋放出來(lái)。圖4顯示Cu-NCC磁共振成像(MRI)。圖5顯示在切割和除去His-標(biāo)簽后，在pH 7. 4下，在Ni (II)存在下純化的純化 野生型PRL-I的照片。照片顯示其特征性的鐵銹色。圖6顯示A)在Ni2+離子存在下純化的PRL-I變體的電子吸收譜。在800 200nm 之間記錄每種蛋白質(zhì)變體的三(兩)幅譜圖，并取平均值。所有變體的蛋白質(zhì)濃度為5mg/ ml至10%以內(nèi)(基于A280比較)。所顯示的是700 300nm的譜圖?？梢姷奶卣鳛槲?最大值位于318nm和421nm。插圖以便于觀察421和526nm處吸收最大值的更小比例顯示 600 400nm的譜圖。各曲線如下PRL-1_WT，黑色(最上部)；PRL-1-H166A，紅色(緊鄰最 上部)；PRL-l-CHOS-CniS，橙色(底部)；PRL-1-C170S，綠色(緊鄰底部)；PRL-1-C171S, 藍(lán)色(中部)。B)PRL-I野生型的解析譜圖，使用5條曲線將經(jīng)Ni純化的PRL-I野生型蛋 白在300 700nm之間的紫外-可見光解析譜圖與數(shù)據(jù)擬合。將318nm肩部(shoulder) 解析成306、325和372nm的峰。顯示了經(jīng)解析的吸收峰(灰色虛線)和原始數(shù)據(jù)(黑色實(shí) 線)的總和。還存在421和526nm的峰。本專利或申請(qǐng)文件包含至少一幅彩圖。經(jīng)請(qǐng)求和支付必要費(fèi)用后，可以從專利局 獲得包括彩圖的本專利或?qū)＠暾?qǐng)公布文件的副本。盡管本公開內(nèi)容允許多種改動(dòng)和替代性形式，但是附圖中顯示了具體實(shí)施例實(shí)施方案并且在本文中進(jìn)行了詳細(xì)描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)具體實(shí)施例實(shí)施方案的描述不旨在 限制本發(fā)明至所公開的特定形式，與之相反，本公開內(nèi)容將覆蓋所附權(quán)利要求定義的所有 改動(dòng)和等同形式。發(fā)明詳述本發(fā)明一般性地涉及短肽基序和使用該基序的方法。這些肽具有選擇性地結(jié)合金 屬的能力，這使得它們可用于多種應(yīng)用。特別地，本發(fā)明的肽可應(yīng)用于成像、研究、化學(xué)療法 和螯合療法。一般地，本公開內(nèi)容涉及與選定金屬?gòu)?qiáng)烈結(jié)合的短的新型肽基序，稱為MAP標(biāo)簽。 因此，這些MAP標(biāo)簽可用于從組合物中提取選定金屬等。本公開內(nèi)容的MAP標(biāo)簽的長(zhǎng)度為 三個(gè)氨基酸，并且可以位于較長(zhǎng)多肽和蛋白質(zhì)的N端、C端或其間任意位置。然而，在一些 實(shí)施方案中，將MAP標(biāo)簽置于多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)型中使MAP標(biāo)簽展示(用于結(jié)合金屬)的位 置(例如該金屬存在在環(huán)狀物表面)可以是有利的。MAP標(biāo)簽還可以與非肽實(shí)體連結(jié)。此 外，可以使特定分子上存在多于一個(gè)MAP標(biāo)簽。已知多種蛋白質(zhì)與金屬結(jié)合。但是，此類結(jié)合通常利用折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中不連續(xù) 的氨基酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)緊密結(jié)合，一旦該蛋白質(zhì)解折疊，則很容易釋放出金屬。另一方面，金 屬與MAP標(biāo)簽的結(jié)合通過(guò)使用非?？拷脑觼?lái)實(shí)現(xiàn)，因此需要極端的條件才能釋放出金 屬。蛋白質(zhì)的熱變性和化學(xué)變性允許金屬的緩慢釋放。例如，使用極端條件(如沸騰溫度、 強(qiáng)酸)可以在一段時(shí)間(如幾個(gè)到很多個(gè)小時(shí))內(nèi)緩慢釋放金屬。A.化學(xué)結(jié)構(gòu)在一些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容提供了新的基于肽的標(biāo)簽或金屬結(jié)合劑(MAP標(biāo) 簽)。該MAP標(biāo)簽可用于在多肽或蛋白質(zhì)中直接編碼高親和力的金屬結(jié)合位點(diǎn)。本公開內(nèi) 容的MAP標(biāo)簽的特征在于，它們能夠以平面四方形或四角錐形幾何構(gòu)造結(jié)合金屬。1.肽序列本公開內(nèi)容的MAP標(biāo)簽一般地包含能夠結(jié)合金屬的至少三個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。本 公開內(nèi)容的MAP標(biāo)簽一般地具有表示為XC1C2的序列，其中C1和C2可以相同或不同并且可 以是半胱氨酸或半胱氨酸樣非天然氨基酸(如含硫的α-或β-氨基酸)，X可以是另一種 天然或非天然的氨基酸或氨基酸類似物(只要所形成的肽標(biāo)簽?zāi)軌蛞云矫嫠姆叫位蛩慕?錐形幾何構(gòu)造結(jié)合金屬即可)。本文使用的L-氨基酸對(duì)映體的縮寫形式是常規(guī)的(如下所 示)表1 天然氨基酸的縮寫氨基酸單字母符號(hào)三字母符號(hào)丙氨酸AAla精氨酸RArg天冬酰胺NAsn天冬氨酸DAsp半胱氨酸CCys谷氨酸EGlu谷氨酰胺QGln甘氨酸GGly
組氨酸HHis異亮氨酸 IIle亮氨酸LLeu賴氨酸KLys甲硫氨酸 MMet苯丙氨酸 FPhe脯氨酸PPro絲氨酸SSer蘇氨酸TThr色氨酸 W Trp酪氨酸Y Tyr纈氨酸V Val在一些實(shí)施方案中，X可以是天冬酰胺(N)、谷氨酰胺⑴)、組氨酸(H)、賴氨酸(K) 或精氨酸(R)。當(dāng)氨基酸序列用三字母或單字母氨基酸縮寫表示時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解左側(cè)方向是氨基端 方向，右側(cè)方向是羧基端方向，這與標(biāo)準(zhǔn)用法和慣例是一致的。本公開內(nèi)容的MAP標(biāo)簽可以采用任意重組技術(shù)系統(tǒng)與基因或用于表達(dá)的核苷酸 序列一同編碼。此外，還可以通過(guò)使用針對(duì)肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)的任意合成或生物合成方法將 所述MAP標(biāo)簽摻入肽或蛋白中。在應(yīng)用中，所述MAP標(biāo)簽自發(fā)地與金屬反應(yīng)，形成肽-金屬 絡(luò)合物。這種肽-金屬絡(luò)合物可以在溶液中形成或者通過(guò)金屬交換或任何其它過(guò)程而形 成。所述MAP標(biāo)簽可以單獨(dú)使用，或者作為可連接至多肽鏈之N-端、C-端的標(biāo)簽或插 入多肽鏈內(nèi)柔性接頭或環(huán)中的標(biāo)簽。除了參與金屬配位的側(cè)鏈以外，所述MAP標(biāo)簽可以在 任意位置進(jìn)行修飾。相應(yīng)地，所述MAP標(biāo)簽可包含如Z-XC1C2-Z1的序列，Z可以為任意氨基 酸或任意氨基酸序列，Z1可以是與Z相同或不同的任意氨基酸或氨基酸序列。所述氨基酸 如上表1所示。該表中未列出非天然氨基酸和氨基酸類似物，但是可將它們摻入Z、Z1和/ 或X中。在一些實(shí)施方案中，所述MAP標(biāo)簽可以連接置另一分子。例如，所述MAP標(biāo)簽可以 連接至非肽實(shí)體(如碳水化合物，例如透明質(zhì)酸)。該連接可以是共價(jià)的，也可以通過(guò)接頭 進(jìn)行連接。在一些實(shí)施方案中，所述MAP標(biāo)簽可包含以下序列=NC1C2 ；Z-NC1C2-Z1 ；Z-NC1C2 ； NC1C2-Z1 ； QC1C2 ；Z-QC1C2-Z1 ；Z-QC1C2 ； QC1C2-Z1 ；HC1C2 ； Z-HC1C2-Z1 ； Z-HC1C2 ；HC1C2-Z1 ；KC1C2 ； Z-KC1C2-Z1 ；Z-KC1C2 ；KC1C2-Z1 ；RC1C2 ；Z-RC1C2-Z1 ；Z-RC1C2 或 RC1C2-Z10 如上所述，Z 可以為任 意氨基酸或氨基酸序列，Z1可以為與Z相同或不同的任意氨基酸或氨基酸序列。所述氨基 酸如上表1所示。該表中未列出非天然氨基酸和氨基酸類似物，但是可將它們摻入Z和Z1 中。在一些實(shí)施方案中，所述MAP標(biāo)簽包含具有如下結(jié)構(gòu)式的NCC
權(quán)利要求
1.組合物，其包含具有序列^(C1C2的三肽，其中X是使得^(C1C2能夠以平面四方形取向 或四角錐形取向或兩者兼有地結(jié)合金屬的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中 C1和C2獨(dú)立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中X選自天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸和精氨酸。
3.權(quán)利要求1的組合物，其還包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
4.權(quán)利要求1的組合物，其還包含如下非肽實(shí)體，所述非肽實(shí)體包含具有序列^(C1C2的 三肽。
5.組合物，其包含具有序列^(C1C2之三肽和金屬，其中所述金屬與所述三肽絡(luò)合，其中 X是使得三肽和金屬形成具有平面四方形取向或四角錐形取向或兩者兼有的絡(luò)合物的任意 氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨(dú)立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天 然氨基酸。
6.權(quán)利要求3的組合物，其中X選自天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸和精氨酸。
7.權(quán)利要求3的組合物，其中所述金屬選自Si、Ni、Cu、Pt、Pd、Au、Ag、Pb和狗。
8.權(quán)利要求3的組合物，其中所述金屬為放射性同位素。
9.權(quán)利要求3的組合物，其中所述金屬為62Cu。
10.權(quán)利要求3的組合物，其還包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
11.權(quán)利要求3的組合物，其還包含如下非肽實(shí)體，所述非肽實(shí)體包含具有序列^(C1C2的三肽。
12.方法，其包括使金屬與具有序列^(C1C2之三肽絡(luò)合以形成金屬-XC1C2絡(luò)合物，其 中X是使得金屬-XC1C2絡(luò)合物具有平面四方形取向或四角錐形取向或兩者兼有的任意氨基 酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨(dú)立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸。
13.權(quán)利要求12的組合物，其中X選自天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、賴氨酸和精氨酸。
14.權(quán)利要求12的組合物，其中所述金屬選自Si、Ni、Cu、Pt、Pd、Au、Ag、Pb和狗。
15.權(quán)利要求12的組合物，其中所述金屬為放射性同位素。
16.權(quán)利要求12的組合物，其中所述金屬為62Cu。
17.權(quán)利要求12的組合物，其還包含如下多肽，所述多肽包含具有序列^(C1C2的三肽。
18.權(quán)利要求12的組合物，其還包含如下非肽實(shí)體，所述非肽實(shí)體包含具有序列^(C1C2 的三肽。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述金屬存在于生物樣品中。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述金屬存在于對(duì)象中。
21.權(quán)利要求12的方法，其還包括檢測(cè)所述金屬-XC1C2絡(luò)合物。
22.權(quán)利要求12的方法，其還包括對(duì)所述金屬-XC1C2絡(luò)合物成像。
全文摘要
包含具有序列XC1C2之三肽的組合物，其中X是使得XC1C2能夠以平面四方形取向或四角錐形取向或兩者兼有地結(jié)合金屬的任意氨基酸，其中C1和C2相同或不同，并且其中C1和C2獨(dú)立地選自半胱氨酸和半胱氨酸樣非天然氨基酸；以及金屬-XC1C2絡(luò)合物和形成該絡(luò)合物的方法。
文檔編號(hào)A61K33/24GK102088991SQ200980127523
公開日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2009年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月13日
發(fā)明者安托尼·安德魯·瓦爾蒂亞, 瑪麗·伊麗莎白·克勞斯, 珍妮弗·安·斯托厄爾·勞倫斯 申請(qǐng)人:堪薩斯大學(xué)