專利名稱：呈遞所希望的肽序列的結(jié)構(gòu)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供具有改良性質(zhì)如結(jié)合性質(zhì)或其它性質(zhì)的結(jié)合分子的方式和方法，以及這些新的結(jié)合分子。
本發(fā)明還涉及在其所有多方面用途中應(yīng)用這些分子的方法。
在現(xiàn)代生物工程學(xué)中，一種最有前途并在許多情況中得以驗證的應(yīng)用依賴于蛋白質(zhì)分子對各種物質(zhì)和/或靶的親和性。蛋白質(zhì)結(jié)合分子(proteinaceous binding molecules)已經(jīng)用于從混合物中純化物質(zhì)，用于針對廣泛物質(zhì)的診斷分析中以及用于制備藥物等。典型地，已經(jīng)使用天然發(fā)生的蛋白質(zhì)分子如免疫球蛋白(或者免疫球蛋白超家族的其它成員)以及受體和酶。衍生自這些分子的肽也已經(jīng)使用。
應(yīng)用現(xiàn)有的(修飾的)天然分子當(dāng)然僅提供了有限的進化所賦予這些分子的性質(zhì)資源。這是這些分子未應(yīng)用于其作用所達的全部范圍的原因之一。另外，由于進化總是導(dǎo)致天然存在的結(jié)合分子的不同功能之間的調(diào)和，因此這些分子對于所設(shè)想的用途而言不是最佳的。典型地，本領(lǐng)域已經(jīng)開始針對改變現(xiàn)有(修飾的)結(jié)合分子的結(jié)合性質(zhì)而努力。在如噬菌體展示(單鏈)抗體的技術(shù)中，幾乎可以獲得任何結(jié)合特異性。然而，這些結(jié)合區(qū)域都存在于相同的鄰近序列中。因此，結(jié)合區(qū)域及其鄰近序列(context)通常還不是最佳的，限制了蛋白質(zhì)結(jié)合分子在本領(lǐng)域中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種通用鄰近序列(versatile context)以呈遞希望的親和區(qū)。本發(fā)明提供了一種結(jié)構(gòu)鄰近序列(structural context)，其基于已經(jīng)鑒別的共有結(jié)構(gòu)元件(稱為核心結(jié)構(gòu))設(shè)計，以產(chǎn)生眾多結(jié)合蛋白。目前這個所謂的共有核心已經(jīng)作為一種新的蛋白質(zhì)分子而產(chǎn)生，其可以擁有一或多個希望的親和區(qū)。
這種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不依賴于任何氨基酸序列，而是僅依賴于共有的結(jié)構(gòu)元件。其可以通過提供不同的氨基酸序列和/或序列中的氨基酸殘基以適應(yīng)于指定的應(yīng)用。其也可以適合被展示的特定親和區(qū)的需要。本發(fā)明因此還提供了結(jié)構(gòu)鄰近序列和親和區(qū)的文庫，用于組合而獲得一種適于所希望目的的最佳蛋白質(zhì)結(jié)合分子。
因此本發(fā)明提供了一種合成的或重組的蛋白質(zhì)分子(proteinaceous molecule)，其包含一個結(jié)合肽和一個核心，所述核心包含一個包含至少5個鏈的β-桶，其中所述β-桶包含至少兩個β-折疊，其中至少一個所述β-折疊包含三個所述鏈及其中所述結(jié)合肽是連接所述β-桶中兩個鏈的一種肽，及其中所述結(jié)合肽在其天然鄰近序列之外(said binding peptide is outside its natural context)。我們已經(jīng)在從半乳糖苷酶至人(及例如駱駝)抗體的所有種類的分子范圍內(nèi)的許多蛋白質(zhì)中鑒別了這種核心結(jié)構(gòu)。自然界顯然已經(jīng)設(shè)計了這種結(jié)構(gòu)元件用以呈遞希望的肽序列?，F(xiàn)在我們產(chǎn)生了這個核心的分離形式，以及仍具有相同或相似結(jié)構(gòu)元件的這一核心的許多變體。這些新的結(jié)構(gòu)可以用于所有使用其它結(jié)合分子的應(yīng)用中，甚至可以用于超出本文所闡述的那些應(yīng)用之外的應(yīng)用中。包含由一個親和區(qū)(希望的肽序列)和兩個β-折疊形成的一個β-桶的結(jié)構(gòu)是本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合分子的最基本形式(蛋白質(zhì)(proteinaceous)是指其本質(zhì)上是氨基酸序列，但可以存在所有種類的側(cè)鏈和/或基團，當(dāng)然這是可能的，因為氨基酸序列對于設(shè)計空間方向相同并可以呈遞肽親和區(qū)的非蛋白質(zhì)性質(zhì)的其它分子的結(jié)構(gòu)不很相關(guān)；空間方向是重要參數(shù))。本發(fā)明還揭示了最佳的核心結(jié)構(gòu)，其中根據(jù)希望目的不太穩(wěn)定的氨基酸由更穩(wěn)定的氨基酸置換(反之亦然)。當(dāng)然，包括其它取代或者甚至與現(xiàn)有結(jié)構(gòu)完全不相關(guān)的氨基酸序列，同樣因為重要參數(shù)是空間分子方向。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用比基本結(jié)構(gòu)更先進的核心結(jié)構(gòu)，因為結(jié)合性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)可以設(shè)計得更好及具有更可預(yù)期的價值。因此本發(fā)明優(yōu)選提供一種蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少5個鏈，其中至少所述折疊包含3個所述鏈，更優(yōu)選本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少6個鏈，其中至少兩個所述折疊包含3個所述鏈。其中每個所述折疊包含3個鏈的所述β-桶在足夠穩(wěn)定的同時提供足夠的變化可能性以適應(yīng)特定目的的核心/親和區(qū)(結(jié)合肽)。當(dāng)然也可以發(fā)現(xiàn)每個折疊包含較少鏈的核心的合適特性。因此一個折疊僅包含兩個鏈的變體屬于本發(fā)明的范圍。在本發(fā)明的另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少7個鏈，其中至少一個所述折疊包含4個所述鏈?；蛘?，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少8個鏈，其中至少一個所述折疊包含4個所述鏈。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少9個鏈，其中至少一個所述折疊包含4個所述鏈。在核心結(jié)構(gòu)中，有一個天然展示親和區(qū)的較開放的一側(cè)(more open side)和一個存在連接序列的較閉合(more closed side)的一側(cè)。優(yōu)選地，至少一個親和區(qū)位于所述較開放的一側(cè)中。
因此本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)分子，其中所述結(jié)合肽連接所述桶的開放一側(cè)上的所述β-桶的兩個鏈。盡管希望的肽序列(親和區(qū))的位置可以在兩個鏈之間的任何部位，但優(yōu)選希望的肽序列連接所述桶的兩個折疊。因此本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)分子，其中所述結(jié)合肽連接所述桶的至少兩個β-折疊。盡管一個親和區(qū)可能就足夠了，但優(yōu)選存在更多的親和區(qū)以產(chǎn)生更好的結(jié)合分子。優(yōu)選地，這些區(qū)域的排列是使得能協(xié)同結(jié)合(例如均在所述桶的開放一側(cè)上)。因此，本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)分子，其包含至少一個進一步的結(jié)合肽。實際上一個成功的核心元件具有三個親和區(qū)和三個連接區(qū)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是分離形式的這個核心。然而，由于本發(fā)明結(jié)合分子的通用性，因此所述桶的不太開放一側(cè)上的連接序列也可以用作親和區(qū)。通過這種方式獲得非常小的雙特異性結(jié)合分子。因此本發(fā)明提供了一種蛋白質(zhì)分子，其包含至少4個結(jié)合肽。本文中“雙特異性”是指結(jié)合分子具有與兩個靶分子(相同或不同)結(jié)合的可能性。核心中的各個鏈優(yōu)選由單個開放閱讀框架編碼。連接各個鏈的環(huán)可具有任何類型的構(gòu)型。并非不適當(dāng)?shù)叵拗坪诵牡耐ㄓ眯裕瑑?yōu)選地這些環(huán)連接核心的相同一側(cè)上的鏈，即所述核心的閉合一側(cè)或開放一側(cè)上的鏈(a)的N末端連接鏈(b)的C末端。環(huán)可以連接同一β-折疊中的鏈或者與反向β-折疊交叉的鏈。連接所述核心中各個鏈的優(yōu)選排列在實施例和附圖中給出，尤其在

圖1中示出。所述核心中的鏈可以是彼此相關(guān)的任何方向(平行或反平行)。優(yōu)選所述鏈的構(gòu)型如圖1所示。
已經(jīng)闡明本發(fā)明的一個目的是使結(jié)合分子的結(jié)合性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)(例如在不同環(huán)境(溫度，pH等)的穩(wěn)定性，抗原性等)均最佳化。這通過以下步驟進行獲取至少一個本發(fā)明的核酸(編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合分子)，并突變編碼的結(jié)構(gòu)區(qū)或親和區(qū)或者二者，并測試是否獲得具有希望的結(jié)合性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的分子。因此本發(fā)明提供了一種鑒別具有改變的結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子的方法，所述方法包括在本發(fā)明蛋白質(zhì)分子核心產(chǎn)生一個變化，并從所述蛋白質(zhì)分子中選擇具有結(jié)合性質(zhì)改變的蛋白質(zhì)分子，本發(fā)明還提供了鑒別具有改變的結(jié)構(gòu)性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子的方法，包括在本發(fā)明蛋白質(zhì)分子核心產(chǎn)生一個變化，并從所述蛋白質(zhì)分子中選擇具有結(jié)構(gòu)性質(zhì)改變的蛋白質(zhì)分子。這些改變在性質(zhì)上可以多種多樣，例如是翻譯后修飾。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計其它相關(guān)突變。
正如所闡述的，突變典型通過突變所述編碼核酸及在合適的系統(tǒng)中表達所述核酸而產(chǎn)生，所述表達系統(tǒng)可以是細菌，真核細胞或者甚至是無細胞系統(tǒng)。當(dāng)選擇時，當(dāng)然可以使用所述選擇系統(tǒng)之外的其它系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合分子的核酸，如生產(chǎn)編碼能展示至少一個希望的肽序列的蛋白質(zhì)分子的核酸的方法，包括提供編碼至少第一個和第二個結(jié)構(gòu)區(qū)的一個核酸序列，所述第一個和第二個結(jié)構(gòu)區(qū)由編碼所述希望的肽序列的核酸序列分隔或者由可以插入這個序列的一個區(qū)域分隔，突變編碼所述第一個和第二個結(jié)構(gòu)區(qū)的所述核酸以獲得編碼能展示至少一個希望的肽序列的所述蛋白質(zhì)分子的一個希望的核酸。本發(fā)明優(yōu)選提供了展示一種希望的肽序列的一種方法，包括提供編碼至少兩個β-折疊的核酸，所述β-折疊形成一個β-桶，所述核酸包含一個區(qū)域以插入編碼所述希望的肽序列的一個序列，插入包含希望的肽序列的一個核酸序列，并表達所述核酸，從而通過上述方法獲得所述β-折疊。本發(fā)明進一步提供了新的結(jié)合分子在目前結(jié)合分子涉及的所有領(lǐng)域中的應(yīng)用，如從混合物中分離物質(zhì)，所述混合物典型地為復(fù)雜的生物學(xué)混合物如體液或分泌液如血液或乳汁，或者血清或乳清。
當(dāng)然本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚制藥學(xué)應(yīng)用和診斷學(xué)應(yīng)用。在診斷學(xué)應(yīng)用中，標(biāo)記可以附于本發(fā)明分子上。在制藥學(xué)應(yīng)用中，本發(fā)明分子可以偶聯(lián)其它部分。在這兩種情況中，這可以是化學(xué)偶聯(lián)或者通過重組融合。在本領(lǐng)域中已經(jīng)就常規(guī)的結(jié)合分子而詳細描述了診斷學(xué)應(yīng)用和制藥學(xué)應(yīng)用。對于本發(fā)明新的結(jié)合分子，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需進一步解釋。定向形式的基因治療是許多實例之一，其中本發(fā)明的結(jié)合分子被提供在基因輸送載體上(基因輸送載體可以是病毒(腺病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺伴隨病毒或慢病毒等)或非病毒(脂質(zhì)體等)的載體)。本領(lǐng)域熟知被輸送的基因。
基因輸送載體也可以編碼輸送于靶位的本發(fā)明結(jié)合分子，其可能與一種毒性部分融合。本領(lǐng)域也熟知毒性部分與結(jié)合分子的綴合物，并包括本發(fā)明新的結(jié)合分子的綴合物。
詳細描述本發(fā)明在以下描述中得以更詳細的闡述。
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的設(shè)計，構(gòu)建，生產(chǎn)，篩選及應(yīng)用，所述蛋白質(zhì)含有參與分子結(jié)合的一或多個區(qū)域。本發(fā)明還涉及具有人工結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然發(fā)生的蛋白質(zhì)，具有額外的結(jié)構(gòu)成分及具有一或多個人工結(jié)合位點的重塑天然發(fā)生的蛋白質(zhì)，具有一或多個人工結(jié)合位點去除一些元件(結(jié)構(gòu)或其它元件)的重塑天然發(fā)生的蛋白質(zhì)，具有一或多個結(jié)合位點含有標(biāo)準化核心結(jié)構(gòu)基序的人工蛋白質(zhì)。所有這些蛋白質(zhì)均稱為VAP(Versatile Affinity Protein，通用親和性蛋白質(zhì))。本發(fā)明進一步涉及根據(jù)本發(fā)明方法鑒別的新VAP并將含有相似核心結(jié)構(gòu)的天然發(fā)生的蛋白質(zhì)上的結(jié)合位點轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)移之前希望將這種天然發(fā)生的蛋白質(zhì)3D模型化或誘變，以通過選擇的VAP上存在的親和區(qū)而恢復(fù)或保證抗原結(jié)合能力。另外，如本發(fā)明的描述，本發(fā)明涉及使用選擇的VAP純化，去除，掩飾，釋放，抑制，刺激，捕捉選擇的配體的方法，所述選擇的配體能由選擇的VAP結(jié)合。
配體結(jié)合蛋白含有一個(推定的)分子結(jié)合位點的許多天然發(fā)生的蛋白質(zhì)包含兩個功能不同的區(qū)域?qū)嶋H展示的結(jié)合區(qū)及一或多個被包裹在分子結(jié)合位點或口袋(pocket)周圍的區(qū)域，本文中稱為支架(scaffold)。這兩個區(qū)域的功能、結(jié)構(gòu)、組成及物理性質(zhì)不同。支架結(jié)構(gòu)保證整個蛋白質(zhì)的穩(wěn)定三維構(gòu)象，及作為實際識別區(qū)的墊腳石(steppingstone)。
可以區(qū)別兩組功能不同的配體結(jié)合蛋白質(zhì)。這種區(qū)別基于存在遺傳可變或不可變的配體結(jié)合區(qū)。一般地，不可變配體結(jié)合蛋白質(zhì)在該物種細胞的結(jié)合口袋中含有固定數(shù)目、固定組成及不可變的氨基酸序列。這種蛋白質(zhì)例如是所有的細胞粘著分子，例如N-CAM和V-CAM，酶家族，例如激酶和蛋白酶，及生長因子受體家族，例如EGF-R，bFGF-R。相反，遺傳可變的配體結(jié)合蛋白質(zhì)在活性遺傳改組、突變或重排機制的控制下，使生物體或細胞改變結(jié)合袋中及或者結(jié)合袋周圍的氨基酸的數(shù)目、組成和序列。這些的實例是抗體的所有類型的輕鏈和重鏈，B細胞受體輕鏈和重鏈及T細胞受體α、β、γ和δ鏈。野生型支架的分子構(gòu)造可以在很大程度上變化。例如，含有DNA結(jié)合分子的鋅指含有與抗體完全不同的支架(針對氨基酸成分和結(jié)構(gòu))，盡管這兩種蛋白質(zhì)均能與特異性的靶結(jié)合。
支架及配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過免疫獲得的抗體表達可變的(推定的)抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合蛋白質(zhì)已經(jīng)示出在研究配體結(jié)合蛋白質(zhì)中具有重要價值。產(chǎn)生配體結(jié)合蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)方法是使用動物免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)參與保護機體抵抗外源物質(zhì)。機體識別、結(jié)合及清除這種外源的高度多樣化的物質(zhì)的一種方式是產(chǎn)生抗這些分子的抗體。免疫系統(tǒng)能選擇并增殖識別抗原的抗體產(chǎn)生細胞。這種方法也能通過主動免疫法而模仿。在一系列免疫之后，可以形成識別并結(jié)合抗原的抗體。具有不同親和區(qū)的抗體的可能數(shù)目超過1040個，所述不同親和區(qū)可由于遺傳重排和突變而形成。然而，實際上免疫系統(tǒng)只篩選及優(yōu)化較少數(shù)目的抗體類型。針對正確的抗體生產(chǎn)細胞的分離及隨后這些細胞的無限增殖化，或者直接克隆選擇的抗體基因，可以保留抗原-抗體對以在將來(商業(yè)及非商業(yè))使用。
以此方式獲得的抗體的應(yīng)用僅限于有限的應(yīng)用。動物抗體的結(jié)構(gòu)與在人體中發(fā)現(xiàn)的抗體不同。將動物產(chǎn)生的抗體導(dǎo)入人體內(nèi)例如醫(yī)學(xué)應(yīng)用，幾乎確實引起不利于導(dǎo)入的抗體作用的免疫應(yīng)答(例如HAMA反應(yīng))。因為其不允許以商業(yè)目的主動免疫人體，因此以這種方式不能或很少能獲得人抗體。由于這些不利因素，已經(jīng)揭示了避免產(chǎn)生動物特異性抗體的方法。一個實例是除去小鼠免疫系統(tǒng)及在該小鼠體內(nèi)導(dǎo)入人免疫系統(tǒng)。在免疫后產(chǎn)生的所有抗體均是人源的。然而，使用動物還有兩個重要缺點。首先，生態(tài)學(xué)研究人員，研究人員，公眾輿論和政府部門密切關(guān)注動物的照管(animal care)。免疫屬于痛苦和緊張性操作，必須盡可能地預(yù)防。其次，免疫不總是產(chǎn)生抗體或者不總是產(chǎn)生包含所需特征如結(jié)合強度、抗原特異性等的抗體。原因可以多種多樣免疫系統(tǒng)恰巧錯過這種推定的抗體；最初形成的抗體表現(xiàn)是毒性或有害的；最初形成的抗體也識別動物特異性分子及因此破壞產(chǎn)生這種抗體的細胞；或者所述表位不能由免疫系統(tǒng)定位(mapped)(這可以有一些原因)。
其它方式獲得的抗體如上所述，可清楚知道免疫程序可導(dǎo)致配體結(jié)合蛋白質(zhì)形成，但其應(yīng)用是受限的，不可改變的及不可控制的。本發(fā)明使用細菌產(chǎn)生抗體片段的方法(Skerra and Pluckthun，1988；Better et al.，1988)提供了新的強有力的工具以避免應(yīng)用動物及免疫程序。已經(jīng)示出克隆的抗體片段(構(gòu)架，親和區(qū)及這些組合)可以在人工表達系統(tǒng)中表達，可以在體外調(diào)節(jié)和產(chǎn)生識別(推定的)特異性靶位的抗體及衍生物(Fab，VL，VH，scFv和VHH)。新的有效選擇技術(shù)及改良的簡并(degeneration)策略指導(dǎo)巨大的人工(人)抗體片段文庫的產(chǎn)生。這種文庫潛在地含有可結(jié)合一或多個選擇的配體的抗體片段。這些推定的配體特異性抗體可以通過篩選及選擇程序提取(retrieve)。因此，特異性靶位的配體結(jié)合蛋白可以工程化及提取而不用使用動物免疫。
其它免疫球蛋白超家族衍生的支架盡管大多數(shù)精力和努力放在產(chǎn)生及優(yōu)化天然產(chǎn)生的或復(fù)制的人抗體衍生的文庫上，但其它支架也已經(jīng)被描述作為一或多個配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的載體是成功的支架。基于天然發(fā)生的抗體的支架的實例涵蓋了小抗體(Pessi等，1993)，Camelidae VHH蛋白(Davies and Riechmann，1994；Hamers-Casterman等，1993)及可溶的VH變體(Dimasi等，1997；Lauwereys等，1998)。已經(jīng)用于親和區(qū)插入的兩個其它天然發(fā)生的蛋白質(zhì)也是免疫球蛋白超家族的成員T細胞受體鏈(Kranz等，WO.Patent 0148145)及纖連蛋白結(jié)構(gòu)域-3區(qū)(Koide US Patent 6,462,189；Koide等，1998)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述兩個T細胞受體鏈均可以具有三個親和區(qū)，而研究者描述的纖連蛋白區(qū)只有兩個區(qū)。
非免疫球蛋白衍生的支架除了免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域衍生的支架之外，也已經(jīng)研究了含有非免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的支架。所有研究的蛋白質(zhì)均只含有一個蛋白質(zhì)鏈及1-4個親和相關(guān)區(qū)。Smith及其同事(1998)報道了使用knottins(一組小型二硫鍵蛋白質(zhì))作為支架。他們成功產(chǎn)生了一個基于具有7個突變的氨基酸的knottins的文庫。盡管所述蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和長度極佳，但可以隨機化的氨基酸數(shù)目及親和區(qū)的奇異點較少使knottin蛋白質(zhì)不是非常有用。Ku和Schultz(1995)在細胞色素b562的四螺旋束(four-helix-bundle)結(jié)構(gòu)中成功導(dǎo)入兩個隨機區(qū)域。然而，選擇的結(jié)合物(binder)示出以微摩爾Kd值結(jié)合而不是所需的納摩爾或者甚至更好的范圍。已經(jīng)使用的另一種構(gòu)架屬于蛋白質(zhì)的酶抑制劑(tendamistat)家族。McConnell和Hoess(1995)論證了來自唐德鏈霉菌(Streptomyces tendae)的α-淀粉酶抑制劑(74個氨基酸β-折疊蛋白)可以作為配體結(jié)合文庫的支架。兩個結(jié)構(gòu)域示出接受簡并的區(qū)域并發(fā)揮配體結(jié)合功能。結(jié)合物的大小和性質(zhì)示出酶抑制劑作為配體模擬物(稱為mimetopes)可以發(fā)揮非常好的功能。這個選項現(xiàn)已經(jīng)加以利用。Lipocalin蛋白也示出是最大4個親和區(qū)的成功支架(Beste等，1999；Skerra，2000 BBA；Skerra，2001 RMB)。Lipocalins參與小分子如類維生素A、花生四烯酸及一些不同類固醇的結(jié)合。每個lipocalin均具有一個識別并結(jié)合一或多個特異性配體的特化區(qū)域。Skerra(2001)使用lipocalin RBP和lipocalin BBP在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的部位導(dǎo)入可變區(qū)。在構(gòu)建一個文庫并連續(xù)篩選后，研究人員能分離并定性一些獨特的結(jié)合物，其與選擇的配體具有納摩爾特異性。目前未知在細菌或真菌細胞中怎樣產(chǎn)生有效的lipocalin。lipocalin的大小(大約170個氨基酸)對VHH鏈(大約100個氨基酸)而言相當(dāng)大，其對工業(yè)應(yīng)用而言也太大。
核心結(jié)構(gòu)開發(fā)在商業(yè)性工業(yè)應(yīng)用中，非常感興趣使用單鏈肽而不是多鏈肽，因為這種肽在生產(chǎn)過程中低成本高效率?？捎糜诠I(yè)應(yīng)用的一個實例是VHH抗體。這種抗體非常穩(wěn)定，可具有高度特異性及相對較小。然而，所述支架已經(jīng)演變?yōu)閷γ庖咭蕾嚬δ芏枪I(yè)應(yīng)用是最佳的。另外，在一個抗體庫(pool)中存在非常多樣的構(gòu)架區(qū)庫阻礙了模塊優(yōu)化(modular optimisation)方法的使用。因此基于VHH蛋白質(zhì)的有利的穩(wěn)定性設(shè)計一種新的支架。
使用3D建模和對比模擬軟件(comparative modeling software)設(shè)計一種支架，其符合通用親和性蛋白質(zhì)(VAP)的需要。然而，目前還不能計算所有可能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和其它特點，因為這將花費幾個月的時間經(jīng)計算機計算。因此，我們通過使用展示技術(shù)測試了最有希望的在實驗室中經(jīng)計算機設(shè)計的支架，所述展示技術(shù)如噬菌體展示等。在這種方式中，可以在相對短時間內(nèi)篩選大量支架。
免疫球蛋白樣(Ig樣)折疊在自然界非常普遍。許多蛋白質(zhì)，尤其在動物王國中，在屬于這個類別的蛋白質(zhì)中均具有一個折疊區(qū)?；仡櫤蠭g樣折疊的蛋白質(zhì)的功能及在特殊蛋白質(zhì)中這個Ig樣折疊的功能，顯然大多數(shù)這些結(jié)構(gòu)域(如果不是全部)均參與配體結(jié)合。含有Ig樣折疊的蛋白質(zhì)的一些實例是V-CAM，免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域，免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，免疫球蛋白恒定區(qū)，T-細胞受體，纖連蛋白，呼腸孤病毒(reovirus)外殼蛋白，β-半乳糖苷酶，整合素(integrin)，EPO-受體，CD58，核酮糖羧化酶，desulphoferrodoxine，超氧化物等，生物素脫羧酶及P53核心DNA結(jié)合蛋白。大多數(shù)Ig樣折疊的分類可得自SCOP數(shù)據(jù)庫(Murzin A.G等，1995；http//scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop)及得自CATH(Orengo等，1997；http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath_new/index.html)。SCOP將這些折疊分類為全部是β蛋白，具有一個免疫球蛋白樣β夾層(sandwich)，其中所述夾層含有2個片層中的7個鏈，盡管含有該折疊的一些成員具有額外的鏈。CATH將這些折疊分類為主要是β蛋白，具有一個如免疫球蛋白樣折疊中的一個類夾層的結(jié)構(gòu)，指定代碼為2.60.40。在結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫如CE(Shindyalov等1998；http//cl.sdsc.edu/ce.htm)，VAST(Gibrat等，1996；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml)和FSSP(Holm等，1998；http//www.ebi.ac.uk/dali/fssp)中，使用相似的分類。
使用Cn3D(NCBI；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml)，InsightII(MSI；http//www.accelrys.com/insight)及其它結(jié)構(gòu)觀察器的軟件將來自不同蛋白質(zhì)的這些折疊投影，示出Ig樣折疊具有不同的亞結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)構(gòu)的投影示意圖示于圖1。在所述折疊的中心觀測到最保守的結(jié)構(gòu)，稱為核心。該核心結(jié)構(gòu)的長度幾乎不變化并具有相對保守的空間制約(constrain)，但發(fā)現(xiàn)其序列和氨基酸組成可有很大程度變化。在核心的兩側(cè)，均存在亞結(jié)構(gòu)域。這些稱為連接環(huán)(connecting loop)。這些連接環(huán)非常易變，因為其在氨基酸容量，序列，長度和構(gòu)型方面均可變化。所述核心結(jié)構(gòu)因此被認為是這些蛋白質(zhì)中最重要的結(jié)構(gòu)域。形成核心的β-元件的數(shù)目可在7-9之間變化，盡管6個鏈的核心結(jié)構(gòu)也可以是重要的。核心的所有的β元件均排列在兩個β-折疊內(nèi)。每個β-折疊均由反平行方向的β-元件構(gòu)成。觀測到的一個β-折疊中β-元件的最小數(shù)目為3個元件。觀測到的一個β-折疊中β-元件的最大數(shù)目是5個元件，盡管不能排除可以具有更高數(shù)目的β-元件。連接環(huán)連接所述桶一側(cè)上的β-元件。一些連接穿經(jīng)β-折疊，而其它的連接連接位于一個β-折疊內(nèi)的β-元件。特別是指定為L2，L4，L6和L8的環(huán)實際上用于配體結(jié)合并因此是導(dǎo)入或修飾結(jié)合肽/親和區(qū)的優(yōu)選位點。L1，L3，L5和L7環(huán)的長度、結(jié)構(gòu)、序列和氨基酸組成的高度多樣性明顯表明這些環(huán)也可以至少以人工形式用于配體結(jié)合。
β-元件中形成實際核心的氨基酸側(cè)鏈朝向核心內(nèi)部投影(project)，并因此充填了核心中心空間，其能通過H鍵，共價鍵(半胱氨酸橋)及其它力而彼此相互作用，決定了折疊的穩(wěn)定性。由于發(fā)現(xiàn)排列在內(nèi)部的β元件部分的殘基的氨基酸組成和序列非常易變，因此推斷可以產(chǎn)生許多其它序列形式。
為獲得所述結(jié)構(gòu)作為出發(fā)點以設(shè)計含有這種Ig樣折疊的新型蛋白質(zhì)的基本理念，使用含有Ig樣折疊的結(jié)構(gòu)域投影。InsightII，Cn3D和Modeller程序用于確定最小元件和長度。另外，只有所述結(jié)構(gòu)的C-α原子被投影，因為這些描述了所述折疊的最低特征。允許這些β-元件的空間位置(坐標(biāo))中有微小差別。
代表Ig樣折疊核心的C-α原子的坐標(biāo)的PDB文件用于產(chǎn)生新的含有9，8，7，6和5個β-元件的結(jié)構(gòu)。針對8個鏈的結(jié)構(gòu)，可以忽略β-元件1或9，而且元件5或6也可以忽略。因此一個8個鏈的核心優(yōu)選包含元件2-8，及1或9。另一個優(yōu)選的8個鏈的核心包含元件1-4，7-9，及鏈5或鏈6。針對7個鏈的結(jié)構(gòu)，可以去除元件1和9，1和5，6和9，9和5及元件4和5的組合中的2個β-元件。因為空間限制優(yōu)選除去元件4和5。6個鏈的結(jié)構(gòu)優(yōu)選缺失元件1，4和5或者4，5和9，但用Insight和Modeller分析顯示其它形式也是可靠的并足以進行工程化。
構(gòu)建多種初級支架并合并起來(pooled)。所有計算機設(shè)計的蛋白質(zhì)僅是推測的。在初級支架中的一個突變或者多個氨基酸變化使其成為成功的支架或者使其功能比預(yù)期的更加完善。為實現(xiàn)這個目的，將構(gòu)建的初級支架通過PCR擴增進行適度突變，所述PCR包括易錯PCR，如在反應(yīng)混合物中dNTP摩爾濃度不等，加入錳或其它添加劑，或者加入核苷酸類似物，如dITP(Spee等，1993)或dPTP(Zaccolo等，1996)，其最后可改變初級支架的氨基酸組成和氨基酸序列。以這種方式產(chǎn)生新的(二級)支架。
為測試所述支架所需的功能性、穩(wěn)定性及其它特性或希望的特征，將一系列已知的親和區(qū)如結(jié)合溶菌酶的1MEL及結(jié)合RNase的1BZQ插入初級模塊構(gòu)建的支架中。構(gòu)建的VAP的功能性、熱及化學(xué)穩(wěn)定性通過測定伸展條件而確定。在化學(xué)或熱處理后的功能性通過結(jié)合分析(ELISA)確定，而溫度誘導(dǎo)的伸展使用圓二色性(CD)旋光計測定。使用噬菌體展示技術(shù)選擇希望的支架或者優(yōu)化支架。
用于構(gòu)建文庫的起始親和區(qū)在本發(fā)明中，需要新的及獨特的親和區(qū)。親和區(qū)可得自天然來源，簡并的引物或者堆積的DNA三聯(lián)體。所有這些來源均具有上述某些重要的局限性。在我們的新設(shè)置中，設(shè)計了一種新的及明顯改良的親和區(qū)來源，其局限性較小，可用于模塊系統(tǒng)中，是非常便于應(yīng)用和優(yōu)化的，并快速及便于產(chǎn)生及調(diào)節(jié)，具有低百分比的終止密碼子，具有非常低百分比的移碼，其中重要的結(jié)構(gòu)特征可以保存在大量新形成的克隆中而且可以導(dǎo)入新的結(jié)構(gòu)元件。
在正?？贵w輕鏈和重鏈中的主要的重要親和區(qū)(CDR3)平均長度在11(小鼠)和13(人)個氨基酸之間。因為在這種抗體中，輕鏈和重鏈中的CDR3協(xié)同作為抗原結(jié)合物(antigen binder)，這種結(jié)合的強度是這兩個區(qū)域共同的結(jié)果。相反，由于缺乏輕鏈的原因，VHH抗體(駱駝科(Camelidae))的抗原結(jié)合是一個CDR3區(qū)的結(jié)果。估計這些CDR3區(qū)域的平均長度為16個氨基酸，明顯比正規(guī)的CDR3區(qū)長(Mol.Immunol.Bang Vu等，1997，34，1121-1131)。強調(diào)的是長的或多個CDR3區(qū)潛在地具有更多的與配體相互作用的位點，及因此可以具有更多的特異性及更強的結(jié)合。另一例外是在牛(Bos taurus)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的CDR3區(qū)(Berens等，1997)。盡管牛體內(nèi)的抗體由輕鏈和重鏈組成，但其CDR3區(qū)比在小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的CDR3區(qū)更長，其長度與駱駝CDR3區(qū)相當(dāng)。主要親和區(qū)的平均長度應(yīng)優(yōu)選是大約16個氨基酸長。為盡可能地覆蓋潛在功能性CDR長度，主要親和區(qū)的長度可在1-50個氨基酸之間或者甚至更多個氨基酸之間變化。由于CDR3區(qū)(類似于CDR1和CDR2)的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)類別還未闡明及理解，因此不可能以至關(guān)重要的氨基酸的位置和性質(zhì)均正確的方式設(shè)計長的親和區(qū)。因此，大多數(shù)文庫要補充完全簡并的區(qū)域，以發(fā)現(xiàn)至少一些正確的區(qū)域。在本發(fā)明中，我們描述了天然發(fā)生的駱駝VHHCDR3以及牛衍生的VHCDR3區(qū)作為新的親和區(qū)的模板的應(yīng)用，但當(dāng)然可以使用其它CDR區(qū)(例如CDR1和CDR2)以及長度相應(yīng)的改變的其它序列。通過PCR將CDR3區(qū)從編碼VHH抗體的mRNA中擴增，所述VHH抗體源自駱駝科的多種動物或者源自含有長CDR3區(qū)的多種其它動物。接著將此大約108個不同CDR3區(qū)如庫上所述通過PCR進行突變，所述庫在編碼氨基酸組成，氨基酸序列，推定的結(jié)構(gòu)類別及長度方面不同。結(jié)果是大多數(shù)產(chǎn)物與原始模板不同，及因此含有潛在地具有不同親和區(qū)的編碼區(qū)。其它非常重要的結(jié)果是所述產(chǎn)物保持其長度，所述庫保持其長度分布，明顯一部分保持結(jié)構(gòu)重要信息而其它部分可形成非天然類別的結(jié)構(gòu)，所述產(chǎn)物不含有或僅非常罕見地含有移碼及大多數(shù)產(chǎn)物缺失終止密碼子。這些新親和區(qū)可以通過模塊親和性及支架轉(zhuǎn)移(Modular Affinity and Scaffold Transfer，MAST)技術(shù)克隆入選擇的支架中。這個技術(shù)基于如下的事實，即上述所有設(shè)計的和構(gòu)建的支架具有一個模塊結(jié)構(gòu)，由此連接β-鏈的所有環(huán)均可以易于由其它環(huán)置換而不改變VAP的整體結(jié)構(gòu)(見圖2)。新構(gòu)建的文庫可以由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員進行與篩選正規(guī)文庫相似的篩選步驟而篩選。因此本發(fā)明進一步提供了一種生產(chǎn)包含人工結(jié)合肽的文庫的方法，所述方法包括提供至少一個核酸模板，其中所述模板編碼不同特異性結(jié)合肽，產(chǎn)生所述模板通過其突變所得的核酸衍生物的集合(collection)，及將所述集合或其一部分提供給肽合成系統(tǒng)以產(chǎn)生包含人工結(jié)合肽的所述文庫。所述文庫的復(fù)雜性隨著用于產(chǎn)生文庫的不同模板的數(shù)目的增加而增加。在這種方式中，使用數(shù)目增加的不同結(jié)構(gòu)。因此優(yōu)選提供至少2個核酸模板，最好提供至少10個核酸模板。可以使用多種方式和方法導(dǎo)入突變。優(yōu)選所述方法通過改變核酸模板或其衍生物中的堿基而導(dǎo)入突變。衍生物是指一種核酸，其與所述模板相比包含至少一個導(dǎo)入的突變。在這種方式中，親和區(qū)的大小不受影響。合適的修飾策略包括擴增策略如PCR策略，包括例如不平衡濃度的dNTPs(Cadwell等，(1992)；Leung等，(1989)1；Kuipers，(1996))，加入dITP(Xu等(1999)；Spee等(1993)；Kuipers，(1996))，加入dPTP(Zaccolo等，5(1996))，加入8-oxo-dG(Zaccolo等，(1996))，加入Mn2+(Cadwell等，(1992)；Leung等，(1989)1，Xu等，(1999))，具有高度誤摻入(highmisincorporation)水平的聚合酶(Mutagene，Stratagene)。當(dāng)然也可以使用導(dǎo)入突變的位點特異性方案，然而，使用這種方法產(chǎn)生文庫需要相當(dāng)多的時間和精力，因此選擇采用一種僅基于定點誘變的策略。當(dāng)然可以使用雜交策略。優(yōu)選包含在新生鏈延伸期間摻入dITP和/或dPTP的突變策略，因為這種策略易于控制在每個循環(huán)中導(dǎo)入的突變數(shù)目。所述方法不依賴使用簡并引物(degenerate primer)導(dǎo)入復(fù)雜性。因此在一個實施方案中，所述擴增利用非簡并引物。然而，可以使用(部分)簡并引物，因此本發(fā)明還提供了一種方法，其中至少一個非簡并引物進一步包含一個簡并區(qū)。產(chǎn)生所述結(jié)合肽的文庫的方法尤其適于產(chǎn)生上述優(yōu)選的較大的親和區(qū)。在這些區(qū)域中，可以導(dǎo)入較多的改變同時保留一樣的相似結(jié)構(gòu)。因此優(yōu)選地，至少一個模板編碼一種特異性結(jié)合肽，其具有一個包含至少14個氨基酸優(yōu)選至少16個氨基酸的親和區(qū)。盡管在本發(fā)明的這個實施方案中可以使用非連續(xù)區(qū)域，但優(yōu)選所述區(qū)域包含至少14個連續(xù)的氨基酸。當(dāng)使用多個模板時，優(yōu)選所述區(qū)域長度包含平均24個氨基酸。
有利的是，產(chǎn)生結(jié)合肽文庫的方法可與本發(fā)明的核心區(qū)及產(chǎn)生核心區(qū)的方法組合。例如，一旦選擇一種合適的結(jié)合區(qū)，則可以設(shè)計或選擇一個核心以適合特殊應(yīng)用。然而，也可以根據(jù)結(jié)合肽的指定用途而選擇一個特殊的核心區(qū)。隨后可以產(chǎn)生具有所述核心的文庫及所述結(jié)合肽的文庫。這類文庫的用途當(dāng)然是多種多樣的?；蛘?，可以使用組合策略以產(chǎn)生具有核心文庫的結(jié)合肽文庫。各個文庫的復(fù)雜性當(dāng)然可以加以控制以使組合文庫適應(yīng)特殊用途。因此在一個優(yōu)選的實施方案中，至少一個所述模板編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子?？梢允褂盟鲭?，核心及其組合選擇本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子，因此本發(fā)明進一步提供了一種方法，其包含提供所述人工肽的文庫中肽的一種潛在的結(jié)合配體，并選擇能特異性結(jié)合來自所述文庫的所述結(jié)合配偶體(partner)的肽。本發(fā)明當(dāng)然還提供了使用所述方法獲得的一種選擇的蛋白質(zhì)分子。為易于回收和生產(chǎn)選擇的蛋白質(zhì)分子，優(yōu)選將至少所述核心和結(jié)合肽展示在一種可復(fù)制的包裝上，所述包裝包含編碼展示的核心/肽蛋白質(zhì)分子的核酸。優(yōu)選地所述可復(fù)制的包裝包含一種噬菌體，如用于噬菌體展示策略中的噬菌體。因此本發(fā)明還提供了一種噬菌體展示文庫，其包含本發(fā)明的至少一個蛋白質(zhì)分子。如上所述，產(chǎn)生結(jié)合肽文庫的方法可有利地適用于核心區(qū)。因此本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)包含人工核心文庫的方法，所述方法包含提供至少一種核酸分子模板，其中所述模板編碼不同的特異性核心，通過突變生產(chǎn)所述模板的核酸衍生物集合，并將所述集合或其一部分提供給肽合成系統(tǒng)以產(chǎn)生所述人工核心文庫。優(yōu)選的結(jié)合肽文庫衍生自包含來自牛(Bos Taurus)或駱駝(優(yōu)選地羊駝(lama pacos)和駝羊(lama glama))的CDR3區(qū)的模板。
親和區(qū)(AR)蛋白質(zhì)-配體相互作用是生命的基本原理之一。實際上蛋白質(zhì)之間，蛋白質(zhì)與核酸之間，蛋白質(zhì)與糖之間或蛋白質(zhì)與其它類型分子之間所有蛋白質(zhì)-配體介導(dǎo)的相互作用是通過蛋白質(zhì)表面存在的界面和配體表面分子性質(zhì)介導(dǎo)的。參與蛋白質(zhì)-配體相互作用的絕大多數(shù)蛋白質(zhì)表面在生物體的生命周期中始終是保守的。屬于這些類別的蛋白質(zhì)例如是受體蛋白、酶和結(jié)構(gòu)蛋白。某一特異性配體的相互作用表面部位通常是恒定的。然而，一些類別的蛋白質(zhì)可通過例如突變、重組或其它類型的自然遺傳工程程序調(diào)節(jié)其暴露的表面部位的性質(zhì)。這種作用的原因是其配體或配體類型可以很大程度地改變。屬于這種類別的蛋白質(zhì)是例如抗體、B細胞受體和T細胞受體蛋白。盡管大體上這兩種類別的蛋白質(zhì)之間無差別，但這兩種類別的表面改變速度不同。第一類主要對進化力敏感(物種的壽命)，而第二類對突變力更敏感(在生物體的壽命期限內(nèi))。
受體與配體之間的結(jié)合特異性和親和性是由這兩種分子的暴露的界面之間的相互作用介導(dǎo)的。蛋白質(zhì)表面是由在該部位存在的氨基酸類型而決定的。自然界常見的20種不同的氨基酸具有有其自身化學(xué)和物理性質(zhì)的側(cè)鏈。這是在可能與其它分子相互作用的某暴露的表面部位中所有氨基酸的累積作用。靜電力，疏水性，H鍵，共價偶聯(lián)及其它類型的性質(zhì)決定了與配體結(jié)合的類型，特異性和強度。
參與蛋白質(zhì)—配體相互作用的最復(fù)雜的蛋白質(zhì)是那些抗體。已經(jīng)進化了一種精巧的系統(tǒng)，其控制可編碼這種蛋白質(zhì)的基因內(nèi)的突變，重組及其它遺傳改變的位置和水平。遺傳改變力(genetic changingforce)主要針對形成參與結(jié)合推定的配體的暴露的抗體表面部位的這些區(qū)域。(理論上)可以形成大量不同的抗體表明抗體的能力。例如，如果在抗體的輕鏈和重鏈中直接參與配體結(jié)合的氨基酸數(shù)目假定為每個鏈8個氨基酸(而且這確實不樂觀)，則可以形成202*8，大約1020個不同的抗體(20種氨基酸類型，2個鏈，8個殘基)。如果位于附近的氨基酸的間接作用包括和/或增加直接相互作用氨基酸的實際數(shù)目，則會以天文數(shù)字而告終。在選擇所述配體的抗體中，地球上沒有一種生物體能測試所有這些或者甚至僅僅是這些組合的一部分。
不是所有存在于暴露表面部位的氨基酸均相等地參與配體結(jié)合。一些氨基酸可以改變?yōu)槠渌被岫伙@著改變或者僅略微改變配體結(jié)合性質(zhì)。另外，蛋白質(zhì)的大多數(shù)表面部位是非常柔性的，并在配體表面的影響下可以易于重塑(remodel)，因此與所述配體表面相適應(yīng)，這種情況在不具柔性的配體結(jié)合區(qū)不會發(fā)生。上述蛋白質(zhì)與配體之間的相互作用力因此可引導(dǎo)(steer)或催化這種重塑。一般地，大量但有限數(shù)目的遺傳改變與氨基酸中的冗余及表面的柔性性質(zhì)組合結(jié)合力一起可導(dǎo)致有效的配體結(jié)合蛋白的產(chǎn)生。
在免疫選擇過程中，對自然產(chǎn)生的抗體及其親和區(qū)已經(jīng)在某種程度上優(yōu)化。這些選擇基于免疫系統(tǒng)中這些分子的作用。在免疫系統(tǒng)之外的抗體應(yīng)用由于免疫選擇標(biāo)準的性質(zhì)和限制被阻礙了。因此，工業(yè)、化妝品、研究及其它應(yīng)用通常需要不同性質(zhì)的配體結(jié)合蛋白。其中可以應(yīng)用結(jié)合分子的環(huán)境對抗體結(jié)構(gòu)可能非?？量?，例如極端的pH條件，鹽條件，不尋常的溫度等。根據(jù)應(yīng)用，CDR可以或不可以從天然抗體中移至一個支架上。針對至少一些應(yīng)用，需要與眾不同的親和區(qū)。因此，針對其它應(yīng)用需要人工構(gòu)建的及仔細選擇的支架和親和區(qū)。
人工支架上存在的親和區(qū)可以得自一些來源。首先，可以使用天然親和區(qū)。使用PCR可以分離編碼抗體片段的cDNA的CDR，并將其在適當(dāng)?shù)奈恢貌迦胫Ъ?。這種區(qū)域的來源可以是免疫或未免疫的動物。其次，使用簡并引物可以構(gòu)建完全合成的AR。再者，可以構(gòu)建半合成的AR，其中只有一些區(qū)域是簡并的。第四，編碼選擇的氨基酸(單一的或混合物)的三聯(lián)體(triplet)可以以預(yù)定的方式融合在一起。第五，將天然產(chǎn)生的親和區(qū)(來自免疫動物或天然的動物)在擴增過程(例如NASBA或PCR)期間通過導(dǎo)入突變條件(例如錳離子)或者在反應(yīng)期間導(dǎo)入制劑(例如dITP)進行突變。
由于先前提及的原因，基于CDR的免疫可以成功，但大多數(shù)配體或配體結(jié)構(gòu)域不是免疫原性的。如果不是必然的，則人工親和區(qū)組合強力選擇及優(yōu)化策略越來越重要?；谝锏牟呗砸驗楦咚降慕K止密碼子，移碼，難以測序，太大隨機化性，相對少量的突變點(spot)(最多大約8個點)及短隨機化序列段(stretch)(不超過8個氨基酸)的原因不是非常強力的。非天然衍生的AR的能力也依賴于推定正確折疊的AR的百分率，即能在支架上呈遞而無AR或者甚至所述支架折疊的問題。目前幾乎沒有關(guān)于在AR中存在的結(jié)構(gòu)和區(qū)域的任何信息可獲得。因此，通過隨機化構(gòu)建的正確折疊及呈遞的人工AR尤其是長AR的百分率，與構(gòu)建的AR的長度成反比。將來很有可能獲得對CDR和AR結(jié)構(gòu)的認識，但現(xiàn)在還未獲得。
用于本發(fā)明中的單支架蛋白質(zhì)需要高親和性及高特異性，一般需要至少一個長親和區(qū)或者多個中等長度的AR以具有足夠暴露的氨基酸側(cè)鏈與配體相互作用。使用引物或三聯(lián)體融合策略，合成構(gòu)建的高度功能性長AR由于上述原因不是非常有效的。含有這種合成AR的文庫功能性太低或太大而不便操作。長AR的唯一可獲得來源是那些可以得自動物來源的那些(最通常是抗體重鏈中的CDR3s)。尤其分別是牛及駱駝的Vh鏈和Vhh鏈產(chǎn)生的CDR3區(qū)域是不同尋常地長。這些區(qū)域的長度平均為大約13個氨基酸，但不排除30個氨基酸或者甚至更多個氨基酸。用得自免疫的動物的這種AR構(gòu)建的文庫對那些具有免疫學(xué)活性的配體或配體結(jié)構(gòu)域是成功的。非免疫原性配體或配體結(jié)構(gòu)域及在免疫應(yīng)答(毒性，自身識別等)中沉默的配體，不觸發(fā)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生配體特異性長CDR。因此，介導(dǎo)這種靶位結(jié)合的長CDR不能或難以通過這種方式獲得，因此存在一個技術(shù)真空，即提供可用于單支架蛋白質(zhì)上的具有特異性長AR的CDR。。Muyldermans闡述了一種相似的結(jié)論(Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001)277-302)，其分析了合成的AR在lama Vhh支架上的應(yīng)用。
通過PCR分離CDR區(qū)域，尤其CDR3區(qū)域，使得可以使用可獲得的CDR區(qū)域中存在的所有長度的變體及所有結(jié)構(gòu)變體。通過核酸擴增技術(shù)例如PCR導(dǎo)入較小，輕度，中等水平或高水平隨機突變，將產(chǎn)生新型親和區(qū)。這種AR庫的益處在于如此產(chǎn)生的區(qū)域的長度分布是保守的。同樣，如果與基于隨機引物的方法相比，由于相對低數(shù)目的突變很大程度上防止了終止密碼子導(dǎo)入和移碼。進一步，根據(jù)突變百分比，明顯一部分或者甚至大部分產(chǎn)物將編碼與動物中存在的其原始模板序列呈現(xiàn)結(jié)構(gòu)信息相同或至少部分相同的肽序列。由于這些突變，大部分產(chǎn)物將產(chǎn)生改變的氨基酸序列及其因此具有新的結(jié)合性質(zhì)。就原始模板而言，結(jié)合性質(zhì)可以改變，不僅強度改變而且特異性和選擇性也改變。如果與合成的、半合成的及天然獲得的AR相比，通過這種方式可以產(chǎn)生長AR區(qū)域文庫，其具有明顯減少的上述技術(shù)或物理問題。
近年來，已經(jīng)發(fā)展了一些新的及有力的體外誘變方法和制劑。誘變方法的一個分支產(chǎn)生不依賴于特定位置的突變(與定點誘變(sitedirected mutagenesis)方法相反)。PCR策略涵蓋了例如不均衡濃度的dNTPs(Cadwell等，(1992)2；Leung等，(1989)；Kuipers，(1996))，加入dITP(Xu等，(1999)；Spee等，(1993)；Kuipers 57(1996))，加入dPTP(Zaccolo等，(1996))，加入8-oxo-dG(Zaccolo等，(1996))，加入Mn2+(Cadwell等，(1992)；Leung等(1989)；Xu等，(1999))，具有高度誤摻入水平的聚合酶(Mutagene，Stratagene)。
親和成熟在一或多個選擇循環(huán)后，形成一群富集的VAP，其識別選擇的配體。為獲得抗所述配體的更好的、不同的或其它改變的VAP，由于其模塊性質(zhì)可以將VAP編碼區(qū)或其一部分進行上述突變。一些策略是可能的首先，可以將完整的VAP或VAP用作模板。其次，只有一或多個親和區(qū)可以突變。第三，構(gòu)架區(qū)可以突變。第四，遍及VAP的片段可以用作模板。當(dāng)然可以重復(fù)處理以改變更多的區(qū)域。突變的平均數(shù)目可以通過改變PCR條件而改變。通過這種方式每個希望的區(qū)域均可以突變及每個希望水平的突變數(shù)目均可以單獨應(yīng)用。在突變之后，新形成的VAP庫可以再篩選及再選擇以發(fā)現(xiàn)抗所述配體的新的及改良的VAP。所述成熟方法可以根據(jù)需要再開始及再應(yīng)用多次。
這種突變程序的作用是不僅可以發(fā)現(xiàn)具有希望親和性和特異性的親和區(qū)1和2，還可以在選擇的親和區(qū)3中導(dǎo)入較小的改變。已經(jīng)示出(REF)在這個主要配體結(jié)合區(qū)中的突變程序可明顯提高配體結(jié)合性質(zhì)?？偠灾?，在此描述的本發(fā)明在成熟階段非常有力。
VAP的工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明的VAP可用于各種各樣的應(yīng)用中，從治療至抗生素，從檢測試劑至純化組件(module)等等。在每種應(yīng)用中，環(huán)境和下游應(yīng)用決定了特點，即配體結(jié)合蛋白應(yīng)具有例如溫度穩(wěn)定性，蛋白酶抗性，標(biāo)簽(tag)等。無論選擇的支架是什么，均具其自身獨特性質(zhì)。一些性質(zhì)對某些應(yīng)用可以是有利的，而其它則是無法接受的。針對大規(guī)工業(yè)性商業(yè)應(yīng)用，至關(guān)重要的是支架含有一個模塊設(shè)計以能易于及快速突變、除去、插入及交換區(qū)域。模塊性使其能通過標(biāo)準化程序使需要的性質(zhì)優(yōu)化，及允許結(jié)構(gòu)域交換程序，例如交換預(yù)制的盒。由于最佳模塊支架基因應(yīng)符合一些特點，因此將其設(shè)計及合成構(gòu)建，而自然提取的基因含有這種特點是極不可能的。
除了模塊性之外，在支架基因或蛋白質(zhì)中應(yīng)存在或不存在一些其它性質(zhì)?；谔烊坏鞍踪|(zhì)中存在的構(gòu)架的所有支架系統(tǒng)也繼承了其天然性質(zhì)。這些性質(zhì)已經(jīng)通過進化動力而優(yōu)化，以用于這一特異性蛋白質(zhì)所作用的系統(tǒng)。特異性性質(zhì)涵蓋了例如密碼子選擇，密碼子頻率，表達水平，折疊模式及半胱氨酸橋(cystein bridge)形成。然而，這類蛋白質(zhì)的工業(yè)上的商業(yè)生產(chǎn)需要優(yōu)化的表達、翻譯和折疊以獲得經(jīng)濟利益。不僅遺傳信息應(yīng)該是適合于該生產(chǎn)生物并為其所接受，而且蛋白質(zhì)性質(zhì)也應(yīng)該對其應(yīng)用類型而言是最佳化的。這類性質(zhì)可以是熱敏感性、pH敏感性、鹽濃度敏感性、蛋白酶解敏感性、穩(wěn)定性、純化可能性等等。因此，為了在親和方法中有實用性，僅僅特異性結(jié)合活性是不夠的。特異性結(jié)合制劑必須也能夠與一固相連接，所述固相例如柱中的載體材料，一種不可溶的珠，一種塑料、金屬或紙表面或任何其它有用的表面。理想地，這種連接通過對特異性結(jié)合活性不具有任何不利作用而實現(xiàn)。因此這種連接優(yōu)選地用VAP分子中與所述特異性親和性區(qū)域相對較遠的區(qū)域而實現(xiàn)。
本發(fā)明的一個重要實施方案是親和性吸收材料，其包含固定在多孔性硅等材料上的一種特異性結(jié)合物(binding agent)，所述特異性結(jié)合物包含所選擇的VAP分子。
本發(fā)明的一個特別重要的實施方案是親和性吸收材料，其包含固定在多孔性載體材料如硅或惰性、剛性聚合物等上的一種特異性結(jié)合物，該多孔性載體材料具有至少30但不超過1000的孔徑，其中所述特異性結(jié)合物包含一系列所選擇的VAP分子。優(yōu)選地所述載體的孔徑為至少60。優(yōu)選地所述孔徑不超過500，更優(yōu)選地不超過300。蛋白質(zhì)與支持物的偶聯(lián)廣泛用于研究和工業(yè)中(Narayanan andCrane，bas(1990)。作為VAP的支持物或載體材料的聚合物包括但非限于尼龍、烯類聚合物、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙酸乙烯酯、聚四氟乙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、纖維素、殼多糖、脫乙酰殼多糖、瓊脂糖、蛋白質(zhì)?；钚缘?即為蛋白質(zhì)偶聯(lián)準備的)支持材料是可商購的或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員化學(xué)激活。
載體介質(zhì)如硅或惰性聚合物的孔大小可以使用例如標(biāo)準大小排阻技術(shù)或其它公布的方法測定。所述孔徑大小通常是指孔平均直徑，其以孔體積與表面積的函數(shù)表示，通過Wheeler等式(MPD＝(40,000×孔體積)/表面積而計算。所述孔體積和表面積可以通過標(biāo)準氮吸收方法測定。
以使VAP呈遞給而且也包括終產(chǎn)物的方式應(yīng)用VAP的產(chǎn)物范圍非常廣泛。但在VAP是固定的及優(yōu)選地可以再生以再循環(huán)應(yīng)用的方法中，充分利用了了VAP的主要優(yōu)勢，即相對低成本的VAP使其特別適合大規(guī)模應(yīng)用，因為需要使用大量的親和體。以下示出了應(yīng)用范圍，無限制之意。用括號表示的可能應(yīng)用的產(chǎn)物或方法實例是(1)工業(yè)化食品加工如乳清、番茄醬、柑橘等的加工，或者與大量農(nóng)業(yè)原料相關(guān)的加工，如從大量農(nóng)作物中提取淀粉、油和脂肪、蛋白質(zhì)、纖維、糖等，所述農(nóng)作物包括但非限于馬鈴薯、玉米、水稻、小麥、大豆、棉花、向日葵、甜菜、甘蔗、木薯、油菜。大量工業(yè)生產(chǎn)加工流(process stream)的其它實例在乳品相關(guān)工業(yè)中發(fā)現(xiàn)，例如在干酪和黃油生產(chǎn)期間。由于所述VAP符合現(xiàn)有的加工步驟，而且所述VAP由于其與支持物的不可逆固定，其不會存在于終產(chǎn)物中，其特別適合于農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)慣用的大規(guī)模工業(yè)環(huán)境。
在更詳細的實例中，干酪生產(chǎn)過程的中產(chǎn)生的乳清級分含有相對大量的具有重要生物學(xué)功能的低豐度(low-abundant)蛋白質(zhì)，例如在嬰兒發(fā)育期間，作為天然抗生素，食品添加劑等。
這種蛋白質(zhì)例如是乳鐵傳遞蛋白、乳過氧化物酶、溶菌酶、血管生長素、胰島素樣生長因子(IGF)、胰島素受體、IGF-結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、結(jié)合及可溶的TGF-受體、表皮生長因子(EGF)、EGF-受體配體、白細胞介素-1受體拮抗劑。可從乳清中回收的另一亞類有價值的化合物是存在于乳汁或初乳中的免疫調(diào)節(jié)肽。也可以選擇特異性VAP以從乳清中回收激素。乳汁中存在的激素例如是促乳素、生長激素抑制素、催產(chǎn)素、黃體激素釋放激素、甲狀腺刺激激素、甲狀腺素、降鈣素、雌激素、孕酮。
(2)消費者可食用產(chǎn)品如冰淇凌，油基(oil-based)產(chǎn)品如油、人造黃油、調(diào)味品和蛋黃醬，其它加工的食品如湯、沙司、預(yù)制食品(pre-fabricated meals)、不含酒精的飲料、啤酒、葡萄酒等。(保存和防止食品變質(zhì)，通過直接的抗生素活性或者選擇性抑制酶，在加工期間保護敏感的基序免于例如以活性形式存在的影響終產(chǎn)物質(zhì)量的酶或化合物的作用，香味和氣味的控制釋放，分子模擬物掩蓋或增強香味或氣味例如在啤酒釀造工業(yè)中掩蓋或除去苦味組成，除去殺蟲劑或其它污染物，在加工期間保護敏感的基序，例如優(yōu)選地變性在變性處理步驟下游需要活性的酶，其與特異性VAP的結(jié)合防止酶的活性位點被變性)(3)個人衛(wèi)生用品(care product)如香波、染發(fā)液、洗發(fā)液、洗衣去污劑、不同形式應(yīng)用的凝膠如粉末、糊狀物、片劑或液體形式等。(應(yīng)用于皮膚或衣物附屬品如鞋墊、衛(wèi)生紙中的抑制頭屑或其它皮膚相關(guān)微生物的抗微生物活性、牙膏和漱口水的抗微生物活性、提高去污劑中去污(stain-removing)酶的特異性，穩(wěn)定肥皂或去污劑中不穩(wěn)定的酶以提高例如溫度或pH穩(wěn)定性，提高染發(fā)產(chǎn)品的結(jié)合活性，抑制產(chǎn)生體味的酶活性)(4)非食品應(yīng)用如打印墨水、膠水、涂料、紙張、衛(wèi)生紙等(針對以別的方式難以印刷的表面的表面特異性墨水、膠水、涂料等，所述難以印刷的表面例如polyofines塑料瓶或容器或者需要高度特異性結(jié)合的表面，例如電子芯片生產(chǎn)中的平版印刷術(shù)，有價紙張的鑒定)(5)環(huán)境保護過程如水凈化、生物除污(bioremediation)、工藝用水的凈化，濃縮污染物(除去水凈化廠中或者例如溫室水再循環(huán)系統(tǒng)中微生物、病毒、有機污染物質(zhì)，除去空調(diào)管道中生物學(xué)有害物質(zhì))(6)干燥或潮濕形式的動物飼料(除去、掩蓋或以其它方式抑制通常在牛和魚飼料組成中發(fā)生的抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用，特別是蛋白酶抑制劑或者陰性因子如肌醇六磷酸，加入VAP作為抗微生物制劑以代替目前的基于蛋白質(zhì)的抗生素)。
盡管本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括工業(yè)過程，但VAP以親和層析方式的應(yīng)用確實不限于這些應(yīng)用。對于生產(chǎn)規(guī)模的“低容積/高價值(low volume/high value)”標(biāo)準，由于針對在傳統(tǒng)免疫應(yīng)答中難以產(chǎn)生抗體的配體的VAP的可利用性，使得針對價格對應(yīng)用而言不是特別重要的制藥、診斷和研究目的的多種應(yīng)用均切實可行，。同樣也由于尺寸小及穩(wěn)定性高可以提供“低容積/高價值”應(yīng)用，因此VAP比常規(guī)抗體或其片段更好。
(7)制藥學(xué)應(yīng)用，其中VAP可用作治療自身，特別當(dāng)所述核心設(shè)計為類似一種天然發(fā)生的蛋白質(zhì)或者為治療而鑒別和設(shè)計了適當(dāng)?shù)挠H和區(qū)和/或核心區(qū)時。
(8)診斷應(yīng)用，其中VAP由于與常用的抗體或抗體片段在本質(zhì)上不同的3D結(jié)構(gòu)，其可以檢測不同類別的分子。例如檢測感染性朊蛋白，其中導(dǎo)致感染狀態(tài)的突變掩藏在天然分子內(nèi)部。常規(guī)抗體僅可以在變性情況下區(qū)別感染形式，而VAP的小的和暴露的AR能識別位于更內(nèi)部的肽序列。
(9)研究應(yīng)用，其中VAP與例如平板表面或組織結(jié)合以提高檢測水平、將特異性化合物定位于一個固定的表面上、固定痕量分子在適當(dāng)?shù)奈恢玫龋蛘咂渲芯幋a特異性VAP的選擇的基因以瞬時、持續(xù)或以控制方式通過在細胞環(huán)境中翻譯所述基因而表達，及其中通過其定向表達而形成功能敲除的靶分子。例如，模擬一種受體配體可干擾正常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，或者具有酶抑制劑功能的VAP可以干擾代謝途徑或代謝行程。
盡管上述實例多種多樣，但VAP可以應(yīng)用的方式中存在共性，如以下與所述應(yīng)用組合形成矩陣的那些類別所例證1.親和層析，其中VAP固定在一個合適的支持物上，例如在層析柱中，其可呈直列式、串連或carroussel構(gòu)型以充分連續(xù)運轉(zhuǎn)。管子、試管、管線過濾器等也可與固定VAP排成一行。可以選擇VAP固定于其上的支持物以適應(yīng)在壓縮穩(wěn)定性、流動特性、化學(xué)惰性、溫度、pH及溶劑穩(wěn)定性等方面的加工需要。優(yōu)選地相對不能壓縮的載體，尤其是硅或剛性惰性聚合物。這些物質(zhì)在用于工業(yè)規(guī)模的親和層析中具有重要優(yōu)勢，因為與用于柔軟載體材料如瓊脂糖相比其可以充填在層析柱中并可在更高壓力下運轉(zhuǎn)。將結(jié)合蛋白質(zhì)與這種不同的支持物偶聯(lián)的方法是熟知的。在將選擇的工業(yè)生產(chǎn)液流加入所述層析柱后，通過熟知的方法如改變pH或鹽濃度，結(jié)合的配體可從固定的VAP中釋放出來，之后所述VAP可再生以用于新的循環(huán)。選擇的VAP的高度穩(wěn)定性使其特別適于這種重復(fù)循環(huán)，因此改良了這種回收和純化方法的成本效力。親和層析的原理和多方適應(yīng)性已經(jīng)在幾千種不同的應(yīng)用中充分描述。
2.不溶珠是一種不同形式的親和層析，其中VAP固定于其上的支持物不是固定位置的，而是如珠一樣的，例如硅石、金屬、磁性顆粒、樹脂等，可以固定在工業(yè)生產(chǎn)液流中以結(jié)合例如流化床(fluidisedbed)或攪拌罐中的特異性配體，之后所述珠可以簡便方法使用重力、磁力、過濾等方法從工業(yè)生產(chǎn)加工流中分離。
3.通過將所述配體與VAP交聯(lián)而凝固(coagulation)靶配體，從而通過沉淀降低其溶解性并濃縮所述配體。為此，VAP應(yīng)是二價的，即在所述支架每一側(cè)必須構(gòu)建至少兩個AR。這兩個AR可具有相同分子靶，但優(yōu)選地兩個不同的分子靶以提供交聯(lián)或凝固作用。
4.掩蓋(masking)特異性分子以在加工步驟期間保護敏感性基序，提高靶配體對于不利pH，溫度或溶劑條件的穩(wěn)定性，或者提高對有害或降解酶的抗性。分子掩蓋的其它功能作用可以是掩蓋揮發(fā)性分子以改變這種分子的感官感覺。相反，這種分子從VAP中緩慢和條件性釋放可以在更下游的加工步驟中，在消耗或消化期間或者在將VAP-配體復(fù)合物定向于合適的位點之后進行生物醫(yī)學(xué)或研究性應(yīng)用期間看到。使用具有特異性受體結(jié)合能力的VAP的揮發(fā)性化合物的分子模擬物也可以用于掩蓋消費品發(fā)出的氣味。
5.用VAP包被不可溶的材料以提供高特異性表面親和性或者將VAP或潛在的融合產(chǎn)物(即與所述VAP化學(xué)結(jié)合的產(chǎn)物，或者在蛋白質(zhì)的情況中與所述VAP一起翻譯的產(chǎn)物，在這種方式中VAP的特異性保持不變)與特異性表面結(jié)合。VAP的這種應(yīng)用例如是將特異性分子固定在例如平板等上的組織以提高檢測水平，將特異性化合物固定在一個固定的表面上，將痕量分子固定在一定位置等。
當(dāng)然不是所有的天然支架從商業(yè)和/或工業(yè)的觀點看均是令人感興趣的。例如整個蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和敏感性應(yīng)符合所提出的應(yīng)用的需要。酸性環(huán)境中的配體結(jié)合蛋白在高鹽或高溫環(huán)境中不適用。設(shè)計一個支架具有所有支架功能特征是不可能的。例如有些應(yīng)用需要蛋白酶解不敏感的支架，而其它應(yīng)用需要支架中特異性蛋白酶裂解位點。針對這些及許多其它應(yīng)用，不可能設(shè)計一個符合所有需要的支架。因此我們設(shè)計了不同的支架，使這些支架適合不同的需要。如本發(fā)明所示，我們能設(shè)計和構(gòu)建具有如熱穩(wěn)定性、廣泛pH抗性及甚至在高鹽濃度中具有配體結(jié)合特性的支架。另外，我們能使所述支架具有所需要的特性而不改變配體特異性，這通過改變核心中的氨基酸或朝向內(nèi)部或外部導(dǎo)向的氨基酸進行，例如導(dǎo)入或除去一個半胱氨酸橋或者除去一個潛在的N-糖基化位點。關(guān)于這方面，可以設(shè)計和構(gòu)建可用于多種配體結(jié)合環(huán)境而不改變配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)和空間位置的支架。使用上述MAST技術(shù)選擇的親和區(qū)可以從一個支架交換至另一個支架而不喪失其配體特異性，意味著僅通過改變支架就可以將一次選擇的親和性用于一些不同應(yīng)用中。
本發(fā)明進一步提供了一種蛋白質(zhì)分子，其生產(chǎn)和應(yīng)用方法，其中所述蛋白質(zhì)分子包含表2、3、10、13或16所示的一種分子。
實施例實施例1確定核心坐標(biāo)(coordinates)免疫球蛋白樣(Ig-樣)折疊在自然界非常普遍。許多蛋白質(zhì)尤其動物界蛋白質(zhì)中，屬于這一類的蛋白質(zhì)具有一個折疊區(qū)域?；仡櫤蠭g樣折疊的蛋白質(zhì)的功能以及回顧這種Ig樣折疊在該特異性蛋白質(zhì)中的功能，明顯表明即便不是所有也是大多數(shù)這些結(jié)構(gòu)域參與配體結(jié)合。含有Ig樣折疊的蛋白質(zhì)的一些實例是V-CAM、免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白的恒定區(qū)、T細胞受體、纖連蛋白、呼腸孤病毒外殼蛋白、β-半乳糖苷酶、整合素、EPO-受體、CD58、核酮糖羧化酶、desulphoferrodoxine、過氧化物，生物素脫羧酶及P53核心DNA結(jié)合蛋白。大多數(shù)Ig樣折疊的分類可以得自SCOP數(shù)據(jù)庫(Murzin A.G等，1995；http//scop.mrc-lmb.camac.uk/scop)及得自CATH(Orengo等，1997；http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath_new/index.html)。SCOP將這些折疊分類為全部是β蛋白，在2個折疊中具有一個含有7個鏈的免疫球蛋白樣β夾層，盡管含有所述折疊的一些成員具有額外的鏈。CATH將這些折疊分類為主要是β蛋白，一個在免疫球蛋白樣折疊中具有如夾層的一個結(jié)構(gòu)，指定代碼為2.60.40。在結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫如CE(Shindyalov等1998；http//cl.sdsc.edu/ce.htm)、VAST(Gibrat等，1996；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml)和FSSP(Holm等，1998；http//www.ebi.ac.uk/dali/fssp)中，使用了相似的分類方法。
使用軟件Cn3D(NCBI；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/CN3D/cn3d.shtml)，InsightII(MSI；http//www.accelrys.com/insight)及其它結(jié)構(gòu)查看程序獲得的對來自不同蛋白質(zhì)的這些折疊的投影示出Ig樣折疊具有不同的亞結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)構(gòu)的示意投影示于圖3A。在所述折疊的中心觀測到最保守的結(jié)構(gòu)，稱為核心。所述核心結(jié)構(gòu)長度幾乎不變化，具有一個相對保守的空間制約，但發(fā)現(xiàn)其在序列和氨基酸組成方面變化程度較大。在所述核心的兩側(cè)，存在極端可變的亞結(jié)構(gòu)域，其稱為連接環(huán)。這些連接環(huán)可以在氨基酸含量、序列、長度和構(gòu)型方面變化。所述核心結(jié)構(gòu)因此認為是這些蛋白質(zhì)中最重要的結(jié)構(gòu)域。形成核心的β元件數(shù)可在7和9之間變化，盡管6鏈核心結(jié)構(gòu)也可能是重要的。所述β元件均排列在兩個β折疊中。每個β折疊均由反平行方向的β元件構(gòu)成。觀測到的一個β折疊中β元件的最小數(shù)目是3個元件。觀測到的一個β折疊中β元件的最大數(shù)目是5個元件。較多數(shù)目的β元件也是可能的。連接環(huán)連接所述桶一側(cè)上的β元件。一些連接穿經(jīng)所述β折疊，而其它連接位于一個β折疊內(nèi)的β元件。尤其稱為L2、L4、L6和L8的環(huán)實際上用于配體結(jié)合。L1、L3、L5和L7環(huán)的長度、結(jié)構(gòu)、序列和氨基酸組成的高度變化性明顯表明這些環(huán)也可以用于配體結(jié)合，至少是在人工形式中。
形成真正核心的β元件中的氨基酸側(cè)鏈朝向核心內(nèi)部投影，因此充填核心中心內(nèi)的空間，可以通過H-鍵、共價鍵(半胱氨酸橋)及其它力量而彼此相互作用以穩(wěn)定所述支架。由于發(fā)現(xiàn)位于內(nèi)部的β元件部分的殘基的氨基酸組成和序列極端可變，因此推斷也可以產(chǎn)生許多其它形式。
為獲得作為設(shè)計含有這種Ig樣折疊的新型蛋白質(zhì)起始點的結(jié)構(gòu)基本理念，使用含有Ig樣折疊的結(jié)構(gòu)域投影。使用InsightII、Cn3D和modeller程序確定最小元件和長度。另外，由于確定氨基酸相同性無任何重要性，只有所述結(jié)構(gòu)的C-α原子投影，因為這些描述了折疊的最小特征。允許這些β元件的空間位置(坐標(biāo))略有不同。確定含有9個β元件的這種結(jié)構(gòu)的四個實例，轉(zhuǎn)變?yōu)镻DB形式(坐標(biāo)描述；見表1)，但結(jié)構(gòu)內(nèi)的許多微小差別也假定是重要的，只要所述折疊符合關(guān)于Ig樣折疊的描述(見例如CATH和SCOP)。
使用代表Ig樣折疊核心的C-α原子的坐標(biāo)的這些PDB文件揭示含有9，8，7和6個β元件的新結(jié)構(gòu)。針對8鏈結(jié)構(gòu)，β元件1或9可以缺失，也可以缺失元件4或5。針對7鏈結(jié)構(gòu)，除去β元件1和9，或者優(yōu)選地缺失元件4和5。由于空間制約，優(yōu)選地除去元件4和5(圖3B)。6鏈結(jié)構(gòu)優(yōu)選地缺失元件1、4和5或者4、5和9，但使用Insight和modeller分析的其它形式示出針對工程目的也是足夠可靠的(圖3C)。
實施例2設(shè)計9鏈折疊蛋白質(zhì)折疊依賴于氨基酸主鏈原子與氨基酸側(cè)鏈中存在的原子之間的相互作用。β折疊依賴于兩種類型相互作用，而例如上述結(jié)構(gòu)中兩個β折疊之間的相互作用主要由對立殘基(opposing residue)的氨基酸側(cè)鏈的相互作用而介導(dǎo)。氨基酸側(cè)鏈的空間制約、物理和化學(xué)性質(zhì)限制了特殊結(jié)構(gòu)和折疊的可能性及因此可在折疊或結(jié)構(gòu)中某一位置可使用的氨基酸類型。為獲得符合空間制約的氨基酸序列及與上述結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)適合的性質(zhì)(實施例1)，使用3D分析軟件(Modeller、Prosa、InsigthII、What if和Procheck)。目前計算機的計算能力及有限的模型精確性和算法可靠性限制了可計算及評價的殘基和推定結(jié)構(gòu)數(shù)。
為獲得可形成上述9β鏈折疊的氨基酸序列，需要不同水平的測試，從例如PDB文件1所述C-α主鏈痕跡開始。首先需要設(shè)計和測試折疊的內(nèi)部。其次，需要附著和計算β元件連接環(huán)。第三，需要裝配外部氨基酸即其氨基酸側(cè)鏈暴露于環(huán)境中的氨基酸而不干擾獲得的推定折疊。另外，外部氨基酸側(cè)鏈應(yīng)優(yōu)選地產(chǎn)生一種可溶產(chǎn)物。在第四及最后階段，重新計算全部模型發(fā)現(xiàn)偶然導(dǎo)入的空間抵觸(spatialconflict)。導(dǎo)致不相容的氨基酸殘基由呈現(xiàn)更適當(dāng)及可靠適應(yīng)性的氨基酸置換。在第一階段，在符合上述標(biāo)準及也如實施例1所示的排列于正確折疊的雙β折疊結(jié)構(gòu)內(nèi)部的氨基酸序列通過在例如VAST中提交結(jié)構(gòu)排列對比的PDB文件而獲得(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml)。服從如PDB文件1中所述的PDB文件已經(jīng)產(chǎn)生了上千個采樣數(shù)(hit)。大多數(shù)這些蛋白質(zhì)是含有至少一個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，所述結(jié)構(gòu)域根據(jù)SCOP或者CATH被分類(見上述)為折疊。
排列在提交結(jié)構(gòu)內(nèi)部的一些獨特序列用于產(chǎn)生產(chǎn)物實例。根據(jù)采樣數(shù)的分類、均方根偏差(rootmean square deviation)(RMSD-值)、VAST-score值(較高數(shù)值代表更精確符合)、序列相同性、物種起源及提出的生物學(xué)功能的標(biāo)準，從這個結(jié)構(gòu)排列對比實驗中選擇感興趣的序列。結(jié)構(gòu)如類纖連蛋白蛋白質(zhì)，抗體相關(guān)的蛋白質(zhì)，細胞粘著分子，病毒核心蛋白及其它蛋白質(zhì)等。由C-α主鏈代表的結(jié)構(gòu)稱為核心結(jié)構(gòu)。
在第二階段，將環(huán)附著于獲得的產(chǎn)物。盡管可以應(yīng)用一些分析方法分辨終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，但最具挑戰(zhàn)性的特點是在核心序列上呈遞具有完整的功能配體結(jié)合性質(zhì)的親和區(qū)。為測試終產(chǎn)物的功能性，識別已知配體的親和環(huán)可以移植在核心結(jié)構(gòu)上。因為充分論證了抗雞溶菌酶(結(jié)構(gòu)已知為1MEL)，而且充分描述了這些親和區(qū)的特點(在抗體稱為CDR′s)，因此將這些環(huán)插入通過第一階段所述方法獲得的核心結(jié)構(gòu)上的正確位置。正確位置通過結(jié)構(gòu)對比確定，即通過已經(jīng)獲得的折疊與描述1MEL的3D結(jié)構(gòu)的文件(例如PDB文件)的重疊投影而確定。對從IBZQ(PDB)描述的結(jié)構(gòu)中提取的牛RNase A結(jié)合親和區(qū)進行相似投影及隨后的環(huán)移植。移植的親和環(huán)將β元件的一個末端與另一個末端相連接。親和區(qū)1將β元件2與3連接(L2)，AR2將β元件4與5連接(L4)，AR3將β元件6與7連接(L6)及AR4將β元件8與9連接(L8)。每個β元件的其它末端通過環(huán)連接，所述環(huán)分別連接1與2(L1)，3與4(L3)，5與6(L5)及7與8(L7)(見圖3A示意投影)。當(dāng)然所有種類的環(huán)均可用于連接β元件。環(huán)序列及環(huán)長度的來源包括例如通過環(huán)建模(軟件)獲得的環(huán)及得自例如SCOP和CATH的指定類別中描述的天然發(fā)生的環(huán)的可利用數(shù)據(jù)。代表環(huán)1(L1)、3(L3)、5(L5)和7(L7；圖3A)環(huán)的C-α主鏈選自結(jié)構(gòu)例如1NEU、1EPF-B、1QHP-A、1CWV-A、1EJ6-A、1E50-C、1MEL、1BZQ和1F2X，但已經(jīng)使用許多具有相似結(jié)果的其它結(jié)構(gòu)。如上述在第一階段獲得的核心結(jié)構(gòu)的3D-對比，與得自結(jié)構(gòu)1EPF、1NEU、1CWV、1F2X、1QHP、1E50和1EJ6的PDB文件中存在的結(jié)構(gòu)信息的環(huán)位置，使用強大的計算機及Cn3D、modeller和/或Insight軟件體現(xiàn)。將相應(yīng)環(huán)插入第一階段模型中的正確位置。環(huán)不是必須精確符合核心，因為可以存在一定程度的能量和/或空間自由度。實際中形成環(huán)的氨基酸種類及這些氨基酸在所述環(huán)內(nèi)的位置決定了環(huán)的能量自由度。不同來源的環(huán)可用于改組(shuffle)環(huán)區(qū)域。這個特征使得在將來的蛋白質(zhì)中存在新的特征，因為不同的環(huán)具有不同的性質(zhì)，如物理、化學(xué)、表達、翻譯后修飾等等。類似地，由于β元件數(shù)降低所致的含有較少環(huán)的結(jié)構(gòu)可以被轉(zhuǎn)變成具有9個β元件和相適應(yīng)數(shù)目的環(huán)的蛋白質(zhì)。本文中證明了7鏈蛋白質(zhì)例如1EPF、1QHP、1E50和1CWV的環(huán)的C-α痕量(trace)主鏈可以用作9鏈核心模板的模板。在此情況中額外的環(huán)(L3)可以從9鏈模板1F2X中挽回，但也可以使用根據(jù)評估分析確認可靠的任何其它環(huán)。指向蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的氨基酸側(cè)鏈的性質(zhì)是受限的，因此通過空間制約而確定。因此，根據(jù)使用模擬軟件的3D結(jié)構(gòu)投影可能獲得幾種有限的構(gòu)型。
在第三階段，針對每個位置逐一計算暴露于外部的氨基酸側(cè)鏈即從所述結(jié)構(gòu)伸出至環(huán)境中的側(cè)鏈的所有可能的特性。對于大多數(shù)應(yīng)用優(yōu)選地使用可溶性非常好的蛋白質(zhì)，因此選擇非疏水性氨基酸。這種氨基酸例如是D、E、N、Q、R、S和T。優(yōu)選地，甲硫氨酸被缺失，因為編碼甲硫氨酸的密碼子(ATG)可以由于異常的翻譯起始而產(chǎn)生另外的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。另外，半胱氨酸殘基也被缺失，因為游離半胱氨酸可以導(dǎo)致半胱氨酸-半胱氨酸鍵。因此，游離半胱氨酸可以導(dǎo)致非所希望的含有游離半胱氨酸的共價蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用?？梢栽诰哂袠O端空間制約的位置導(dǎo)入甘氨酸殘基。這些殘基不具有側(cè)鏈，因此在活性上或多或少是中性的。然而，甘氨酸殘基的極端柔性及缺乏相互作用性的側(cè)鏈可導(dǎo)致不穩(wěn)定，因此甘氨酸殘基不常用。
在第四階段，使用modeller軟件評價所述模型。Modeller編程為當(dāng)合適時接受半胱氨酸-半胱氨酸橋。然后將所有預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)用ProsaII(http//www.came.sbg.ac.at/Services/prosa.html)，Procheck和What if(http//www.cmbi.kun.nl/What if)評估。假定ProsaII zp-comb值低于-4.71表示蛋白質(zhì)序列在體內(nèi)可能會折疊成所希望的β基序。表1所示7個蛋白質(zhì)序列代表符合上述所有標(biāo)準的一系列解決方案。
Procheck和What if評價還表示這些序列可以適合所述模型，因此是可靠的(例如pG值大于0.80；Sanchez等，1998)。
實施例3裝配合成的支架基于其推測的三維結(jié)構(gòu)設(shè)計合成的VAP。使用腸道細菌基因表達優(yōu)選的密碼子(Informax Vector Nti)，將氨基酸序列(表3)反向翻譯為DNA序列(表4)。檢測所得DNA序列可能干擾隨后克隆步驟的非希望的限制位點。這種位點通過改變DNA序列而不改變氨基酸密碼子而除去。然后將所述DNA序列在5’末端產(chǎn)生一個Ndel位點以導(dǎo)入ATG起始密碼子及在3’末端產(chǎn)生一個SfiI位點，這兩個位點均是單向克隆所需要的。PCR裝配由4個步驟組成寡引物設(shè)計(操縱子順序)、基因裝配、基因擴增及克隆。如下方法裝配所述支架首先將DNA序列的正鏈和負鏈均分成大約35bp的寡核苷酸引物，以此方式設(shè)計編碼相反鏈的寡核苷酸引物對，其具有大約16-17個堿基的互補重疊。其次，將每個合成支架的所有寡核苷酸引物均以等摩爾數(shù)量混合，將100pmol這種引物混合物用于PCR裝配反應(yīng)中，使用1單位Taq聚合酶(Roche)、1×PCR緩沖液+MgCl2(Roche)和0.1mM dNTP(Roche)，終體積為50μl，共進行35次循環(huán)30秒92℃、30秒50℃及30秒72℃。第三，將5μl PCR裝配產(chǎn)物用于標(biāo)準PCR擴增反應(yīng)中，使用合成支架的兩種外側(cè)引物、1單位Taq聚合酶、1×PCR緩沖液+MgCl2及0.1mM dNTP，終體積為50μl，進行25次循環(huán)30秒92℃、30秒℃55℃、1分鐘72℃。第四，通過瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，將正確大小的PCR產(chǎn)物用NdeI和SfiI消化并連接入用NdeI和SfiI線性化的載體pCM126中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細胞中(InVitrogen)，所述細胞在37℃在含有100mg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖的2×TY平板上生長過夜。單一集落在含有100μg氨芐青霉素的液相培養(yǎng)基中生長，分離質(zhì)粒DNA并用于序列分析。
實施例4構(gòu)建表達載體CM126基于pET-12a(Novagen)構(gòu)建有效表達蛋白質(zhì)的載體(CM126；見圖4A)。插入一個虛擬(dummy)的VAP，iMab100，其包含常規(guī)的限制位點、接頭(linker)、VSV-標(biāo)簽、6×His-標(biāo)簽及終止密碼子(見表4，3)。結(jié)果pET-12a中缺失信號肽OmpT。經(jīng)PCR擴增iMab100，使用含有5′Ndel突出端序列的正向引物129(見表5)及含有所有接頭和標(biāo)簽序列及一個BamHI突出端序列的一種非常長的反向寡核苷酸引物306(見表5)。在擴增后，將PCR產(chǎn)物和pET-12a用NdeI和BamHI消化。在經(jīng)凝膠純化后，將產(chǎn)物通過Qiagen凝膠洗脫系統(tǒng)根據(jù)廠商指導(dǎo)純化。連接所述載體與PCR片段，通過電穿孔轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10細胞中。選擇正確的克隆，通過測序核實其序列。包含所述虛擬VAP的該載體作為其它VAP表達分析的基本載體。通過用引物129和51(見表5)擴增，用NdeI和SfiI消化及連接入NdeI和SfiI消化的CM126中而插入其它VAP。
實施例5表達iMab100大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)用表達載體CM 126-iMab100轉(zhuǎn)化。將細胞在含有補加了氨芐青霉素(200mg/ml)的50ml2×TY培養(yǎng)基(16g/l胰化蛋白胨、10g/l酵母提取物，5g/l NaCl(Merck))的250ml搖瓶中，在30℃攪動生長。加入終濃度為0.2mM的異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)，以當(dāng)OD(600nm)達到1時引發(fā)蛋白質(zhì)表達。在加入IPTG后4小時收獲細胞，離心(4000g，15分鐘，40℃)并將沉淀在-20℃貯存直至使用。
蛋白質(zhì)表達通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。圖X泳道2示出大腸桿菌BL21(CM126-iMab100)表達iMab100。
實施例6經(jīng)加熱從包涵體中純化iMab100蛋白如實施例5所述，iMab100在大腸桿菌BL21中表達(CM126-iMab100)。大多數(shù)表達的iMab100沉積在包涵體中。這在圖5泳道3中證實，其表示了大腸桿菌BL21(CM126)在裂解后(弗氏細胞壓碎器，french press)及隨后離心(12000g，15分鐘)后的可溶蛋白質(zhì)。如下純化包涵體。將細胞沉淀(來自50ml培養(yǎng)物)再懸浮于5ml PBS pH8中直至20g cdw/l，通過流經(jīng)2次冷的弗氏細胞壓碎器(Sim-Aminco)而裂解。通過離心(12000g，15分鐘)收集包涵體并再懸浮于含有1％Tween-20(ICN)的PBS中，以溶解及除去膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。在離心(12000g，15分鐘)后，將沉淀(含有包涵體)用PBS洗滌2次。分離的包涵體再懸浮于PBS pH 8+1％ Tween-20中，在60℃孵育10分鐘。由此導(dǎo)致iMab100幾乎完全溶解，如圖5所示。泳道1表示分離的iMab100包涵體。泳道2表示將分離的包涵體在60℃在PBS pH8+1％Tween-20中孵育10分鐘后溶解的iMab100。將上清加樣于鎳-氨三乙酸(Ni-NTA)超流層析柱(superflow column)上，根據(jù)Qiagen(TheQIAexpressionistTM，fifth edition，2001)所述標(biāo)準方法純化。由此純化的iMab100與雞溶菌酶的結(jié)合通過ELISA分析(根據(jù)實施例8所述分析)，概括示于表6。
實施例7使用尿素及有助于再折疊的基質(zhì)從包涵體中純化iMab100蛋白。
或者，使用8m尿素從包涵體中溶解iMab100，通過有助于再折疊的基質(zhì)純化為活性形式。如實施例6所述制備包涵體，溶解于1mlPBS pH8+8m尿素中。溶解的蛋白質(zhì)通過離心(12000g，30分鐘)從不可溶的物質(zhì)中澄清，隨后加樣于用PBS pH8+8M尿素平衡的Ni-NTA超流動層析柱(Qiagen)中。通過用4倍體積PBS pH6.2+8M尿素洗滌該層析柱釋放一種特異性蛋白質(zhì)。結(jié)合的His-標(biāo)簽的iMab100通過在室溫逐步降低于PBS pH8中尿素濃度而在所述層析柱上再折疊。將所述層析柱用2倍體積的PBS+4M尿素洗滌，隨后用2倍體積的PBS+2M尿素、2倍體積的PBS+1M尿素及2倍體積的無尿素的PBS洗滌。iMab100用含有250mM咪唑的PBS pH8洗脫。釋放的iMab100用PBS pH8(4℃)透析過夜，凍干濃縮及確定結(jié)合性質(zhì)及進行結(jié)構(gòu)測定。
純化的iMab100級分通過SDS-PAGE分析，如圖6泳道13所示。
實施例8iMab100蛋白與雞溶菌酶的特異性結(jié)合(ELISA)iMab蛋白與靶分子的結(jié)合使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測。用希望的抗原(如雞溶菌酶)包被微滴定平板(Nunc)的孔，及用合適的封閉劑如3％脫脂奶粉溶液(ELK)封閉而進行ELISA。將源自一個單一集落的純化的iMab蛋白或者純化的噬菌體(108-109)加入每個孔中，在室溫孵育1小時。使用平板洗滌儀(Bio-Tek Instruments)將平板用含有0.1％Tween-20的PBS徹底洗滌。結(jié)合的iMab蛋白或噬菌體通過標(biāo)準ELISA方法分別使用抗-VSV-hrp綴合物(Roche)或抗-M13-hrp綴合物(Pharmacia)檢測。使用Turbo-TMB(3，3′，5，5′-四甲聯(lián)苯胺，Pierce)作為底物進行比色分析。
如下分析iMab100與雞溶菌酶的結(jié)合。將100μl純化的iMab100(～50μg)加入用ELK(對照組)或溶菌酶(+ELK作為封閉劑)包被的一個微滴定平板孔中，在一個臺式搖動器上(300rpm)在室溫孵育1小時。將該微滴定平板用PBS(3次)、PBS+0.1％Tween-20(3次)及PBS(3次)徹底洗滌。結(jié)合的iMab100通過將所述孔與含有抗VSV-HRP綴合物(Roche)的100μl ELK在室溫孵育1小時而檢測。
在用PBS(3次)、PBS+0.1％Tween-20(3次)和PBS(3次)徹底洗滌后，將所述孔與100μl Turbo-TMB孵育5分鐘。
用100μl 2M H2SO4終止反應(yīng)，使用微滴定平板讀數(shù)器(Biorad)讀數(shù)在450nm的吸光度。
如實施例6和實施例7所述制備的純化iMab100呈現(xiàn)與雞溶菌酶強力及特異性的結(jié)合，如表6所示。
實施例9大小排阻層析如實施例7所述純化iMab100。
使用具有40％乙腈、60％milliQ和0.1％TFA作為流動相的Shodex 803層析柱分析純化的iMab100的分子量分布。在14.7分鐘的存留時間洗脫的90％蛋白質(zhì)相應(yīng)于分子量為21.5kD。這與用計算機計算的分子量(19.5kD)非常吻合，表明大多數(shù)蛋白質(zhì)以單體形式存在。
實施例10在95℃隨著時間推移iMab100的穩(wěn)定性在95℃通過ELISA確定iMab100的穩(wěn)定性。將10μg/ml iMab100加熱至95℃持續(xù)10分鐘-2.5小時，未加熱的iMab用作輸入對照。
在加熱后，將樣品置于20℃并加以保持直至進行分析。
這些樣品與溶菌酶的結(jié)合通過ELISA使用于PBS中1∶2000稀釋的抗-VSV-hrp(Roche)測試。TMB-ultra(Pierce)用作hrp酶水平的底物(圖7)。iMab100在高溫非常穩(wěn)定。檢測到活性略微降低。
實施例11在20℃隨著時間推移iMab100的穩(wěn)定性在20℃在50天時間內(nèi)測定iMab100的穩(wěn)定性。將iMab100(0.1mg/ml)在20℃下放置。每7天取樣品并將每個樣品均在-20℃貯存至少2小時以防止破壞及冷凍所述實驗條件。將樣品在PBS中稀釋200倍。這些樣品與溶菌酶的結(jié)合通過ELISA使用于PBS中1∶2000稀釋的抗-VSV-hrp(Roche)測試。TMB-ultra(Pierce)用作hrp酶水平的底物(圖8)。iMab100在室溫非常穩(wěn)定。iMab100的活性隨著時間的推移幾乎不降低，因此可以推斷所述iMab支架及其親和區(qū)是非常穩(wěn)定的。
實施例12通過凝膠測試確定iMab100大小，對pH4.8環(huán)境的抗性及將純化的iMab100(如實施例6所述)使用乙酸鉀(終濃度為50mM)調(diào)節(jié)為pH4.8，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。通過離心(12000g，30分鐘)收集沉淀，再溶解于PBS pH7.5中，隨后通過0.45μm濾膜過濾以除去剩余沉淀。
在pH休克之前和之后通過SDS-PAGE，western印跡分析樣品，及使用ELISA定性結(jié)合(實施例8)。
結(jié)果表明所有iMab100在pH4.8均沉淀及在再次溶解于PBS pH7.5中及過濾后也可以完全回收。ELISA測定表明沉淀及隨后的再次溶解不導(dǎo)致活性喪失(表7)。證實VSV-標(biāo)簽在純化和沉淀期間不喪失而且不形成降解產(chǎn)物。
實施例13支架的結(jié)構(gòu)分析使用圓二色性(CD)旋光計分析iMab100的結(jié)構(gòu)并與另一種結(jié)構(gòu)相對比。作為參考，測定一種天然發(fā)生的含有9β鏈的Vhh分子Vhh10-2/271102(由Kwaaitaal，Wagening University惠贈)。這兩種蛋白質(zhì)均具有附于C-末端的標(biāo)簽。這些標(biāo)簽的氨基酸序列和長度相同。這兩個蛋白質(zhì)之間的唯一結(jié)構(gòu)差別存在于相當(dāng)于親和環(huán)4(iMab100)的CDR3(Vhh)中。系統(tǒng)設(shè)置是靈敏性＝標(biāo)準(100mdeg)、起始＝260nm、結(jié)束＝205nm、間隔＝0.1nm；延遲＝1秒、速度＝50nm/分、堆積(accumulation)＝10。
制備iMab100和Vhh10-2/271102，純度為于PBS pH7.5中98％及OD280約為1.0。將樣品加樣于0.1cm石英試管中，并用計算機控制JASCO公司J-715旋光分光計軟件(Spectramanager version 1.53.00，JASCO Corporation)的測定CD光譜。通過測定PBS光譜獲得基線校正。獲得的PBS信號從所有測定值中減去以校正溶劑和鹽作用。用每個樣品進行初始測定以確定最大信號。如果需要，將樣品用1倍PBS稀釋以優(yōu)化光電倍增管信號分辨。使用于PBS中的RNase A溶液以校驗所述CD設(shè)備。如果與iMab100和Vhh光譜相比，觀測到的KNase A光譜完全不同。圖9L代表在遠UV(205-260nm)中iMab100和所述Vhh蛋白的CD光譜。大部分光譜模式是相同的。光譜差異主要在波長低于220nm時觀測到。觀測到的光譜差異可能由于CDR3/AR4結(jié)構(gòu)不同所致。從1MEL中挽回的iMab100的AR4結(jié)構(gòu)可以按隨機卷曲分類。同樣，iMab100中存在的AR4比Vhh蛋白的CDR3大約長10個氨基酸。
以相似方式使用CD-儀確定iMab100蛋白的溫度穩(wěn)定性，除了進行測定時調(diào)整溫度之外。
除了在室溫進行測定，還在20、50、80(未示出)和95℃分析折疊和再折疊情況。首先在20℃測定于PBS中稀釋的iMab100蛋白的新鮮溶液。然后，確定溫度增加情況下的光譜，最后再次測定在20℃的光譜。用PBS的光譜作為基線校正(圖9A)。結(jié)果清晰示出隨著溫度提高橢圓率也逐漸提高。在加熱之后再次出現(xiàn)20℃的光譜明顯表明所述支架完全再折疊。這個結(jié)論隨后通過ELISA檢測樣品的溶菌酶結(jié)合能力也得以證實(數(shù)據(jù)未示出)。
實施例14大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)用均含有9個β鏈的iMab1302，iMab1602，iMab1202和iMab122的多種VAP插入體的表達載體CM126轉(zhuǎn)化。生長和表達類似于實施例5所述。
所有9鏈iMab蛋白均與實施例7所述相似，通過有助于再折疊的基質(zhì)進行純化。iMab1302，iMab1602，iMab1202和iMab122的純化級分通過SDS-PAGE分析，分別如圖10泳道10，9，8和7所示。
實施例15多種9鏈iMab蛋白與雞溶菌酶的特異性結(jié)合(ELISA)與實施例8所述相似，分析純化的iMab1302(～50ng)，iMab1602(～50ng)，iMab1202(～50ng)和iMab122(～50ng)與ELK(對照)或溶菌酶(+ELK作為封閉劑)的結(jié)合。ELISA證實純化的iMab1302，iMab1602，iMab1202和iMab122與雞溶菌酶的特異性結(jié)合，如表6所示。
實施例16多種9鏈iMab的CD光譜如實施例14所述純化iMab100，iMab1202，iMab1302和iMab1602及如實施例13所述分析CD光譜。在20℃、95℃及再次在20℃測定iMab1202，iMab1302和iMab1602的光譜以測試支架穩(wěn)定性和再折疊特性。相應(yīng)光譜分別示于圖9D，9E和9F。在20℃測定的光譜與在20℃測定的iMab100的光譜相對比以確定二級結(jié)構(gòu)的相似程度(見圖9J)?？梢酝茢嗨胁煌?鏈支架性質(zhì)相同。這表明這些支架的基本結(jié)構(gòu)相同。在連續(xù)20-95-20℃處理之后獲得的數(shù)據(jù)清晰示出所有支架均重現(xiàn)其原始構(gòu)象。
實施例17設(shè)計7鏈Ig樣-折疊如實施例2所述的方法用于發(fā)展含有Ig樣折疊的序列，所述Ig樣折疊由核心中7個β元件和3+3個連接環(huán)組成。所述方法與實施例2所述方法相同，包括4個階段，由其指導(dǎo)新序列的開發(fā)。第一階段，使在PDB表1中表明的9鏈核心結(jié)構(gòu)的C-α原子的坐標(biāo)相適應(yīng)。代表β元件4和5的C-α原子從PDB文件中去除，產(chǎn)生一個7鏈的核心實例(PDB表8)。如實施例2所詳述獲得在β折疊內(nèi)部排列的氨基酸側(cè)鏈并插入。在第二階段，加入連接環(huán)。在一個位點上，通過親和區(qū)將β元件與另一個β元件連接，所述親和區(qū)從得自結(jié)構(gòu)1MEL或1BZQ的牛RNase A結(jié)合區(qū)(L2，L6和L8)的抗雞溶菌酶結(jié)合區(qū)中挽回。在所述結(jié)構(gòu)的其它末端，β元件與得自一些不同來源(1E50，1CWV，1QHP，1NEU，1EPF，1F2x或1EJ6)的C-α主鏈痕跡環(huán)連接。附著并使所述環(huán)適合的方法如實施例2所詳述。在第三階段，如實施例2所述確定決定蛋白質(zhì)溶解性的位于核心和環(huán)L1，L3，L7的氨基酸側(cè)鏈。在最后階段，使用Insight建立模型。Insight以當(dāng)合適時接受半胱氨酸-半胱氨酸橋形式編程。然后用ProsaII，Procheck和WHATIF評價用Insigth建立的所有預(yù)測的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。假定ProsaII zp-combscore小于-4.71表示可以在體內(nèi)折疊為希望的Ig樣β基序折疊的蛋白質(zhì)序列(表9)。表10所示的眾多序列代表表現(xiàn)可靠的一個集合。Procheck和What if評價還表明這些序列可以符合所述模型及因此是可靠的(例如pG值大于0.80；Sanchez等，1998)。
實施例18大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)用均含有7個β鏈的iMab1300，iMab1200，iMab101和iMab900的多種VAP插入體的表達載體CM126轉(zhuǎn)化。生長和表達類似于實施例5所述。
所有7鏈iMabs均類似如實施例7所述，通過有助于再折疊的基質(zhì)純化。iMab101，iMab1300，iMab1200和iMab900的純化級分通過SDS-PAGE分析，分別如圖10的泳道2，3，5和6所示。
實施例19如實施例8所述相似地分析純化的iMab1300(～50ng)，iMab1200(～5ng)，iMab101(～20ng)和iMab900(～10ng)與ELK(對照)或溶菌酶(+ELK作為封閉劑)的結(jié)合。ELISA證實純化的iMab1300，iMab1200，iMab101和iMab900與雞溶菌酶的特異性結(jié)合，如表6所示。
實施例20多種7鏈iMab蛋白的CD光譜iMab1200和iMab101如實施例18所述純化并如實施例13所述分析CD光譜。在20℃、95℃及再次在20℃測定iMab1200和iMab101的光譜，以測試支架穩(wěn)定性和再折疊特性。相應(yīng)的光譜分別示于圖9H和9G。相互對比在20℃測定的iMab1200和iMab101光譜以確定二級結(jié)構(gòu)的相似程度(見圖9K)?？梢酝茢嗖煌?鏈支架性質(zhì)相同。這表明這些支架的基本結(jié)構(gòu)相同。進而，由于從9鏈支架獲得的信號(實施例16)與所述7鏈支架觀測到的信號相似，因此還可推斷這兩種類型的支架具有相似構(gòu)象。在連續(xù)20-95-20℃處理后獲得的數(shù)據(jù)清晰示出所有支架均在其原始構(gòu)象中。
實施例21設(shè)計6鏈Ig-樣折疊如實施例2和3所述方法用于發(fā)展含有Ig樣折疊的序列，所述Ig樣折疊由核心中6個β元件及3+3個連接環(huán)組成。所述方法包括4個階段，由其指導(dǎo)發(fā)展新序列，與實施例2和3所述方法相同。在第一階段，使在PDB表1中表明的9鏈核心結(jié)構(gòu)的C-α原子的坐標(biāo)相適應(yīng)。代表β元件1，4和5的C-α原子從PDB文件中去除，產(chǎn)生一個6鏈的核心實例(表11)。如實施例2和3所述獲得在β折疊內(nèi)部排列的氨基酸側(cè)鏈并插入。在第二階段，加入連接環(huán)。在一個位點上，通過親和區(qū)將β元件與另一個β元件連接，所述親和區(qū)從得自結(jié)構(gòu)1MEL或1BZQ的牛RNase A結(jié)合區(qū)(L2，L6和L8)的抗雞溶菌酶結(jié)合區(qū)中挽回。在所述結(jié)構(gòu)的其它末端，β元件與得自一些不同來源(1E50，1CWV，1QHP，1NEU，1EPF，1F2x或1EJ6)的C-α主鏈痕跡環(huán)連接。附著并使所述環(huán)適合的方法如實施例2和3所述。在第三階段，如實施例2和3所述確定決定蛋白質(zhì)溶解性的位于核心和環(huán)L1，L3，L7的氨基酸側(cè)鏈。在最后階段，使用Modeller軟件評價所述模型。Modeller以當(dāng)合適時接受半胱氨酸-半胱氨酸橋形式編程。然后用ProsaII，Procheck和WHAT IF評價所有預(yù)測的蛋白質(zhì)。確定ProsaII zp-comb score(表12)以表明產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列是否可以在體內(nèi)折疊為希望的Ig樣β基序折疊。應(yīng)用Procheck和What if評價以檢測序列是否符合所述模型(表13)。
實施例22純化6鏈iMab蛋白大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)用含有6個β鏈的iMab701的VAP插入的表達載體CM126轉(zhuǎn)化。生長和表達類似于實施例5所述。
類似如實施例7所述，通過有助于再折疊的基質(zhì)純化iMab701蛋白。iMab701的純化級分通過SDS-PAGE分析，如圖6泳道4所示。
實施例236鏈iMab蛋白與雞溶菌酶的特異性結(jié)合(ELISA)類似如實施例8所述，分析純化的iMab701(～10ng)與ELK(對照)和溶菌酶(+ELK作為封閉劑)的結(jié)合。
ELISA證實純化的iMab701與雞溶菌酶的特異性結(jié)合，如表6所示。
實施例246鏈iMab蛋白的CD光譜IMab701如實施例22所述純化并如實施例13所述分析CD光譜。在20℃、95℃及再次在20℃測定iMab701的光譜以測試支架穩(wěn)定性和再折疊特性。相應(yīng)的光譜示于圖9I。如實施例20所述可以推斷6鏈支架與7鏈支架性質(zhì)相同。這表明這個支架的基本結(jié)構(gòu)與含有7鏈的支架結(jié)構(gòu)相同。進而，由于從9鏈支架獲得的信號(實施例16)與在此所述6鏈支架觀測到的信號相似，也可以推斷這兩種類型的支架具有相似構(gòu)象。在連續(xù)20-95-20℃處理后獲得的數(shù)據(jù)清晰表明所有支架均在其原始構(gòu)象中。
實施例25設(shè)計一種最小的初級(primary)支架如實施例1所述根據(jù)需要及特點設(shè)計一種最小的支架。然而目前所述支架中只使用4和5個β元件(見圖1)。在形成新支架的外套(mantle)的β元件2，3，6，7和8的5個β元件氨基酸側(cè)鏈的情況中，需要調(diào)整以適應(yīng)水環(huán)境。免疫球蛋白殺傷受體2dl2(VAST代碼2DLI)用作對比建模模板以設(shè)計一種由5個β元件組成的新的小支架。
實施例26交換表面殘基的方法賴氨酸置換賴氨酸殘基含有化學(xué)活性的氨基基團，其在例如共價偶聯(lián)VAP的方法中是便利的。共價偶聯(lián)可用于將蛋白質(zhì)固定在表面上或者將其它分子與靶位不可逆地偶聯(lián)。
VAP內(nèi)賴氨酸殘基的空間位置決定了在固定后VAP在表面上的位置。由于VAP表面上暴露的不固定位置的賴氨酸殘基可易于發(fā)生錯誤定位。因此針對一些VAP結(jié)構(gòu)需要從某些位置除去賴氨酸殘基，尤其從可引起親和區(qū)可用性降低的那些位置中除去。
位于外表面上殘基的交換策略例如是改變iMab100外表面賴氨酸殘基。3D成像表明iMab100中存在的所有賴氨酸殘基實際上均位于外表面上。3D建模及分析軟件(InsightII)確定了這種置換的空間結(jié)果。
Modeller軟件以這種方式編程，即考慮β折疊之間半胱氨酸橋形成或者在分析中忽略半胱氨酸橋。針對更多或更少的客觀結(jié)果順序，所有挽回模型均用ProsaII軟件構(gòu)建。ProsaII的zp-comb參數(shù)表明所述模型的可靠性。結(jié)果示出實際上所有類型的氨基酸均可以置換賴氨酸殘基。然而，表面暴露的氨基酸側(cè)鏈決定蛋白質(zhì)的溶解性。因此只考慮溶解所述蛋白質(zhì)的氨基酸并用X標(biāo)示(見表14)。
iMab100的序列下劃線處賴氨酸殘基被交換。
NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSRGQGTDVTVSS實施例27改變外部氨基酸除去糖基化位點如果糖基化位點例如存在于推定的配體結(jié)合位點內(nèi)，則N-糖基化可強烈干擾蛋白質(zhì)功能。iMab100蛋白質(zhì)示出在巴斯德畢氏酵母(Pichia pastoris)細胞中是糖基化的而且不能與配體結(jié)合。分析示出在AR3中有一個推定的N糖基化位點。使用模板建模策略與Modeller軟件分析iMab100結(jié)構(gòu)表明這個位點由于糖基化的阻礙而潛在地阻斷配體結(jié)合。這個位可以通過兩種方式去除，通過除去糖基化的殘基或者通過改變N-糖基化識別基序進行。在此除去糖基化位點自身(..RDNAS..)。所有殘基均可以用于置換該氨基酸，之后可以使用ProsaII、What if和Procheck檢測各個氨基酸的可靠性。然而，一些氨基酸可導(dǎo)入不適宜的化學(xué)或物理性質(zhì)。例如半胱氨酸可使蛋白質(zhì)易于與也攜帶一個游離半胱氨酸基團的蛋白質(zhì)形成共價二聚體。非親水性氨基酸還可擾亂折疊過程因而被忽略。另一方面，甲硫氨酸由ATG編碼，其在DNA序列中可導(dǎo)入異常起始位點。導(dǎo)入ATG序列可造成由于潛在的起始位點改變而產(chǎn)生改變的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果無其它合適的氨基酸，則僅評價甲硫氨酸。所有其它氨基酸殘基均用ProsaII、What if和Procheck評價。用Q置換N認為可行及可靠的。
來自具有糖基化位點的iMab的蛋白質(zhì)序列NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSRGQGTDVTVSS來自沒有糖基化位點的iMab的蛋白質(zhì)序列NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDQASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSRGQGTDVTVSS在Primus96 PCR儀(MWG)中，通過在100μl PCR反應(yīng)混合物中擴增10ng的CM114-iMab100 DNA在巴斯德畢氏酵母中表達iMab100，所述PCR反應(yīng)混合物包含2單位Taq聚合酶(Roche)、200μl每種dNTP(Roche)、緩沖液(Roche Taq緩沖系統(tǒng))、2.5μM引物107和108，按以下程序進行25次[94℃ 20″，55℃ 25″，72℃ 30″]，用EcoRI和NotI消化并連接入EcoRI和NotI消化的pPIC9(InVitrogen)中。通過測序檢測構(gòu)建體，示出所有正確的iMab100序列。根據(jù)廠商方案通過電穿孔進行巴斯德畢氏酵母轉(zhuǎn)化。根據(jù)廠商方案進行生長及通過甲醇誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。iMab100的表達導(dǎo)致產(chǎn)生一種蛋白質(zhì)，其在SDS-PAGE上示出大小為50kD，而在大腸桿菌中表達時iMab100的大小為21kD。這種差別很可能是由于如上所述的在iMab100中存在的推定的N-糖基化位點糖基化所致。因此將這個糖基化位點通過除了使用引物136(表5)之外與實施例26所述相似方式用天冬酰胺(N)交換谷氨酰胺(Q)而除去。這樣產(chǎn)生iMab115。iMab115在大腸桿菌中表達產(chǎn)生一個21kD蛋白質(zhì)。ELISA實驗證實這個iMab對溶菌酶的特異性。因此，iMab115中的AR正確定位，更特別地，在AR3中用谷氨酰胺置換天冬酰胺不改變AR3性質(zhì)。
實施例28改變核心內(nèi)部氨基酸除去半胱氨酸殘基獲得的在Ig樣結(jié)構(gòu)中折疊的序列可用于挽回相似折疊的結(jié)構(gòu)但異常的氨基酸序列。氨基酸可以用其它氨基酸交換及因此與模板蛋白質(zhì)相比推定地改變新蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)外側(cè)的改變是非常直接了當(dāng)?shù)摹Ｔ诖宋覀兏淖兞撕诵膬?nèi)部排列的氨基酸。相鄰氨基酸側(cè)鏈的空間制約及核心結(jié)構(gòu)自身的空間制約確定并限制了在這些位置可以存在的側(cè)鏈類型。另外，相鄰側(cè)鏈的化學(xué)性質(zhì)也可以影響置換結(jié)果。在一些置換研究中，可能需要置換緊密接近靶殘基的另外的氨基酸以獲得合適及可靠的置換。在此去除了在核心中形成半胱氨酸橋的潛力。僅除去一個半胱氨酸已經(jīng)阻止了在核心中形成半胱氨酸橋的潛力。然而，也可以進行雙重置換以防止在體內(nèi)或體外折疊或再折疊期間游離半胱氨酸與其它游離半胱氨酸相互作用。首先，將各個半胱氨酸殘基用任何其它普通的氨基酸置換(共19個)。重復(fù)兩次這種方式，得到19個模型。將所有模型使用ProsaII(zp-score)，What if(2ndgeneration packing quality，主鏈構(gòu)象)及Procheck(允許區(qū)域外的殘基數(shù))評價。獲得一些可靠的模型。表15示出在96位半胱氨酸置換的zp-combined Prosa score。在體內(nèi)測試用纈氨酸置換半胱氨酸之一以驗證所述方法。這個克隆稱為iMab116(見表3)并根據(jù)實施例3所述方法構(gòu)建(表4)。將這個克隆的全部iMab序列通過以下方式移至CM126中。iMab序列，iMab116使用Cys-min iMab116作為模板及引物pr121和pr129(表5)通過PCR分離。所得PCR片段用NdeI和SfiI消化并連接入用NdeI和SfiI線性化的CM126中。選擇稱為CM126-iMab116的這個克隆并用于進一步測試。
實施例29純化iMab116大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)用含有iMab116的VAP插入體的表達載體CM126轉(zhuǎn)化，所述iMab116含有9個β鏈及潛在地缺失核心中半胱氨酸橋(如實施例27所述)。生長和表達與實施例5所述相似進行。
類似于實施例7所述，將iMab116通過有助于再折疊的基質(zhì)純化。純化的iMab116級分通過SDS-PAGE分析，如圖6泳道11所示。
實施例30iMab116與雞溶菌酶的特異性結(jié)合(ELISA)類似于實施例8所述，分析純化的iMab116(～50ng)與ELK(對照)和溶菌酶(+ELK作為封閉劑)的結(jié)合。
ELISA證實純化的iMab116與雞溶菌酶特異性結(jié)合，如表6所示。
實施例31iMab116蛋白的CD光譜iMab116如實施例28所述純化及如實施例13所述分析CD光譜。在20℃、95℃及再次在20℃測定iMab116光譜以測試支架穩(wěn)定性及再折疊特性。相應(yīng)的光譜示于圖9C。在20℃測定的光譜與在20℃測定的iMab100及其它9鏈iMab蛋白的光譜相對比，以確定二級結(jié)構(gòu)的相似程度(見圖9J)。由于獲得的光譜與得自其它9鏈支架的光譜包括iMab100光譜相同，因此可推斷從內(nèi)部核心除去半胱氨酸殘基對其自身結(jié)構(gòu)無作用。
實施例32在核心中導(dǎo)入額外的半胱氨酸橋蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中兩個半胱氨酸殘基的化學(xué)結(jié)合(半胱氨酸橋)在低于大約70℃的溫度下可顯著穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。高于該溫度，半胱氨酸橋斷裂。一些應(yīng)用需要比原始蛋白質(zhì)更穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。如實施例1所述β鏈折疊核心的空間制約產(chǎn)生了半胱氨酸橋。這個結(jié)論基于觀測到在一些具有所述折疊的天然發(fā)生的蛋白質(zhì)中半胱氨酸橋存在于核心中央(例如抗體中所有重鏈可變區(qū))。這種半胱氨酸C-α主鏈原子之間的距離最通常發(fā)現(xiàn)在6.3-7.4之間。通過測量而分析在核心基序中推定形成橋的新半胱氨酸殘基的導(dǎo)入。在PDB文件中書寫的蛋白質(zhì)C-α原子的坐標(biāo)可用于確定潛在的半胱氨酸橋?？梢杂嬎愀鱾€C-α原子及所有其它C-α原子之間的距離。通過對比建模獲得的iMab100蛋白的C-α原子的位置示于圖BBB3?？梢允褂肐nsight軟件確定C-α原子之間的距離。然而，也可以使用確定由坐標(biāo)(如在PDB坐標(biāo)中所示)表示的兩個位置空間距離的標(biāo)準數(shù)學(xué)公式。Excel表單用于確定所有可能的距離。距離數(shù)值在6.3-7.4之間認為是推定的半胱氨酸位置。分析表明33個可能的半胱氨酸橋位于iMab100內(nèi)。半胱氨酸數(shù)表明所述結(jié)構(gòu)中C-α原子的位置，其可以用于插入一個半胱氨酸(表16A)。然而，不是所有空間位置均是非常有用的，一些橋可以接近已經(jīng)利用的半胱氨酸橋，彼此相鄰的兩個半胱氨酸可能有問題，相同β鏈之間的兩個半胱氨酸橋不是非常有益的，與位于附近的其它氨基酸側(cè)鏈有空間制約。構(gòu)建所有33個模型并用iMab100作為模板在modeller中分析。用ProsaII獲得的評估模型的Zp-score表明大多數(shù)半胱氨酸殘基是有問題的。最佳半胱氨酸位置示于表16B?；谶@些半胱氨酸殘基的空間位置及與其它潛在半胱氨酸橋相關(guān)的橋選擇兩個模型，以黑體字表示。同樣，盡管zp-score極佳但因為其在折疊內(nèi)的位置仍放棄一些模型，如用Insight(MSI)所示。
實施例33構(gòu)建在核心中含有兩個額外半胱氨酸的iMab100衍生物使用寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變方法構(gòu)建一種iMab100衍生物，稱為iMab111(表3)，其接受兩個額外的半胱氨酸殘基。CM114-iMab100與寡核苷酸pr33、pr35、pr82、pr83一起用作PCR反應(yīng)的模板(見表5)。在第一次PCR反應(yīng)中，引物pr82和pr83用于產(chǎn)生一個401bp片段。在這個PCR片段中，一個谷氨酰胺和一個甘氨酸編碼殘基改變?yōu)榘腚装彼峋幋a序列。這個PCR片段在兩個平行PCR反應(yīng)中用作模板。在一個反應(yīng)中，使用獲得的PCR片段，CM114-iMab100模板和pr33，在另一個反應(yīng)中，使用獲得的PCR片段，CM114-iMab100模板和引物35。所述第一個反應(yīng)產(chǎn)生一個584bp產(chǎn)物，而第二個反應(yīng)產(chǎn)生一個531bp片段。將這兩個PCR片段均經(jīng)瓊脂糖凝膠分離方法分離(Qiagen gel extraction試劑盒)。將產(chǎn)物等摩爾混合，用引物pr33和pr35進行的片段重疊-PCR反應(yīng)產(chǎn)生一個714bp片段。這個PCR片段用NotI和SfiI消化。所得411bp片段通過瓊脂糖凝膠分離并連接入用NotI和SfiI線性化的CM114中。測序分析證實所述產(chǎn)物，即iMab111(表4和3)。
實施例34表達iMab111如實施例28所述將iMab111 DNA亞克隆入CM126中。CM126-iMab111轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)細胞用IPTG誘導(dǎo)并如實施例7所述分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)提取物在15％SDS-PAGE凝膠上分析，示出強誘導(dǎo)21KD蛋白質(zhì)。包括標(biāo)簽的iMab111的期望長度也為大約21kD，表明這個克隆的高水平生產(chǎn)。
實施例35純化iMab111大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)用含有iMab111 VAP插入體的表達載體CM126轉(zhuǎn)化，所述iMab111含有潛在具有一個額外半胱氨酸橋的9β鏈(如實施例32和33所述)。生長和表達如實施例5和34所述相似進行。
如實施例7所述相似地通過有助于再折疊的基質(zhì)純化iMab111。通過SDS-PAGE分析iMab111的純化級分，如圖6泳道12所示。
實施例36iMab111與雞溶菌酶的特異性結(jié)合(ELISA)如實施例8所述相似地分析純化的iMab111(～50ng)與ELK(對照)和溶菌酶(+ELK作為封閉劑)的結(jié)合。在ELISA分析中蛋白質(zhì)提取物的100倍稀釋物產(chǎn)生的信號比背景信號高大約20倍。ELISA結(jié)果證實純化的iMab111與雞溶菌酶特異性結(jié)合，如表6所示。
實施例37iMab111蛋白的CD光譜iMab111如實施例32所述純化并如實施例13所述分析CD光譜。在20℃、95℃及再次在20℃測定iMab116的光譜以測試支架的穩(wěn)定性及再折疊特性。相應(yīng)的光譜示于圖9C。將在20℃測定的光譜與在20℃測定的iMab100及其它9鏈iMab蛋白質(zhì)的光譜相對比，以確定二級結(jié)構(gòu)的相似程度(見圖9J)。由于獲得的光譜與得自其它9鏈支架的光譜包括iMab100光譜相同，因此可以推斷所述核心中央的一個額外的半胱氨酸殘基對其自身結(jié)構(gòu)無作用。
實施例38改良特異性應(yīng)用的支架的性質(zhì)針對某些應(yīng)用，支架的性質(zhì)需要優(yōu)化。例如熱穩(wěn)定性、耐酸性或蛋白酶解穩(wěn)定性可以有利于或者甚至是在某些環(huán)境中所需要的以更好地發(fā)揮作用?？蓱?yīng)用突變和再選擇程序產(chǎn)生一種新支架，其具有相似結(jié)合性質(zhì)，除了改良了性質(zhì)。在這個實施例中，一種選擇的結(jié)合蛋白得以改良以在蛋白酶解環(huán)境中抵抗蛋白酶解降解。新支架的蛋白酶解抗性可以通過用蛋白酶的一種混合物處理或者用特異性蛋白酶連續(xù)處理而測試。另外，可以將新支架導(dǎo)入將要應(yīng)用的環(huán)境中測試其抗性。為獲得蛋白酶解抗性支架，使用誘變方法突變編碼支架的基因。然后從該突變的PCR產(chǎn)物中建立一個噬菌體展示文庫，以便新支架在噬菌體外側(cè)表達為與一種外殼蛋白的融合蛋白。將所述噬菌體加入一個希望的蛋白酶解活性環(huán)境中，在希望的溫度持續(xù)一定時間。完整的噬菌體可用于所述標(biāo)準淘選(panning)方法中。在充分洗滌后，結(jié)合的噬菌體被洗脫，感染攜帶F-pili的大腸桿菌細胞，并在含有適當(dāng)抗生素的瓊脂平板上生長過夜。重新檢測各個克隆的新性質(zhì)并測序。可將突變導(dǎo)入和選擇方法重復(fù)幾次或者在進一步優(yōu)化循環(huán)中可以應(yīng)用其它選擇條件。
實施例39隨機誘變支架區(qū)域退火僅3個和5個主要的希望區(qū)域(親和區(qū)、構(gòu)架、環(huán)或這些結(jié)構(gòu)組合)的引物用于在存在所述dITP或dPTP情況下的擴增。這些突變的片段在第二次PCR反應(yīng)中用引物擴增，所述引物與第一次PCR中使用的系列引物具有相同的序列，但還含有將所述片段再克隆入支架結(jié)構(gòu)中的限制位點，在此DNA序列彼此不同及因此蛋白質(zhì)序列也不同。噬菌體展示選擇程序可用于挽回具有希望性質(zhì)的克隆。
實施例40構(gòu)建噬菌體展示載體CM114-iMab100使用pBAD(InVitrogen)的部分主鏈構(gòu)建噬菌體展示的有效載體(CM114-iMab100，見圖4B)。將所需要的pBAD載體部分使用分別含有AscI和BamHI突出端限制位點的引物4和5擴增。平行產(chǎn)生一個合成構(gòu)建的含有表4所述序列的片段，其包括一個新啟動子、優(yōu)化的g3分泌前導(dǎo)序列、NotI位點、虛擬的插入體、Sfil位點、接頭、VSV-標(biāo)簽、胰蛋白酶特異性蛋白酶解位點、Strep-標(biāo)簽II及AscI位點(見圖4B)。在組合消化的片段與PCR擴增的pBAD載體片段后，ml3噬菌體g3核心蛋白的編碼區(qū)使用與引物附著的AscI突出端位點擴增(表5，引物6和7)并在AscI消化后插入。含有正確序列及正確插入片段方向的載體用于進一步實驗。
實施例41構(gòu)建噬菌體展示載體CM114-iMab113AR4與其它親和區(qū)(例如針對iMab100的AR1)之間的半胱氨酸橋可參與某些類型的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，如果沒有半胱氨酸橋形成，所述結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性是不太可能的。不僅AR1可用于附著一些親和區(qū)4中存在的半胱氨酸，而且AR2和AR3也是半胱氨酸橋形成的明顯的穩(wěn)定位點。由于AR2是與AR4形成半胱氨酸橋的另一個有吸引力的部位，因此構(gòu)建一個與CM114-iMab100完全相同的表達載體，除了AR2中半胱氨酸密碼子的位置不同及在AR1中沒有該密碼子之外。3D-建模分析表明AR2中半胱氨酸最合適的位置在最初確定為蘇氨酸的位置(.VATIN..→.VACIN..)。分析表明除了新的半胱氨酸位置之外(..VACIN..)，AR2中就在蘇氨酸殘基之前的丙氨酸殘基由一個絲氨酸殘基(..VSCIN..)置換。根據(jù)3D建模分析，AR1中原始半胱氨酸由一個絲氨酸置換，產(chǎn)生了一個合適的置換體(表3)。
新確定的序列稱為iMab113(表4)，根據(jù)上述基因構(gòu)建方法(實施例3)構(gòu)建并插入CM114中置換iMab100。
實施例42構(gòu)建噬菌體展示載體CM114-iMab114AR4與其它區(qū)域之間的半胱氨酸橋不總是希望的，因為在折疊期間形組成子間半胱氨酸橋可影響表達效力及正確折疊的蛋白質(zhì)的百分率。同樣，在還原環(huán)境中，這種AR也變得活性降低或者甚至無活性。因此，需要無半胱氨酸橋的支架。
構(gòu)建在AR1，2和3中無半胱氨酸的一種表達載體。這種載體與CM114完全相同，除了AR1中半胱氨酸(..PYCMG..)改變?yōu)榻z氨酸(..PMSMG..，見表3)。新確定的序列稱為iMab114(表4)，根據(jù)上述基因構(gòu)建方法(實施例3)構(gòu)建并插入CM114中置換iMab100。
實施例43擴增駱駝衍生的CDR3區(qū)域根據(jù)Spinelli等(Biochemistry 39(2000)1217-1222)所述標(biāo)準方法分離羊駝和駝羊的血液淋巴細胞。這些細胞的RNA通過QiagenRNeasy方法根據(jù)廠商方案而分離。使用muMLv或AMV(NewEngland Biolabs)根據(jù)廠商方法產(chǎn)生cDNA。來自Vhh cDNA的CDR3區(qū)域使用于100μl PCR反應(yīng)混合物中的1μl cDNA反應(yīng)物在Primus96PCR儀(MWG)中進行擴增(見圖10)，所述PCR反應(yīng)混合物包含2單位Taq聚合酶(Roche)，200μM每種dNTP(Roche)，緩沖液(Roche Taq緩沖液系統(tǒng))，2.5μM正向和反向引物，以下擴增程序進行35次[94℃ 20″，50℃ 25″，72℃ 30″]。在第一次PCR循環(huán)中，為選擇含有至少一個半胱氨酸的CDR3區(qū)域，使用引物56(表5)作為正向引物，在選擇不含有半胱氨酸的CDR區(qū)域的情況中，使用引物76(表5)。在這兩種情況中，引物16(表5)均用作反向引物。產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分離，并分離出正確長度(～250bp)的產(chǎn)物及使用Qiagen gelextraction試劑盒純化。將5μl這些產(chǎn)物用于與上述相似的下一個PCR循環(huán)，其中引物8(表5)和引物9(表5)用于擴增CDR3區(qū)域。產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上分離，分離出正確長度(～80-150bp)的產(chǎn)物及使用Qiagen gel extraction試劑盒純化。為使駱駝CDR3區(qū)域的環(huán)境適應(yīng)支架iMab100，對5μl產(chǎn)物進行與第一次PCR方法相似的兩次額外的PCR，除了循環(huán)次數(shù)降低為15次及其中引物73(表5)和75(表5)隨后用作正向引物及引物49(表5)用作反向引物。
實施例44擴增牛衍生的CDR3區(qū)域根據(jù)Spinelli等(Biochemistry 39(2000)1217-1222)所述標(biāo)準方法分離牛(Bos taurus)血液淋巴細胞。這些細胞的RNA通過QiagenRNeasy方法根據(jù)廠商方案分離。使用muMLv或AMV(New EnglandBiolabs)根據(jù)廠商方法產(chǎn)生cDNA。來自Vh cDNA的CDR3區(qū)域使用于100μl PCR反應(yīng)混合物中的1μl cDNA反應(yīng)物在Primus96 PCR儀中(MWG)擴增，所述PCR反應(yīng)混合物包含2單位Taq聚合酶(Roche)，200μM每種dNTP(Roche)，緩沖液(Roche Taq緩沖液系統(tǒng))，2.5μM引物299(表5)和300(表5)，進行35次以下程序[94℃ 20″，50℃25″，72℃ 30″]。將產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上分離，分離出正確長度的產(chǎn)物及使用Qiagen gel extraction試劑盒純化。觀測到的PCR產(chǎn)物長度分布(見圖11)代表牛CDR3區(qū)域的平均長度。校正引物299(21個氨基酸，表5)和300(27個氨基酸，表5)中存在的構(gòu)架序列，可以推斷牛CDR3的平均長度為120個堿基PCR產(chǎn)物平均長度減去48個構(gòu)架堿基得72個堿基及因此是24個氨基酸。這個結(jié)果非常符合Spinelli等(Biochemistry 39(2000)1217-1222)觀測的結(jié)果。這些CDR區(qū)因此對天然文庫構(gòu)建非常有用。
分離及純化的產(chǎn)物可用于適應(yīng)實際CDR3/AR4位置周圍的序列，以通過與針對lama衍生的AR所述相似的一些PCR修飾循環(huán)而逐漸適應(yīng)所述構(gòu)架編碼區(qū)的方式進行(見實施例43)。
實施例45通過插入擴增的CDR3區(qū)域使文庫在AR4中含有環(huán)多樣化(variegation)通過以下方法制備在AR4中具有多樣化的核酸噬菌體展示文庫。如實施例43所述獲得來自用乳過氧化物酶和乳鐵蛋白免疫的lama′s的擴增的CDR3區(qū)域，并用PstI和KpnI消化及用T4 DNA連接酶連接入PstI和KpnI消化的及堿性磷酸酶處理的載體CM114-iMab113或CM114-iMab114中。將含有半胱氨酸的CDR3克隆入CM114-iMab114中，而無半胱氨酸的CDR3克隆入載體CM114-iMab113中。通過使用BTX電子細胞操縱儀(electrocellmanipulator)ECM630電穿孔入大腸桿菌TG1電子感受態(tài)(electrocompetent)細胞中而構(gòu)建文庫。將細胞回收在SOB中并在含有4％葡萄糖，于2×TY瓊脂中100μg/ml氨芐青霉素的平板上生長。在37℃培養(yǎng)過夜后，在2×TY培養(yǎng)基中收獲細胞并以濃縮的分散系在-80℃貯存在50％甘油中。典型地，用1μg DNA獲得5×108個轉(zhuǎn)化體，一個文庫含有大約109個獨立克隆。
實施例46通過隨機化插入CDR3區(qū)域使文庫在AR4中含有多樣化通過以下方法通過隨機化插入CDR3區(qū)域制備在AR4中具有多樣化的核酸噬菌體展示文庫。如實施例28所述擴增來自未免疫的及免疫的lama′s的CDR3區(qū)域，除了在第二次PCR循環(huán)中包括如實施例35所述Spee等(1993)的dITP或者Zaccolo等(1996)的dPTP。如實施例28所述制備文庫。PCR中使用dITP突變率達到2％，而使用dPTP突變率達到20％以上。
實施例47富集與靶分子結(jié)合的VAP將大約50μl所述文庫原種(stock)接種于50ml 2×TY/100μg氨芐青霉素/4％葡萄糖中，并生長直至OD600達到0.5。接著加入1011VCSM13(Stratagene)輔助噬菌體。在37℃靜止培養(yǎng)45分鐘以感染。將細胞通過離心沉淀并棄去上清。將沉淀再懸浮于400ml 2×TY/100μg氨芐青霉素中，在37℃培養(yǎng)1小時，之后加入50μg/ml卡那霉素。將感染的培養(yǎng)物在200rpm搖床上在30℃生長8小時。接著，通過以5000g在4℃離心沉淀30分鐘除去細菌。將上清通過0.45μmPVDF濾膜過濾。加入聚乙二醇和NaCl，流過的終濃度分別為4％和0.5M。在這種方式中，將噬菌體在冰上沉淀并通過在6000g離心而沉淀。將所述噬菌體沉淀溶解于50％甘油/50％PBS中并在-20℃貯存。
如下進行選擇噬菌體展示的VAP。
將于0.1m碳酸鈉緩沖液(pH9.4)中的大約1μg靶分子(抗原)在4℃在一個免疫試管(immunotube)(Nunc)或微滴定平板(Nunc)中固定過夜。在除去該溶液后，將該試管用于PBS中3％脫脂奶粉溶液(ELK)或者相似的封閉劑封閉至少2小時，在室溫或在4℃過夜。在除去封閉劑后，在封閉緩沖液中加入含有大約1012-1013個集落生成單位(cfu)的噬菌粒文庫溶液，所述噬菌粒文庫溶液用封閉緩沖液在室溫預(yù)先封閉1小時。在緩慢旋轉(zhuǎn)的平臺上在室溫孵育1小時。然后將該試管用PBS洗滌3次，用具有0.1％Tween的PBS洗滌2次，再用PBS洗滌4次。結(jié)合的噬菌體用合適的洗脫緩沖液洗脫，所述洗脫緩沖液為于PBS中的300μl 0.1m甘氨酸pH2.2或500μl 0.1％胰蛋白酶。如果用甘氨酸洗脫，則將回收的噬菌體立即用700μl 1m Tris-HClpH8.5中和?；蛘撸Y(jié)合的噬菌體通過用含有抗原(1-10μM)的PBS孵育而洗脫。回收的噬菌體如上述擴增，應(yīng)用大腸桿菌XLI-Blue(Stratagene)或Top10F′(InVitrogen)細胞作為宿主。將選擇方法重復(fù)幾次以濃縮陽性克隆。在最后一次循環(huán)后，挑取各個克隆并確定其結(jié)合親和性及DNA序列。
如實施例6所述通過ELISA確定VAP的結(jié)合親和性，作為噬菌體顆粒上的g-III融合蛋白或之后如實施例4所述作為NdeI-SfiI亞克隆入表達載體CM126中。大腸桿菌BL21(DE3)或Origami(DE3)(Novagen)如實施例5所述通過電穿孔轉(zhuǎn)化，并將轉(zhuǎn)化體在補加氨芐青霉素(100μg/ml)的2×TY培養(yǎng)基上生長。當(dāng)細胞培養(yǎng)物達到OD600為大約1時，通過加入IPTG(0.2mM)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達。在37℃4小時后，通過離心收獲細胞。如實施例5所述分離蛋白質(zhì)。
實施例48富集乳鐵蛋白結(jié)合VAP純化的乳鐵蛋白(LF)由DMV-Campina提供。
如實施例45所述使用AR4中具有多樣化的一個噬菌體展示文庫選擇LF結(jié)合VAP。將(于1ml碳酸氫鈉緩沖液(0.1m，pH9.4)中的10μg)LF固定于一個免疫試管中(Nunc)，隨后用于PBS中的3％雞血清封閉。如實施例32所述進行淘選。1013個噬菌體用作輸入物。在第一輪淘選后，形成大約10000個集落。在第二輪淘選后，形成500-1000個集落。如實施例6所述將各個克隆生長并生產(chǎn)VAP，通過ELISA檢測。發(fā)現(xiàn)富集的是具有以下AR4的克隆CAAQTGGPPAPYYCTEYGSPDSW。
實施例49富集乳過氧化物酶結(jié)合VAP純化的乳過氧化物酶(LP)由DMV-Campina提供。
如實施例45所述AR4中具有多樣化的一個噬菌體展示文庫用于選擇LP結(jié)合VAP。將(于1ml碳酸氫鈉緩沖液(0.1m，pH9.4)中10μg)LP固定于一個免疫試管中(Nunc)，隨后用于PBS中的3％雞血清封閉。如實施例32所述進行淘選。1013個噬菌體用作輸入物。在第一輪淘選后，形成大約5000個集落。在第二輪淘選后，形成500-1000個集落。如實施例6所述將各個克隆生長及生產(chǎn)VAP，并通過ELISA檢測。對陽性克隆進行測序。發(fā)現(xiàn)富集的是具有以下AR4的克隆CAAVLGCGYCDYDDGDVGSWCAATENFRIAREGYEYDYWCAATSDFRIAREDYEYDYW。
實施例50RNase A結(jié)合物，構(gòu)建成熟及淘選如實施例3所述合成一種合成的RNase A結(jié)合iMab，iMab130(表4，表3)，隨后克隆入CM114中形成CM114-iMab130。在如實施例32中針對文庫擴增程序所述條件下產(chǎn)生iMab130的嵌合噬菌體，作為具有g(shù)3外殼蛋白的一種融合蛋白質(zhì)。用這些嵌合噬菌體針對RNaseA包被的免疫試管進行淘選(見實施例32淘選程序)，未示出RNase A特異性結(jié)合iMab130。顯然無法進行RNase A結(jié)合區(qū)的功能性定位，可能由于周圍氨基酸側(cè)鏈的略微扭曲所致。對支架少量修飾可有助于將AR移至正確位置。為達到這個目的，將iMab130編碼區(qū)使用以下方法突變將載體CM114中存在的iMab130使用dITP或dPTP在用引物120和121(表...)擴增所述支架期間突變，使用誘變濃度為1.7mM dITP或300μM，75μM或10μM dPTP。將所得PCR產(chǎn)物從瓊脂糖凝膠中根據(jù)廠商方法通過Qiagen′s凝膠洗脫系統(tǒng)進行分離。分離的產(chǎn)物在存在100μM dNTPs(Roche)時擴增以產(chǎn)生dITP和dPTP游離產(chǎn)物。在經(jīng)過Qiagen′s PCR clean up試劑盒純化后，將這些PCR片段用NotI和Sfil(NEB)消化并連接入NotI和SfiI線性化的CM114中。將沉淀并用70％乙醇洗滌的連接產(chǎn)物通過電穿孔轉(zhuǎn)化入TGI中，及在含有100μg/ml氨芐青霉素和2％葡萄糖的2×TY培養(yǎng)基中生長，隨后用VCSM13輔助噬菌體(Stratagene)感染以如實施例32所述產(chǎn)生嵌合噬菌體。將一部分轉(zhuǎn)化體鋪板于含有2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2×TY平板上，以確定轉(zhuǎn)化頻率。如實施例32所述將這些噬菌體文庫用于RNase A淘選實驗中。將RNase A固定在免疫試管中進行淘選。在淘選后，洗脫噬菌體并用于感染TOP10 F′(InVitrogen)，在37℃在含有2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素及25μg/ml四環(huán)素的2×TY平板上生長過夜。挽回集落的數(shù)目示于表17。
從用衍生自iMab130不同誘變水平的噬菌體文庫淘選后獲得的集落數(shù)目可以推斷在具有輕度誘變水平，dITP的文庫中可觀測到結(jié)合物明顯增加(表17)。
實施例51固定程序?qū)?g環(huán)氧激活的瓊脂糖6B(廠商Amersham Biosciences)填充在一個層析柱中并用10個床體積的偶聯(lián)緩沖液(200mM磷酸鉀，pH7)洗滌。將待偶聯(lián)的蛋白質(zhì)以1mg/ml濃度溶解在偶聯(lián)緩沖液中，以0.1ml/分鐘的流速流經(jīng)所述層析柱。在流過20個床體積的蛋白質(zhì)溶液之后，將該柱用偶聯(lián)緩沖液洗滌。流過10個床體積的0.2M乙醇胺/200mM磷酸鉀pH7封閉未反應(yīng)的環(huán)氧基團。然后將該樹脂用20個床體積的50mM磷酸鉀pH7洗滌，之后備用。
實施例52通過溶菌酶固定的珠進行iMab100純化將溶菌酶固定在Eupergit上并用于一個層析柱中，所述Eupergit是得自Rohm的一種激活的環(huán)氧樹脂。將含有iMab100的一種溶液經(jīng)過所述柱并測定直接旁路(direct bypass)及流經(jīng)所述柱后的濃度(A280nm)。差別表示與所述柱結(jié)合的iMab100數(shù)量。結(jié)合的iMab100可以用CAPS緩沖液pH11釋放。用BSA的對照實驗表明iMab100與固定的溶菌酶的結(jié)合是特異性的。
實施例53通過iMab100固定的珠進行溶菌酶純化將iMab100固定在Eupergit上并用于一個層析柱中。將一種含有溶菌酶的溶液經(jīng)過該柱并測定在直接旁路及流經(jīng)所述柱后的濃度(A280nm)。差別表示與所述柱結(jié)合的溶菌酶數(shù)量。結(jié)合的溶菌酶可以用CAPS緩沖液pH11釋放。用BSA的對照實驗表明溶菌酶與固定的iMab100的結(jié)合是特異性的。
實施例54iMab100在乳清級分中的穩(wěn)定性iMab100在一些乳汁級分中的穩(wěn)定性通過ELISA方法(實施例8)使用溶菌酶包被的平板測定。如果所述標(biāo)簽，支架區(qū)或親和區(qū)經(jīng)蛋白酶解降解，則觀測到抗溶菌酶活性降低。將iMab100在一些不同溶液中稀釋1×PBS作為對照，來自干酪乳清、高德干酪乳清及低巴氏滅菌的undermilk的離子交換組分，經(jīng)1.4μm過濾為終濃度40μg/ml。將所有級分在8℃貯存，在0，2和5小時及在1，2，3，4，5和7天后取樣品。將樣品置于-20℃以防止進一步降解。如實施例8所述進行ELISA檢測并示于圖12。IMab100的活性模式在實驗始終保持相似。因此可以推斷iMab100，包括所述標(biāo)簽，在分析的乳汁級分中是穩(wěn)定的。
附圖簡述表1PDB形式中9鏈(僅是鏈)實例。
表2很可能與9鏈iMab蛋白同樣折疊的氨基酸序列實例。
表3VAP氨基酸序列。
表4iMab DNA序列。
表5使用的引物表。
表6純化的iMab變體與溶菌酶的結(jié)合特性。分析含有6-，7-或9-β折疊的多種純化的iMabs與ELK(對照)及溶菌酶的結(jié)合，如實施例8，15，19和23中所述。
所有iMabs均使用尿素及隨后用有助于再折疊的基質(zhì)純化(實施例7)，除了iMab100之外，其額外通過熱誘導(dǎo)的包涵體溶解而純化(實施例6)。
表7pH休克(shock)對iMab100的作用，在通過乙酸鉀pH4.8沉淀之前和之后在對溶菌酶的ELISA中測定。
表8在PDB2.0版本中7鏈(僅是鏈)折疊的四個表示空間構(gòu)象的實例。
表9來自針對7鏈iMab蛋白的MODELLER目標(biāo)功能的PROSAII結(jié)果(zp-comp)及數(shù)值。較低數(shù)值相應(yīng)于更可能正確折疊的iMab蛋白。
表10不太可能與7鏈iMab蛋白同樣折疊的氨基酸序列實例。
表11在PDB2.0版本中6鏈(僅是鏈)折疊的4個表示空間構(gòu)象的實例。
表12來自針對6鏈iMab蛋白的MODELLER目標(biāo)功能的PROSAII結(jié)果(zp-comp)及數(shù)值。較低數(shù)值相應(yīng)于更可能正確折疊的iMab蛋白。
表13很可能與6鏈iMab蛋白同樣折疊的氨基酸序列實例。
表14來自iMab100衍生物的PROSAII結(jié)果(zp-comp)，所述衍生物在3，7，19和65位的賴氨酸由所有其它可能的氨基酸殘基置換。產(chǎn)生有及無天然半胱氨酸橋的模型。更有利的衍生物(親水性的)用X表示。
表15來自iMab100衍生物的PROSAII結(jié)果(zp-comp)，所述衍生物在第96位的半胱氨酸由所有其它可能的氨基酸殘基置換。
表16A)iMab100的氨基酸序列(參考)及可能的候選物以形成額外的半胱氨酸橋。標(biāo)明了可以形成半胱氨酸橋的位置。
B)半胱氨酸橋的優(yōu)選位置，具有其相應(yīng)PROSAII score(zp-comp)及相應(yīng)iMab名稱。
表17在淘選之后dITP的突變頻率對結(jié)合物數(shù)目的作用。
表18在實施例40和實施例4中使用的載體的序列。
圖1支架結(jié)構(gòu)域的3D-拓撲學(xué)示意圖該圖描述了可用于呈遞抗原結(jié)合位點的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的8個拓撲學(xué)實例。基本核心β元件在實例A中提及。這個基本結(jié)構(gòu)含有位于2個平板(plate)中的9個β元件。一個β折疊含有元件1，2，6和7，另一個含有元件3，4，5，8和9。與所述β元件連接的環(huán)也加以了描述。粗線是在頂部β元件之間的連接環(huán)，虛線表示位于底部的連接環(huán)。從虛線開始至實線結(jié)束的連接表示β元件底部和頂部之間的連接。該圖中描述的β元件的數(shù)目相應(yīng)于在圖1和2中提及的數(shù)目和位置。
A9β元件拓撲學(xué)例如所有抗體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域及T細胞受體可變結(jié)構(gòu)域。
B8β元件拓撲學(xué)例如白細胞介素-4α受體(lIAR)。
C7aβ元件拓撲學(xué)例如免疫球蛋白殺傷受體2d12(2DLI)。
D7bβ元件拓撲學(xué)例如E-鈣粘著蛋白結(jié)構(gòu)域(1FF5)。
E6aβ鏈拓撲學(xué)。
F6bβ元件拓撲學(xué)例如Fcε受體類型α(1J88)。
G6cβ元件拓撲學(xué)例如白細胞介素-1受體類型-1(1GOY)。
H5β元件拓撲學(xué)。
圖2模塊親和性及支架轉(zhuǎn)移(MAST)技術(shù)。
含有本發(fā)明所述核心結(jié)構(gòu)的推定的抗原結(jié)合蛋白可用于轉(zhuǎn)移操作。另外，支架或核心結(jié)構(gòu)的各個或多個元件或區(qū)域也可用于轉(zhuǎn)移作用。所述轉(zhuǎn)移操作可在結(jié)構(gòu)相同的或相似的氨基酸組分不同的支架或核心之間發(fā)生。推定的親和區(qū)可以從一個支架或核心移至另一個支架或活性，通過例如PCR，限制性消化，DNA合成或其它分子學(xué)技術(shù)進行。這種轉(zhuǎn)移的結(jié)果在此以示意圖形式描述。來自分子A的推定的(編碼)結(jié)合區(qū)(上部，親和區(qū))及分子B的支架(編碼)區(qū)(下部，構(gòu)架區(qū))可以通過分子方式分離。在重組這兩個元件后，出現(xiàn)一種新的分子(雜合結(jié)構(gòu))，其具有分子A的結(jié)合性質(zhì)及支架B的支架性質(zhì)。
圖3免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域指示。
該圖示出分別由9，7和6個β元件組成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的拓撲學(xué)(從N末端至C末端以1-9表示)。B元件1，2，6和7及元件3，4，5，8和9形成兩個β折疊。
8個環(huán)(L1-L8)負責(zé)所有β元件的連接。
環(huán)2，4，6和8位于該圖的上部，這代表這些環(huán)在所述蛋白質(zhì)中的物理位置。環(huán)2，4和8在輕鏈和抗體可變結(jié)構(gòu)域中的功能是結(jié)合抗原，已知是CDR區(qū)。L6的位置(也用圖案標(biāo)記)也允許抗原結(jié)合活性，但未指明為結(jié)合區(qū)。
L2，L4，L6，L8分別確定為親和區(qū)1(AR1)，AR2，AR3和AR4。環(huán)1，3，5和7位于蛋白質(zhì)的相對位置。
圖4A)載體CM126的示意圖B)載體CM126的示意圖。
圖5加熱(60℃)溶解iMab100的包涵體。
泳道分子量標(biāo)記(1)，分離的iMab100包涵體(2)，包涵體在PBS pH8+1％Tween-20中在60℃孵育10分鐘基礎(chǔ)上的溶解的iMab100。
圖6含有6，7或9個β折疊的純化的iMab變體。
泳道分子量標(biāo)記(1)，iMab1300(2)，iMab1200(3)，iMab701(4)，iMab101(5)，iMab900(6)，iMab122(7)，iMab1202(8)，iMab1602(9)，iMab1302(10)，iMab116(11)，iMab111(12)，iMab100(13)。
圖7iMab100在95℃的穩(wěn)定性。
分析在95℃孵育多種時間的純化的iMab100與ELK(方形所示)或溶菌酶(圓形所示)的結(jié)合。
圖8iMab100在20℃的穩(wěn)定性。
分析在20℃孵育多種時間的純化的iMab100與ELK(方形所示)或雞溶菌酶(圓形所示)的結(jié)合。
圖9A-LAiMab100在20℃，95℃及再次在20℃的遠UV CD光譜(205-260nm)。iMab100溶解于1×PBS，pH7.5中。
BiMab111，與在20℃的iMab100光譜相比，在20℃，在95℃(部分)變性，及在20℃再折疊測定的遠UV光譜。
CiMab116，與在20℃的iMab100光譜相比，在20℃，在95℃(部分)變性，及在20℃再折疊測定的遠UV光譜。
DiMab1202，與在20℃的iMab100光譜相比，在20℃，在95℃(部分)變性，及在20℃再折疊測定的遠UV光譜。
EiMab1302，與在20℃的iMab100光譜相比，在20℃，在95℃(部分)變性，及在20℃再折疊測定的遠UV光譜。
FiMab1602，與在20℃的iMab100光譜相比，在20℃，在95℃(部分)變性，及在20℃再折疊測定的遠UV光譜。
GiMab101，在20℃，在95℃(部分)變性及在20℃再折疊測定的遠UV光譜。
HiMab1200，在20℃，在95℃(部分)變性及在20℃再折疊測定的遠UV光譜。
IiMab701，在20℃，在95℃(部分)變性及在20℃再折疊測定的遠UV光譜。
J天然(未變性的)9鏈iMab支架的覆蓋圖。
K天然(未變性的)7鏈iMab支架的覆蓋圖。
LiMab100和VHH的遠UV CD光譜(感謝Kwaaitaal M，Wageningen University and Research，Wageningen，the Netherlands)。
圖10針對MAST，PCR分離CDR3的示意圖。
圖11擴增牛衍生的CDR3區(qū)2％瓊脂糖-TBE凝膠。
泳道1用引物8和9經(jīng)PCR擴增的1μg Llama cDNA cyst+。
泳道2用引物8和9經(jīng)PCR擴增的1μg Llama cDNA cyst-。
泳道325bp DNA步梯(step ladder)(Promega)。
泳道4用引物299和300經(jīng)PCR擴增的0.75μg牛cDNA。
泳道5用引物299和300經(jīng)PCR擴增的1.5μg牛cDNA。
泳道6用引物299和301經(jīng)PCR擴增的0.75μg牛cDNA。
泳道7用引物299和301經(jīng)PCR擴增的1.5μg牛cDNA。
泳道850bp GeneRuler DNA梯(MBI Fermentas)。
圖12用iMab100的ELISA測定的溶菌酶結(jié)合活性。及時測試一些不同溶液對iMab100蛋白的蛋白酶解活性。在圖A)和C)中測試樣品稀釋100倍，而在圖B)和D)中樣品稀釋1000倍。A)和B)示出溶菌酶活性而C)和D)示出背景活性。
表11NeuATOM 1 CA GLY 2-9.450 -13.069 10.6711.0025.06 CATOM 2 CA GLY 3-9.868 -10.322 8.019 1.0020.77 CATOM 3 CA GLY 4-6.884 -9.280 5.813 1.0019.01 CATOM 4 CA GLY 5-6.047 -5.991 4.016 1.0019.75 CATOM 5 CA GLY 6-2.638 -4.349 3.125 1.0022.33 CATOM 6 CA GLY 7-1.382 -1.720 5.647 1.0024.80 CATOM 7 CA GLY 8-0.685 1.0803.150 1.0028.23 CATOM 8 CA GLY 9-0.917 1.393-0.6231.0026.37 CATOM 9 CA GLY 10 0.737 3.923-2.8871.0029.08 CATOM 10CA GLY 11 -0.741 5.082-6.1561.0026.48 CATOM 11CA GLY 12 0.157 7.450-8.9891.0027.26 CATOM 12CA GLY 13 -2.216 10.173 -10.146 1.0026.73 CATOM 13CA GLY 15 -3.567 5.434-12.371 1.0023.37 CATOM 14CA GLY 16 -5.492 2.682-10.482 1.0022.86 CATOM 15CA GLY 17 -4.920 0.709-7.2881.0020.21 CATOM 16CA GLY 18 -6.462 -2.512 -5.9331.0019.23 CATOM 17CA GLY 19 -7.735 -2.659 -2.3661.0017.13 CATOM 18CA GLY 20 -7.524 -6.278 -1.1411.0019.06 CATOM 19CA GLY 21 -9.914 -7.812 1.355 1.0015.28 CATOM 20CA GLY 22 -10.325-11.479 2.238 1.0015.88 CATOM 21CA GLY 23 -11.233-13.572 5.249 1.0018.12 CATOM 22CA GLY 24 -10.228-16.988 6.550 1.0018.67 CATOM 23CA GLY 25 -11.569-19.457 9.107 1.0020.29 CATOM 24CA GLY 33 -21.431-13.432 3.640 1.0024.64 CATOM 25CA GLY 34 -21.423-9.665 3.090 1.0021.24 CATOM 26CA GLY 35 -18.613-7.157 2.347 1.0017.90 CATOM 27CA GLY 36 -18.908-3.427 3.018 1.0016.78 CATOM 28CA GLY 37 -16.219-0.829 2.103 1.0015.77 CATOM 29CA GLY 38 -16.1232.5733.946 1.0016.15 CATOM 30CA GLY 39 -13.8705.6193.251 1.0017.11 CATOM 31CA GLY 40 -12.4948.3145.642 1.0019.95 CATOM 32CA GLY 46 -16.46110.313 9.058 1.0025.44 CATOM 33CA GLY 47 -16.5566.8207.445 1.0021.65 CATOM 34CA GLY 48 -18.7356.8344.274 1.0018.17 CATOM 35CA GLY 49 -19.8773.5392.632 1.0016.87 CATOM 36CA GLY 50 -18.7813.271-1.0241.0016.20 CATOM 37CA GLY 51 -19.542-0.410 -1.8191.0018.17 CATOM 38CA GLY 58 -23.016-6.057 -5.6561.0025.27 CATOM 39CA GLY 59 -24.037-2.432 -4.8971.0025.25 CATOM 40CA GLY 60 -21.8010.483-5.9601.0027.11 CATOM 41CA GLY 61 -22.3914.033-4.7461.0033.08 CATOM 42CA GLY 69 -14.4284.962-10.168 1.0019.37 CATOM 43CA GLY 70 -15.1911.646-8.3891.0017.40 CATOM 44CA GLY 71 -14.920-1.883 -9.8621.0017.48 CATOM 45CA GLY 72 -15.954-5.092 -8.0381.0017.29 CATOM 46CA GLY 73 -13.296-7.784 -8.4461.0017.82 CATOM 47CA GLY 74 -13.990-10.198 -5.6111.0020.26 CATOM 48CA GLY 81 -14.142-8.971 -1.3811.0015.95 CATOM 49CA GLY 82 -11.604-6.836 -3.2561.0014.51 CATOM 50CA GLY 83 -12.322-3.672 -5.3371.0014.59 CATOM 51CA GLY 84 -10.287-1.441 -7.6461.0015.51 CATOM 52CA GLY 85 -10.2042.403-7.2911.0016.32 CATOM 53CA GLY 86 -9.791 3.931-10.768 1.0017.40 CATOM 54CA GLY 87 -8.338 7.203-12.126 1.0020.53 CATOM 55CA GLY 89 -6.478 11.899 -7.8441.0033.26 CATOM 56CA GLY 90 -4.328 13.752 -5.2931.0033.41 CATOM 57CA GLY 91 -7.275 14.318 -3.0271.0028.24 CATOM 58CA GLY 92 -8.033 10.627 -2.7151.0023.61 CATOM 59CA GLY 93 -5.654 10.161 0.314 1.0022.12 CATOM 60CA GLY 94 -7.413 8.4863.205 1.0018.21 CATOM 61CA GLY 95 -8.183 5.2945.047 1.0018.57 CATOM 62CA GLY 96 -10.4622.5023.647 1.0017.72 CATOM 63CA GLY 97 -12.048-0.109 5.899 1.0018.72 CATOM 64CA GLY 98 -13.364-3.549 4.893 1.0018.53 CATOM 65CA GLY 99 -16.169-4.934 7.135 1.0018.45 CATOM 66CA GLY 100 -17.005-8.651 6.806 1.0017.71 CATOM 67CA GLY 108 -18.629-7.767 11.6741.0032.51 CATOM 68CA GLY 109 -14.846-7.953 11.7181.0028.62 C
ATOM69 CA GLY110 -12.921 -5.079 10.098 1.00 23.31 CATOM70 CA GLY111 -9.483 -4.260 8.692 1.00 19.82 CATOM71 CA GLY112 -8.175 -1.005 7.171 1.00 19.75 CATOM72 CA GLY113 -5.635 0.154 4.554 1.00 18.42 CATOM73 CA GLY114 -4.325 3.731 4.046 1.00 18.70 CATOM74 CA GLY115 -3.915 5.265 0.576 1.00 19.95 CATOM75 CA GLY116 -1.274 7.843 -0.510 1.00 25.78 CATOM76 CA GLY117 -1.158 9.173 -4.076 1.00 31.06 CATOM77 CA GLY118 1.96210.836 -5.500 1.00 38.60 CATOM78 CA GLY119 3.25111.884 -8.972 1.00 42.50 CTER1MELATOM79 CA GLY A 3 -9.610 -12.24111.306 1.00 36.96 CATOM80 CA GLY A 4 -9.672 -9.746 8.420 1.00 28.80 CATOM81 CA GLY A 5 -6.352 -8.965 6.761 1.00 31.64 CATOM82 CA GLY A 6 -6.225 -6.212 4.154 1.00 24.68 CATOM83 CA GLY A 7 -3.391 -5.808 1.630 1.00 21.60 CATOM84 CA GLY A 8 -2.679 -3.267 -1.055 1.00 17.27 CATOM85 CA GLY A 9 -2.837 0.450 -0.715 1.00 18.58 CATOM86 CA GLY A 10 0.1122.848 -0.895 1.00 16.78 CATOM87 CA GLY A 11 0.6635.945 -3.023 1.00 11.36 CATOM88 CA GLY A 12 -0.001 6.528 -6.640 1.00 8.84CATOM89 CA GLY A 13 -0.394 9.450 -8.944 1.00 11.16 CATOM90 CA GLY A 14 -3.805 10.880 -9.667 1.00 10.62 CATOM91 CA GLY A 16 -3.498 5.586 -11.682 1.00 7.90CATOM92 CA GLY A 17 -5.029 2.507 -10.132 1.00 7.54CATOM93 CA GLY A 18 -4.536 0.406 -6.998 1.00 6.47CATOM94 CA GLY A 19 -5.823 -2.962 -5.868 1.00 5.43CATOM95 CA GLY A 20 -6.773 -3.739 -2.263 1.00 8.09CATOM96 CA GLY A 21 -7.534 -7.231 -0.907 1.00 8.76CATOM97 CA GLY A 22 -9.056 -8.745 2.173 1.00 8.33CATOM98 CA GLY A 23 -9.100 -12.2813.393 1.00 13.77 CATOM99 CA GLY A 24 -11.485 -13.1776.222 1.00 17.53 CATOM100 CA GLY A 25 -9.970 -15.9108.360 1.00 23.23 CATOM101 CA GLY A 26 -11.324 -17.98511.176 1.00 25.25 CATOM102 CA GLY A 32 -22.537 -12.9614.478 1.00 5.00CATOM103 CA GLY A 33 -21.061 -9.574 3.450 1.00 4.64CATOM104 CA GLY A 34 -17.557 -8.097 2.923 1.00 2.48CATOM105 CA GLY A 35 -17.173 -4.447 1.958 1.00 2.00CATOM106 CA GLY A 36 -14.942 -1.420 2.147 1.00 3.40CATOM107 CA GLY A 37 -15.248 1.775 4.153 1.00 6.64CATOM108 CA GLY A 38 -12.980 4.768 4.009 1.00 8.74CATOM109 CA GLY A 39 -12.174 7.634 6.381 1.00 19.24 CATOM110 CA GLY A 44 -17.378 11.364 7.293 1.00 26.93 CATOM111 CA GLY A 45 -16.728 7.653 7.090 1.00 16.63 CATOM112 CA GLY A 46 -17.836 6.562 3.651 1.00 13.26 CATOM113 CA GLY A 47 -19.278 3.220 2.664 1.00 8.30CATOM114 CA GLY A 48 -17.484 2.453 -0.627 1.00 6.32CATOM115 CA GLY A 49 -18.387 -0.943 -1.936 1.00 3.71CATOM116 CA GLY A 57 -24.217 -9.042 -5.792 1.00 11.04 CATOM117 CA GLY A 58 -22.300 -5.759 -5.582 1.00 7.10CATOM118 CA GLY A 59 -23.147 -2.237 -4.440 1.00 9.00CATOM119 CA GLY A 60 -21.067 0.930 -4.751 1.00 8.36CATOM120 CA GLY A 61 -21.147 4.392 -3.266 1.00 15.85 CATOM121 CA GLY A 67 -14.348 3.577 -11.091 1.00 12.68 CATOM122 CA GLY A 68 -14.176 0.900 -8.416 1.00 8.15CATOM123 CA GLY A 69 -15.003 -2.767 -8.799 1.00 8.39CATOM124 CA GLY A 70 -15.301 -5.266 -5.949 1.00 5.47CATOM125 CA GLY A 71 -15.018 -8.998 -6.510 1.00 8.48CATOM126 CA GLY A 72 -14.299 -12.215-4.617 1.00 18.00 CATOM127 CA GLY A 79 -12.288 -10.021-1.938 1.00 9.55CATOM128 CA GLY A 80 -10.619 -7.230 -3.968 1.00 4.94CATOM129 CA GLY A 81 -11.319 -3.691 -4.814 1.00 4.92CATOM130 CA GLY A 82 -9.808 -2.556 -8.096 1.00 7.44CATOM131 CA GLY A 83 -9.608 1.233 -8.010 1.00 6.55CATOM132 CA GLY A 84 -9.109 2.986 -11.359 1.00 9.49CATOM133 CA GLY A 85 -9.157 6.689 -12.211 1.00 12.54 CATOM134 CA GLY A 87 -8.265 11.163 -7.900 1.00 15.46 CATOM135 CA GLY A 88 -6.724 12.875 -4.855 1.00 13.94 CATOM136 CA GLY A 89 -10.223 13.046 -3.286 1.00 18.68 C
ATOM 137 CA GLY A 90 -9.896 9.253-2.924 1.00 9.55CATOM 138 CA GLY A 91 -7.043 9.782-0.407 1.00 6.54CATOM 139 CA GLY A 92 -8.201 8.1112.809 1.00 6.38CATOM 140 CA GLY A 93 -7.841 5.1985.205 1.00 6.33CATOM 141 CA GLY A 94 -9.509 2.1303.746 1.00 6.08CATOM 142 CA GLY A 95 -11.083 -0.367 6.028 1.00 10.12 CATOM 143 CA GLY A 96 -12.264 -3.845 5.241 1.00 10.76 CATOM 144 CA GLY A 97 -15.411 -5.059 6.995 1.00 9.08CATOM 145 CA GLY A 98 -17.534 -8.225 7.154 1.00 8.28CATOM 146 CA GLY A 122-15.862 -7.486 11.967 1.00 15.49 CATOM 147 CA GLY A 123-13.351 -4.917 11.000 1.00 12.37 CATOM 148 CA GLY A 124-9.811 -4.988 9.801 1.00 14.34 CATOM 149 CA GLY A 125-6.730 -2.842 10.015 1.00 22.49 CATOM 150 CA GLY A 126-6.910 0.3347.957 1.00 17.72 CATOM 151 CA GLY A 127-4.732 0.8024.921 1.00 16.51 CATOM 152 CA GLY A 128-3.822 4.3193.804 1.00 16.84 CATOM 153 CA GLY A 129-4.119 5.1190.160 1.00 11.90 CATOM 154 CA GLY A 130-2.710 8.445-0.901 1.00 8.75CATOM 155 CA GLY A 131-3.277 9.842-4.344 1.00 14.37 CATOM 156 CA GLY A 132-0.480 12.243 -5.478 1.00 23.32 CATOM 157 CA GLY A 133-0.447 15.425 -7.580 1.00 36.14 CTER1F97ATOM 158 CA GLY A 29 -9.830 -13.499 10.551 1.00 41.25 CATOM 159 CA GLY A 30 -9.746 -10.552 8.150 1.00 22.43 CATOM 160 CA GLY A 31 -6.475 -9.224 6.722 1.00 24.73 CATOM 161 CA GLY A 32 -4.787 -7.203 3.981 1.00 20.95 CATOM 162 CA GLY A 33 -1.574 -7.581 1.983 1.00 28.77 CATOM 163 CA GLY A 34 -0.760 -3.875 2.262 1.00 33.48 CATOM 164 CA GLY A 35 -2.198 -1.487 4.855 1.00 27.47 CATOM 165 CA GLY A 36 -0.223 1.5103.544 1.00 29.20 CATOM 166 CA GLY A 37 -0.984 1.885-0.160 1.00 23.99 CATOM 167 CA GLY A 38 0.6814.472-2.392 1.00 24.19 CATOM 168 CA GLY A 39 -0.199 4.783-6.071 1.00 15.35 CATOM 169 CA GLY A 40 0.2607.491-8.737 1.00 12.64 CATOM 170 CA GLY A 41 -2.766 9.641-9.587 1.00 9.24CATOM 171 CA GLY A 43 -3.890 4.861-12.131 1.00 14.44 CATOM 172 CA GLY A 44 -5.807 1.735-11.160 1.00 21.52 CATOM 173 CA GLY A 45 -5.444 0.202-7.726 1.00 22.48 CATOM 174 CA GLY A 46 -6.964 -2.720 -5.861 1.00 21.22 CATOM 175 CA GLY A 47 -7.458 -2.391 -2.118 1.00 20.06 CATOM 176 CA GLY A 48 -7.106 -5.988 -0.927 1.00 13.56 CATOM 177 CA GLY A 49 -9.118 -7.626 1.851 1.00 19.14 CATOM 178 CA GLY A 50 -8.738 -11.362 2.401 1.00 22.49 CATOM 179 CA GLY A 51 -10.667 -13.442 4.932 1.00 20.58 CATOM 180 CA GLY A 52 -11.032 -17.051 6.076 1.00 24.55 CATOM 181 CA GLY A 53 -13.512 -18.935 8.234 1.00 17.82 CATOM 182 CA GLY A 57 -19.932 -13.290 4.102 1.00 10.39 CATOM 183 CA GLY A 58 -21.330 -9.790 3.738 1.00 8.00CATOM 184 CA GLY A 59 -18.524 -7.465 2.656 1.00 7.62CATOM 185 CA GLY A 60 -18.773 -3.717 3.244 1.00 6.84CATOM 186 CA GLY A 61 -16.384 -0.804 2.777 1.00 8.48CATOM 187 CA GLY A 62 -16.301 2.6564.292 1.00 13.92 CATOM 188 CA GLY A 63 -14.245 5.7263.449 1.00 11.89 CATOM 189 CA GLY A 64 -13.094 8.0836.189 1.00 23.18 CATOM 190 CA GLY A 68 -16.689 12.612 6.413 1.00 46.37 CATOM 191 CA GLY A 69 -17.861 8.9886.532 1.00 32.33 CATOM 192 CA GLY A 70 -19.096 7.4273.276 1.00 18.88 CATOM 193 CA GLY A 71 -19.976 3.8412.373 1.00 12.11 CATOM 194 CA GLY A 72 -18.208 2.531-0.728 1.00 9.54CATOM 195 CA GLY A 73 -19.659 -0.955 -0.492 1.00 9.17CATOM 196 CA GLY A 77 -22.346 -4.092 -3.568 1.00 17.96 CATOM 197 CA GLY A 78 -20.630 -0.882 -4.664 1.00 11.41 CATOM 198 CA GLY A 79 -22.720 2.163-3.704 1.00 8.01CATOM 199 CA GLY A 85 -15.239 3.577-11.142 1.00 17.93 CATOM 200 CA GLY A 86 -15.128 0.968-8.358 1.00 15.44 CATOM 201 CA GLY A 87 -15.569 -2.740 -9.020 1.00 16.79 CATOM 202 CA GLY A 88 -16.272 -5.311 -6.312 1.00 14.07 CATOM 203 CA GLY A 89 -14.727 -8.756 -5.888 1.00 16.75 CATOM 204 CA GLY A 91 -10.820 -10.288 -2.524 1.00 17.13 C
ATOM 205 CA GLY A 92-11.033 -6.489 -2.552 1.00 12.84 CATOM 206 CA GLY A 93-12.232 -3.404 -4.409 1.00 12.33 CATOM 207 CA GLY A 94-10.610 -2.146 -7.602 1.00 12.43 CATOM 208 CA GLY A 95-10.518 1.519 -8.590 1.00 11.12 CATOM 209 CA GLY A 96-10.279 1.926 -12.3551.00 16.95 CATOM 210 CA GLY A 97-8.644 5.292 -11.5321.00 21.11 CATOM 211 CA GLY A 99-7.443 11.068 -7.844 1.00 22.37 CATOM 212 CA GLY A 100 -5.937 13.065 -4.977 1.00 23.75 CATOM 213 CA GLY A 101 -9.515 13.338 -3.639 1.00 22.84 CATOM 214 CA GLY A 102 -9.383 9.634 -2.783 1.00 15.51 CATOM 215 CA GLY A 103 -6.718 10.015 -0.070 1.00 11.57 CATOM 216 CA GLY A 104 -7.876 8.577 3.237 1.00 9.52 CATOM 217 CA GLY A 105 -8.530 5.333 5.050 1.00 12.64 CATOM 218 CA GLY A 106 -10.727 2.534 3.753 1.00 7.32 CATOM 219 CA GLY A 107 -12.073 -0.044 6.175 1.00 7.52 CATOM 220 CA GLY A 108 -13.078 -3.483 4.952 1.00 9.97 CATOM 221 CA GLY A 109 -15.819 -4.936 7.140 1.00 12.91 CATOM 222 CA GLY A 110 -16.559 -8.639 6.792 1.00 11.27 CATOM 223 CA GLY A 118 -17.046 -10.415 12.491 1.00 13.29 CATOM 224 CA GLY A 119 -13.800 -8.756 11.482 1.00 15.55 CATOM 225 CA GLY A 120 -12.342 -5.613 9.917 1.00 11.36 CATOM 226 CA GLY A 121 -9.139 -4.141 8.532 1.00 11.36 CATOM 227 CA GLY A 122 -8.151 -0.571 7.641 1.00 11.14 CATOM 228 CA GLY A 123 -6.080 0.520 4.643 1.00 11.58 CATOM 229 CA GLY A 124 -4.595 3.978 4.206 1.00 15.52 CATOM 230 CA GLY A 125 -4.504 5.200 0.621 1.00 9.61 CATOM 231 CA GLY A 126 -2.079 7.899 -0.493 1.00 10.84 CATOM 232 CA GLY A 127 -2.415 9.054 -4.098 1.00 10.58 CATOM 233 CA GLY A 128 0.98510.216 -5.373 1.00 14.41 CATOM 234 CA GLY A 129 1.30813.675 -6.915 1.00 12.32 CTER1DQTATOM 235 CA GLY C 2 -10.005 -8.876 13.603 1.00 35.96 CATOM 236 CA GLY C 3 -10.267 -7.502 10.101 1.00 30.20 CATOM 237 CA GLY C 4 -7.171 -6.498 8.221 1.00 27.24 CATOM 238 CA GLY C 5 -6.397 -5.009 4.845 1.00 23.16 CATOM 239 CA GLY C 6 -3.219 -3.760 3.070 1.00 22.73 CATOM 240 CA GLY C 7 -1.859 -0.343 3.998 1.00 24.33 CATOM 241 CA GLY C 8 -1.267 0.851 0.436 1.00 21.64 CATOM 242 CA GLY C 9 -2.613 0.109 -3.024 1.00 20.25 CATOM 243 CA GLY C 10-1.486 1.813 -6.246 1.00 20.37 CATOM 244 CA GLY C 11-4.559 2.055 -8.480 1.00 22.46 CATOM 245 CA GLY C 12-4.228 1.091 -12.1391.00 24.30 CATOM 246 CA GLY C 14-7.812 2.779 -15.6131.00 30.82 CATOM 247 CA GLY C 15-8.831 3.617 -12.0601.00 25.29 CATOM 248 CA GLY C 16-8.949 0.054 -10.7091.00 21.63 CATOM 249 CA GLY C 17-7.920 -0.828 -7.174 1.00 20.22 CATOM 250 CA GLY C 18-8.037 -4.397 -5.930 1.00 20.86 CATOM 251 CA GLY C 19-7.062 -5.746 -2.558 1.00 21.25 CATOM 252 CA GLY C 20-7.903 -8.418 0.003 1.00 21.73 CATOM 253 CA GLY C 21-9.906 -7.860 3.174 1.00 22.97 CATOM 254 CA GLY C 22-9.210 -10.573 5.688 1.00 26.59 CATOM 255 CA GLY C 23-10.945 -11.564 8.878 1.00 26.47 CATOM 256 CA GLY C 24-10.701 -13.907 11.826 1.00 31.54 CATOM 257 CA GLY C 25-11.932 -16.084 13.335 1.00 31.33 CATOM 258 CA GLY C 32-20.611 -12.339 5.419 1.00 21.25 CATOM 259 CA GLY C 33-21.785 -8.834 4.607 1.00 21.86 CATOM 260 CA GLY C 34-18.854 -6.717 3.456 1.00 19.78 CATOM 261 CA GLY C 35-18.920 -2.932 3.364 1.00 19.11 CATOM 262 CA GLY C 36-16.430 -0.515 1.806 1.00 19.23 CATOM 263 CA GLY C 37-16.229 2.889 3.460 1.00 25.95 CATOM 264 CA GLY C 38-14.212 5.923 2.415 1.00 30.90 CATOM 265 CA GLY C 39-12.916 7.802 5.426 1.00 40.84 CATOM 266 CA GLY C 43-16.713 11.053 8.779 1.00 46.74 CATOM 267 CA GLY C 44-17.290 8.066 6.505 1.00 36.18 CATOM 268 CA GLY C 45-19.030 7.541 3.173 1.00 28.21 CATOM 269 CA GLY C 46-20.279 4.093 2.143 1.00 25.48 CATOM 270 CA GLY C 47-18.891 3.200 -1.269 1.00 23.13 CATOM 271 CA GLY C 48-20.541 -0.174 -1.750 1.00 20.54 CATOM 272 CA GLY C 58-19.057 -12.667 -7.642 1.00 24.08 C
ATOM 273 CA GLY C 59 -20.627 -9.992 -5.444 1.00 22.25CATOM 274 CA GLY C 60 -21.579 -6.311 -5.553 1.00 22.96CATOM 275 CA GLY C 61 -23.676 -7.234 -8.605 1.00 28.83CATOM 276 CA GLY C 62 -25.740 -4.088 -8.210 1.00 32.00CATOM 277 CA GLY C 63 -22.747 -1.772 -7.854 1.00 30.87CATOM 278 CA GLY C 66 -17.371 -2.468 -7.103 1.00 23.17CATOM 279 CA GLY C 67 -16.897 -6.161 -7.488 1.00 22.56CATOM 280 CA GLY C 68 -15.405 -9.022 -5.517 1.00 21.60CATOM 281 CA GLY C 69 -15.312 -12.649 -4.466 1.00 22.69CATOM 282 CA GLY C 75 -12.905 -11.173 0.577 1.00 23.03CATOM 283 CA GLY C 76 -11.171 -10.003 -2.613 1.00 24.30CATOM 284 CA GLY C 77 -12.370 -6.459 -3.308 1.00 23.46CATOM 285 CA GLY C 78 -12.157 -4.457 -6.510 1.00 25.74CATOM 286 CA GLY C 79 -13.139 -0.780 -6.670 1.00 26.08CATOM 287 CA GLY C 80 -13.383 0.660 -10.196 1.00 29.15CATOM 288 CA GLY C 81 -13.950 3.973 -11.951 1.00 26.23CATOM 289 CA GLY C 84 -7.281 11.072 -8.931 1.00 24.79CATOM 290 CA GLY C 85 -9.649 12.909 -6.605 1.00 25.37CATOM 291 CA GLY C 86 -10.734 9.536 -5.170 1.00 25.21CATOM 292 CA GLY C 87 -7.287 9.058 -3.657 1.00 23.95CATOM 293 CA GLY C 88 -7.874 8.354 0.014 1.00 23.67CATOM 294 CA GLY C 89 -8.483 5.896 2.834 1.00 22.75CATOM 295 CA GLY C 90 -10.866 2.985 2.312 1.00 23.39CATOM 296 CA GLY C 91 -12.127 0.902 5.210 1.00 22.55CATOM 297 CA GLY C 92 -13.188 -2.683 4.810 1.00 22.29CATOM 298 CA GLY C 93 -15.931 -3.797 7.205 1.00 20.45CATOM 299 CA GLY C 94 -16.933 -7.418 7.719 1.00 20.73CATOM 300 CA GLY C 105 -15.090 -5.968 12.589 1.00 24.94CATOM 301 CA GLY C 106 -13.327 -3.332 10.512 1.00 25.24CATOM 302 CA GLY C 107 -9.792 -2.872 9.205 1.00 24.05CATOM 303 CA GLY C 108 -7.671 0.283 9.656 1.00 25.85CATOM 304 CA GLY C 109 -8.117 1.175 6.019 1.00 23.77CATOM 305 CA GLY C 110 -6.209 0.891 2.770 1.00 22.46CATOM 306 CA GLY C 111 -4.626 4.045 1.330 1.00 24.13CATOM 307 CA GLY C 112 -5.545 4.027 -2.339 1.00 22.83CATOM 308 CA GLY C 113 -3.438 6.352 -4.496 1.00 23.40CATOM 309 CA GLY C 114 -4.906 7.221 -7.840 1.00 25.42CEND
表2iMab100NVKLVE--KGG-NFVEN--DDDL--KLTCRAEGYTI----GPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPED---SAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYR--GQ-GTDVTVSSAiMab502SVKFVC--KVLPNFWEN--NKDLPIKFTVRASGYTI----GPTCVGVFAQNPEDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKLRFDIRRDNAKVTRTNSLDDVQPEGRGKSFELTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDQVAR--YHRGIDITVDGPiMab702AVKSVF--KVSTNFIENDGTMDS--KLTFRASGYTI----GPQCLGFFQQGVPDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKSIFDIRRDNAKDTYTASVDDNQPE----DVEITCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDLILRTLQK-GIDLFVVPTiMab1202(1EJ6)IVKLVM--EKR-GNFEN--GQDC--KLTIRASGYTI----GPACDGFFCQFPSDDSFSTED-NMGGGIT-VNDAMKPQFDIRRDNAKGTWTLSM-DFQPEG---IYEMQCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDNPVR--LG-GFDVDVPDViMab1302VVKVVI--KPSQNFIEN--GEDK--KFTCRASGYTI----GPKCIGWFSQNPEDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNAKDTSTLSIDDAQPED---AGIYKCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDSEA---TV-GVDIFVKLMiMab1502(1NEU)NVKVVT--KRE-NFGEN--GSDV--KLTCRASGYTI----GPICFGWFYQPEGDDSAISIFHNMGGGITDEVDTFKERFDIRRDNAKKTGTISIDDLQPSD---NETFTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDGKTR--QV-GLDVFVKVPiMab1602AVKPVIGSKAP-NFGEN---GDV--KTIDRASGYTI----GPTCGGVFFQGPTDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKETFDIRRDNAKSTRTESYDDNQPEG---LTEVKCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYDVSSR--LY-GYDILVGTQ
表3VAPs氨基酸序列iMab100NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab101VKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab102DLKLTCRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab111NVKLVCKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRCQGTDVTVSSiMab112NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFCQAPNDDSTCVATINMGGGITYYGDSVKER
FDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab113NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYSMGWFRQAPNDDSTNVSCINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab114NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYSMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab115NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDQASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab116NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNGAGDSTIYGSYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGQGTDVTVSSiMab120NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRAEGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKER
FDIRRDNASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSRGQGTDVTVSSiMab121NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGRSFSSYIMGWFRQAPNDDSTNVATISETGGDIVYTNYGDSVKERFDIRRDIASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGSVYGSGWRPDRYDYRGQGTDVTVSSiMab124DDLKLTCRASGRSFSSYIMGWFRQAPNDDSTNVATISETTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGSVYGSGWRPDRYDYRGQGTDVTVSSiMab122NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGRTFSSRTMGWFRQAPNDDSTNVATIRWNGGSTYYTNYGDSVKERFDIRVDQASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGTDIGDGWSGRYDYRGQGTDVTVSSiMab125DDLKLTCRASGRTFSSRTMGWFRQAPNDDSTNVATIRWNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGTDIGDGWSGRYDYRGQGTDVTVSSiMab123NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGRTFSRAAMGWFRQAPNDDSTNVATITWSGRHTRYGDSVKERFDIRRDQASNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAGEGSNTASTSPRPYDYRGQGTDVTVSS
iMab130NVKLVEKGGNFVENDDDLKLTCRASGYAYTYTYMGWFRQAPNDDSTNVATIDSGGGGTLYGDSVKERFDIRRDKGSNTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAAGGYELRDRTYGQRGQGTDVTVSSiMab201VQLQASGGGSVQAGGSLRLSCRASGYTIGPYCMGWFRQAPGDDSEGVAAINMGTVYLLMNSLEPEDTAIYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSWGQGTQVTVSSiMab300VQLQQPGSNLVRPGASVKLSCKASGYTIGPSCIHWAKQRPGDGLEWIGEINMGTAYVDLSSLTSEDSAVYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDYWGQGTTLTVSSiMab302ASVKLSCKASGYYTIGPSCIHWAKQPPGDGLEWIGEINMGTAYVDLSSLTSEDSAVYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDYWGQGTTLTVSSiMab400VQLVESGGGLVQPGGSLRLSCRASGYTIGPYCMNWVRQAPGDGLEWVGWINMGTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDVWGQGTLVTVSSiMab500PNFLCSVLPTHWRCNKTLPIAFKCRASGYTIGPTCVTVMAGNDEDYSNMGARFNDLRFVGRSGRGKS
FTLTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYPQVATYHRAIKITVDGPiMab502SVKFVCKVLPNFWENNKDLPIKFTVRASGYTIGPTCVGVFAQNPEDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKLRFDIRRDNAKVTRTNSLDDVQPEGRGKSFELTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDQVARYHRGIDITVDGPiMab600APVGLKARNADESGHVVLRCRASGYTIGPICYEVDVSAGQDAGSVQRVEINMGRTESVLSNLRGRTRYTFACAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYSEWSEPVSLLTPSiMab700DKSTLAAVPTSIIADGLMASTITCEASGYTIGPACVAFDTTLGNNMGTYSAPLTSTTLGVATVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYAAFSVPSVTVNFTAiMab702AVKSVFKVSTNFIENDGTMDSKLTFRASGYTIGPQCLGFFQQGVPDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKSIFDIRRDNAKDTYTASVDDNQPEDVEITCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDLILRTLQKGIDLFVVPTiMab701MASTITCEASGYTIGPACVAFDTTLGNNMGTYSAPLTSTTLGVATVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYAAFSVPSVTVNFTAiMab800
GRSSFTVSTPDILADGTMSSTLSCRASGYTIGPQCLSFTQNGVPVSISPINMGSYTATVVGNSVGDVTTTCAADSTTYASYYECGHGLSTGGYGYTLILSTLQKKISLFPiMab900LTLTAAVIGDGAPANGKTAITVECTASGYTIGPQCVVITTNNGALPNKITENMGVARIALTNTTDGVTVVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYQRQSVDTHFVKiMab1000HKPVIEKVDGGYLCKASGYTIGPECIELLADGRSYTKNMGEAFFAIDASKVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYHWKAENiMab1001VDGGYLCKASGYTIGPECIELLADGRSYTKNMGEAFFAIDASKVTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYHWKAENiMab1100APVGLKARLADESGHVVLRCRASGYTIGPICYEVDVSAGNDAGSVQRVEILNMGTESVLSNLRGRTRYTFACAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYSAWSEPVSLLTPSiMab1200HGLPMEKRGNFIVGQNCSLTCPASGYTIGPQCVFNCYFNSALAFSTENMGEWTLDMVFSDAGIYTMCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYNPVSLGSFVVDSPiMab1202
IVKLVMEKRGNFENGQDCKLTIRASGYTIGPACDGFFCQFPSDDSFSTEDNMGGGITVNDAMKPQFDIRRDNAKGTWTLSMDFQPEGIYEMQCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDNPVRLGGFDVDVPDViMab1300LQVDIKPSQGEISVGESKFFLCQASGYTIGPCISWFSPNGEKLNMGSSTLTIYNANIDDAGIYKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYQSEATVNVKIFQiMab1302VVKVVIKPSQNFIENGEDKKFTCRASGVTIGPKCIGWFSQNPEDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKERFDIRRDNAKDTSTLSIDDAQPEDAGIYKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSEATVGVDIFVKLMiMab1301ESKFFLCQASGYTIGPCISWFSPNGEKLNMGSSTLTIYNANIDDAGIYKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYQSEATVNVKIFQiMab1400VPRDLEVVAATPTSLLISCDASGYTIGPYCITYGETGGNSPVQEFTVPNMGKSTATISGLKPGVDYTITCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYSKPISINYRTiMab1500IKVYTDRENYGAVGSQVTLHCSASGYTIGPICFTWRYQPEGDRDAISIFHYNMGDGSIVIHNLDYSDNGTFTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYVGKTSQVTLYVFE
iMab1502NVKVVTKRENFGENGSDVKLTCRASGYTIGPICFGWFYQPEGDDSAISIFHNMGGGITDEVDTFKERFDIRRDNAKKTGTISIDDLQPSDNETFTCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDGKTRQVGLDVFVKVPiMab1501SQVTLHCSASGYTIGPICFTWRYQPEGDRDAISIFHYNMGDGSIVIHNLDYSDNGTFTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYVGKTSQVTLYVFEiMab1600SKPQIGSVAPNMGIPGNDVTITCRASGYTIGPTCGTVTFGGVTNMGNRIEVYVPNMAAGLTDVKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYGVSSNLYSYNILSiMab1602AVKPVIGSKAPNFGENGDVKTIDRASGYTIGPTCGGVFFQGPTDDSTNVATINMGGGITYYGDSVKETFDIRRDNAKSTRTESYDDNQPEGLTEVKCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDVSSRLYGYDILVGTQiMab1700KDPEIHLSGPLEAGKPITVKCSASGYTIGPLCIDLLKGDHLMKSQEFNMGSLEVTFTPVIEDIGKVLVCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYVRQAVKELQVDiMab1701KPITVKCSASGYTIGPLCIDLLKGDHLMKSQEFNMGSLEVTFTPVIEDIGKVLVCAADSTIYASYYEC
GHGLSTGGYGYVRQAVKELQVD
表4iMab DNA序列iMab D1001AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401CGiMab D1011 CATA TGGTTAAACT GGTTGAAAAA GGTGGTAACT TCGTTGAAAA CGACGACGAC CTGAAACTGACCTGCCGTGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGTACTGCAT GGGTTGGTTC CGTCAGGCTC CGAACGACGA CTCCACCAACGTTGCTACCA161TCAACATGGG TACCGTTACC CTGTCCATGG ACGACCTGCA GCCGGAAGAC TCCGCTGAAT ACAACTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC GACTCCCACTACCGTGGTCA321GGGTACCGAC GTTACCGTTT CCTCGGCCAG CTCGGCCiMab D1021 CATA TGGACCTGAA ACTGACCTGC CGTGCTTCCG GTTACACCAT CGGTCCGTAC TGCATGGGTTGGTTCCGTCA81GGCTCCGAAC GACGACTCCA CCAACGTTGC TACCATCAAC ATGGGTACCG TTACCCTGTC CATGGACGACCTGCAGCCGG161AAGACTCCGC TGAATACAAC TGCGCTGCTG ACTCCACCAT CTACGCTTCC TACTACGAAT GCGGTCACGGTATCTCCACC241GGTGGTTACG GTTACGACTC CCACTACCGT GGTCAGGGTA CCGACGTTAC CGTTTCCTCG GCCAGCTCGG CCiMab D1111CATATG AATGTGAAAC TGGTTTGTAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTCACGTGCCGTG81CTGAAGGTTA CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAACGTGGCCACG161ATCAACATGG GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACAACGCGTCCAA241CACCGTTACC TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCTACCATTTACG321CGAGCTATTA TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTTGCCAGGGTACCGAC401GTTACCGTCT CGTCGGCCAG CTCGGCCiMab D1121AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CTGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTTG CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401CGTCGiMab D1131AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA
81CACCATTGGC CCGTACTCCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGTCCTGCATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401 CGTCGiMab D1141AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTCCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401CGTCGiMab D1151AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACC AGGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCA GGGTACCGACGTTACCGTCT401CGTCGiMab D1161CATATG AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTCACGTGTCGTG81CTGAAGGTTA CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAACGTGGCCACG161ATCAACATGG GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACAACGCGTCCAA241CACCGTTACC TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATGGTGC AGGTGATTCTACCATTTACG321GGAGCTATTA TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCACT ACCGTGGTCAGGGTACCGAC401GTTACCGTCT CGTCGGCCAG CTCGGCCiMab D1201AATGTGAAAC TGGTTGAAAA AGGTGGCAAT TTCGTCGAAA ACGATGACGA TCTTAAGCTC ACGTGCCGTGCTGAAGGTTA81CACCATTGGC CCGTACTGCA TGGGTTGGTT CCGTCAGGCG CCGAACGACG ACAGTACTAA CGTGGCCACGATCAACATGG161GTGGCGGTAT TACGTACTAC GGTGACTCCG TCAAAGAGCG CTTCGATATC CGTCGCGACA ACGCGTCCAACACCGTTACC241TTATCGATGG ACGATCTGCA ACCGGAAGAC TCTGCAGAAT ACAATTGTGC AGGTGATTCT ACCATTTACGCGAGCTATTA321TGAATGTGGT CATGGCCTGA GTACCGGCGG TTACGGCTAC GATAGCCGTG GTCAGGGTAC CGACGTTACCGTCTCGTCGiMab D1211 CATA TGAACGTTAA ACTGGTTGAA AAAGGTGGTA ACTTCGTTGA AAACGACGAC GACCTGAAACTGACCTGCCG81TGCTTCCGGT CGTTCCTTCT CCTCCTACAT CATGGGTTGG TTCCGTCAGG CTCCGAACGA CGACTCCACCAACGTTGCTA161CCATCTCCGA AACCGGTGGT GACATCGTTT ACACCAACTA CGGTGACTCC GTTAAAGAAC GTTTCGACATCCGTCGTGAC
241ATCGCTTCCA ACACCGTTAC CCTGTCCATG GACGACCTGC AGCCGGAAGA CTCCGCTGAA TACAACTGCGCTGGTTCCGT321TTACGGTTCC GGTTGGGGTC CGGACCGTTA CGACTACCGT GGTCAGGGTA CCGACGTTAC CGTTTCCTCGGCCAGCTCGG401CCiMab D1221 CATA TGAACGTTAA ACTGGTTGAA AAAGGTGGTA ACTTCGTTGA AAACGACGAC GACCTGAAACTGACCTGCCG81TGCTTCCGGT CGTACCTTCT CCTCCCGTAC CATGGGTTGG TTCCGTCAGG CTCCGAACGA CGACTCCACCAACGTTGCTA161CCATCCGTTG GAACGGTGGT TCCACCTACT ACACCAACTA CGGTGACTCC GTTAAAGAAC GTTTCGACATCCGTGTTGAC241CAGGCTTCCA ACACCGTTAC CCTGTCCATG GACGACCTGC AGCCGGAAGA CTCCGCTGAA TACAACTGCGCTGGTACCGA321CATCGGTGAC GGTTGGTCCG GTCGTTACGA CTACCGTGGT CAGGGTACCG ACGTTACCGT TTCCTCGGCCAGCTCGGCCiMab D1231 CATA TGAACGTTAA ACTGGTTGAA AAAGGTGGTA ACTTCGTTGA AAACGACGAC GACCTGAAACTGACCTGCCG81TGCTTCCGGT CGTACCTTCT CCCGTGCTGC TATGGGTTGG TTCCGTCAGG CTCCGAACGA CGACTCCACCAACGTTGCTA161CCATCACCTG GTCCGGTCGT CACACCCGTT ACGGTGACTC CGTTAAAGAA CGTTTCGACA TCCGTCGTGACCAGGCTTCC241AACACCGTTA CCCTGTCCAT GGACGACCTG CAGCCGGAAG ACTCCGCTGA ATACAACTGC GCTGGTGAAGGTTCCAACAC321CGCTTCCACC TCCCCGCGTC CGTACGACTA CCGTGGTCAG GGTACCGACG TTACCGTTTC CTCGGCCAGCTCGGCCiMab D1241 CATA TGGACGACCT GAAACTGACC TGCCGTGCTT CCGGTCGTTC CTTCTCCTCC TACATCATGGGTTGGTTCCG81TCAGGCTCCG AACGACGACT CCACCAACGT TGCTACCATC TCCGAAACCA CCGTTACCCT GTCCATGGACGACCTGCAGC161CGGAAGACTC CGCTGAATAC AACTGCGCTG GTTCCGTTTA CGGTTCCGGT TGGCGTCCGG ACCGTTACGACTACCGTGGT241CAGGGTACCG ACGTTACCGT TTCCTCGGCC AGCTCGGCCiMab D1251 CATA TGGACGACCT GAAACTGACC TGCCGTGCTT CCGGTCGTAC CTTCTCCTCC CGTACCATGGGTTGGTTCCG81TCAGGCTCCG AACGACGACT CCACCAACGT TGCTACCATC CGTTGGAACA CCGTTACCCT GTCCATGGACGACCTGCAGC161CGGAAGACTC CGCTGAATAC AACTGCGCTG GTACCGACAT CGGTGACGGT TGGTCCGGTC GTTACGACTACCGTGGTCAG241GGTACCGACG TTACCGTTTC CTCGGCCAGC TCGGCCiMab D1301 A ATGTGAAACT GGTTGAAAAA GGTGGCAATT TCGTCGAAAA CGATGACGAT CTTAAGCTCACGTGCCGTGC81TAGCGGTTAC GCCTACACGT ATATCTACAT GGGTTGGTTC CGTCAGGCGC CGAACGACGA CAGTACTAACGTGGCCACCA161TCGACTCGGG TGGCGGCGGT ACCCTGTACG GTGACTCCGT CAAAGAGCGC TTCGATATCC GTCGCGACAAAGGCTCCAAC241ACCGTTACCT TATCGATGGA CGATCTGCAA CCGGAAGACT CTGCAGAATA CAATTGTGCA GCGGGTGGCTACGAACTGCG321CGACCGCACC TACGGTCAGC GTGGTCAGGG TACCGACGTT ACCGTCTCGT CGGCCAGCTC GGCCiMab D2011 CATA TGGTTCAGCT GCAGGCTTCC GGTGGTGGTT CCGTTCAGGC TGGTGGTTCC CTGCGTCTGTCCTGCCGTGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGTACTGCAT GGGTTGGTTC CGTCAGGCTC CGGGTGACGA CTCCGAAGGTGTTGCTGCTA161TCAACATGGG TACCGTTTAC CTGCTGATGA ACTCCCTGGA ACCGGAAGAC ACCGCTATCT ACTACTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC GACTCCTGGGGTCAGGGTAC321CCAGGTTACC GTTTCCTCGG CCAGCTCGGC C
iMab D3001 CATA TGGTTCAGCT GCAGCAGCCG GGTTCCAACC TGGTTCGTCC GGGTGCTTCC GTTAAACTGTCCTGCAAAGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGTCCTGCAT CCACTGGGCT AAACAGCGTC CGGGTGACGG TCTGGAATGGATCGGTGAAA161TCAACATGGG TACCGCTTAC GTTGACCTGT CCTCCCTGAC CTCCGAAGAC TCCGCTGTTT ACTACTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC GACTACTGGGGTCAGGGTAC321CACCCTGACC GTTTCCTCGG CCAGCTCGGC CiMab D3021 CATA TGGCTTCCGT TAAACTGTCC TGCAAAGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG TCCTGCATCCACTGGGCTAA81ACAGCGTCCG GGTGACGGTC TGGAATGGAT CGGTGAAATC AACATGGGTA CCGCTTACGT TGACCTGTCCTCCCTGACCT161CCGAAGACTC CGCTGTTTAC TACTGCGCTG CTGACTCCAC CATCTACGCT TCCTACTACG AATGCGGTCACGGTATCTCC241ACCGGTGGTT ACGGTTACGA CTACTGGGGT CAGGGTACCA CCCTGACCGT TTCCTCGGCC AGCTCGGCCiMab D4001 CATA TGGTTCAGCT GGTTGAATCC GGTGGTGGTC TGGTTCAGCC GGGTGGTTCC CTGCGTCTGTCCTGCCGTGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGTACTGCAT GAACTGGGTT CGTCAGGCTC CGGGTGACGG TCTGGAATGGGTTGGTTGGA161TCAACATGGG TACCGCTTAC CTGCAGATGA ACTCCCTGCG TGCTGAAGAC ACCGCTGTTT ACTACTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC GACGTTTGGGGTCAGGGTAC321CCTGGTTACC GTTTCCTCGG CCAGCTCGGC CiMab D5001 CATA TGCCGAACTT CCTGTGCTCC GTTCTGCCGA CCCACTGGCG TTGCAACAAA ACCCTGCCGATCGCTTTCAA81ATGCCGTGCT TCCGGTTACA CCATCGGTCC GACCTGCGTT ACCGTTATGG CTGGTAACGA CGAAGACTACTCCAACATGG161GTGCTCGTTT CAACGACCTG CGTTTCGTTG GTCGTTCCGG TCGTGGTAAA TCCTTCACCC TGACCTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC CCGCAGGTTGCTACCTACCA321CCGTGCTATC AAAATCACCG TTGACGGTCC GGCCAGCTCG GCCiMab D5021 CATA TGTCCGTTAA ATTCGTTTGC AAAGTTCTGC CGAACTTCTG GGAAAACAAC AAAGACCTGCCGATCAAATT81CACCGTTCGT GCTTCCGGTT ACACCATCGG TCCGACCTGC GTTGGTGTTT TCGCTCAGAA CCCGGAAGACGACTCCACCA161ACGTTGCTAC CATCAACATG GGTGGTGGTA TCACCTACTA CGGTGACTCC GTTAAACTGC GTTTCGACATCCGTCGTGAC241AACGCTAAAG TTACCCGTAC CAACTCCCTG GACGACGTTC AGCCGGAAGG TCGTGGTAAA TCCTTCGAACTGACCTGCGC321TGCAGACTCC ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTCTGT CCACCGGTGG TTACGGTTACGACCAGGTTG401CTCGTTACCA CCGTGGTATC GACATCACCG TCTCGTCGGC CAGCTCGGCCiMab D6001 CATA TGGCTCCGGT TGGTCTGAAA GCTCGTAACG CTGACGAATC CGGTCACGTT GTTCTGCGTTGCCGTGCTTC81CGGTTACACC ATCGGTCCGA TCTGCTACGA AGTTGACGTT TCCGCTGGTC AGGACGCTGG TTCCGTTCAGCGTGTTGAAA161TCAACATGGG TCGTACCGAA TCCGTTCTGT CCAACCTGCG TGGTCGTACC CGTTACACCT TCGCTTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC TCCGAATGGTCCGAACCGGT321TTCCCTGCTG ACCCCGTCGG CCAGCTCGGC CiMab D700
1 CATA TGGACAAATC CACCCTGGCT GCTGTTCCGA CCTCCATCAT CGCTGACGGT CTGATGGCTTCCACCATCAC81CTGCGAAGCT TCCGGTTACA CCATCGGTCC GGCTTGCGTT GCTTTCGACA CCACCCTGGG TAACAACATGGGTACCTACT161CCGCTCCGCT GACCTCCACC ACCCTGGGTG TTGCTACCGT TACCTGCGCT GCTGACTCCA CCATCTACGCTTCCTACTAC241GAATGCGGTC ACGGTATCTC CACCGGTGGT TACGGTTACG CTGCTTTCTC CGTTCCGTCC GTTACCGTTAACTTCACCGC321GGCCAGCTCG GCCiMab D7011 CATA TGATGGCTTC CACCATCACC TGCGAAGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG GCTTGCGTTGCTTTCGACAC81CACCCTGGGT AACAACATGG GTACCTACTC CGCTCCGCTG ACCTCCACCA CCCTGGGTGT TGCTACCGTTACCTGCGCTG161CTGACTCCAC CATCTACGCT TCCTACTACG AATGCGGTCA CGGTATCTCC ACCGGTGGTT ACGGTTACGCTGCTTTCTCC241GTTCCGTCCG TTACCGTTAA CTTCACCGCG GCCAGCTCGG CCiMab D7021 CATA TGGCTGTTAA ATCCGTTTTC AAAGTTTCCA CCAACTTCAT CGAAAACGAC GGCACCATGGACTCCAAACT81GACCTTCCGT GCTTCCGGTT ACACCATCGG TCCGCAGTGC CTGGGTTTCT TCCAGCAGGG TGTTCCGGACGACTCCACCA161ACGTTGCTAC CATCAACATG GGTGGTGGTA TCACCTACTA CGGTGACTCC GTTAAATCCA TCTTCGACATCCGTCGTGAC241AACGCTAAAG ACACCTACAC CGCTTCCGTT GACGACAACC AGCCGGAAGA CGTTGAAATC ACCTGCGCTGCAGACTCCAC321CATCTACGCT TCCTACTACG AATGCGGTCA CGGTCTGTCC ACCGGTGGTT ACGGTTACGA CCTGATCCTGCGTACCCTGC401AAAAAGGTAT CGACCTGTTC GTCTCGTCGG CCAGCTCGGC CiMab D8001 CATA TGGGTCGTTC CTCCTTCACC GTTTCCACCC CGGACATCCT GGCTGACGGT ACCATGTCCTCCACCCTGTC81CTGCCGTGCT TCCGGTTACA CCATCGGTCC GCAGTGCCTG TCCTTCACCC AGAACGGTGT TCCGGTTTCCATCTCCCCGA161TCAACATGGG TTCCTACACC GCTACCGTTG TTGGTAACTC CGTTGGTGAC GTTACCATCA CCTGCGCTGCTGACTCCACC241ATCTACGCTT CCTACTACGA ATGCGGTCAC GGTATCTCCA CCGGTGGTTA CGGTTACACC CTGATCCTGTCCACCCTGCA321GAAAAAAATC TCCCTGTTCC CGGCCAGCTC GGCCiMab D9001 CATA TGCTGACCCT GACCGCTGCT GTTATCGGTG ACGGTGCTCC GGCTAACGGT AAAACCGCTATCACCGTTGA81ATGCACCGCT TCCGGTTACA CCATCGGTCC GCAGTGCGTT GTTATCACCA CCAACAACGG TGCTCTGCCGAACAAAATCA161CCGAAAACAT GGGTGTTGCT CGTATCGCTC TGACCAACAC CACCGACGGT GTTACCGTTG TTACCTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC CAGCGTCAGTCCGTTGACAC321CCACTTCGTT AAGGCCAGCT CGGCCiMab D10001 CATA TGCACAAACC GGTTATCGAA AAAGTTGACG GTGGTTACCT GTGCAAAGCT TCCGGTTACACCATCGGTCC81GGAATGCATC GAACTGCTGG CTGACGGTCG TTCCTACACC AAAAACATGG GTGAAGCTTT CTTCGCTATCGACGCTTCCA161AAGTTACCTG CGCTGCTGAC TCCACCATCT ACGCTTCCTA CTACGAATGC GGTCACGGTA TCTCCACCGGTGGTTACGGT241TACCACTGGA AAGCTGAAAA CTCGGCCAGC TCGGCCiMab D10011 CATA TGGTTGACGG TGGTTACCTG TGCAAAGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG GAATGCATCGAACTGCTGGC81TGACGGTCGT TCCTACACCA AAAACATGGG TGAAGCTTTC TTCGCTATCG ACGCTTCCAA AGTTACCTGCGCTGCTGACT
161CCACCATCTA CGCTTCCTAC TACGAATGCG GTCACGGTAT CTCCACCGGT GGTTACGGTT ACCACTGGAAAGCTGAAAAT241TCGGCCAGCT CGGCCiMab D11001 CATA TGGCTCCGGT TGGTCTGAAA GCTCGTCTGG CTGACGAATC CGGTCACGTT GTTCTGCGTTGCCGTGCTTC81CGGTTACACC ATCGGTCCGA TCTGCTACGA AGTTGACGTT TCCGCTGGTA ACGACGCTGG TTCCGTTCAGCGTGTTGAAA161TCCTGAACAT GGGTACCGAA TCCGTTCTGT CCAACCTGCG TGGTCGTACC CGTTACACCT TCGCTTGCGCTGCTGACTCC241ACCATCTACG CTTCCTACTA CGAATGCGGT CACGGTATCT CCACCGGTGG TTACGGTTAC TCCGCTTGGTCCGAACCGGT321TTCCCTGCTG ACCCCGTCGG CCAGCTCGGC CiMab D12001 CATA TGCACGGTCT GCCGATGGAA AAACGTGGTA ACTTCATCGT TGGTCAGAAC TGCTCCCTGACCTGCCCGGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGCAGTGCGT TTTCAACTGC TACTTCAACT CCGCTCTGGC TTTCTCCACCGAAAACATGG161GTGAATGGAC CCTGGACATG GTTTTCTCCG ACGCTGGTAT CTACACCATG TGCGCTGCTG ACTCCACCATCTACGCTTCC241TACTACGAAT GCGGTCACGG TATCTCCACC GGTGGTTACG GTTACAACCC GGTTTCCCTG GGTTCCTTCGTTGTTGACTC321CCCGGCCAGC TCGGCCiMab D12021 CATA TGATCGTTAA ACTGGTTATG GAAAAACGTG GTAACTTCGA AAACGGTCAG GACTGCAAACTGACCATCCG81TGCTTCCGGT TACACCATCG GTCCGGCTTG CGACGGTTTC TTCTGCCAGT TCCCGTCCGA CGACTCCTTCTCCACCGAAG161ACAACATGGG TGGTGGTATC ACCGTTAACG ACGCTATGAA ACCGCAGTTC GACATCCGTC GTGACAACGCTAAAGGCACC241TGGACCCTGT CCATGGACTT CCAGCCGGAA GGTATCTACG AAATGCAGTG CGCTGCAGAC TCCACCATCTACGCTTCCTA321CTACGAATGC GGTCACGGTC TGTCCACCGG TGGTTACGGT TACGACAACC CGGTTCGTCT GGGTGGTTTCGACGTTGACG401TCTCGTCGGC CAGCTCGGCCiMab D13001 CATA TGCTGCAGGT TGACATCAAA CCGTCCCAGG GTGAAATCTC CGTTGGTGAA TCCAAATTCTTCCTGTGCCA81GGCTTCCGGT TACACCATCG GTCCGTGCAT CTCCTGGTTC TCCCCGAACG GTGAAAAACT GAACATGGGTTCCTCCACCC161TGACCATCTA CAACGCTAAC ATCGACGACG CTGGTATCTA CAAATGCGCT GCTGACTCCA CCATCTACGCTTCCTACTAC241GAATGCGGTC ACGGTATCTC CACCGGTGGT TACGGTTACC AGTCCGAAGC TACCGTTAAC GTTAAAATCTTCCAGGCCAG321CTCGGCCiMab D13011 CATA TGGAATCCAA ATTCTTCCTG TGCCAGGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG TGCATCTCCTGGTTCTCCCC81GAACGGTGAA AAACTGAACA TGGGTTCCTC CACCCTGACC ATCTACAACG CTAACATCGA CGACGCTGGTATCTACAAAT161GCGCTGCTGA CTCCACCATC TACGCTTCCT ACTACGAATG CGGTCACGGT ATCTCCACCG GTGGTTACGGTTACCAGTCC241GAAGCTACCG TTAACGTTAA AATCTTCCAG GCCAGCTCGG CCiMab D13021 CATA TGGTTGTTAA AGTTGTTATC AAACCGTCCC AGAACTTCAT CGAAAACGGT GAAGACAAAAAATTCACCTG81CCGTGCTTCC GGTTACACCA TCGGTCCGAA ATGCATCGGT TGGTTCTCCC AGAACCCGGA AGACGACTCCACCAACGTTG161CTACCATCAA CATGGGTGGT GGTATCACCT ACTACGGTGA CTCCGTTAAA GAACGTTTCG ACATCCGTCGTGACAACGCT241AAAGACACCT CCACCCTGTC CATCGACGAC GCTCAGCCGG AAGACGCTGG TATCTACAAA TGCGCTGCAGACTCCACCAT
321CTACGCTTCC TACTACGAAT GCGGTCACGG TCTGTCCACC GGTGGTTACG GTTACGACTC CGAAGCTACCGTTGGTGTTG401ACATCTTCGT CTCGTCGGCC AGCTCGGCCiMab D14001 CATA TGGTTCCGCG TGACCTGGAA GTTGTTGCTG CTACCCCGAC CTCCCTGCTG ATCTCCTGCGACGCTTCCGG81TTACACCATC GGTCCGTACT GCATCACCTA CGGTGAAACC GGTGGTAACT CCCCGGTTCA GGAATTCACCGTTCCGAACA161TGGGTAAATC CACCGCTACC ATCTCCGGTC TGAAACCGGG TGTTGACTAC ACCATCACCT GCGCTGCTGACTCCACCATC241TACGCTTCCT ACTACGAATG CGGTCACGGT ATCTCCACCG GTGGTTACGG TTACTCCAAA CCGATCTCCATCAACTACCG321TACGGCCAGC TCGGCCiMab D15001 CATA TGATCAAAGT TTACACCGAC CGTGAAAACT ACGGTGCTGT TGGTTCCCAG GTTACCCTGCACTGCTCCGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGATCTGCTT CACCTGGCGT TACCAGCCGG AAGGTGACCG TGACGCTATCTCCATCTTCC161ACTACAACAT GGGTGACGGT TCCATCGTTA TCCACAACCT GGACTACTCC GACAACGGTA CCTTCACCTGCGCTGCTGAC241TCCACCATCT ACGCTTCCTA CTACGAATGC GGTCACGGTA TCTCCACCGG TGGTTACGGT TACGTTGGTAAAACCTCCCA321GGTTACCCTG TACGTTTTCG AGGCCAGCTC GGCCiMab D15011 CATA TGTCCCAGGT TACCCTGCAC TGCTCCGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG ATCTGCTTCACCTGGCGTTA81CCAGCCGGAA GGTGACCGTG ACGCTATCTC CATCTTCCAC TACAACATGG GTGACGGTTC CATCGTTATCCACAACCTGG161ACTACTCCGA CAACGGTACC TTCACCTGCG CTGCTGACTC CACCATCTAC GCTTCCTACT ACGAATGCGGTCACGGTATC241TCCACCGGTG GTTACGGTTA CGTTGGTAAA ACCTCCCAGG TTACCCTGTA CGTTTTCGAG GCCAGCTCGG CCiMab D15021 CATA TGAACGTTAA AGTGGTTACC AAACGTGAAA ACTTCGGTGA AAACGGTTCC GACGTTAAACTGACCTGCCG81TGCTTCCGGT TACACCATCG GTCCGATCTG CTTCGGTTGG TTCTACCAGC CGGAAGGTGA CGACTCCGCTATCTCCATCT161TCCACAACAT GGGTGGTGGT ATCACCGACG AAGTTGACAC CTTCAAAGAA CGTTTCGACA TCCGTCGTGACAACGCTAAA241AAAACCGGCA CCATCTCCAT CGACGACCTG CAACCGTCCG ACAACGAAAC CTTCACCTGC GCTGCAGACTCCACCATCTA321CGCTTCCTAC TACGAATGCG GTCACGGTCT GTCCACCGGT GGTTACGGTT ACGACGGTAA AACCCGTCAGGTTGGTCTGG401ACGTTTTCGT CTCGTCGGCC AGCTCGGCCiMab D16001 CATA TGATCAAAGT TTACACCGAC CGTGAAAACT ACGGTGCTGT TGGTTCCCAG GTTACCCTGCACTGCTCCGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGATCTGCTT CACCTGGCGT TACCAGCCGG AAGGTGACCG TGACGCTATCTCCATCTTCC161ACTACAACAT GGGTGACGGT TCCATCGTTA TCCACAACCT GGACTACTCC GACAACGGTA CCTTCACCTGCGCTGCTGAC241TCCACCATCT ACGCTTCCTA CTACGAATGC GGTCACGGTA TCTCCACCGG TGGTTACGGT TACGTTGGTAAAACCTCCCA321GGTTACCCTG TACGTTTTCG AGGCCAGCTC GGCCiMab D16021CATATGGCTG TTAAACCGGT TATCGGTTCC AAAGCTCCGA ACTTCGGTGA AAACGGTGAC GTTAAAACCATCGACCGTGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGACCTGCGG TGGTGTTTTC TTCCAGGGTC CGACCGACGA CTCCACCAACGTTGCTACCA161TCAACATGGG TGGTGGTATC ACCTACTACG GTGACTCCGT TAAAGAAACC TTCGACATCC GTCGTGACAACGCTAAATCC241ACCCGTACCG AATCCTACGA CGACAACCAG CCGGAAGGTC TGACCGAAGT TAAATGCGCT GCAGACTCCACCATCTACGC
321TTCCTACTAC GAATGCGGTC ACGGTCTGTC CACCGGTGGT TACGGTTACG ACGTTTCCTC CCGTCTGTACGGTTACGACA401TCCTGGTCTC GTCGGCCAGC TCGGCCiMab D17001 CATA TGAAAGACCC GGAAATCCAC CTGTCCGGTC CGCTGGAAGC TGGTAAACCG ATCACCGTTAAATGCTCCGC81TTCCGGTTAC ACCATCGGTC CGCTGTGCAT CGACCTGCTG AAAGGTGACC ACCTGATGAA ATCCCAGGAATTCAACATGG161GTTCCCTGGA AGTTACCTTC ACCCCGGTTA TCGAAGACAT CGGTAAAGTT CTGGTTTGCG CTGCTGACTCCACCATCTAC241GCTTCCTACT ACGAATGCGG TCACGGTATC TCCACCGGTG GTTACGGTTA CGTTCGTCAG GCTGTTAAAGAACTGCAGGT321TGACTCGGCC AGCTCGGCCiMab D17011 CATA TGAAACCGAT CACCGTTAAA TGCTCCGCTT CCGGTTACAC CATCGGTCCG CTGTGCATCGACCTGCTGAA81AGGTGACCAC CTGATGAAAT CCCAGGAATT CAACATGGGT TCCCTGGAAG TTACCTTCAC CCCGGTTATCGAAGACATCG161GTAAAGTTCT GGTTTGCGCT GCTGACTCCA CCATCTACGC TTCCTACTAC GAATGCGGTC ACGGTATCTCCACCGGTGGT241TACGGTTACG TTCGTCAGGC TGTTAAAGAA CTGCAGGTTG ACTCGGCCAG CTCGGCC
表5
表6吸收(450nm)ELK 溶菌酶(100每孔應(yīng)用的iMabNo.ofβ-純化方法 μg/ml)折疊 iMab量(in100μl) (對照)13029 尿素 ～50ng0.045 0.34516029 尿素 ～50ng0.043 0.35712029 尿素 ～50ng0.041 0.317116 9 尿素 ～50ng0.042 0.238101 7 尿素 ～20ng0.043 0.142111 9 尿素 ～50ng0.043 0.420701 6 尿素 ～10ng0.069 0.094122 9 尿素 ～50ng0.051 0.27113007 尿素 ～50ng0.041 0.32512007 尿素 ～5ng 0.040 0.061900 7 尿素 ～10ng0.043 0.087100 9 尿素 ～50ng0.040 0.494100 9 加熱(60℃)～50ng0.041 0.369表X.純化的iMab變體對溶菌酶的結(jié)合性質(zhì)。
分析多種含有6-，7-，或9β-折疊的純化的iMab對ELK(對照)和溶菌酶的結(jié)合，如實施例8，15，19和23所述。所有iMab使用尿素及隨后用有助于再折疊的基質(zhì)進行純化(實施例7)，除了iMab100，其還通過熱誘導(dǎo)包涵體溶解進行純化(實施例6)。
表7
表81NEUATOM 1CA GLY2 -33.839 -10.967 -0.688 1.00 25.06 CATOM 2CA GLY3 -31.347-8.590 -2.388 1.00 20.77 CATOM 3CA GLY4 -29.325-6.068 -0.288 1.00 19.01 CATOM 4CA GLY5 -27.767-2.669 -1.162 1.00 19.75 CATOM 5CA GLY6 -27.1090.4871.010 1.00 22.33 CATOM 6CA GLY7 -29.8343.2040.812 1.00 24.80 CATOM 7CA GLY8 -27.5426.1610.057 1.00 28.23 CATOM 8CA GLY9 -23.7906.593-0.286 1.00 26.37 CATOM 9CA GLY10 -21.7509.765-0.074 1.00 29.08 CATOM 10 CA GLY11 -18.50510.289 -1.920 1.00 26.48 CATOM 11 CA GLY12 -15.85912.991 -2.286 1.00 27.26 CATOM 12 CA GLY13 -14.78214.286 -5.685 1.00 26.73 CATOM 13 CA GLY15 -12.2219.666-4.538 1.00 23.37 CATOM 14 CA GLY16 -13.8626.196-4.876 1.00 22.86 CATOM 15 CA GLY17 -16.9484.527-3.422 1.00 20.21 CATOM 16 CA GLY18 -18.0420.875-3.195 1.00 19.23 CATOM 17 CA GLY19 -21.543-0.132 -4.244 1.00 17.13 CATOM 18 CA GLY20 -22.550-3.266 -2.294 1.00 19.06 CATOM 19 CA GLY21 -24.854-5.946 -3.635 1.00 15.28 CATOM 20 CA GLY22 -25.493-9.401 -2.203 1.00 15.88 CATOM 21 CA GLY23 -28.333-11.882 -1.980 1.00 18.12 CATOM 22 CA GLY24 -29.458-14.458 0.564 1.00 18.67 CATOM 23 CA GLY25 -31.806-17.445 0.594 1.00 20.29 CATOM 24 CA GLY33 -26.348-16.618 -10.937 1.00 24.64 CATOM 25 CA GLY34 -26.032-13.298 -12.772 1.00 21.24 CATOM 26 CA GLY35 -25.552-9.691 -11.546 1.00 17.90 CATOM 27 CA GLY36 -26.440-6.639 -13.630 1.00 16.78 CATOM 29 CA GLY37 -25.790-3.001 -12.553 1.00 15.77 CATOM 29 CA GLY38 -27.841-0.127 -14.139 1.00 16.15 CATOM 30 CA GLY39 -27.4213.671-13.662 1.00 17.11 CATOM 31 CA GLY40 -30.0236.514-13.788 1.00 19.95 CATOM 32 CA GLY69 -13.9753.798-13.786 1.00 19.37 CATOM 33 CA GLY70 -15.5170.412-12.834 1.00 17.40 CATOM 34 CA GLY71 -13.840-2.419 -10.867 1.00 17.48 CATOM 35 CA GLY72 -15.422-5.847 -10.205 1.00 17.29 CATOM 36 CA GLY73 -14.951-6.863 -6.568 1.00 17.82 CATOM 37 CA GLY74 -17.604-9.507 -6.001 1.00 20.26 CATOM 38 CA GLY81 -21.892-8.819 -6.747 1.00 15.95 CATOM 39 CA GLY82 -20.250-5.588 -5.572 1.00 14.51 CATOM 40 CA GLY83 -18.342-3.035 -7.740 1.00 14.59 CATOM 41 CA GLY84 -16.2540.065-7.050 1.00 15.51 CATOM 42 CA GLY85 -16.8473.424-8.859 1.00 16.32 CATOM 43 CA GLY86 -13.4905.206-9.235 1.00 17.40 CATOM 44 CA GLY87 -12.3928.860-9.565 1.00 20.53 CATOM 45 CA GLY89 -17.02213.543 -10.254 1.00 33.26 CATOM 46 CA GLY90 -19.76316.019 -9.293 1.00 33.41 CATOM 47 CA GLY91 -21.94614.910 -12.147 1.00 28.24 CATOM 48 CA GLY92 -22.00111.307 -11.004 1.00 23.61 CATOM 49 CA GLY93 -25.08411.842 -8.710 1.00 22.12 CATOM 50 CA GLY94 -27.7979.318-9.433 1.00 18.21 CATOM 51 CA GLY95 -29.4086.033-8.549 1.00 18.57 CATOM 52 CA GLY96 -27.7532.594-9.167 1.00 17.72 CATOM 53 CA GLY97 -29.778-0.614 -9.279 1.00 18.72 CATOM 54 CA GLY98 -28.513-4.176 -8.741 1.00 18.53 CATOM 55 CA GLY99 -30.558-6.911 -10.517 1.00 18.45 CATOM 56 CA GLY100-29.969-10.529 -9.427 1.00 17.71 CATOM 57 CA GLY108-34.816-10.904 -11.290 1.00 32.51 CATOM 58 CA GLY109-34.993-9.224 -7.900 1.00 28.62 CATOM 59 CA GLY110-33.628-5.668 -7.622 1.00 23.31 CATOM 60 CA GLY111-32.406-3.176 -5.020 1.00 19.82 CATOM 61 CA GLY112-31.1400.403-5.467 1.00 19.75 CATOM 62 CA GLY113-28.6972.839-3.811 1.00 18.42 CATOM 63 CA GLY114-28.4616.627-4.417 1.00 18.70 CATOM 64 CA GLY115-25.1108.413-4.799 1.00 19.95 CATOM 65 CA GLY116-24.28612.022 -3.753 1.00 25.78 CATOM 66 CA GLY117-20.81613.493 -4.292 1.00 31.06 CATOM 67 CA GLY118-19.61616.565 -2.380 1.00 38.60 CATOM 68 CA GLY119-16.26718.356 -1.757 1.00 42.50 C
TER1MELATOM 69 CA GLY A3 -34.517 -10.371 -1.234 1.0036.96CATOM 70 CA GLY A4 -31.790 -8.022-2.500 1.0028.80CATOM 71 CA GLY A5 -30.310 -5.6030.0181.0031.G4CATOM 72 CA GLY A6 -27.884 -2.957-1.209 1.0024.68CATOM 73 CA GLY A7 -25.500 -1.0421.0731.0021.60CATOM 74 CA GLY A8 -23.005 1.710 0.4581.0017.27CATOM 75 CA GLY A9 -23.567 4.843 -1.499 1.0018.58CATOM 76 CA GLY A10 -23.648 8.381 -0.100 1.0016.78CATOM 77 CA GLY A11 -21.736 11.497-1.127 1.0011.36CATOM 78 CA GLY A12 -18.140 11.942-1.980 1.008.84 CATOM 79 CA GLY A13 -16.006 14.459-3.746 1.0011.16CATOM 80 CA GLY A14 -15.243 14.091-7.418 1.0010.62CATOM 81 CA GLY A16 -12.920 9.782 -4.554 1.007.90 CATOM 82 CA GLY A17 -14.217 6.244 -4.387 1.007.54 CATOM 83 CA GLY A18 -17.233 4.430 -2.940 1.006.47 CATOM 84 CA GLY A19 -18.104 0.790 -2.418 1.005.43 CATOM 85 CA GLY A20 -21.615 -0.610-2.878 1.008.09 CATOM 86 CA GLY A21 -22.724 -4.116-1.837 1.008.76 CATOM 87 CA GLY A22 -25.644 -6.399-2.433 1.008.33 CATOM 88 CA GLY A23 -26.642 -9.585-0.745 1.0013.77CATOM 89 CA GLY A24 -29.318 -11.732 -2.396 1.0017.53CATOM 90 CA GLY A25 -31.340 -13.525 0.2561.0023.23CATOM 91 CA GLY A26 -33.969 -16.194 0.0811.0025.25CATOM 92 CA GLY A32 -27.171 -16.809 -12.135 1.005.00 CATOM 93 CA GLY A33 -26.411 -13.068 -12.502 1.004.64 CATOM 94 CA GLY A34 -26.109 -10.036 -10.166 1.002.48 CATOM 95 CA GLY A35 -25.386 -6.603-11.615 1.002.00 CATOM 96 CA GLY A36 -25.845 -2.895-11.151 1.003.40 CATOM 97 CA GLY A37 -28.032 -0.410-12.986 1.006.64 CATOM 98 CA GLY A38 -28.158 3.311 -12.472 1.008.74 CATOM 99 CA GLY A39 -30.731 6.025 -13.179 1.0019.24CATOM 100 CA GLY A67 -12.972 2.698 -13.036 1.0012.68CATOM 101 CA GLY A68 -15.482 0.261 -11.584 1.008.15 CATOM 102 CA GLY A69 -14.843 -3.306-10.511 1.008.39 CATOM 103 CA GLY A70 -17.520 -5.831-9.556 1.005.47 CATOM 104 CA GLY A71 -16.742 -8.900-7.482 1.008.48 CATOM 105 CA GLY A72 -18.459 -11.484 -5.287 1.0018.00CATOM 106 CA GLY A79 -21.342 -8.788-4.615 1.009.55 CATOM 107 CA GLY A80 -19.553 -5.399-4.519 1.004.94 CATOM 108 CA GLY A81 -18.901 -2.601-6.858 1.004.92 CATOM 109 CA GLY A82 -15.755 -0.638-6.085 1.007.44 CATOM 110 CA GLY A83 -16.081 2.748 -7.765 1.006.55 CATOM 111 CA GLY A84 -12.869 4.759 -8.177 1.009.49 CATOM 112 CA GLY A85 -12.245 8.019 -10.028 1.0012.54CATOM 113 CA GLY A87 -16.853 12.035-11.452 1.0015.46CATOM 114 CA GLY A88 -20.054 14.055-10.955 1.0013.94CATOM 115 CA GLY A89 -21.497 12.384-14.095 1.0018.68CATOM 116 CA GLY A90 -21.637 9.217 -11.955 1.009.55 CATOM 117 CA GLY A91 -24.288 10.888-9.734 1.006.54 CATOM 118 CA GLY A92 -27.349 8.637 -9.936 1.006.38 CATOM 119 CA GLY A93 -29.573 6.105 -8.204 1.006.33 CATOM 120 CA GLY A94 -27.866 2.727 -8.154 1.006.08 CATOM 121 CA GLY A95 -29.928 -0.377-8.312 1.0010.12CATOM 122 CA GLY A96 -28.884 -3.923-7.638 1.0010.76CATOM 123 CA GLY A97 -30.439 -6.641-9.794 1.009.08 CATOM 124 CA GLY A98 -30.321 -10.442 -10.097 1.008.28 CATOM 125 CA GLY A122-35.231 -9.331-9.016 1.0015.49CATOM 126 CA GLY A123-34.520 -5.802-8.079 1.0012.37CATOM 127 CA GLY A124-33.455 -4.050-4.953 1.0014.34CATOM 128 CA GLY A125-33.918 -0.696-3.317 1.0022.49CATOM 129 CA GLY A126-32.054 2.128 -5.022 1.0017.72CATOM 130 CA GLY A127-29.137 3.817 -3.342 1.0016.51CATOM 131 CA GLY A128-29.275 7.401 -4.265 1.0016.84CATOM 132 CA GLY A129-24.678 8.216 -4.904 1.0011.90CATOM 133 CA GLY A130-23.878 11.873-5.299 1.008.75 CATOM 134 CA GLY A131-20.508 13.061-6.466 1.0014.37CATOM 135 CA GLY A132-19.632 16.597-5.198 1.0023.32CATOM 136 CA GLY A133-17.732 19.533-6.720 1.0036.14C
TER1F97ATOM 137 CA GLY A 29-33.679-11.517 -0.808 1.00 41.25 CATOM 138 CA GLY A 30-31.468-8.740-2.170 1.00 22.43 CATOM 139 CA GLY A 31-30.250-5.8860.038 1.00 24.73 CATOM 140 CA GLY A 32-27.706-3.1050.530 1.00 20.95 CATOM 141 CA GLY A 33-25.811-1.7233.523 1.00 28.77 CATOM 142 CA GLY A 34-26.3491.878 2.419 1.00 33.48 CATOM 143 CA GLY A 35-29.0273.067 -0.012 1.00 27.47 CATOM 144 CA GLY A 36-27.9806.732 0.249 1.00 29.20 CATOM 145 CA GLY A 37-24.2796.955 -0.586 1.00 23.99 CATOM 146 CA GLY A 38-22.27510.179-0.393 1.00 24.19 CATOM 147 CA GLY A 39-18.59210.286-1.302 1.00 15.35 CATOM 148 CA GLY A 40-16.11713.059-2.218 1.00 12.64 CATOM 149 CA GLY A 41-15.28613.515-5.906 1.00 9.24 CATOM 150 CA GLY A 43-12.4128.992 -4.540 1.00 14.44 CATOM 151 CA GLY A 44-13.1155.267 -4.685 1.00 21.52 CATOM 152 CA GLY A 45-16.4603.862 -3.630 1.00 22.48 CATOM 153 CA GLY A 46-18.0820.444 -3.532 1.00 21.22 CATOM 154 CA GLY A 47-21.8170.219 -4.135 1.00 20.06 CATOM 155 CA GLY A 48-22.797-2.825-2.072 1.00 13.56 CATOM 156 CA GLY A 49-25.390-5.432-3.034 1.00 19.14 CATOM 157 CA GLY A 50-25.724-8.537-0.876 1.00 22.49 CATOM 158 CA GLY A 51-28.046-11.470 -1.549 1.00 20.58 CATOM 159 CA GLY A 52-28.951-14.871 -0.105 1.00 24.55 CATOM 160 CA GLY A 53-30.893-17.875 -1.353 1.00 17.82 CATOM 161 CA GLY A 57-26.875-15.797 -9.701 1.O0 10.39 CATOM 162 CA GLY A 58-26.674-13.408 -12.632 1.00 8.00 CATOM 163 CA GLY A 59-25.845-9.939-11.318 1.00 7.62 CATOM 164 CA GLY A 60-26.653-6.841-13.371 1.00 6.84 CATOM 165 CA GLY A 61-26.457-3.109-12.711 1.00 8.48 CATOM 166 CA GLY A 62-28.184-0.168-14.336 1.0O 13.92 CATOM 167 CA GLY A 63-27.6113.567 -14.043 1.00 11.89 CATOM 168 CA GLY A 64-30.5325.981 -14.200 1.00 23.18 CATOM 169 CA GLY A 85-12.8882.268 -13.813 1.00 17.93 CATOM 170 CA GLY A 86-15.508-0.149-12.447 1.00 15.44 CATOM 171 CA GLY A 87-14.603-3.542-11.016 1.00 16.79 CATOM 172 CA GLY A 88-17.118-6.318-10.381 1.00 14.07 CATOM 173 CA GLY A 89-17.389-8.592-7.349 1.00 16.75 CATOM 174 CA GLY A 91-20.798-8.262-3.202 1.00 17.13 CATOM 175 CA GLY A 92-20.995-5.059-5.247 1.00 12.84 CATOM 176 CA GLY A 93-19.287-2.826-7.795 1.00 12.33 CATOM 177 CA GLY A 94-16.243-0.709-6.986 1.00 12.43 CATOM 178 CA GLY A 95-15.4852.596 -8.696 1.00 11.12 CATOM 179 CA GLY A 96-11.7653.339 -8.675 1.00 16.95 CATOM 180 CA GLY A 97-12.8557.004 -8.899 1.00 21.11 CATOM 181 CA GLY A 99-16.93512.349-10.689 1.00 22.37 CATOM 182 CA GLY A 100 -19.97414.613-10.361 1.00 23.75 CATOM 183 CA GLY A 101 -21.19013.009-13.619 1.00 22.84 CATOM 184 CA GLY A 102 -21.8209.789 -11.695 1.00 15.51 CATOM 185 CA GLY A 103 -24.65111.224-9.565 1.00 11.57 CATOM 186 CA GLY A 104 -27.8179.170 -9.882 1.00 9.52 CATOM 187 CA GLY A 105 -29.4015.897 -8.871 1.00 12.64 CATOM 188 CA GLY A 106 -27.8512.484 -9.413 1.00 7.32 CATOM 189 CA GLY A 107 -30.057-0.590-9.334 1.00 7.52 CATOM 190 CA GLY A 108 -28.588-3.984-8.524 1.00 9.97 CATOM 191 CA GLY A 109 -30.576-6.743-10.211 1.00 12.91 CATOM 192 CA GLY A 110 -29.973-10.300 -9.043 1.00 11.27 CATOM 193 CA GLY A 118 -35.528-12.495 -8.616 1.00 13.29 CATOM 194 CA GLY A 119 -34.748-9.395-6.594 1.00 15.55 CATOM 195 CA GLY A 120 -33.436-5.837-6.855 1.00 11.36 CATOM 196 CA GLY A 121 -32.267-2.894-4.778 1.00 11.36 CATOM 197 CA GLY A 122 -31.6350.758 -5.660 1.00 11.14 CATOM 198 CA GLY A 123 -28.7912.935 -4.379 1.00 11.58 CATOM 199 CA GLY A 124 -28.6266.699 -4.773 1.00 15.52 CATOM 200 CA GLY A 125 -25.1288.065 -5.281 1.00 9.61 CATOM 201 CA GLY A 126 -24.27511.677-4.483 1.00 10.84 CATOM 202 CA GLY A 127 -20.73912.778-5.330 1.00 10.58 CATOM 203 CA GLY A 128 -19.66715.540-2.929 1.00 14.41 CATOM 204 CA GLY A 129 -18.35518.818-4.335 1.00 12.32 C
TER1DQTATOM 205 CA GLY C 2 -37.000-7.803 -3.232 1.00 35.96 CATOM 206 CA GLY C 3 -33.582-6.481 -4.122 1.00 30.20 CATOM 207 CA GLY C 4 -31.887-3.962 -1.908 1.00 27.24 CATOM 208 CA GLY C 5 -28.640-2.044 -1.950 1.00 23.16 CATOM 209 CA GLY C 6 -27.0690.7200.216 1.00 22.73 CATOM 210 CA GLY C 7 -28.2564.289-0.273 1.00 24.33 CATOM 211 CA GLY C 8 -24.8005.874-0.329 1.00 21.64 CATOM 212 CA GLY C 9 -21.2524.822-1.130 1.00 20.25 CATOM 213 CA GLY C 10 -18.1867.087-0.970 1.00 20.37 CATOM 214 CA GLY C 11 -15.8555.961-3.761 1.00 22.46 CATOM 215 CA GLY C 12 -12.1595.548-2.990 1.00 24.30 CATOM 216 CA GLY C 14 -8.661 5.520-6.931 1.00 30.82 CATOM 217 CA GLY C 15 -12.2185.495-8.241 1.00 25.29 CATOM 218 CA GLY C 16 -13.3422.240-6.604 1.00 21.63 CATOM 219 CA GLY C 17 -16.8531.719-5.287 1.00 20.22 CATOM 220 CA GLY C 18 -17.869-1.533 -3.647 1.00 20.86 CATOM 221 CA GLY C 19 -21.187-2.475 -2.147 1.00 21.25 CATOM 222 CA GLY C 20 -23.544-5.395 -1.581 1.00 21.73 CATOM 223 CA GLY C 21 -26.665-6.116 -3.611 1.00 22.97 CATOM 224 CA GLY C 22 -29.032-8.318 -1.684 1.00 26.59 CATOM 225 CA GLY C 23 -32.087-10.258 -2.722 1.00 26.47 CATOM 226 CA GLY C 24 -34.892-12.390 -1.373 1.00 31.54 CATOM 227 CA GLY C 25 -36.216-14.994 -1.386 1.00 31.33 CATOM 228 CA GLY C 32 -28.221-15.396 -10.763 1.00 21.25 CATOM 229 CA GLY C 33 -27.582-12.861 -13.499 1.00 21.86 CATOM 230 CA GLY C 34 -26.676-9.507 -11.974 1.00 19.78 CATOM 231 CA GLY C 35 -26.814-6.238 -13.884 1.00 19.11 CATOM 232 CA GLY C 36 -25.505-2.810 -12.890 1.00 19.23 CATOM 233 CA GLY C 37 -27.3710.131-14.384 1.00 25.95 CATOM 234 CA GLY C 38 -26.5923.830-14.106 1.00 30.90 CATOM 235 CA GLY C 39 -29.7615.879-13.906 1.00 40.84 CATOM 236 CA GLY C 66 -16.463-4.323 -12.728 1.00 23.17 CATOM 237 CA GLY C 67 -15.869-7.277 -10.506 1.00 22.56 CATOM 238 CA GLY C 68 -17.716-9.180 -7.811 1.00 21.60 CATOM 239 CA GLY C 69 -18.545-12.367 -5.959 1.00 22.69 CATOM 240 CA GLY C 75 -23.757-10.273 -4.597 1.00 23.03 CATOM 241 CA GLY C 76 -20.713-8.179 -3.648 1.00 24.30 CATOM 242 CA GLY C 77 -20.192-5.631 -6.425 1.00 23.46 CATOM 243 CA GLY C 78 -17.130-3.554 -7.209 1.00 25.74 CATOM 244 CA GLY C 79 -17.159-0.822 -9.864 1.00 26.08 CATOM 245 CA GLY C 80 -13.7220.567-10.770 1.00 29.15 CATOM 246 CA GLY C 81 -12.1543.299-12.879 1.00 26.23 CATOM 247 CA GLY C 77 -15.85712.510 -10.546 1.00 24.79 CATOM 248 CA GLY C 85 -18.20012.785 -13.517 1.00 25.37 CATOM 249 CA GLY C 86 -19.3829.218-12.817 1.00 25.21 CATOM 250 CA GLY C 87 -20.99310.374 -9.582 1.00 23.95 CATOM 251 CA GLY C 88 -24.5889.210-9.761 1.00 23.67 CATOM 252 CA GLY C 89 -27.2276.570-9.098 1.00 22.75 CATOM 253 CA GLY C 90 -26.4362.913-9.751 1.00 23.39 CATOM 254 CA GLY C 91 -29.1500.276-9.841 1.00 22.55 CATOM 255 CA GLY C 92 -28.491-3.332 -9.011 1.00 22.29 CATOM 256 CA GLY C 93 -30.706-5.811 -10.865 1.00 20.45 CATOM 257 CA GLY C 94 -30.958-9.487 -9.970 1.00 20.73 CATOM 258 CA GLY C 105-35.975-7.679 -9.086 1.00 24.94 CATOM 259 CA GLY C 106-34.133-4.376 -8.832 1.00 25.24 CATOM 260 CA GLY C 107-32.992-2.157 -5.970 1.00 24.05 CATOM 261 CA GLY C 108-33.7171.590-5.665 1.00 25.85 CATOM 262 CA GLY C 109-30.1272.411-6.479 1.00 23.77 CATOM 263 CA GLY C 110-26.9423.329-4.666 1.00 22.46 CATOM 264 CA GLY C 111-25.7596.950-4.824 1.00 24.13 CATOM 265 CA GLY C 112-22.0656.752-5.605 1.00 22.83 CATOM 266 CA GLY C 113-20.1369.957-4.898 1.00 23.40 CATOM 267 CA GLY C 114-16.79910.239 -6.594 1.00 25.42 CEND
表9分子zp-comb目標(biāo)功能(越低越好) (越低越好)iMab 101 -5.63 853iMab 201 -5.34 683iMab IS003 -4.29 860iMab IS004 -1.49 2744iMab 300 -6.28 854iMab IS006 -3.29 912iMab IS007 -2.71 1558iMab IS008 -1.10 808iMab IS009 -3.70 1623iMab IS0010-2.85 2704iMab 400 -5.58 734iMab IS0012-5.35 889iMab IS0013-2.85 1162iMab IS0014-2.92 924iMab IS0015-3.48 925iMab IS0016-3.23 837iMab 500 -3.94 1356iMab IS0018-2.97 867iMab IS0019-3.11 1366iMab 600 -4.15 880iMab 700 -3.94 1111iMab 800 -3.68 653iMab 900 -4.65 833iMab 1000 -3.57 631iMab IS0025-2.79 1080iMab 1100 -4.07 823iMab IS0027-3.59 809iMab IS0028-3.51 1431iMab 1200 -2.66 783iMab 1300 -3.18 1463iMab IS0031-2.98 1263iMab IS0032-3.84 896iMab 1400 -5.17 939iMab IS0034-4.38 966iMab IS0035-3.86 966iMab IS0036-3.29 862iMab IS0037-3.45 874iMab IS0038-2.80 792iMab IS0039-4.44 1858iMab IS0040-S.01 751iMab IS0041-2.70 907iMab IS0042-3.14 837iMab IS0043-2.80 1425iMab IS0044-3.27 1492iMab IS0045-3.56 1794iMab IS0046-3.79 832
表10IMABIS003IVLTQS-P--ASLAV-S-----LGQRATISCRASGYTIGPS-FMNWFQQKP------G--Q-PP-K-LLIYANMGDFSLNI-H-P-M-EE---EDTA---MYFCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYLTFGAGTKVELKRIMABIS004PTVSIF-P--P-SSE-QL----TSGGASVVCFASGYTIGPI-NVKWKIDGS------E----------------NMGSSTLTL-T--K--D-E---YERHN---SYTCAADSTTYASYYECGHGISTGGYGYPIVKSFNRNE---IMABIS006TPPSVY-P--L-APG-SAAQTNSMVTLGCLVKASGYTIGPE-PVTVTWNSG------S--L--SS-G--VHTFPNMGTLSSSV-T--V--P-SSTWPSETN---TCNCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-STKVDKKIVPK-IMABIS007LASPAKTH--E-KTP-I-----EGRPFQLDCVASGYTIGP--LITWKKRLSGADPN------------------NMG-GNLYF-T--I--V-TK---EDVSDIYKYVCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYEVVLVEYEIKGVTIMABIS008PVLKDQPA--E-VLF-R-----ENNPTVLECLASGYTIGPV-KYSWKKDGKSYNW-----Q--EH-N--AALRKNMGEGSLVF-L--R--P-QA---SDEG---HYQCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYVASSRVISFRKTYIMABIS009KYEQKPEK--V-IVV-K-----QGQDVTIPCKASGYTIGPP-NVVWSHNAKP----------------------NMGDSGLVI-K--G--V-KN---GDKG---YYGCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-DKYFETLVQVN-IMABIS010VPQYVS-K--D-MMA-K-----AGDVTMIYCMASGYTIGPG-YPNYFKNGKDVN--------------------NMGGKRLLF-K--T--T-LP---EDEG---VYTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-PQKHSLKTTVVSIMABIS012IQMTQS-P-SS-LSA-S-----VGDRVTITCSASGYTIGPN-YLNWYQQKP------G--K--AP-K--VLIYFNMGDFTLTI-S--S--L-QP---EDFA---TYYCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYWTFGQGTKVEIKRIMABIS013PSVFIF-P--P-SDE-Q----LKSGTASVVCLASGYTIGPA-KVQWLVD---------------N-A--LQS--NMGSSTLTL-S--K--A-DY---EKHK---VYACAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYPVTKSFNRGEC--IMABIS014KGPSVF-P--L-APS-SKSTSGGTAALGCLVKASGYTIGPE-PVTVSWNSG------A--L--TS-G--VHTFPNMGSLSSVV-T--V--P-SSSLGTQTY---ICNCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-NTKVDKKVEPKSIMABIS015NPPHNL-S--V-INSEE-----LSSILKLTWTASGYTIGPL-KYNIQYRTKD-----A--S--TW-S--QIPP-NMGRSSFTV-Q--D--L-KP---FTEY---VFRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSDWSEEASGITYEIMABIS016EKPKNL-S--C-IV--N-----EGKKMRCEWDASGYTIGPT-NFTLKSEWA------T--H--K--F--ADCKANMGPTSCTVDY--S--T-VY---FVNI---EVWCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYKVTSDHINFDPVYIMABIS018NAPKLT-G-IT-CQA-D--------KAEIHWEASGYTIGPL-HYTIQFNTS------F--TPASW-D--AAYEKNMGDSSFVV-Q--M--S--P---WANY---TFRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSPPSAHSDSCT--
IMABIS019GPEELL-C--F-TE--------RLEDLVCFWEASGYTIGPG-QYSFSYQLE------D--E--PW-K--LCR--NMGRFWCSL-P--TADT-SS---FVPL---ELRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGAPRYHRVIHINEIMABIS020APVGLV-A--R-LA--D-----ESGHVVLRWLASGYTIGPI-RYEVDVSAG------Q--GAG-S-V--QRVEINMGRTECVL-S--N--L-RG---RTRY---TFACAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSEWSEPVSLLTPSIMABIS025GPEELL-C--F-TE--------RLEDLVCFWEASGYTIGPPGNYSFSYQLE------D--E--PW-K--LCR--NMGRFWCSL-P--TADT-SS---FVPL---ELRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGAPRYHRVIHINEIMABIS027APVGLV-A--R-LAD-E------SGHVVLRWLASGYTIGPI-RYEVDVSAG------QGAG--SV-Q--RVEILNMG-TECVL-S--N--L-RG---RTRY---TFACAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSEWSEPVSLLTPSIMABIS028GPEELL-C--F-TE--------RLEDLVCFWEASGYTIGPG-QYSFSYQLE------D--E--PW-K--LCR--NMGRFWCSL-PTAD--T-SS---FVPL---ELRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGAPRYHRVIHINEIMABIS031LMFKNAPT-PQ-EFK-------EGEDAVIVCDASGYTIGPP-TIIWKHKGRDV---------------------NMGNNYLQI-R--G--I-KK---TDEG---TYRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYINFK-DIQVIV-IMABIS032DSPTGI-D--F-SD--I-----TANSFTVHWIASGYTIGPT-GYRIRHHPE------H--F--SGRP--REDRVNMGRNSITL-T--N--L-TP---GTEY---VVSCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSPL-LIGQQSTVSIMABIS034SPPTNL-H--L-EAN-P-----DTGVLTVSWEASGYTIGPT-GYRITTTPT------N--G--QQGN-SLEEVVNMGQSSCTG-D--N--L-SP---GLEY---NVSCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSVP-ISDTIIPAVIMABIS035PPTDLR-F--T-NIG-P-----D--TMRVTWAASGYTIGPT-NFLVRYSPV------K--N--EEDV--AELSINMGDNAVVL-T--N--L-LP---GTEY---VVSCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSTPL-RGRQKTGLIMABIS036NPPHNL-S--V-INSEE-----LSSILKLTWTASGYTIGPL-KYNIQYRTKD-----A--S--TW-S--QIPPENMGRSSFTV-Q--D--L-KP---FTEY---VFRCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYSDWSEEASGITYEIMABIS037PCGYIS-P--ESPVV-Q-----LHSNFTAVCVASGYTIGPN-YIVWKTN---------------H-F--TIPK-NMGASSVTF-T--D--I-AS---L-NI---QLTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYEQNVYGITIISGLIMABIS038EKPKNL-S--CIVN--------EGKKMRCEWDASGYTIGPT-NFTLKSEWA------T--H--KF----ADCKANMGPTSCTV-D--Y--STVY---FVNI---EVWCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYKVTSDHINFDPVYIMABIS039RFIVKP-Y--G-TEV-G-----EGQSANFYCRASGYTIGPP-VVTWHKD-----------D--RE-L--K----NMGDYGLTI-N--R--V-KG---DDKG---EYTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGTKEEIVFLNVTRIMABIS041SEPGRL-A--FNV---V-----SSTVTQLSWAASGYTIGPT-AYEVCYGLVNDDNRPI--
G--PM-K--KVLVDNMGNRMLLI-E--N--L-RE---SQPY---RYTCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYWGPEREAIINLATIMABIS042APQNPN-A--K-AA--------GSRKIHFNWLASGYTIGPM-GYRVKYWIQ------G--D--SE-SEAHLLDSNMGVPSVEL-T--N--L-YP---YCDY---EMKCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYGPYSSLVSCRTHQIMABIS044IEVEKP--LYG-VEV-F-----VGETAHFEIKASGYTIGPV-HGQWKLKGQP----------------------NMGKHILIL-H--N--C-QL---GMTG---EVSCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGY-NAKSAANLKVKEIMABIS045FKIETT-PESR-YLA-Q-----IGDSVSLTCSASGYTIGPP-FFSWRTQIDS----------------------NMGTSTLTM-N--P--V-SF---GNEH---SYLCAADSTIYASYYECGHGISTGGYGYRKLEKGIQVEIYS
表111NEUATOM 1 CA GLY 15 -13.154 9.208-3.380 1.00 23.37 CATOM 2 CA GLY 16 -14.293 5.561-3.888 1.00 22.86 CATOM 3 CA GLY 17 -16.782 3.259-2.179 1.00 20.21 CATOM 4 CA GLY 18 -17.260 -0.530 -2.245 1.00 19.23 CATOM 5 CA GLY 19 -20.702 -2.004 -2.834 1.00 17.13 CATOM 6 CA GLY 20 -20.862 -5.442 -1.161 1.00 19.06 CATOM 7 CA GLY 21 -22.944 -8.326 -2.443 1.00 15.28 CATOM 8 CA GLY 22 -22.792 -11.964 -1.378 1.00 15.88 CATOM 9 CA GLY 23 -25.143 -14.899 -1.017 1.00 18.12 CATOM 10 CA GLY 24 -25.395 -17.869 1.3271.00 18.67 CATOM 11 CA GLY 25 -27.226 -21.197 1.3561.00 20.29 CATOM 12 CA GLY 33 -24.118 -18.315 -10.706 1.00 24.64 CATOM 13 CA GLY 34 -24.637 -14.823 -12.130 1.00 21.24 CATOM 14 CA GLY 35 -24.488 -11.328 -10.549 1.00 17.90 CATOM 15 CA GLY 36 -26.181 -8.277 -12.056 1.00 16.78 CATOM 16 CA GLY 37 -25.898 -4.707 -10.644 1.00 15.77 CATOM 17 CA GLY 38 -28.607 -2.078 -11.499 1.00 16.15 CATOM 18 CA GLY 39 -28.680 1.671-10.617 1.00 17.11 CATOM 19 CA GLY 40 -31.657 4.031-9.957 1.00 19.95 CATOM 20 CA GLY 69 -15.648 4.079-12.895 1.00 19.37 CATOM 21 CA GLY 70 -16.470 0.404-12.145 1.00 17.40 CATOM 22 CA GLY 71 -14.063-2.286-10.851 1.00 17.48 CATOM 23 CA GLY 72 -14.971-5.980-10.384 1.00 17.29 CATOM 24 CA GLY 73 -13.707-7.259-7.030 1.00 17.82 CATOM 25 CA GLY 74 -15.790-10.357 -6.383 1.00 20.26 CATOM 26 CA GLY 81 -20.196-10.332 -6.333 1.00 15.95 CATOM 27 CA GLY 82 -18.870-7.004-5.037 1.00 14.51 CATOM 28 CA GLY 83 -17.786-3.962-7.142 1.00 14.59 CATOM 29 CA GLY 84 -16.094-0.638-6.409 1.00 15.51 CATOM 30 CA GLY 85 -17.4982.735 -7.656 1.00 16.32 CATOM 31 CA GLY 86 -14.5675.088 -8.340 1.00 17.40 CATOM 32 CA GLY 87 -14.1058.889 -8.375 1.00 20.53 CATOM 33 CA GLY 89 -19.42912.768-7.705 1.00 33.26 CATOM 34 CA GLY 90 -22.29114.637-6.007 1.00 33.41 CATOM 35 CA GLY 91 -24.76113.465-8.588 1.00 28.24 CATOM 36 CA GLY 92 -24.0719.808 -7.919 1.00 23.61 CATOM 37 CA GLY 93 -26.7369.584 -5.107 1.00 22.12 CATOM 38 CA GLY 94 -29.1276.723 -5.698 1.00 18.21 CATOM 39 CA GLY 95 -30.0453.141 -4.991 1.00 18.57 CATOM 40 CA GLY 96 -28.0330.110 -6.301 1.00 17.72 CATOM 41 CA GLY 97 -29.544-3.367-6.491 1.00 18.72 CATOM 42 CA GLY 98 -27.685-6.700-6.623 1.00 18.53 CATOM 43 CA GLY 99 -29.584-9.550-8.379 1.00 18.45 CATOM 44 CA GLY 100-28.276-13.106 -7.867 1.00 17.71 CATOM 45 CA GLY 108-33.268-14.108 -8.956 1.00 32.51 CATOM 46 CA GLY 109-33.081-12.828 -5.395 1.00 28.62 CATOM 47 CA GLY 110-32.234-9.138-4.891 1.00 23.31 CATOM 48 CA GLY 111-30.950-6.748-2.225 1.00 19.82 CATOM 49 CA GLY 112-30.333-2.979-2.412 1.00 19.75 CATOM 50 CA GLY 113-28.024-0.343-0.875 1.00 18.42 CATOM 51 CA GLY 114-28.4693.472 -1.024 1.00 18.70 CATOM 52 CA GLY 115-25.5465.827 -1.713 1.00 19.95 CATOM 53 CA GLY 116-25.0959.402 -0.363 1.00 25.78 CATOM 54 CA GLY 117-22.03711.484-1.264 1.00 31.06 CATOM 55 CA GLY 118-20.98514.5080.8051.00 38.60 CATOM 56 CA GLY 119-17.88416.7681.1011.00 42.50 CTER1MELATOM 57 CA GLY A16 -13.8539.205 -3.269 1.00 7.90 CATOM 58 CA GLY A17 -14.5575.500 -3.346 1.00 7.54 CATOM 59 CA GLY A18 -16.9583.068 -1.674 1.00 6.47 CATOM 60 CA GLY A19 -17.168-0.701-1.485 1.00 5.43 CATOM 61 CA GLY A20 -20.455-2.621-1.546 1.00 8.09 CATOM 62 CA GLY A21 -20.823-6.351-0.794 1.00 8.76 CATOM 63 CA GLY A22 -23.429-9.023-1.196 1.00 8.33 CATOM 64 CA GLY A23 -23.620-12.484 0.2111.00 13.77 C
ATOM 65 CA GLY A 24 -26.198 -14.877 -1.2451.00 17.53 CATOM 66 CA GLY A 25 -27.419 -17.241 1.448 1.00 23.23 CATOM 67 CA GLY A 26 -29.608 -20.285 1.362 1.00 25.25 CATOM 68 CA GLY A 32 -25.105 -18.522 -11.770 1.00 5.00 CATOM 69 CA GLY A 33 -24.991 -14.689 -11.775 1.00 4.64 CATOM 70 CA GLY A 34 -24.729 -11.897 -9.1521.00 2.48 CATOM 71 CA GLY A 35 -24.799 -8.264 -10.249 1.00 2.00 CATOM 72 CA GLY A 36 -25.716 -4.753 -9.2491.00 3.40 CATOM 73 CA GLY A 37 -28.543 -2.502 -10.376 1.00 6.64 CATOM 74 CA GLY A 38 -29.128 1.074-9.3791.00 8.74 CATOM 75 CA GLY A 39 -32.163 3.371-9.3091.00 19.24 CATOM 76 CA GLY A 67 -14.374 3.095-12.462 1.00 12.68 CATOM 77 CA GLY A 68 -16.189 0.136-10.946 1.00 8.15 CATOM 78 CA GLY A 69 -14.842 -3.360 -10.453 1.00 8.39 CATOM 79 CA GLY A 70 -16.896 -6.384 -9.4081.00 5.47 CATOM 80 CA GLY A 71 -15.309 -9.468 -7.8941.00 8.48 CATOM 81 CA GLY A 72 -16.197 -12.511 -5.7981.00 18.00 CATOM 82 CA GLY A 79 -19.282 -10.422 -4.3311.00 9.55 CATOM 83 CA GLY A 80 -18.031 -6.806 -4.0951.00 4.94 CATOM 84 CA GLY A 81 -18.236 -3.718 -6.1331.00 4.92 CATOM 85 CA GLY A 82 -15.331 -1.340 -5.6351.00 7.44 CATOM 86 CA GLY A 83 -16.455 2.094-6.7951.00 6.55 CATOM 87 CA GLY A 84 -13.706 4.649-7.4621.00 9.49 CATOM 88 CA GLY A 85 -13.919 9.136-8.9591.00 12.54 CATOM 89 CA GLY A 87 -19.256 11.437 -9.0961.00 15.46 CATOM 90 CA GLY A 88 -22.580 12.828 -7.8361.00 13.94 CATOM 91 CA GLY A 89 -24.298 11.258 -10.888 1.00 18.68 CATOM 92 CA GLY A 90 -23.577 7.916-9.1751.00 9.55 CATOM 93 CA GLY A 91 -26.004 8.885-6.3601.00 6.54 CATOM 94 CA GLY A 92 -28.681 6.180-6.3491.00 6.38 CATOM 95 CA GLY A 93 -30.154 3.149-4.6181.00 6.33 CATOM 96 CA GLY A 94 -27.980 0.121-5.2741.00 6.08 CATOM 97 CA GLY A 95 -29.551 -3.256 -5.4911.00 10.12 CATOM 98 CA GLY A 96 -27.885 -6.624 -5.4511.00 10.76 CATOM 99 CA GLY A 97 -29.379 -9.337 -7.6561.00 9.08 CATOM 100 CA GLY A 98 -28.752 -13.014 -8.4551.00 8.28 CATOM 101 CA GLY A 122 -33.497 -12.862 -6.4621.00 15.49 CATOM 102 CA GLY A 123 -33.164 -9.374 -5.2111.00 12.37 CATOM 103 CA GLY A 124 -31.827 -7.789 -2.1021.00 14.34 CATOM 104 CA GLY A 125 -32.483 -4.741 0.002 1.00 22.49 CATOM 105 CA GLY A 126 -31.400 -1.487 -1.6081.00 17.72 CATOM 106 CA GLY A 127 -28.513 0.495-0.2211.00 16.51 CATOM 107 CA GLY A 128 -28.376 4.247-0.8071.00 16.84 CATOM 108 CA GLY A 129 -25.116 5.718-1.9101.00 11.90 CATOM 109 CA GLY A 130 -24.954 9.478-1.9611.00 8.75 CATOM 110 CA GLY A 131 -22.066 11.329 -3.4961.00 14.37 CATOM 111 CA GLY A 132 -21.513 14.817 -1.9471.00 23.32 CATOM 112 CA GLY A 133 -20.378 18.169 -3.3691.00 36.14 CTET1F97ATOM 113 CA GLY A 43 -13.239 8.515 -3.437 1.00 14.44 CATOM 114 CA GLY A 44 -13.393 4.758 -3.940 1.00 21.52 CATOM 115 CA GLY A 45 -16.246 2.710 -2.546 1.00 22.48 CATOM 116 CA GLY A 46 -17.296 -0.926-2.623 1.00 21.22 CATOM 117 CA GLY A 47 -21.001 -1.717-2.638 1.00 20.06 CATOM 118 CA GLY A 48 -21.128 -5.074-0.848 1.00 13.56 CATOM 119 CA GLY A 49 -23.434 -7.972-1.703 1.00 19.14 CATOM 120 CA GLY A 50 -22.907 -11.288 0.0671.00 22.49 CATOM 121 CA GLY A 51 -24.848 -14.490 -0.589 1.00 20.58 CATOM 122 CA GLY A 52 -24.961 -18.121 0.5381.00 24.55 CATOM 123 CA GLY A 53 -26.625 -21.271 -0.752 1.00 17.82 CATOM 124 CA GLY A 57 -24.531 -17.722 -9.307 1.00 10.39 CATOM 125 CA GLY A 58 -25.219 -15.054 -11.903 1.00 8.00 CATOM 126 CA GLY A 59 -24.694 -11.642 -10.310 1.00 7.62 CATOM 127 CA GLY A 60 -26.312 -8.537-11.794 1.00 6.84 CATOM 128 CA GLY A 61 -26.560 -4.910-10.704 1.00 8.48 CATOM 129 CA GLY A 62 -28.971 -2.156-11.641 1.00 13.92 CATOM 130 CA GLY A 63 -28.917 1.574 -10.971 1.00 11.89 CATOM 131 CA GLY A 64 -32.146 3.463 -10.346 1.00 23.18 CATOM 132 CA GLY A 85 -14.367 2.765 -13.291 1.00 17.93 C
ATOM 133 CA GLY A 86-16.308 -0.184 -11.839 1.00 15.44CATOM 134 CA GLY A 87-14.665 -3.500 -11.017 1.00 16.79CATOM 135 CA GLY A 88-16.581 -6.711 -10.341 1.00 14.07CATOM 136 CA GLY A 89-15.959 -9.289 -7.620 1.00 16.75CATOM 137 CA GLY A 91-18.578 -9.954 -2.969 1.00 17.13CATOM 138 CA GLY A 92-19.615 -6.643 -4.531 1.00 12.84CATOM 139 CA GLY A 93-18.746 -3.911 -7.017 1.00 12.33CATOM 140 CA GLY A 94-15.956 -1.401 -6.447 1.00 12.43CATOM 141 CA GLY A 95-16.021 2.137 -7.822 1.00 11.12CATOM 142 CA GLY A 96-12.511 3.493 -8.309 1.00 16.95CATOM 143 CA GLY A 97-14.158 6.925 -7.885 1.00 21.11CATOM 144 CA GLY A 99-19.244 11.655 -8.297 1.00 22.37CATOM 145 CA GLY A 100 -22.479 13.329 -7.197 1.00 23.75CATOM 146 CA GLY A 101 -24.007 11.875 -10.393 1.00 22.84CATOM 147 CA GLY A 102 -23.793 8.420 -8.818 1.00 15.51CATOM 148 CA GLY A 103 -26.377 9.137 -6.093 1.00 11.57CATOM 149 CA GLY A 104 -29.205 6.618 -6.153 1.00 9.52 CATOM 150 CA GLY A 105 -30.075 3.041 -5.324 1.00 12.64CATOM 151 CA GLY A 106 -28.157 0.010 -6.540 1.00 7.32 CATOM 152 CA GLY A 107 -29.828 -3.384 -6.497 1.00 7.52 CATOM 153 CA GLY A 108 -27.747 -6.545 -6.374 1.00 9.97 CATOM 154 CA GLY A 109 -29.572 -9.419 -8.055 1.00 12.91CATOM 155 CA GLY A 110 -28.245 -12.921 -7.462 1.00 11.27CATOM 156 CA GLY A 118 -33.242 -16.054 -6.426 1.00 13.29CATOM 157 CA GLY A 119 -32.582 -13.085 -4.179 1.00 15.55CATOM 158 CA GLY A 120 -31.884 -9.348 -4.193 1.00 11.36CATOM 159 CA GLY A 121 -30.813 -6.471 -1.975 1.00 11.36CATOM 160 CA GLY A 122 -30.903 -2.696 -2.475 1.00 11.14CATOM 161 CA GLY A 123 -28.232 -0.209 -1.404 1.00 11.58CATOM 162 CA GLY A 124 -28.703 3.550 -1.338 1.00 15.52CATOM 163 CA GLY A 125 -25.598 5.531 -2.225 1.00 9.61 CATOM 164 CA GLY A 126 -25.164 9.137 -1.123 1.00 10.84CATOM 165 CA GLY A 127 -22.043 10.899 -2.383 1.00 10.58CATOM 166 CA GLY A 128 -20.981 13.549 0.145 1.00 14.41CATOM 167 CA GLY A 129 -20.447 17.126 -1.025 1.00 12.32CTERZ1DQTATOM 168 CA GLY C 14-9.505 5.982 -6.825 1.00 30.82CATOM 169 CA GLY C 15-13.195 5.487 -7.536 1.00 25.29CATOM 170 CA GLY C 16-13.507 1.942 -6.167 1.00 21.63CATOM 171 CA GLY C 17-16.606 0.707 -4.377 1.00 20.22CATOM 172 CA GLY C 18-16.814 -2.817 -3.021 1.00 20.86CATOM 173 CA GLY C 19-19.629 -4.451 -1.137 1.00 21.25CATOM 174 CA GLY C 20-21.383 -7.769 -0.574 1.00 21.73CATOM 175 CA GLY C 21-24.675 -8.800 -2.148 1.00 22.97CATOM 176 CA GLY C 22-26.301 -11.552 -0.160 1.00 26.59CATOM 177 CA GLY C 23-29.169 -13.867 -0.930 1.00 26.47CATOM 178 CA GLY C 24-31.335 -16.565 0.573 1.00 31.54CATOM 179 CA GLY C 25-32.236 -19.342 0.443 1.00 31.33CATOM 180 CA GLY C 32-26.091 -17.451 -10.077 1.00 21.25CATOM 181 CA GLY C 33-26.340 -14.584 -12.535 1.00 21.86CATOM 182 CA GLY C 34-25.686 -11.294 -10.762 1.00 19.78CATOM 183 CA GLY C 35-26.651 -7.922 -12.193 1.00 19.11CATOM 184 CA GLY C 36-25.711 -4.438 -10.995 1.00 19.23CATOM 185 CA GLY C 37-28.233 -1.721 -11.782 1.00 25.95CATOM 186 CA GLY C 38-27.978 2.010 -11.165 1.00 30.90CATOM 187 CA GLY C 39-31.328 3.464 -10.196 1.00 40.84CATOM 188 CA GLY C 66-16.664 -4.410 -12.490 1.00 23.17CATOM 189 CA GLY C 67-15.247 -7.428 -10.788 1.00 22.56CATOM 190 CA GLY C 68-16.273 -9.875 -8.095 1.00 21.60CATOM 191 CA GLY C 69-16.270 -13.324 -6.554 1.00 22.69CATOM 192 CA GLY C 75-21.405 -12.287 -4.112 1.00 23.03CATOM 193 CA GLY C 76-18.587 -9.814 -3.409 1.00 24.30CATOM 194 CA GLY C 77-18.961 -6.951 -5.886 1.00 23.46CATOM 195 CA GLY C 78-16.435 -4.318 -6.884 1.00 25.74CATOM 196 CA GLY C 79-17.349 -1.380 -9.129 1.00 26.08CATOM 197 CA GLY C 80-14.377 0.652 -10.395 1.00 29.15CATOM 198 CA GLY C 81-13.639 3.807 -12.365 1.00 26.23CATOM 199 CA GLY C 84-18.194 11.980 -8.310 1.00 24.79CATOM 200 CA GLY C 85-21.048 12.151 -10.804 1.00 25.37C
ATOM 201 CA GLY C 86 -21.5408.383 -10.383 1.00 25.21CATOM 202 CA GLY C 87 -22.6968.922 -6.809 1.00 23.95CATOM 203 CA GLY C 88 -26.0507.191 -6.551 1.00 23.67CATOM 204 CA GLY C 89 -28.1034.091 -5.812 1.00 22.75CATOM 205 CA GLY C 90 -26.9050.703 -7.044 1.00 23.39CATOM 206 CA GLY C 91 -29.167-2.332 -7.030 1.00 22.55CATOM 207 CA GLY C 92 -27.838-5.841 -6.783 1.00 22.29CATOM 208 CA GLY C 93 -29.956-8.462 -8.555 1.00 20.45CATOM 209 CA GLY C 94 -29.490-12.198 -8.107 1.00 20.73CATOM 210 CA GLY C 105-34.479-11.361 -6.201 1.00 24.94CATOM 211 CA GLY C 106-33.136-7.836 -5.829 1.00 25.24CATOM 212 CA GLY C 107-31.842-5.752 -2.931 1.00 24.05CATOM 213 CA GLY C 108-33.051-2.231 -2.O38 1.00 25.85CATCM 214 CA GLY C 109-29.830-0.739 -3.310 1.00 23.77CATOM 215 CA GLY C 110-26.5440.520 -1.934 1.00 22.46CATOM 216 CA GLY C 111-25.9634.285 -1.818 1.00 24.13CATOM 217 CA GLY C 112-22.4824.793 -3.205 1.00 22.83CATOM 218 CA GLY C 113-20.9588.192 -2.417 1.00 23.40CATOM 219 CA GLY C 114-18.0619.201 -4.580 1.00 25.42CEND
表12imab號 目標(biāo)功能zp-combiMabis050 617 -1,83Mabis051 636 -0,5iMab102598 -0.38Mabis052 586 -0,88Mabis053 592 -0,73Mabis054 540 -0,42
表13iMab102DDLKLTCRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSHYRGTiMabis050DDLKLTSRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNSACDSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDCRGQGTiMabis051DDLKLTSRASGYTIGPYCMGWFRQAPNDDSTNVATINMGTVTLSMDDLQPEDSAEYNSCADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSCGQGTiMabis052GSLRLSSAASGYTIGPYCMGWFRQAPGDDREGVAAINMGTVYLLMNSLEPEDTAICYSAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSWGQGCiMabis053GSLRLSSAASGYTIGPYCNGWFRQAPGDDREGVAAINMGTVYLLMNSLEPEDTAIYYSCADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSCGQGTiMabis054GSLRLSSAASGYTIGPYCMGWFRQAPGDDREGVAAINMGTVYLLMNSLEPEDTAIYYCAADSTIYASYYECGHGLSTGGYGYDSWGCGG
表14結(jié)果沒有半胱氨酸橋 有半胱氨酸橋殘基取代溶解度zp-compzp-combIMABA_K_3_A-6.61 -6.85IMABA_K_3_C-6.72 -6.62IMABA_K_3_D X X -6.65 -6.54IMABA_K_3_E X X -6.63 -6.48IMABA_K_3_F-6.61 -6.44IMABA_K_3_G-6.70 -6.63IMABA_K_3_H-6.70 -6.79IMABA_K_3_I-6.65 -6.47IMABA_K_3_L-6.42 -6.55IMABA_K_3_M-6.34 -6.57IMABA_K_3_N X X -6.57 -6.41IMABA_K_3_P-6.74 -6.46IMABA_K_3_Q X X -6.64 -6.56IMABA_K_3_R X X -6.91 -6.56 最佳采樣數(shù)IMABA_K_3_S X X -6.52 -6.61IMABA_K_3_T X X -6.69 -6.61IMABA_K_3_V-6.60 -6.63IMABA_K_3_W-6.61 -6.57IMABA_K_3_Y-6.54 -6.54IMABA_K_7_A-6.58 -6.51IMABA_K_7_C-6.73 -6.6IMABA_K_7_D X X -6.47 -6.67IMABA_K_7_E X X -6.83 -6.61IMABA_K_7_F-6.66 -6.58IMABA_K_7_G-6.65 -6.76IMABA_K_7_H-6.80 -6.57IMABA_K_7_I-6.62 -6.28IMABA_K_7_L-6.76 -6.66IMABA_K_7_M-6.69 -6.62IMABA_K_7_N X X -6.34 -6.61IMABA_K_7_P-6.48 -6.94IMABA_K_7_Q X X -6.72 -6.61 最佳采樣數(shù)IMABA_K_7_R X X -6.63 -6.94IMABA_K_7_S X X -6.83 -6.61IMABA_K_7_T X X -6.80 -6.54IMABA_K_7_V-6.78 -6.58IMABA_K_7_W-6.87 -6.61IMABA_K_7_W-6.60 -6.63IMABA_K_19_A -6.67 -6.47IMABA_K_19_C -6.46 -6.41IMABA_K_19_D X X -6.5 -6.41IMABA_K_19_E X X -6.69 -6.77IMABA_K_19_F -6.61 -6.55IMABA_K_19_G -6.94 -6.54IMABA_K_19_H -6.48 -6.62IMABA_K_19_I -6.74 -6.51IMABA_K_19_L -6.52 -6.72IMABA_K_19_M -6.60 -6.16IMABA_K_19_N X X -6.49 -6.84IMABA_K_19_P -6.56 -6.41IMABA_K_19_Q X X -6.91 -6.65
IMABA_K_19_R X X-6.72-6.73IMABA_K_19_S X X-6.57-6.61IMABA_K_19_T X X-6.85-6.61 最佳采樣數(shù)IMABA_K_19_V -6.75-6.81IMABA_K_19_W -6.4 -6.43IMABA_K_19_Y -6.53-6.48IMABA_K_65_A -6.526.22IMABA_K_65_C -6.436.23IMABA_K_65_D X X-6.796.72IMABA_K_65_E X X-6.826.70 最佳采樣數(shù)IMABA_K_65_F -6.526.26IMABA_K_65_G -6.666.58IMABA_K_65_H -6.546.33IMABA_K_65_I -6.356.18IMABA_K_65_L -6.236.34IMABA_K_65_M -6.446.72IMABA_K_65_N X X-6.746.62IMABA_K_65_P -6.506.42IMABA_K_65_Q X X-6.626.59IMABA_K_65_R X X-6.636.53IMABA_K_65_S X X-6.686.41IMABA_K_65_T X X-6.476.41IMABA_K_65_V -6.306.25IMABA_K_65_W -6.506.39IMABA_K_65_Y -6.486.72
表15分子 zp-combIMAB_C_96_A -6,52IMAB_C_96_C -7,11IMAB_C_96_D -6,26IMAB_C_96_E -5,75IMAB_C_96_F -6,70IMAB_C_96_G -6,38IMAB_C_96_H -6,26IMAB_C_96_I -6,66IMAB_C_96_K -5,56IMAB_C_96_L -6,37IMAB_C_96_M -6,51IMAB_C_96_N -6,53IMAB_C_96_P -6,48IMAB_C_96_Q -6,19IMAB_C_96_R -6,08IMAB_C_96_S -6,39IMAB_C_96_T -6,38IMAB_C_96_V -6,75IMAB_C_96_W -6,22IMAB_C_96_Y -6,60
表16AiMab100序列1NVKLVEKGGN FVENDDDLKL TCRAEGYTIG PYCMGWFRQAPNDDSTNVAT INMGGGITYY161GDSVKERFDI RRDNASNTVT LSMDDLQPED SAEYNCAGDSTIYASYYECG HGLSTGGYGY221DSHYRGQGTD VTVSS可能的候選CYS2_CYS24CYS4_CYS22CYS4_CYS111CYS5_CYS24CYS6_CYS22CYS6_CYS112CYS6_CYS115CYS7_CYS22CYS7_CYS115CYS16_CYS84CYS18_CYS82CYS18_CYS84CYS20_CYS82CYS21_CYS81CYS22_CYS80CYS23_CYS79CYS34_CYS79CYS35_CYS98CYS36_CYS94CYS39_CYS97CYS37_CYS45CYS37_CYS96CYS38_CYS47CYS38_CYS48CYS39_CYS94CYS92_CYS118CYS94_CYS116CYS95_CYS111CYS95_CYS113
CYS95_CYS115CYS98_CYS109CYS98_CYS111CYS99_CYS110表16B優(yōu)選的半胱氨酸殘基半胱氨酸位置zp-score iMab名稱CYS6 CYS112-7.81 iMab111CYS35 CYS98 -7.54CYS99 CYS110-7.50CYS5 CYS24 -7.32CYS23 CYS79 -7.23CYS38 CYS47 -7.11 iMab112
表17突變頻率 轉(zhuǎn)化體數(shù)目 化合物(binder)數(shù)目0 9.3*10F6 502 8.1*10E6 10003，5 5.4*10E6 758 7.4*10E6 1001322*10E6100
表18CM114-IMAB100AAGAAACCAATTGTCCATATTGCATCAGACATTGCCGTCACTGCGTCTTTTACTGGCTCTTCTCGCTAACCAAACCGGTAACCCCGCTTATTAAAAGCATTCTGTAACAAAGCGGGACCAAAGCCATGACAAAAACGCGTAACAAAAGTGTCTATAATCACGGCAGAAAAGTCCACATTGATTATTTGCACGGCGTCACACTTTGCTATGCCATAGCATTTTTATCCATAAGATTAGCGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACCCGTTTTTTGGGCTAACAGGAGAAGATATACCATGAAAAAACTGTTATTTGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTTTATAGCCATAGCGCGGGCGGCCGCAATGTGAAACTGGTTGAAAAAGGTGGCAATTTCGTCGAAAACGATGACGATCTTAAGCTCACGTGCCGTGCTGAAGGTTACACCATTGGCCCGTACTGCATGGGTTGGTTCCGTCAGGCGCCGAACGACGACAGTACTAACGTGGCCACGATCAACATGGGTGGCGGTATTACGTACTACGGTGACTCCGTCAAAGAGCGCTTCGATATCCGTCGCGACAACGCGTCCAACACCGTTACCTTATCGATGGACGATCTGCAACCGGAAGACTCTGCAGAATACAATTGTGCAGGTGATTCTACCATTTACGCGAGCTATTATGAATGTGGTCATGGCCTGAGTACCGGCGGTTACGGCTACGATAGCCACTACCGTGGTCAGGGTACCGACGTTACCGTCTCGTCGGCCAGCTCGGCCGGTGGCGGTGGCAGCTATACCGATATTGAAATGAACCGCCTGGGCAAAACCGGCAGCAGTGGTGATTCGGGCAGCGCGTGGAGTCATCCGCAGTTTGAGAAAGCGGCGCGCCTGGAAACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCCCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATGAGGGTTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTAGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATTGGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTACTAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACGGCACTTATCCGCCTGGTACTGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAATCCTTCTCTTGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAATAGGTTCCGAAATAGGCAGGGGGCATTAACTGTTTATACGGGCACTGTTACTCAAGGCACTGACCCCGTTAAAACTTATTACCAGTACACTCCTGTATCATCAAAAGCCATGTATGACGCTTACTGGAACGGTAAATTCAGAGACTGCGCTTTCCATTCTGGCTTTAATGAGGATCCATTCGTTTGTGAATATCAAGGCCAATCGTCTGACCTGCCTCAACCTCCTGTCAATGCTGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGCTCTGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGCTCTGAGGGAGGCGGTTCCGGTGGTGGCTCTGGTTCCGGTGATTTTGATTATGAAAAGATGGCAAACGCTAATAAGGGGGCTATGACCGAAAATGCCGATGAAAACGCGCTACAGTCTGACGCTAAAGGCAAACTTGATTCTGTCGCTACTGATTACGGTGCTGCTATCGATGGTTTCATTGGTGACGTTTCCGGCCTTGCTAATGGTAATGGTGCTACTGGTGATTTTGCTGGCTCTAATTCCCAAATGGCTCAAGTCGGTGACGGTGATAATTCACCTTTAATGAATAATTTCCGTCAATATTTACCTTCCCTCCCTCAATCGGTTGAATGTCGCCCTTTTGTCTTTAGCGCTGGTAAACCATATGAATTTTCTATTGATTGATGACAAAATAAACTTATTCCGTGGTGTCTTTGCGTTTCTTTTATATGTTGCCACCTTTATGTATGTATTTTCTACGTTTGCTAACATACT
GCGTAATAAGGAGTCTTAAGGCGCGCCTGTAATGAACGGTCTCCAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCGCCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCAGGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCT
GCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCAGATCAATTCGCGCGCGAAGGCGAAGCGGCATGCATAATGTGCCTGTCAAATGGACGAAGCAGGGATTCTGCAAACCCTATGCTACTCCGTCAAGCCGTCAATTGTCTGATTCGTTACCAATTATGACAACTTGACGGCTACATCATTCACTTTTTCTTCACAACCGGCACGGAACTCGCTCGGGCTGGCCCCGGTGCATTTTTTAAATACCCGCGAGAAATAGAGTTGATCGTCAAAACCAACATTGCGACCGACGGTGGCGATAGGCATCCGGGTGGTGCTCAAAAGCAGCTTCGCCTGGCTGATACGTTGGTCCTCGCGCCAGCTTAAGACGCTAATCCCTAACTGCTGGCGGAAAAGATGTGACAGACGCGACGGCGACAAGCAAACATGCTGTGCGACGCTGGCGATATCAAAATTGCTGTCTGCCAGGTGATCGCTGATGTACTGACAAGCCTCGCGTACCCGATTATCCATCGGTGGATGGAGCGACTCGTTAATCGCTTCCATGCGCCGCAGTAACAATTGCTCAAGCAGATTTATCGCCAGCAGCTCCGAATAGCGCCCTTCCCCTTGCCCGGCGTTAATGATTTGCCCAAACAGGTCGCTGAAATGCGGCTGGTGCGCTTCATCCGGGCGAAAGAACCCCGTATTGGCAAATATTGACGGCCAGTTAAGCCATTCATGCCAGTAGGCGCGCGGACGAAAGTAAACCCACTGGTGATACCATTCGCGAGCCTCCGGATGACGACCGTAGTGATGAATCTCTCCTGGCGGGAACAGCAAAATATCACCCGGTCGGCAAACAAATTCTCGTCCCTGATTTTTCACCACCCCCTGACCGCGAATGGTGAGATTGAGAATATAACCTTTCATTCCCAGCGGTCGGTCGATAAAAAAATCGAGATAACCGTTGGCCTCAATCGGCGTTAAACCCGCCACCAGATGGGCATTAAACGAGTATCCCGGCAGCAGGGGATCATTTTGCGCTTCAGCCATACTTTTCATACTCCCGCCATTCAGAGCM126-IMAB100TTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCGGGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTTGATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGTCCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCTGTGGATATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAGCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGCCAACTCAGCTTCCTTTCGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCCTTAGTGGTGATGGTGATGGTGGCTTTTGCCCAGGCGGTTCATTTCTATATCGGTATAGCTGCCACCGCCACCGGCCGAGCTGGCCGACGAGACGGTAACGTCGGTACCCTGACCACGGTAGTGGCTATCGTAGCCGTAACCGCCGGTACTCAGGCCATGACCACATTCATAATAGCTCGCGTAAATG
GTAGAATCACCTGCACAATTGTATTCTGCAGAGTCTTCCGGTTGCAGATCGTCCATCGATAAGGTAACGGTGTTGGACGCGTTGTCGCGACGGATATCGAAGCGCTCTTTGACGGAGTCACCGTAGTACGTAATACCGCCACCCATGTTGATCGTGGCCACGTTAGTACTGTCGTCGTTCGGCGCCTGACGGAACCAACCCATGCAGTACGGGCCAATGGTGTAACCTTCAGCACGGCACGTGAGCTTAAGATCGTCATCGTTTTCGACGAAATTGCCACCTTTTTCAACCAGTTTCACATTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGAAACCGTTGTGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTCGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGATCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCATGCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTGGAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTTGGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATGGAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCAAGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAAACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATCCCCCTTACACGGAGGCATCAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCA
TGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATGAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAA
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權(quán)利要求
1.一種包含一個結(jié)合肽及一個核心的合成或重組蛋白質(zhì)分子，所述核心包含一個含至少4個鏈的β-桶，其中所述β-桶包含至少兩個β-折疊，其中每個所述β-折疊包含兩個所述鏈，及其中所述結(jié)合肽是連接所述β-桶內(nèi)兩個鏈的肽，其中所述結(jié)合肽在其天然鄰近序列之外。
2.權(quán)利要求1的蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少5個鏈，其中至少一個所述折疊包含3個所述鏈。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少6個鏈，其中至少2個所述折疊包含3個所述鏈。
4.權(quán)利要求1-3任一項的蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少7個鏈，其中至少一個所述折疊包含4個所述鏈。
5.權(quán)利要求1-4任一項的蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少8個鏈，其中至少一個所述折疊包含4個所述鏈。
6.權(quán)利要求1-5任一項的蛋白質(zhì)分子，其中所述β-桶包含至少9個鏈，其中至少一個所述折疊包含4個所述鏈。
7.權(quán)利要求1-6任一項的蛋白質(zhì)分子，其中所述結(jié)合肽連接所述桶的開放側(cè)上的所述β-桶的兩個鏈。
8.權(quán)利要求1-7任一項的蛋白質(zhì)分子，其中所述結(jié)合肽連接所述桶的至少兩個β-折疊。
9.權(quán)利要求1-8任一項的蛋白質(zhì)分子，其包含至少一個進一步的結(jié)合肽。
10.權(quán)利要求1-9任一項的蛋白質(zhì)分子，其包含3個結(jié)合肽及3個連接肽序列。
11.權(quán)利要求1-9任一項的蛋白質(zhì)分子，其包含至少4個結(jié)合肽。
12.權(quán)利要求11的蛋白質(zhì)分子，其中至少一個結(jié)合肽識別與至少一個其它結(jié)合肽識別的靶分子不同的另一個靶分子。
13.一種鑒別具有改變的結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子的方法，包含在權(quán)利要求1-12任一項的蛋白質(zhì)分子的核心中導(dǎo)入一個變化，并從所述蛋白質(zhì)分子中選擇具有改變的結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子。
14.一種鑒別具有改變的結(jié)構(gòu)性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子的方法，包含在權(quán)利要求1-12任一項的蛋白質(zhì)分子的核心中導(dǎo)入一個變化，并從所述蛋白質(zhì)分子中選擇具有改變的結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)分子。
15.權(quán)利要求13或14的方法，其中所述變化包含一個翻譯后修飾。
16.權(quán)利要求13-15任一項的方法，其中所述變化是在編碼所述至少一個蛋白質(zhì)分子的核酸中導(dǎo)入，所述方法進一步包含在能產(chǎn)生所述蛋白質(zhì)分子的表達系統(tǒng)中表達所述核酸。
17.通過權(quán)利要求13-16任一項的方法可獲得的蛋白質(zhì)分子。
18.權(quán)利要求1-12或17任一項的蛋白質(zhì)分子，其衍生自免疫球蛋白超家族。
19.權(quán)利要求18的蛋白質(zhì)分子，其中蛋白質(zhì)分子的外部與衍生其的免疫球蛋白超家族的分子免疫學(xué)相似。
20.包含權(quán)利要求1-12或17-19任一項的蛋白質(zhì)分子的細胞。
21.一種生產(chǎn)編碼一種蛋白質(zhì)分子的核酸的方法，所述蛋白質(zhì)分子能展示至少一個所希望的肽序列，所述方法包含提供一種編碼至少第一個和第二個結(jié)構(gòu)區(qū)的核酸序列，所述第一個和第二個結(jié)構(gòu)區(qū)由編碼所述所希望的肽序列的核酸序列分隔或者由可以插入這種序列的一個區(qū)域分隔，及突變編碼所述第一個和第二個結(jié)構(gòu)區(qū)的所述核酸以獲得編碼能展示至少一個所希望的肽序列的所述蛋白質(zhì)分子的所希望的核酸。
22.一種展示一種所希望的肽序列的方法，包括提供編碼至少兩個β-折疊的核酸，所述β-折疊形成一個β-桶，所述核酸包含一個用于插入編碼所希望的肽序列的序列的區(qū)域，插入包含所希望的肽序列的一個核酸序列，及表達所述核酸，從而所述β-折疊可通過權(quán)利要求21的方法獲得。
23.一種生產(chǎn)包含人工結(jié)合肽的文庫的方法，所述方法包含提供至少一個核酸模板，其中所述模板編碼不同的特異性結(jié)合肽，通過突變產(chǎn)生所述模板的核酸衍生物的集合，并將所述集合或其一部分提供給肽合成系統(tǒng)以產(chǎn)生包含人工結(jié)合肽的所述文庫。
24.權(quán)利要求23的方法，包含提供至少兩個核酸模板。
25.權(quán)利要求24的方法，包含提供至少10個核酸模板。
26.權(quán)利要求23-25任一項的方法，其中所述突變是通過所述模板的易突變核酸擴增而導(dǎo)入。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述擴增利用非簡并引物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中至少一個非簡并引物進一步包含一個簡并區(qū)。
29.權(quán)利要求26-28任一項的方法，其中所述核酸擴增包含在存在dITP，dPTP情況下的至少一個延伸步驟。
30.權(quán)利要求23-29任一項的方法，其中至少一個模板編碼具有包含至少14個氨基酸的親和區(qū)的一個特異性結(jié)合肽。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述親和區(qū)包含至少16個氨基酸。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述親和區(qū)平均長度包含24個氨基酸。
33.權(quán)利要求30-32任一項的方法，其中所述親和區(qū)包含至少14個連續(xù)氨基酸。
34.權(quán)利要求23-33任一項的方法，其中至少一個所述模板編碼權(quán)利要求1-12，17-19任一項的蛋白質(zhì)分子。
35.權(quán)利要求23-34任一項的方法，進一步包含提供所述人工肽文庫中的肽的一種潛在結(jié)合配體，并從所述文庫中選擇能與所述結(jié)合配體特異性結(jié)合的肽。
36.權(quán)利要求36的方法，其中所述文庫以噬菌體展示文庫提供。
37.可通過權(quán)利要求35或36的方法獲得的權(quán)利要求1-12，17-19任一項的蛋白質(zhì)分子，或者如表2，3，10，13或16所述的蛋白質(zhì)分子。
38.權(quán)利要求1-12或17-19或37任一項的蛋白質(zhì)分子用于從一種混合物中分離一種物質(zhì)的應(yīng)用。
39.權(quán)利要求38的應(yīng)用，其中所述混合物是一種生物學(xué)液體。
40.權(quán)利要求39的應(yīng)用，其中所述生物學(xué)液體是生物體的一種分泌物。
41.權(quán)利要求40的應(yīng)用，其中所述分泌物是乳汁或乳汁的衍生物。
42.權(quán)利要求39的應(yīng)用，其中所述混合物是血液或其衍生物。
43.權(quán)利要求1-12，17-19或37任一項的蛋白質(zhì)分子作為一種藥物的應(yīng)用。
44.權(quán)利要求1-12，17-19或37任一項的蛋白質(zhì)分子在制備一種用于治療有害的蛋白質(zhì)或細胞或微生物所致的病理狀態(tài)的藥物配方中的應(yīng)用。
45.權(quán)利要求1-12，17-19或37任一項的蛋白質(zhì)分子在制備一種診斷分析中的應(yīng)用。
46.一種基因輸送載體，其包含權(quán)利要求1-12，17-19或37任一項的蛋白質(zhì)分子及一個感興趣的基因。
47.一種基因輸送載體，其包含編碼權(quán)利要求1-12，17-19或37任一項的蛋白質(zhì)分子的核酸及編碼感興趣基因的核酸序列。
48.權(quán)利要求1-12，17-19或37任一項的蛋白質(zhì)分子，其與一種感興趣的部分綴合。
49.權(quán)利要求48的蛋白質(zhì)分子，其中所述感興趣的部分是一種毒性部分。
50.一個層析柱，其包含權(quán)利要求1-12，17-19或37任一項的蛋白質(zhì)分子及一種填充材料。
51.可通過權(quán)利要求21的方法獲得的核酸。
52.一個核酸文庫，其包含權(quán)利要求51的不同核酸的集合。
53.權(quán)利要求52的核酸文庫，其進一步包含編碼不同親和區(qū)的核酸集合。
54.權(quán)利要求52或53的文庫，其是一個表達文庫。
全文摘要
本發(fā)明提供了產(chǎn)生與一種合適的核心區(qū)域相關(guān)的結(jié)合肽的方式和方法、所得蛋白質(zhì)分子及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種與結(jié)合分子在其全部應(yīng)用范圍內(nèi)應(yīng)用相關(guān)的問題的解決方法。結(jié)合分子可以設(shè)計為適應(yīng)極端應(yīng)用條件如極端溫度或pH?；蛘?，結(jié)合分子可以設(shè)計為應(yīng)答環(huán)境中非常細微的變化。
文檔編號C12N15/09GK1617926SQ02827979
公開日2005年5月18日 申請日期2002年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月10日
發(fā)明者埃爾溫·豪特扎格爾, 伊爾瑪·瑪麗亞·塞西麗婭·維金, 彼得·克里斯蒂安·賽蒙斯 申請人:凱馳麥布斯股份有限公司