全自動(dòng)多肽提取飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)儀的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及體液蛋白提取以及質(zhì)譜點(diǎn)樣的自動(dòng)化系統(tǒng)，結(jié)合磁珠法提取體液中的蛋白，實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜芯片點(diǎn)樣的自動(dòng)化操作，從而用來制備生物芯片，并通過質(zhì)譜儀的激光采樣，得到蛋白的質(zhì)譜圖以及相關(guān)信息，可用來制備生物芯片，因此屬于蛋白檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和推進(jìn)，生命科學(xué)研宄已進(jìn)入了后基因組時(shí)代。在這個(gè)時(shí)代，生命科學(xué)的主要研宄對(duì)象是功能基因組學(xué)，包括結(jié)構(gòu)基因組研宄和蛋白質(zhì)組研宄等。盡管現(xiàn)在已有多個(gè)物種的基因組被測(cè)序，但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略，如基因芯片、基因表達(dá)序列分析(Serialanalysis of gene express1n，SAGE)等，都是從細(xì)胞中mRNA的角度來考慮的，其前提是細(xì)胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達(dá)的水平。但事實(shí)并不完全如此，從DNA mRNA蛋白質(zhì)，存在三個(gè)層次的調(diào)控，即轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控(Transcript1nal control)，翻譯水平調(diào)控(Translat1nal control)，翻譯后水平調(diào)控(Post-translat1nal control)。從 mRNA 角度考慮，實(shí)際上僅包括了轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，并不能全面代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)也證明，組織中mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性并不好，尤其對(duì)于低豐度蛋白質(zhì)來說，相關(guān)性更差。更重要的是，蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或迀移、蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用等則幾乎無法從mRNA水平來判斷。毋庸置疑，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研宄將直接闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制。蛋白質(zhì)本身的存在形式和活動(dòng)規(guī)律，如翻譯后修飾、蛋白質(zhì)間相互作用以及蛋白質(zhì)構(gòu)象等問題，仍依賴于直接對(duì)蛋白質(zhì)的研宄來解決。雖然蛋白質(zhì)的可變性和多樣性等特殊性質(zhì)導(dǎo)致了蛋白質(zhì)研宄技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)比核酸技術(shù)要復(fù)雜和困難得多，但正是這些特性參與和影響著整個(gè)生命過程。
[0003]傳統(tǒng)的對(duì)單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行研宄的方式已無法滿足后基因組時(shí)代的要求。這是因?yàn)?(1)生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，必然涉及到多個(gè)蛋白質(zhì)。(2)多個(gè)蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的，或平行發(fā)生，或呈級(jí)聯(lián)因果。(3)在執(zhí)行生理功能時(shí)蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動(dòng)態(tài)的，并不象基因組那樣基本固定不變。因此要對(duì)生命的復(fù)雜活動(dòng)有全面和深入的認(rèn)識(shí)，必然要在整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研宄。因此在上世紀(jì)90年代中期，國際上產(chǎn)生了一門新興學(xué)科一蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)，它是以細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動(dòng)方式為研宄對(duì)象。可以說蛋白質(zhì)組研宄的開展不僅是生命科學(xué)研宄進(jìn)入后基因組時(shí)代的里程碑，也是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研宄的核心內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)組學(xué)的興起對(duì)技術(shù)有了新的需求和挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)組的研宄實(shí)質(zhì)上是在細(xì)胞水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模的平行分離和分析，往往要同時(shí)處理成千上萬種蛋白質(zhì)。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研宄技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研宄中的主要任務(wù)。當(dāng)前在國際蛋白質(zhì)組研宄技術(shù)中，通常可采用細(xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即采用各種方法將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成幾部分，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組研宄。
[0004]質(zhì)譜分析法主要是通過對(duì)樣品的離子的質(zhì)荷比的分析而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量的一種方法?；驹硎菍悠忿D(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)的帶電氣態(tài)離子，于磁場(chǎng)中按質(zhì)荷比(m/z)大小分離并記錄。質(zhì)譜法是應(yīng)用最為廣泛的分析方法，它可以提供包括樣品元素組成，無機(jī)、有機(jī)及生物分析的結(jié)構(gòu)，復(fù)雜混合物的定量分析，固體表面結(jié)構(gòu)和組成分析，樣品中原子的同位素比。最初的質(zhì)譜儀主要用來測(cè)定元素或同位素的原子量，隨著離子光學(xué)理論的發(fā)展，質(zhì)譜儀不斷改進(jìn)，其應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大，到20世紀(jì)50年代后期已廣泛地應(yīng)用于無機(jī)化合物和有機(jī)化合物的測(cè)定?，F(xiàn)今，質(zhì)譜分析的足跡已遍布各個(gè)學(xué)科的技術(shù)領(lǐng)域，在固體物理、冶金、電子、航天、原子能、地球和宇宙化學(xué)、生物化學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域均有著廣闊的應(yīng)用。質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，更為質(zhì)譜的發(fā)展注入了新的活力，形成了獨(dú)特的生物質(zhì)譜技術(shù)。
[0005]近年來，以電噴霧質(zhì)譜技術(shù)(eleetrospray1nizat1n，ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)(matrix assisted laserdesort1n/onizat1, MALDI)為基礎(chǔ)的生物質(zhì)譜技術(shù)，它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍，使準(zhǔn)確分析分子量高達(dá)幾萬到幾十萬的生物大分子(蛋白分子)成為可能，從而使大量的蛋白分子的快速分析成為現(xiàn)實(shí)。
[0006]電噴霧質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是誕生于80年代末期的兩項(xiàng)軌電離技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研宄的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革。它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測(cè)范圍，使得在pmol (10-12)甚至fmol (10-15)的水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能，從而使質(zhì)譜技術(shù)真正走入了生命科學(xué)的研宄領(lǐng)域，并得到迅速的發(fā)展。
[0007]電噴霧質(zhì)譜技術(shù)(ESI)是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比(m/z)降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電行數(shù)算出。電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)就是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液一質(zhì)聯(lián)用(LC 一 MS)是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達(dá)到檢測(cè)大分子物質(zhì)的目的。
[0008]基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)(MALD1-T0F)的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDAI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間檢測(cè)器來檢測(cè)，理論上講，只要飛行管的長(zhǎng)度足夠，TOF檢測(cè)器可檢測(cè)分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的，因此MALD1-T0F質(zhì)譜很適合對(duì)蛋白質(zhì)、多肽的研宄。
[0009]然而，傳統(tǒng)的體液全蛋白純化提取是將樣品加入到含有磁珠和化學(xué)試劑的管中，通過人工的混合以及洗滌、洗脫來制備。這種方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、通量低、一致性差，有可能有交叉污染等諸多缺點(diǎn)，無法有效的進(jìn)行大規(guī)模，大批量的蛋白提取與純化分析工作，逐漸難以滿足快速、準(zhǔn)確、大批量的蛋白提取和質(zhì)譜的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供一種大批量樣本同時(shí)提取，且耗時(shí)少、效率高、一致性好、避免交叉污染的蛋白自動(dòng)化提取系統(tǒng)。本發(fā)明的原理在于:采用電磁棒+磁棒套的模式，利用自動(dòng)化機(jī)械臂完成蛋白提取動(dòng)作，然后通過自動(dòng)導(dǎo)軌分別將提取的核酸通過分液器分裝到樣品板上、以及通過移液器將樣品板轉(zhuǎn)移到芯片點(diǎn)樣儀上，通過點(diǎn)樣儀制備基因芯片，通過質(zhì)譜儀的激光采樣，得到蛋白的質(zhì)譜圖以及相關(guān)信息。
[0011]因此，出于實(shí)現(xiàn)快速、直接、連續(xù)的蛋白分析的研宄目的，綜合了磁珠法和電磁棒法提取分離蛋白、DNA芯片的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明