一種動(dòng)物多肽的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物多肽提取技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種動(dòng)物多肽的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肽是涉及生物體內(nèi)多種細(xì)胞功能的生物活性物質(zhì)。截止2003年9月，生物體內(nèi)已 發(fā)現(xiàn)幾百種肽，是機(jī)體完成各種復(fù)雜的生理活性必不可少的參與者。所有細(xì)胞都能合成多 肽物質(zhì)，其功能活動(dòng)也受多肽的調(diào)節(jié)。它涉及激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖各領(lǐng)域，其重要性 在于調(diào)節(jié)體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)器官和細(xì)胞。酶法多肽的生理和藥理作用主要是激活體內(nèi)有關(guān)酶 系，促進(jìn)中間代謝膜的通透性，或通過(guò)控制DNA轉(zhuǎn)錄或翻譯而影響特異的蛋白合成，最終產(chǎn) 生特定的生理效應(yīng)或發(fā)揮其藥理作用。肽優(yōu)于氨基酸，一是較氨基酸吸收快速；二是以完整 的形式被機(jī)體吸收；三是主動(dòng)吸收（氨基酸屬被動(dòng)吸收）；四是低耗，與氨基酸比較，肽吸收 具有低耗或不需消耗能量的特點(diǎn)，肽通過(guò)十二指腸吸收后，直接進(jìn)入血液循環(huán)，將自身能量 營(yíng)養(yǎng)輸送到人體各個(gè)部位；五是肽吸收較氨基酸，具有不飽和的特點(diǎn)；六是氨基酸只有20 種，功能可數(shù)，而肽以氨基酸為底物，可合成上百上千種。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外研發(fā)生產(chǎn)的肽主要有三種。第一種是以植物蛋白質(zhì)為原料加工成的 鈦制品，通稱(chēng)為植物多肽。目前國(guó)內(nèi)外比較大的企業(yè)現(xiàn)行的肽制品主要是植物多肽。由于 大豆類(lèi)植物本身含蛋白質(zhì)多，常為植物多肽的主要原料。但是由于豆類(lèi)抗胰酶類(lèi)強(qiáng)，往往由 于酶解不徹底，影響產(chǎn)品的含肽量；此外，植物多肽的加工工藝、設(shè)備較為復(fù)雜，導(dǎo)致生產(chǎn)成 本較高。第二種是以動(dòng)物蛋白質(zhì)為原料加工生產(chǎn)的肽，通稱(chēng)為動(dòng)物多肽。動(dòng)物多肽的原料 來(lái)源主要是海洋生物和陸地生物。第三種是用已知肽的分子量和特殊功能，通過(guò)人工合成 的方式生產(chǎn)的肽，這種合成肽是疫苗和治療某種疾病的特殊藥品，由于這種肽的生產(chǎn)設(shè)備 和工藝要求特別嚴(yán)格，生產(chǎn)成本昂貴，臨床觀察期長(zhǎng)，很難成為中小企業(yè)的產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，而提供一種動(dòng)物多肽的提取方 法，該提取工藝能夠在保證動(dòng)物多肽產(chǎn)品質(zhì)量的情況下實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采用的技術(shù)方案是：一種動(dòng)物多肽的提取方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0006] (1)取富含動(dòng)物蛋白的動(dòng)物組織及動(dòng)物骨骼作為原料，進(jìn)行清洗、粉碎、保鮮處 理；
[0007] (2)將原料進(jìn)行蒸煮升溫至140°C，然后保溫8小時(shí)；
[0008] (3)原料自然降溫至37-50°C后，加入到Tris -緩沖液中，料液比（w/v)為1 : 2， 加入木瓜蛋白酶或復(fù)合酶，進(jìn)行水解；
[0009] (4)水解后，將原料升溫至146°C滅酶，干燥處理3小時(shí)；
[0010] (5)自然降溫至50°C進(jìn)行保溫；然后在11000r/min下離心20min，取上清液；
[0011] (6)上清液經(jīng)活性炭吸附后即得動(dòng)物多肽。
[0012] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中使用木瓜蛋白酶的水解時(shí)間為2-4小時(shí)。
[0013] 優(yōu)選的，所述步驟（3)使用木瓜蛋白酶水解時(shí)的pH值范圍為4~6。
[0014] 優(yōu)選的，所述步驟（3)使用的木瓜蛋白酶濃度為480~600U/g。
[0015] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中使用木瓜蛋白酶的水解條件為溫度50°C、時(shí)間4h、pH5、酶 濃度 600U/g。
[0016] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中加入的復(fù)合酶優(yōu)選為等量的中性蛋白酶和胰蛋白酶。優(yōu) 選的，當(dāng)使用復(fù)合酶時(shí)，所述步驟（3)中的水解時(shí)間優(yōu)選為1-4小時(shí)。
[0017] 現(xiàn)有技術(shù)中有使用酸水解的工藝，雖酸法較酶法水解強(qiáng)度高，但動(dòng)物組織或骨骼 中的灰分、色素易溶于酸，水解后需脫灰、脫色。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明采用酶法水解反應(yīng) 溫和，氨基酸破壞小，安全可靠，易控制，無(wú)污染，且得到的膠原多肽純度高，水溶性好，理化 性質(zhì)穩(wěn)定。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1所示為木瓜蛋白酶水解溫度對(duì)水解度的影響曲線圖；
[0019] 圖2所示為木瓜蛋白酶水解時(shí)間對(duì)水解度的影響曲線圖；
[0020] 圖3所示為木瓜蛋白酶水解pH值對(duì)水解度的影響曲線圖；
[0021] 圖4所示為木瓜蛋白酶濃度對(duì)酶解效果的影響曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體 實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0023] 實(shí)施例1 :
[0024] 一種動(dòng)物多肽的提取方法，包括以下步驟：
[0025] (1)取豬內(nèi)臟及豬骨作為原料，進(jìn)行清洗、粉碎、保鮮處理；
[0026] (2)將原料進(jìn)行蒸煮升溫至140°C，然后保溫8小時(shí)；
[0027] (3)原料自然降溫至37-50°C后，加入Tris -緩沖液（0? 05mol/L，pH7. 5)中，料液 比（w/v)為1 : 2,加入木瓜蛋白酶，進(jìn)行水解；
[0028] (4)水解后，將原料升溫至146°C滅酶，干燥處理3小時(shí)；
[0029] (5)自然降溫至50°C進(jìn)行保溫；然后在11000r/min下離心20min，取上清液； [0030] (6)上清液經(jīng)活性炭吸附后即得動(dòng)物多肽。
[0031] 本實(shí)施例1中使用的木瓜蛋白酶采購(gòu)自廣西杰沃利生物公司。
[0032] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中的水解時(shí)間為2-4小時(shí)。酶是特定的蛋白質(zhì)，只有在特定 溫度下，酶才能保持其最佳的活性。因此，溫度對(duì)水解效果的影響較顯著。如圖1所示，本 發(fā)明在使用木瓜蛋白酶或復(fù)合酶水解豬蛋白時(shí)，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)論證，溫度在37-50°C，其水解度 是在較高的范圍的；而當(dāng)溫度從50°C增加到70°C，水解度逐漸下降，溫度為50°C時(shí)水解度 達(dá)到最高。因此，確定木瓜蛋白酶進(jìn)行水解的最適溫度范圍為37-50°C。
[0033] 優(yōu)選的，所述步驟（3)中的水解時(shí)間為2-4小時(shí)。如圖2所示，水解豬蛋白時(shí)，隨 水解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸升高，但當(dāng)水解一定時(shí)間后，水解度的升高趨于緩慢。這是因 為隨著水解的進(jìn)行，蛋白質(zhì)底物逐漸減少，且酶解產(chǎn)物不斷積累對(duì)酶本身造成抑制。經(jīng)過(guò)試 驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶水解膠原蛋白3h時(shí)后，水解度上升曲線逐漸趨于平坦，因此，選擇木瓜 蛋白酶水解豬蛋白的最適時(shí)間是2~4h。
[0034] 優(yōu)選的，所述步驟（3)水解時(shí)的pH值范圍為4~6。因?yàn)?，酶分子的活性部位一?由結(jié)合部位和催化部位組成，結(jié)合部位的功能是結(jié)合底物，催化部位則起催化底物化學(xué)反 應(yīng)的作用?；钚圆课坏陌被醾?cè)鏈基團(tuán)以特定的空間結(jié)構(gòu)靠在一起形成活化中心，而活化 中心必須在酶蛋白分子保持一定的空間構(gòu)象時(shí)才能存在，從而發(fā)揮催化功能。活化中心這 些基團(tuán)對(duì)pH值變化較敏感，因此，只有在一定的pH值條件下，活化中心才能發(fā)揮最佳的催 化作用，而且，隨著pH值的變化活性中心的催化作用差異有可能很大。另外，酶的催化也和 底物構(gòu)像有很大關(guān)系，而底物蛋白構(gòu)像也需要特定的pH值條件。如圖3所示，木瓜蛋白酶 水解豬蛋白時(shí)，pH值從3增加到5時(shí)，水解度逐漸升高；而當(dāng)pH值從5增加到7時(shí)，水解度 逐漸下降，pH值為5時(shí)水解度達(dá)到最高。
[0035] 優(yōu)選的，所述步驟（3)使用的木瓜蛋白酶濃度為480~600U/g。圖4可以看出， 酶濃度對(duì)水解效果有顯著的影響。水解豬蛋白時(shí)，隨酶濃度的增加，水解度逐漸升高。因?yàn)?當(dāng)?shù)孜餄舛扰c反應(yīng)時(shí)間一定時(shí)，底物的水解度取決于酶濃度，只有當(dāng)酶分子在體系中趨于 飽和后，部分酶分子不能和底物接觸時(shí)，水解度的提高才會(huì)減慢甚至停止。但從圖4中可發(fā) 現(xiàn)，當(dāng)酶濃度達(dá)到一定值時(shí)，隨酶濃度的增加水解度的升高趨于緩慢。由于水解底物是有限 的，當(dāng)酶量達(dá)到一定程度時(shí)，就可將大部分的底物反應(yīng)掉。由于水解底物的缺乏，這時(shí)即使 再增加酶量，也無(wú)法使水解度得到顯著提高，而且還會(huì)增加成本。木瓜蛋白酶水解膠原蛋白 時(shí)，加酶量達(dá)到540U/g時(shí)，水解度上升速度已非常緩慢。
[0036] 下表為木瓜蛋白酶酶解豬骨膠原蛋白的試驗(yàn)結(jié)果
[0037]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種動(dòng)物多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取富含動(dòng)物蛋白的動(dòng)物組織及動(dòng)物骨骼作為原料，進(jìn)行清洗、粉碎、保鮮處理； (2) 將原料進(jìn)行蒸煮升溫至140°C，然后保溫8小時(shí)； (3) 原料自然降溫至37-50°C后，加入到Tris-緩沖液中，料液比（w/v)為1 : 2,加入 木瓜蛋白酶或復(fù)合酶，進(jìn)行水解； (4) 水解后，將原料升溫至146°C滅酶，干燥處理3小時(shí)； (5) 自然降溫至50°C進(jìn)行保溫；然后在llOOOr/min下離心20min，取上清液； (6) 上清液經(jīng)活性炭吸附后即得動(dòng)物多肽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物多肽的提取方法，其特征在于所述步驟（3)中木瓜 蛋白酶所需的水解時(shí)間為2-4小時(shí)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物多肽的提取方法，其特征在于所述步驟（3)木瓜蛋 白酶的水解時(shí)的pH值范圍為4~6。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物多肽的提取方法，其特征在于所述步驟（3)使用的 木瓜蛋白酶濃度為480~600U/g。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物多肽的提取方法，其特征在于所述步驟（3)中使用 木瓜蛋白酶的水解條件為溫度50°C、時(shí)間4h、pH5、酶濃度600U/g。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種動(dòng)物多肽的提取方法，其特征在于所述步驟（3)中加入 的復(fù)合酶為等量的中性蛋白酶和胰蛋白酶。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種動(dòng)物多肽的提取方法，其特征在于所述步驟（3)使用復(fù) 合酶的水解時(shí)間為1-4小時(shí)。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種動(dòng)物多肽的提取方法，包括以下步驟：(1)取動(dòng)物組織及動(dòng)物骨骼作為原料，進(jìn)行清洗、粉碎、保鮮處理；(2)將原料進(jìn)行蒸煮升溫至140℃，保溫8小時(shí)；(3)降溫至37-50℃后，加入到緩沖液中，加入木瓜蛋白酶或復(fù)合酶，進(jìn)行水解；(4)水解后，將原料升溫至146℃，干燥處理3小時(shí)；(5)降溫至50℃進(jìn)行保溫，離心，取上清液；(6)上清液經(jīng)活性炭吸附后即得。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明采用酶法水解反應(yīng)溫和，氨基酸破壞小，安全可靠，易控制，無(wú)污染，且得到的膠原多肽純度高，水溶性好，理化性質(zhì)穩(wěn)定。
【IPC分類(lèi)】C07K1-22, C12P21-06
【公開(kāi)號(hào)】CN104846048
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510287704
【發(fā)明人】王進(jìn)章, 于少軍, 石建國(guó), 曹善明
【申請(qǐng)人】天津市信順康生物制品科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月29日