專利名稱：一種c型副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及模擬副雞嗜血桿菌抗原表位的短肽，具體說涉及一組能模擬C型副雞嗜血桿菌的血清型抗原表位的短肽，以及該組短肽在制備雞傳染性鼻炎鑒別診斷及疫苗研制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum，Hpg)是引起雞傳染性鼻炎的致病菌。它可以分為A、B、C三種血清型，我國現(xiàn)在常見的是A和C型。雞傳染性鼻炎是一種急性呼吸道傳染病，它的主要危害是造成蛋雞產(chǎn)蛋量下降及育成雞生長不良。有文獻(xiàn)報(bào)道，由Hpg引起的傳染性鼻炎可使產(chǎn)蛋量下降40％，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重。
對Hpg的鑒別主要有表型鑒定，血清型鑒定及PCR等方法。這些方法在實(shí)際推廣應(yīng)用中都受到一定的限制由于Hpg生長緩慢，培養(yǎng)條件苛刻，普通實(shí)驗(yàn)室很難通過表型對其進(jìn)行分離鑒定；血清型鑒定是常用的方法，它的經(jīng)典方法是根據(jù)Page使用的平板凝集試驗(yàn)將分離到的Hpg分型；也有通過血清型單抗阻斷酶聯(lián)免疫反應(yīng)進(jìn)行血清分型的報(bào)道。由于迄今尚沒有商品供應(yīng)的血清型特異的單抗，因此無法推廣應(yīng)用。近來有文獻(xiàn)報(bào)道，通過合成特異的寡核苷酸探針，采用PCR法對Hpg進(jìn)行快速鑒別。但該法較易出現(xiàn)假陽性，且需要特殊的儀器設(shè)備，因而不利于在基層推廣使用。
目前對雞傳染性鼻炎的防治主要采用接種油佐劑滅活菌苗的方法。因?yàn)槿鄙俜奖憧旖葸m于基層推廣的血清型鑒別方法，所以通常都是混合接種A和C型滅活菌苗。因此需要大量使用滅活的細(xì)菌以及化工材料的佐劑，Hpg是革蘭氏陰性菌，含有內(nèi)毒素，大量接種會影響蛋雞的產(chǎn)蛋及育成雞的生長。若能針對疫情分型接種將減少內(nèi)毒素的影響，減少佐劑殘留，從而減少經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立一種簡便有效的Hpg血清型鑒別診斷方法及研制新型多肽疫苗將具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決Hpg的鑒別診斷的技術(shù)難題，本發(fā)明公開了一種能模擬Hpg C的血清型抗原表位的短肽，還公開了該短肽在制備雞傳染性鼻炎鑒別診斷及疫苗中的應(yīng)用。
一種C型副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽，其氨基酸序列為以下通式Y(jié)X1PX2QWWX3X4X5X6X7，其中Y代表酪氨酸殘基；P代表脯氨酸殘基；Q代表谷氨酰胺殘基；W代表色氨酸殘基；X1～X7代表任意氨基酸。
上述序列的最優(yōu)選序列為YSPHQWWLSGAV，其中Y代表酪氨酸殘基；S代表絲氨酸殘基；P代表脯氨酸殘基；H代表組氨酸殘基；Q代表谷氨酰胺殘基；W代表色氨酸殘基；L代表亮氨酸殘基；G代表甘氨酸殘基；A代表丙氨酸殘基；V代表纈氨酸殘基。
上述抗原模擬表位肽在制備雞傳染性鼻炎診斷試劑和疫苗中的用途。
所述診斷試劑為C型副雞嗜血桿菌血清抗原的診斷試劑。
所述疫苗為C型副雞嗜血桿菌疫苗。
本發(fā)明的發(fā)明人以C型Hpg的一株血清型單抗為靶蛋白，從噬菌體展示的隨機(jī)線形十二肽庫(New England Biolabs公司)中篩選到與之結(jié)合的短肽。所篩選到的短肽具有12個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列為YX1PX2QWWX3X4X5X6X7序列。本發(fā)明公開了上述序列之一的最優(yōu)選序列為YSPHQWWLSGAV。
本發(fā)明的短肽可通過本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)如化學(xué)合成等方法制備。
將本發(fā)明公開的序列與GeneBank中已公布的Hpg的蛋白序列進(jìn)行比較，未發(fā)現(xiàn)有同源性，這些短肽可抑制天然抗原與單抗的結(jié)合，說明它們在結(jié)構(gòu)上能模擬天然抗原表位，為一種新的抗原模擬表位序列。
Hpg的血清型抗原成分迄今尚不清楚。本發(fā)明的目的是以這類短肽作為替代血清型抗原，用于對Hpg的鑒別診斷及新型疫苗的研制。將含有上述保守序列短肽的M13噬菌體純化后作為替代抗原，包被到96孔酶聯(lián)板，ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明該融合短肽可特異地與C型HPG單抗及C型Hpg接種后雞的多抗血清結(jié)合，而不與A型單抗及A型Hpg接種后雞的多抗血清反應(yīng)。
本發(fā)明的申請人將上述序列展示在大腸桿菌鞭毛硫氧還蛋白的袢環(huán)區(qū)，該區(qū)位于細(xì)菌鞭毛上，外源片段不僅具有一定的構(gòu)象約束性，而且可以實(shí)現(xiàn)高拷貝表達(dá)。將此重組菌作為免疫原，免疫接種SPF雞，獲得了特異識別插入序列和天然抗原的抗體，說明該表位肽構(gòu)成免疫原后可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對C型Hpg的抗體。
利用本發(fā)明的短肽，可以提供一種新型，快速，易于操作的雞的傳染性鼻炎的血清型鑒別診斷方法，并為進(jìn)一步研制安全高效新型疫苗奠定了工作基礎(chǔ)，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和市場前景。


圖1SDS-PAGE檢測單抗純化結(jié)果1，低分子量蛋白Marker.2，3，純化HPG-C-44單抗IgG圖2純化的HPG-C-44單抗對十二肽庫進(jìn)行篩選后富集情況圖3重組載體構(gòu)建示意4pFlitrx空載體酶切；1，空載體(P0)；2，P0+ApaI酶切；3，P0+XhoI酶切；4，Marker。
圖5重組質(zhì)粒P44酶切鑒定1，P44+Apa I；2，P44+EcoR V；3，P0+EcoR V；4，P0+Apa I；5，MarkerVI；6，P0。
圖6P44多克隆位點(diǎn)定點(diǎn)測序結(jié)果圖7重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖譜具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但所述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 C型副雞嗜血桿菌抗原模擬表位的篩選及序列分析實(shí)驗(yàn)材料1、噬菌體隨機(jī)肽庫試劑盒噬菌體表面衣殼蛋白III展示的線形12肽庫(Ph.D.-12TMPhage Peptide Library PeptideLibrary Kit)試劑盒購自美國New England Biolabs公司。肽庫的滴度4×1012pfu/ml，隨機(jī)多樣性1.9×109；受體菌E.coli ER2537基因型為F′lacqΔ(lacZ)M15proA+B+fhuA2 supE thiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5(rk-mk-McrBC-)。DNA全自動測序引物(-96gIII sequencing primer)5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’2、1株抗C型副雞嗜血桿菌單抗HPG-C-44；1株抗A型副雞嗜血桿菌單抗HPG-A-48；由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。
3、0083株A型副雞嗜血桿菌；668株和Modesto株C型副雞嗜血桿菌；人工感染SPF雞制備的0083株HPG-A、668株HPG-C和Modesto株HPG-C多抗雞血清均由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所張培君研究員保存。
4、化學(xué)試劑明膠、BSA、Tween-20、PEG 8000為Sigma公司產(chǎn)品；X-gal、IPTG為賽百盛公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨Amersham公司產(chǎn)品；抗M13KE多抗本室免疫兔得到的抗血清；羊抗鼠IgG-HRP、TMB中山生物工程公司產(chǎn)品；其它試劑為國產(chǎn)分析純。ProteinG-Sepharose4B親合層析柱購自Pharmacia公司。
5、相關(guān)試劑的配制低鹽LB培養(yǎng)基酵母提取物5g、胰蛋白胨10g和NaCl 5g溶解于蒸餾水并定容至1L，高壓滅菌；頂層瓊脂糖LB培養(yǎng)基+1g/L MgCl2·6H2O+7g/L瓊脂糖，高壓滅菌；底層LB/IPTG/X-gal平板LB培養(yǎng)基+15g/L瓊脂粉，高壓滅菌，冷卻至70℃時(shí)，加入IPTG和X-gal(終濃度分別為50μg/ml，40μg/ml)，鋪平板；PEG/NaCl20％(w/v)PEG-8000，2.5mol/LNaCl，高壓滅菌；TBS緩沖液50mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA，高壓滅菌；碘化鈉緩沖液10mmol/LTris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA，4mol/LNaI；PB緩沖液0.02mol/L Na2HPO4，0.02mol/L NaH2PO4；；6、主要儀器HimacCR21型高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；Biofuge22R臺式高速離心機(jī)(德國HERAEUS產(chǎn)品)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；JY92-IIII型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；DF-D型恒流恒壓電泳儀(北京東方儀器廠)；蛋白電泳槽(BIO-RAD公司)；UV-120-02型紫外分光光度儀(日本島津公司)；8823A-UV型紫外檢測儀(北京新技術(shù)應(yīng)用研究所)；EL311SX酶聯(lián)儀(美國BIO-TEK公司)；φ71型pH計(jì)(美國貝克曼公司)；EAGLE EYE II型成像儀(美國STRATAGENE公司)；潔凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；PYX-DHS-40×50型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；LRH-250A生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)。
1.1單克隆抗體的親和純化a.平衡將Protein G親合層析柱用0.02M pH7.0磷酸緩沖液清洗8～10柱體積，使柱平衡；b.上樣待純化的HPG-C-44單抗腹水1.5ml上樣，棄掉前兩滴，收集流出液，反復(fù)上樣3-5次，并在柱上保留數(shù)分鐘；c.洗脫先用3～5個(gè)柱體積的平衡液洗柱，洗掉非特異結(jié)合的部分，然后用0.1M Gly-HClpH2.7的洗脫緩沖液洗脫2～5個(gè)體積，在每個(gè)收集管中預(yù)先加入50μl pH9.0的1MTris-HCl中和液，使收集液近中性；d.SDS-PAGE電泳鑒定將收集液超濾濃縮，電泳鑒定純度。
e.純化鑒定SDS-PAGE檢測單抗純化效果(結(jié)果見圖1)，經(jīng)分光光度計(jì)計(jì)算，單抗HPG-C-44濃度是4.0μg/μl，單抗純度超過95％。
1.2純化單抗IgG的ELISA效價(jià)測定用滅活的HPG-C細(xì)菌(1010個(gè)/ml)超聲裂解后包被酶標(biāo)板兩條(8孔/條)，并設(shè)不包被的空白對照一條(8個(gè)孔)。4℃過夜，PBST清洗之后用10％脫脂乳300μl/孔、37℃封閉1hr。之后加入44#單抗1μg/100μl/孔到8個(gè)裂解菌液的包被孔和空白對照孔中，另外8個(gè)HPG-C包被孔加入無關(guān)單抗100μl/孔做對照。37℃作用0.5hr，PBST清洗之后加入稀釋好的兔抗鼠酶標(biāo)二抗IgG-HRP100μl/孔，37℃作用0.5hr，PBST清洗之后，加TMB底物顯色20min，2N的50μl/孔H2SO4終止反應(yīng)，50μl/孔，OD450讀數(shù)，結(jié)果見表1。
表1，純化HPG-C-44單抗IgG的ELISA效價(jià)測定

1.3純化的HPG-C單抗對十二肽庫進(jìn)行篩選a.包被純化的HPG-C-44單抗以100μg/ml包被96孔酶聯(lián)板，100μl/孔，4℃包被過夜；b.封閉移去孔中的包被液，然后用0.5％BSA封閉包被孔和空白對照孔300μl/孔，37℃1h；c.洗滌移去封閉液，用TBS-T(0.1％Tween-20)洗6遍；d.結(jié)合用TBS-T(0.1％Tween-20)稀釋噬菌體，每孔加入1μg，室溫輕輕搖動孵育60min；e.清洗移去未結(jié)合的噬菌體，按照上述清洗方法，用TBS-T洗10遍；f.洗脫每孔加入100μl 0.2mol/L Gly-HCl(pH2.2)，室溫洗脫7-9ming.中和吸出洗脫液，加入含有15μl 1M Tris-HCl(pH9.1)中和緩沖液的離心管中，使洗脫液近中性；h.滴度測定和噬菌體的擴(kuò)增取出10μl中和液用LB培養(yǎng)基按10-8-10-10稀釋，進(jìn)行噬菌體滴度的測定，剩余的擴(kuò)增、純化后重復(fù)步驟a-g進(jìn)行下一輪篩選。單抗篩選富集情況見圖2。
1.4噬菌體的擴(kuò)增和純化a.挑取宿主菌ER2537單菌落，接種于低鹽LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈振動培養(yǎng)過夜。
b.過夜菌按1∶100接種于20ml低鹽LB培養(yǎng)基中，加入待擴(kuò)增的噬菌體，37℃振搖培養(yǎng)4.5h；c.將菌液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中，4℃、10,000r/m離心10min；上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，混勻，在4℃沉淀2h。然后4℃、10,000r/m離心5-10min，棄上清；d.沉淀溶于1ml TBS，然后移至1.5ml離心管中，12,000r/m離心10min；e.上清移至另一1.5ml離心管中，再加入1/6體積的PEG/NaCI，混勻后于4℃沉淀15min，然后4℃，10,000r/m離心10min；f.沉淀溶于60ul TBS(含0.02％NaN3)，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 1.5噬菌體滴度的測定a.挑取宿主菌ER2537單菌落，接種于低鹽LB培養(yǎng)基中，37℃劇烈搖至對數(shù)生長期(OD600≈0.5)；b.37℃預(yù)溫LB/IPTG/X-gal平板。
c.頂層瓊脂糖在微波爐中融化后分裝到無菌試管，每管3ml，保溫于65℃水浴鍋中；d.用低鹽LB培養(yǎng)基將洗脫的噬菌體按10倍梯度稀釋；e.取10μl不同梯度的噬菌體稀釋液分別加入200μl對數(shù)生長期的ER2537菌液中，渦旋混勻，室溫孵育5min；f.將上述混合液加入3ml頂層瓊脂糖中迅速渦旋后，立即在37℃預(yù)熱的LB/IPTG/X-gal平板上鋪板，放置冷卻后，培養(yǎng)箱中37℃倒置培養(yǎng)過夜；g.計(jì)算噬菌斑數(shù)在平板中選100個(gè)噬菌斑左右者進(jìn)行1/2面積計(jì)數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)即得每10μl原液所含噬菌體的個(gè)數(shù)，通常以pfu/μl或pfu/ml表示。
一般情況下，淘洗下來的噬菌體以101-104倍稀釋，擴(kuò)增后的噬菌體以108-1011倍稀釋。
1.6 HPG-C-44單抗篩選出的噬菌體克隆與該單抗ELISA及與HPG-C競爭ELISA分析a.包被A、B、C、D、E五行均用0.5μg/100μl的HPG-C-44抗包被；F行只包被液空白對照。4℃包被過夜。
b.封閉移去孔中的包被液，然后用5％脫脂奶封閉包被孔和空白對照孔300μl/孔，37℃1hr；c.洗滌移去封閉液，用PBS-T(0.1％Tween-20)洗3遍。
d.噬菌體克隆與HPG-C細(xì)菌裂解液競爭結(jié)合A、B、C、D、F各行的所有孔中加入與所對應(yīng)列號的phage克隆，0.5μg/50μl/孔，在B、C、D、E各行依次加入10倍、102倍、103倍、103倍稀釋的細(xì)菌(原始濃度1010個(gè)/ml)裂解液50μl/孔，37℃1hr。A、F行各孔用PBS補(bǔ)足液量至100μl。
e.洗滌移去結(jié)合液，用PBS-T(0.1％Tween-20)洗6遍。
f.M13酶標(biāo)抗體結(jié)合在各反應(yīng)孔中加入1∶5000倍稀釋的酶標(biāo)二抗兔抗M13IgG-HRP，37℃1hr。
g.洗滌移去反應(yīng)液，用PBS-T(0.1％Tween-20)洗6遍。控干。
h.顯色加入TMB底物顯色，10分鐘后用2N的H2SO4終止反應(yīng)。
i.讀數(shù)分光光度計(jì)讀OD450，并記錄。試驗(yàn)結(jié)果如表2表2，HPG-C-44單抗篩選出的噬菌體克隆與該單抗ELISA及與HPG-C競爭ELISA結(jié)果

1.7噬菌體單鏈DNA的制備、序列的測定a.將1.4中的ER2537過夜菌按1∶100接種于低鹽LB培養(yǎng)基中，1ml/管分裝于培養(yǎng)試管中，挑取噬菌斑加入其中，37℃振搖培養(yǎng)4.5-5h；b.將500μl擴(kuò)增后的噬菌體液體，10,000r/m離心10分鐘，取上清重復(fù)離心一次。
c.上清移至另一離心管中，加入200μl PEG/NaCl，混勻，室溫放置10mind.10,000r/m離心10min，棄上清，再短暫離心，吸盡上清；e.用100μl碘化鈉緩沖液充分重懸沉淀，加入250μl無水乙醇，室溫放置10min；f.10,000r/m離心10min，棄上清，用70％乙醇清洗沉淀；用30μl TE溶解沉淀，送公司進(jìn)行測序并翻譯為氨基酸序列。用M13反向-96位遠(yuǎn)端引物在CEQ2000XL自動測序儀上完成。
測序結(jié)果如下
44-B2Y S P H Q W W L S G A V44-34T D K N Y S P D Q W W T44-27Q P N V P Y D P H A W W44-28D T T S Y N P R A W W A44-31S L P Y D P L E W W G I44-36Y L P Y D P L E W W G I44-26G T V Q Y S P Y L W W T44-33A L W T P V S P S W W W44-25I Y P P N L W Q A V S Q采用Internet BLAST(網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)軟件對Hpg結(jié)合肽的共有序列進(jìn)行比較，得出，上述氨基酸序列有共同的核心序列Y-P-WW。
實(shí)施例2 模擬表位融合肽在鑒別診斷中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)材料宿主菌GI826(F-，lacIq，ampC∷PtrpcI，ΔfliC，ΔmotB，eda∷Tn10)，Invitrogen公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pFliTrx Invitrogen公司產(chǎn)品；主要試劑限制性內(nèi)切酶ApaI，Xho I TaKaRa公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶TaKaRa公司產(chǎn)品；Taq聚合酶TaKaRa公司產(chǎn)品。
相關(guān)培養(yǎng)基10×M9鹽Na2HPO460g，KH2PO430g，NaCl 5g，NH4Cl 10g溶于900ml去離子水，用10MNaOH調(diào)至pH7.4；IMC培養(yǎng)基含1×M9鹽溶液，0.2％酪蛋白酸性水解物，0.5％葡萄糖，1mmol/L MgCl2；RM培養(yǎng)基1×M9鹽，2％酪氨酸，1％甘油，1mMMgCl2；SOC培養(yǎng)基胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl0.5g，2.5mmol/L KCl，10mmol/LMgCl2，20mmol/L葡萄糖。
兔抗雞IgG-HRPROCKLAND公司產(chǎn)品，購自上海吉泰科技有限公司儀器設(shè)備BIO-Rad Gene Pulser II電轉(zhuǎn)儀(美國BIO-RAD公司)；PTC-150minicycler PCR儀(美國MJ RESEARCH產(chǎn)品)；HimacCR21型高速冷凍離心機(jī)(日本日立公司)；Biofuge22R臺式高速離心機(jī)(德國HERAEUS產(chǎn)品)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科器研究所)；DF-D型恒流恒壓電泳儀(北京東方儀器廠)；蛋白電泳槽(BIO-RAD公司)；UV-120-02型紫外分光光度儀(日本島津公司)；8823A-UV型紫外檢測儀(北京新技術(shù)應(yīng)用研究所)；EL311SX酶聯(lián)儀(美國BIO-TEK公司)；φ71型pH計(jì)(美國貝克曼公司)；EAGLE EYE II型成像儀(美國STRATAGENE公司)；潔凈工作臺(北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠)；PYX-DHS-40×50型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；LRH-250A生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)。
2.1質(zhì)粒DNA的小量提取自RMG平板上挑取單克隆菌落，接種于RM(氨芐濃度100μg/μl)培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD值為1.0～2.0，取菌液1ml利用Wizard Plus Minipreps DNA系統(tǒng)提取質(zhì)粒，具體操作參照說明書。
2.2電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備g.挑取單克隆GI826宿主菌在50mlLB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12～16小時(shí)；h.50ml過夜培養(yǎng)的菌液加入1L LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD550為0.6i.菌液冰浴30min，4℃2000g離心15min，棄上清；j.預(yù)冷的無菌去離子水500ml懸浮沉淀，4℃2000g離心15min；k.預(yù)冷的無菌去離子水250ml懸浮沉淀，4℃2000g離心15min；l.預(yù)冷的10％無菌甘油10ml懸浮沉淀，4℃4000g離心15min；m.預(yù)冷的10％無菌甘油1ml懸浮沉淀，分裝于0.5ml離心管中，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.3模擬表位基因片段的獲得a.基因片段的設(shè)計(jì)合成根據(jù)線性12肽庫對C型單抗的篩選結(jié)果，選取模擬表位氨基酸序列YSPHQWWLSGAV，把帶有該片段的噬菌體克隆命名為P44。
按照原始測序結(jié)果并在5`端加ApaI，3`端加XhoI合成如下堿基序列44-15`CAGTATTCGCCTCATCAGTGGTGGCTTAGTGGTGCTGTTGC 3`44-25`TCGAGCAACAGCACCACTAAGCCACCACTGATGAGGCGAATACTGGGCC3`b.合成片段的退火反應(yīng)將合成的互補(bǔ)片段分別溶于滅菌去離子水中，使其濃度為1μg/μl，以等摩爾取互補(bǔ)片段各10μl，加入退火緩沖液(10mM Tris，pH7.5～8.0，50mMNaCl，1mM EDTA)3μl，用去離子水補(bǔ)至終體積為50μl，混勻后放入95℃水浴，緩慢降至室溫。
2.4外源片段與載體的連接重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖3a.載體的酶切根據(jù)插入片段所加的酶切位點(diǎn)，以相應(yīng)的酶對載體進(jìn)行酶切。操作按酶切說明書進(jìn)行，可適當(dāng)放大反應(yīng)體系；b.連接反應(yīng)酶切的載體回收純化，插入片段與載體片段以5∶1的摩爾比，16℃連接過夜，反應(yīng)體系10μl。
2.5質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化根據(jù)所用的菌種，電轉(zhuǎn)儀的參數(shù)設(shè)置為25μF，2.5kV，200Ω；采用0.2mm電轉(zhuǎn)杯，將100μl電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞與2μl連接產(chǎn)物混勻后加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯，置入電擊槽中，電擊4msec，迅速加入900ulSOC(室溫)培養(yǎng)液，37℃緩慢振搖45min，將菌液涂布于RMG-Amp培養(yǎng)板中，待菌液干后，于30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)(不超出12小時(shí))。
2.6重組質(zhì)粒的鑒定a.酶切鑒定按酶切說明書，分別用Apa I，Xho I，EcoR V進(jìn)行單酶切，電泳觀察酶切條帶；(如圖4，圖5)由于外源片段的插入對質(zhì)粒基因組的大小改變不顯著，所以直接用瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳不易鑒別；但由于外源片段的插入，改變了原載體多克隆位點(diǎn)的酶切圖譜，使一些酶切位點(diǎn)被切除，利用這一改變可對重組質(zhì)粒作初步鑒定即用載體中保留的及被切除的酶切位點(diǎn)的內(nèi)切酶消化原質(zhì)粒及重組質(zhì)粒，針對我們所設(shè)計(jì)的片段，EcoRV位點(diǎn)被切除；Apa I，Xhol I等位點(diǎn)依然保留，這樣，能被Xhol I切開而不能被EcoRV切開的可能為重組質(zhì)粒；能被兩種酶切開的則是原質(zhì)粒。
b.測序鑒定將經(jīng)上述方法初步鑒定為陽性的克隆作DNA測序鑒定(結(jié)果如圖6)。經(jīng)序列比對，所得序列與目的序列完全一致。
2.7模擬表位融合肽在鑒別診斷中的應(yīng)用a.將噬菌體克隆P44作為抗原包被96孔酶聯(lián)板(濃度1μg/100μl)，每孔100μl，4℃孵育過夜；設(shè)M13噬菌體肽庫包被對照和不包被空白對照。
b.倒掉包被液，每孔加入250μl 10％的脫脂奶粉，37℃封閉1h；c.洗去封閉液，用ELISA方法對A型和C型單抗及多抗雞血清(均由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存)分別進(jìn)行檢測，并設(shè)SPF雞血清對照，血清稀釋度為1∶100，37℃孵育1h；d.在加入單抗的孔中加入羊抗鼠IgG-HRP酶標(biāo)二抗，在加入雞血清多抗的孔中加入兔抗雞IgG-HRP酶標(biāo)二抗。采用TMB顯色系統(tǒng)顯色，測定OD450。
e.重組噬菌體P44與不同HPG抗體的ELISA結(jié)果以及噬菌體肽庫與不同HPG抗體的EUSA結(jié)果見表3。
表3 噬菌體與不同抗體的ELISA反應(yīng)

表3的ELISA結(jié)果顯示帶有目的肽段的噬菌體P44能特異結(jié)合Hpg-C-44單抗及HPG-C多抗血清，而不與Hpg-A型單抗及HPG-A多抗血清結(jié)合，兩者有顯著性差異(p＜0.01)；不帶目的肽段的M13噬菌體與A型和C型單抗或多抗均不反應(yīng)。
因此該方法能方便快捷地識別HPG致病菌是否為C型，為按血清型進(jìn)行免疫接種提供鑒別依據(jù)。
實(shí)施例3模擬表位融合肽在疫苗中的應(yīng)用3.1實(shí)驗(yàn)動物及材料45日齡非免疫雞56只，購自北京市實(shí)驗(yàn)動物研究所；誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌F44；誘導(dǎo)后的帶有空載體的宿主菌F0；HPG-C活細(xì)菌等，本研究室保存；SPF雞抗HPG-C的抗血清，HPG油乳劑滅活疫苗等，本研究室保存。
3.2展示模擬表位的重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)測序鑒定正確的重組菌(命名為F44)菌液按1∶100比例接種于RM培養(yǎng)基，(氨芐濃度為100μg/μl)中，30℃振蕩培養(yǎng)15h，(約為2.0-3.0)；取過夜菌40μl接種至2mlIMC培養(yǎng)基中，色氨酸(濃度為100μg/ml)誘導(dǎo)，37℃振蕩培養(yǎng)6h，收集菌體，檢測OD600，根據(jù)吸收值確定電泳上樣體積，檢測菌體的誘導(dǎo)表達(dá)。(如圖7)3.3表位展示疫苗的安全性試驗(yàn)45日齡非免疫雞16只，用誘導(dǎo)表達(dá)后的F44活菌分別口服(滴鼻、點(diǎn)眼)、肌注注射各8只，劑量為5億菌/只，是免疫劑量的5倍。三周內(nèi)觀察實(shí)驗(yàn)雞有無異常反應(yīng)；安全性檢驗(yàn)的試驗(yàn)雞在試驗(yàn)期間沒有出現(xiàn)任何異?，F(xiàn)象，說明本表位疫苗在雞體內(nèi)不產(chǎn)生任何的不良反應(yīng)。
3.4表位疫苗的保護(hù)性試驗(yàn)45日齡非免疫雞40只分A、B、C、D、E五組，8只/組。A、B兩組分別用重組菌F44活菌肌注、滴鼻點(diǎn)眼免疫。首免1億菌/只，三周后進(jìn)行二次免疫，劑量及途徑同首免；C組為常規(guī)疫苗免疫對照組，用二價(jià)油乳劑滅活菌苗(本所生產(chǎn))肌注0.5ml/只；D組為空載體宿主菌免疫對照組，用不含有目的肽段的F0活菌肌肉注射，1億菌/只，免疫方法同F(xiàn)44；E組為不免疫對照組，試驗(yàn)全程不使用任何副雞嗜血桿菌疫苗免疫，肌注相同劑量的生理鹽水。二次免疫三周后，用HPG-C強(qiáng)毒(668株)細(xì)菌給所有試驗(yàn)雞攻毒，眶下竇注射20萬菌/只，分別觀察各組的保護(hù)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
第一次免疫之前隨機(jī)采集8只試驗(yàn)雞的血清；第二次免疫之前以及最后攻毒之前分別采集各組試驗(yàn)雞血清并編號，以備抗體檢測之用。
表4重組菌作為表位疫苗的免疫保護(hù)試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果是不免疫對照組雞只7/8發(fā)病，而重組菌F44免疫雞兩組共16只全部免疫保護(hù)，沒有發(fā)病；常規(guī)疫苗免疫組也全部保護(hù)，沒有發(fā)病；空載體宿主菌免疫的試驗(yàn)雞6/8發(fā)病。說明該重組菌作為副雞嗜血桿菌疫苗，具有預(yù)防HPG-C攻擊的能力。
3.5重組菌免疫血清與天然HPG-C抗原的反應(yīng)用HPG-C細(xì)菌抗原包被ELISA反應(yīng)板，與重組菌免疫后不同時(shí)期采集的雞血清(見上述步驟3.4)進(jìn)行反應(yīng)，并設(shè)HPG-C陽性血清對照和SPF雞血清對照。
a.包被C型副雞嗜血桿菌(濃度為1010cell/ml)的超聲破碎液，每孔100μl，4℃孵育過夜；b.每孔加入250μl 10％的脫脂奶粉，37℃封閉1h；c.洗去封閉液，每孔相應(yīng)加入重組菌與宿主菌免疫后的血清，血清稀釋度為1∶100，37℃孵育1h；d.用ELISA方法檢測不同細(xì)菌免疫雞血清與副雞嗜血桿菌的反應(yīng)性。
e.酶標(biāo)二抗用兔抗雞IgG-HRP，采用TMB顯色系統(tǒng)顯色，測定OD450。結(jié)果見表5。
表5.重組菌免疫血清與天然抗原副雞嗜血桿菌的ELISA反應(yīng)

附圖一種C型副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽的優(yōu)選序列SEQ 1YSPHQWWLSGAV
權(quán)利要求
1.一種C型副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽，其氨基酸序列為以下通式Y(jié)X1PX2QWW X3X4X5X6X7，其中Y代表酪氨酸殘基；P代表脯氨酸殘基；Q代表谷氨酰胺殘基；W代表色氨酸殘基；X1～X7代表任意氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的C型副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽，所述氨基酸序列為YSPHQWWLSGAV，其中S代表絲氨酸殘基；H代表組氨酸殘基；L代表亮氨酸殘基；G代表甘氨酸殘基；A代表丙氨酸殘基；V代表纈氨酸殘基。
3.權(quán)利要求1或2所述的C型副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽在制備雞傳染性鼻炎診斷試劑和疫苗中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，所述診斷試劑為C型副雞嗜血桿菌血清抗原的診斷試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，所述疫苗為C型副雞嗜血桿菌疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種C型副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽及其用途。一種C型副雞嗜血桿菌的抗原模擬表位肽，其氨基酸序列為以下通式Y(jié)X
文檔編號A61K39/07GK1724560SQ20051001196
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月20日
發(fā)明者張培君, 王宏俊, 柳川, 高亞萍, 龔玉梅, 孫惠玲 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所