一種副豬嗜血桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】 本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物制品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種副豬嗜血桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuas,簡稱HPs)是一種條件性致病菌，又稱革拉瑟 氏菌?。℅lasser' s disease)，是豬群上呼吸道的一種常在菌，屬于巴氏桿菌科，嗜血桿菌 屬，在特定條件下可以侵入機體并導(dǎo)致嚴重的全身性疾病，如多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，以 發(fā)熱、咳嗽、消瘦、呼吸困難、跛行、共濟失調(diào)和被毛粗亂等主要臨床癥狀。該病只感染豬，從 2周齡到4月齡的豬均易感，通常見于5?8周齡的豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病。本 病是Glasser于1910年首次描述了漿液性纖維素性胸膜炎、心包炎以及腦膜炎患豬的漿液 性分泌物中存在的一種革蘭氏陰性桿菌，1922年由Schermer和Ehrlich首次分離到該菌， 直到1992年才通過SPF(Specific Pathogen Free，無特定病原體）豬證實了副豬嗜血桿 菌的致病性以及不同血清型菌株之間的毒力差異。通常情況下，在正常豬的鼻腔、扁桃體中 可分離到該菌，但不引起豬發(fā)病。一些導(dǎo)致機體抵抗力下降的因素，如應(yīng)激、惡劣環(huán)境及其 他病原感染會造成副豬嗜血桿菌病的暴發(fā)和流行。臨床實踐表明，當豬群感染豬圓環(huán)病毒 2型（PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)后，容易繼發(fā)感染副豬嗜血桿菌。目前，該 病在集約化豬場內(nèi)發(fā)病率呈明顯上升趨勢，發(fā)病率一般在10 %?15%，嚴重時死亡率可達 50%，主要引起哺乳和斷奶仔豬死亡率升高、生長發(fā)育不良、飼料利用率降低，給養(yǎng)豬業(yè)造 成嚴重的經(jīng)濟損失。 副豬嗜血桿菌對營養(yǎng)要求苛刻，生長嚴格需要V因子（NAD，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）， 不需要X因子（血紅素和其他卟啉類物質(zhì)）。該菌在添加有胎牛血清和NAD的TSA固體培 養(yǎng)基上培養(yǎng)24h可見針尖大小灰白色菌落，呈表面光滑濕潤、邊緣整齊、中間隆起、針尖大 小的圓形菌落。該菌在巧克力瓊脂平板上生長困難，據(jù)報道也不適合于體外傳代培養(yǎng)。液體 培養(yǎng)時需要在肉湯或TSB培養(yǎng)基中添加NAD和胎牛血清。由于葡萄球菌生長過程中會將自 身代謝產(chǎn)物V因子釋放到培養(yǎng)基中，所以兩菌共培養(yǎng)時，隨著與金黃色葡萄球菌距離增加， 菌落逐漸變小，該現(xiàn)象被稱為衛(wèi)星現(xiàn)象。細菌分離鑒定時應(yīng)采集處于疾病急性期的豬并沒 有應(yīng)用抗生素的病料，最好選擇心臟血液及漿膜表面物質(zhì)或滲出的腦脊髓液，以減少雜菌 的污染并能增加分離到致病菌的機會。 HPs感染的大多數(shù)流行病學研宄是根據(jù)血清學分型，傳統(tǒng)的血清學分型方法是根據(jù)熱 穩(wěn)定可溶性抗原和瓊脂擴散試驗（GD)，已有15種血清型得到證實，另有20%以上的分離 株血清型不可定型，各血清型菌株之間的致病力有極大的差異，其中血清1、5、10、12、13、14 型毒力最強，其次是血清2、4、8、15型，血清3、6、7、9、11型的毒力較弱，并且副豬嗜血桿菌 還具有明顯的地方性特征，相同血清型的不同地方分離株可能毒力不同。雖然有研宄表明 相同血清型的不同菌株可能沒有交叉保護，但血清分型信息依然可以用于對交叉保護的預(yù) 測。HPs最近已成為豬場保育豬死亡的主要原因之一，導(dǎo)致HPs流行加強的因素仍不清楚。 研宄表明，抗生素預(yù)防或口服藥物治療對嚴重的HPs暴發(fā)可能無效，一旦臨床癥狀出現(xiàn)，應(yīng) 對整個主群進行藥物治療，而將HPs徹底清除以控制該病發(fā)生的措施并不可取，因為1周齡 前的仔豬鼻黏膜就可能有HPs的定居，因此通過早期斷奶來根除該病不可能取得成功。因 此研宄針對本地區(qū)流行的廣譜疫苗，是防治副豬嗜血桿菌需要深入研宄的重要問題。

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明的目的是提供一種副豬嗜血桿菌及其應(yīng)用，即從山東青島萊西分離的副豬嗜血 桿菌血清5型疫苗株LX-5,從而解決副豬嗜血桿菌商品化疫苗各個血清型之間免疫交叉保 護力低、免疫原性不強、相同血清型不同地域間免疫交叉保護力低的問題。 本發(fā)明的副豬嗜血桿菌（Haemophilus Parasuis)，菌株號為LX-5,已保藏于位于北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日 期為2014年12月19日，保藏編號為CGMCC No. 10230。 所述的副豬嗜血桿菌用于制備治療豬副豬嗜血桿菌病的藥物。 其中，所述的藥物為疫苗，優(yōu)選為滅活疫苗，其使用的佐劑優(yōu)選為蜂膠。 該豬嗜血桿菌與藥學上可接受的載體或輔料組合構(gòu)成藥物，如單價苗、多價苗或聯(lián)苗 等。 所述副豬嗜血桿菌在藥物中含菌量優(yōu)選為4 X IO9CFUAiL以上。 本發(fā)明的副豬嗜血桿菌血清5型疫苗株LX-5具有穩(wěn)定的生物學特性，對仔豬有較強的 致病性，且具有良好的免疫原性，應(yīng)用其制備的蜂膠滅活疫苗安全可靠，能夠產(chǎn)生較高水平 的抗體，持續(xù)期長，并且對同源菌種攻毒的豬具有非常好的保護效果，免疫后豬群的發(fā)病率 和死亡率均明顯減少，其免疫效果達到或優(yōu)于市場上現(xiàn)有的商品化疫苗，能夠有效的預(yù)防 副豬嗜血桿菌病的流行和傳播，降低本病造成的經(jīng)濟損失，有著廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】 根據(jù)下述實施例，可以更好的理解本發(fā)明。 實施例1 :副豬嗜血桿菌血清5型疫苗株LX-5的分離純化和鑒定。 1. 生產(chǎn)用培養(yǎng)基 TSA固體培養(yǎng)基配制：準確稱取TSA粉末4g，溶于IOOmL蒸餾水，充分搖勻后121°C高 壓蒸汽滅菌20min，冷卻至50?60 °C時，加入5 %無支原體胎牛血清和0. 005% NAD，混合均 勻后倒板，放4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?TSB液體培養(yǎng)基配制：準確稱取TSB粉末3g，溶于IOOmL蒸餾水，充分搖勻后121°C高 壓蒸汽滅菌20min，冷卻至50?60 °C時，加入5 %無支原體胎牛血清和0. 005% NAD，混合均 勻后放4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?2. 副豬嗜血桿菌的分離純化及鑒定 2. 1分離純化 該菌株是發(fā)明人于2012年8月在青島農(nóng)業(yè)大學山東省重點預(yù)防獸醫(yī)實驗室分離來自 青島萊西病豬的肝臟、肺臟、關(guān)節(jié)液等部位，具有較強的毒力和很高的免疫原性。 2012年8月，分離的病料由青島農(nóng)業(yè)大學山東省重點預(yù)防獸醫(yī)實驗室提供，其具有 典型漿膜炎、腹膜炎、心包炎等癥狀，無菌采集肝臟、肺臟、關(guān)節(jié)液，接種于TSA平板，放于 37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?48h，并進行連續(xù)純化培養(yǎng)，挑取無色光滑透明、邊緣整齊、 中間隆起、針尖大小的單菌落，與生理鹽水混勻后，進行革蘭氏染色，鏡下可見紅色革蘭氏 陰性小桿菌。同時接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂固體培養(yǎng)基，結(jié)果，在添加有胎牛血清和 NAD的TSA平板上生長良好，鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基和普通瓊脂固體培養(yǎng)基沒有菌落生成。 2. 2生化鑒定 在超凈工作臺中，用接種環(huán)挑取針尖大小、光滑透明的單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基 中，180r/min振蕩培養(yǎng)12?16h，吸取菌液依次加入到以下含NAD的生化鑒定管中，37°C恒 溫箱中培養(yǎng)，結(jié)果為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、半乳糖、接觸酶、硝酸鹽還原陽性，乳糖、甘露糖、 阿拉伯糖、氧化酶、吲哚、尿素酶陰性，均與HPs標準菌株的特征相符合。 將純培養(yǎng)的菌落在脫纖綿羊鮮血瓊脂固體培養(yǎng)