一種副豬嗜血桿菌試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種副豬嗜血桿菌5型膠體金定型試劑盒和試劑盒的制備方法。本發(fā)明的試紙條,包括依次連接固定于PVC板上的由吸水材料構成的樣品墊、包被有抗原的膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸收墊，以及位于硝酸纖維素膜上且相互分開的檢測線和質(zhì)控線，其中膠體金墊包被的抗原是副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白，檢測線是副豬嗜血桿菌5型全菌抗原，質(zhì)控線是副豬嗜血桿菌全菌抗原的多抗IgG。本發(fā)明的試紙條具有特異性好、敏感性強和重復性的優(yōu)點。
【專利說明】一種副豬嗜血桿菌試紙條及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種畜牧業(yè)使用的疾病檢測試劑及制備方法，特別是一種副豬嗜血桿菌5型膠體金定型試劑盒,和該試劑盒的制備方法。

【背景技術】
[0002]由于副豬嗜血桿菌血清型較多，目前已知的有15個血清型，用于檢測該病原和抗體的方法也較多，但均是種特異性的，副豬嗜血桿菌病的檢測方法有檢測抗原的PCR方法還有檢測血清抗體的間接血凝方法以及ELISA方法，定型檢測只有本 申請人:研制的瓊擴試驗進行，瓊擴試驗制備復雜，檢測需要2-3天才能出結果，且被檢血清需要濃縮，對抗原的要求高。副豬嗜血桿菌5型是目前我國副豬嗜血桿菌病的流行的毒株之一，但現(xiàn)有技術中缺少能夠定型檢測5型血清型抗體，特別是快速檢測方法，因此影響田間流行病學的調(diào)查和準確進行防治工作。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術不足，能簡捷、方便且快速地進行副豬嗜血桿菌5型分型檢測的試紙條。
[0004]一種檢測副豬嗜血桿菌5型試紙條，包括依次連接固定于PVC板上的由吸水材料構成的樣品墊、包被有抗原的膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸收墊，以及位于硝酸纖維素膜上且相互分開的檢測線和質(zhì)控線，其中膠體金墊包被的抗原是副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白，檢測線是副豬嗜血桿菌5型全菌抗原，質(zhì)控線是副豬嗜血桿菌全菌抗原的多抗IgG。
[0005]本發(fā)明的副豬嗜血桿菌試紙條制備方法是:
a.用副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白包被膠體金，制備出膠體金；
b.在PVC條上依次固定吸水材料構成的樣品墊、包被有抗原的膠體金墊、硝酸纖維膜、吸收墊
c.取副豬嗜血桿菌5型全菌抗原，經(jīng)過超聲波破碎，反復凍融之后3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清在硝酸纖維膜上制備檢測線；
d.用得到的副豬嗜血桿菌5型全菌抗原多抗IgG，在硝酸纖維膜上制備檢測線；
e.按要求切割得到副豬嗜血桿菌試紙條。
[0006]本發(fā)明的副豬嗜血桿菌試紙條制備方法中，抗原結合金標墊的pH值為7.0，且在抗原結合的過程中需要加入18% BSA 50ul/ml、l%PEG 20000 50ul/ml進行封閉，封閉時間為30分鐘，經(jīng)過封閉可減少假陽性的出現(xiàn)，離心后的重懸液其配方為:0.02M四硼酸鈉、0.5% BSA,5%蔗糖、0.05%吐溫20，重懸后鋪金，37°C干燥I小時。然后進行試紙條的組裝。
[0007]本發(fā)明的副豬嗜血桿菌試紙條所用的制備方法中，副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白是以副豬嗜血桿菌DNA 為模板，以 5' -GGCGAATTCATGCAAACAACCTTTACC-3' (SEQ ID N0.1)和 5' -CCCTCGAGTTACTGCTTAATGATATA-3' (SEQ ID No2).為引物進行 PCR 擴增，將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物連接入pMD18-T simple vector，再按常規(guī)方法轉化DH5 α感受態(tài)細，經(jīng)酶切后陽性重組質(zhì)粒命名為為pMD-OppA，分別用I和通ο I雙酶切重組質(zhì)粒pMD-OppA與pET-30a-c (+)載體，酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切下所需的目的條帶，回收純化目的片段和載體片段，用T4 Iigase連接，再將連接產(chǎn)物轉化到DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞中得到陽性重組質(zhì)粒命名為pET-30a-0ppA，再將重組表達質(zhì)粒pET-30a-0ppA轉化大腸桿菌BL21得到DE3-HPS-0ppA工程菌種，DE3-HPS_0ppA工程菌誘導表達后層析柱純化后得到。
[0008]本發(fā)明的試紙條具有特異性好、敏感性強和重復性的優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明的試紙條示意圖，圖中:IPVC板，2硝酸纖維素膜，3吸收墊，4金標墊，5樣品墊，6質(zhì)控線，7檢測線，
圖2為純化的OppA重組蛋白SDS-PAGE電泳圖，其中:M.蛋白分子質(zhì)量標準；1泳道為純化前蛋白；2.泳道為純化后的蛋白。
[0010]圖3為本發(fā)明的試紙條對標準陽性血清和陰性血清檢測結果圖，其中:1為陽性血清；2為陰性血清。
[0011]圖4為本發(fā)明試紙條檢測田間血清陽性結果圖和陰性對照，其中:1-7為試紙條檢測田間血清陽性結果；8為陰性對照。
[0012]圖5為本發(fā)明試紙條特異性結果圖，其中:1)對副豬嗜血桿菌5型血清；2)豬傳胸血清；3)豬肺炎支原體血清；4)巴氏桿菌陽性血清。由圖可見本發(fā)明的試紙條僅對副豬嗜血桿菌5型血清顯陽性，而對其它的血清均為陰性。
[0013]圖6試紙條檢測15個血清型結果圖，由圖可知其中只有5型(左邊第一條試紙)為陽性結果，其他血清型為陰性結果。

【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明以下結合實施例解說。
[0015]本發(fā)明的試紙條中使用的金標墊包被的抗原為副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白。本發(fā)明的金標墊包被的抗原為副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白，該蛋白是副豬嗜血桿菌15個血清型中共有的特異性蛋白，經(jīng)過體外獲得序列，進行了序列優(yōu)化，加入了融合標簽，然后克隆、表達的蛋白，表達之后經(jīng)過一系列的純化，然后運用于該試紙條，其目的是提高了檢測試紙條的特異性。其制備方法如下:
I引物設計及酶切位點的選擇
根據(jù) GenBank 中 HPS OppA 基因序列(SH0165 株登錄號:NC_011852.1),應用 Primer
5.0設計I對特異性引物，上、下游引物分別引入I和通ο I酶切位點(下劃線部分)，引物如下:
上游引物 OppA-F:5' -GGCGAATTCATGCAAACAACCTTTACC-3' (SEQ ID N0.1)；
下游引物 OppA-R:5' -CCCTCGAGTTACTGCTTAATGATATA-3' (SEQ ID N0.2)。
[0016]擴增片段長度為1638 bp。
[0017]2 OppA基因的克隆
副豬嗜血桿菌5型(HPS 5型)抗原系中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所保存，經(jīng)過劃線培養(yǎng)接種搖菌瓶到一定量，將培養(yǎng)的HPS提取DNA，使用0ppA-F/0ppA-R引物進行PCR，PCR條件為:94°C 變性5 min后，以94°C 50 s、51°C 45 s ,72°C 2 min循環(huán)35次，最后72°C延伸10min，PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用干凈的刀片快速切下含有目的片段的瓊脂糖凝膠，按Agarose Gel DNA Extract1nKit (Axygen)說明書操作進行回收純化。按照pMD18_T simple vector kit (TaKaRa)操作說明書，將純化的PCR產(chǎn)物連接入pMD18-T simple vector, 16 1:連接過夜。按常規(guī)方法轉化DH5ci感受態(tài)細胞后挑選陽性克隆(《分子克隆》第二版，中國科學出版社)。經(jīng)酶切和測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為為pMD-OppA。
[0018]3 OppA表達工程菌構建
3.1重組表達載體pET-30a-0ppA的構建
分別用I和通ο I雙酶切重組質(zhì)粒pMD-OppA與pET-30a-c (+)載體，使其產(chǎn)生相同的粘性末端。酶切后經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，切下所需的目的條帶，用Agarose GelDNA Extract1n Kit (Axygen)回收純化目的片段和載體片段,用T4 ligase (TaKaRa)過夜連接，將連接產(chǎn)物轉化到DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經(jīng)酶切和測序鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET-30a-0ppA。
[0019]3.2重組表達質(zhì)粒pET-30a_0ppA轉化大腸桿菌BL21 (DE3)
重組質(zhì)粒pET-30a-0ppA按常規(guī)方法轉化BL21 (DE3)感受態(tài)細胞(《分子克隆》第二版，中國科學出版社)，轉化菌涂布于LB平板(5(^g/mL Kan+)，37°C過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接入5mL LB培養(yǎng)液(5(^g/mL，Kan+)中，37°C，220r/min振蕩培養(yǎng)過夜。經(jīng)酶切和PCR鑒定正確。含表達重組質(zhì)粒pET-30a-0ppA，并能表達OppA重組蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)命名為DE3-HPS-0ppA 工程菌種。
[0020]3.3 DE3-HPS-0ppA工程菌誘導表達及產(chǎn)物鑒定
(I) DE3-HPS-0ppA工程菌種的試表達和表達產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定挑取LB平板(5(^g/mL Kan+)上單菌落培養(yǎng)鑒定篩選OppA表達工程菌。接種3 ml LB液體培養(yǎng)基(5(^g/mL Kan+)，37°C，220r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取Iml上述過夜培養(yǎng)物接種于新鮮的10ml含LB液體培養(yǎng)基(5(^g/mL Kan+), 37°C，220r/min振蕩培養(yǎng)3h左右，至OD6tltl為0.5，在37。。，IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導6h時，表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE鑒定。
[0021](2) OppA表達條件的優(yōu)化
經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠鑒定確定最佳表達條件。DE3-HPS_0ppA工程菌種在16°C低溫誘導可產(chǎn)生大量可溶性蛋白，IPTG濃度0.0lmmol/L為最佳誘導濃度，16小時為最佳誘導時間。
[0022](3)親和層析柱純化OppA重組蛋白
用鎳離子親和層析方法純化OppA重組蛋白。先將8 mL N1-NTA His Bind Resin (南京金斯瑞)裝入空層析柱，讓液體靠重力作用自然滴出后，層析柱用10倍NTA體積的平衡Buffer洗滌，然后將樣品加到層析柱中，冰上結合30分鐘然后讓其流出；層析柱用5倍平衡Buffer洗滌，最后用5倍NTA體積的NTA-60洗脫Buffer進行洗脫，收集洗脫液，得到純化后蛋白，其檢測的電泳圖見圖2。
[0023]用上述方法得到的純化OppA重組蛋白包被膠體金并制備膠體金墊，抗原結合金標墊的pH值為7.0，且在抗原結合的過程中需要加入18% BSA 50ul/mlU%PEG 2000050ul/ml進行封閉，封閉時間為30分鐘，離心后的重懸液其配方為:0.02M四硼酸鈉、0.5%BSA、5%蔗糖、0.05%吐溫20。重懸后鋪金，37°C干燥I小時。然后進行試紙條的組裝。
[0024]本發(fā)明的檢測線是運用副豬嗜血桿菌5型全菌抗原，本發(fā)明的副豬嗜血桿菌5型菌取自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所。全菌抗原的制備方法是:
將甘油凍存的副豬嗜血桿菌5型接種于含5%馬血清的TSA平板上，置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時后，挑取單個菌落接種于含5%馬血清的TSB培養(yǎng)基中，置37°C恒溫搖床培養(yǎng)12-16小時，以同樣方法擴大培養(yǎng)，收集菌液，以3500轉/分鐘離心10分鐘，棄上清，收集沉淀，用PH7.2的PBS洗滌2次，然后用少量相同的PBS重懸，超聲破碎，經(jīng)過超聲波破碎，反復凍融之后3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清，定量后用于制備檢測線。
[0025]質(zhì)控線是運用的副豬嗜血桿菌5型全菌抗原的多抗IgG，該IgG是用高免血清經(jīng)過純化而得，副豬嗜血桿菌5型高免血清的制備方法如下:
I選用2kg左右、12月齡的健康雄性家兔。菌種用副豬嗜血桿菌5型標準株。
[0026]2免疫原的制備
2.1滅活抗原制備將甘油凍存的副豬嗜血桿菌接種于含5%馬血清的TSA平板上，置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時后，挑取單個菌落接種于含5%馬血清的TSB培養(yǎng)基中，置37°C恒溫搖床培養(yǎng)12-16小時，以同樣方法擴大培養(yǎng)，收集菌液，濃縮，培養(yǎng)物滴度達108CFU/mL,經(jīng)檢驗合格后，加入40%甲醛溶液，使其終濃度0.2%進行滅活，滅活抗原抽樣接種TSA培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24小時，無細菌生長為合格。合格抗原在4°C條件下用PBS(0.15M，pH為6.4)離心洗滌3次，用紫外分光光度計測定蛋白濃度后，將抗原稀釋至10mg/mL備用。
[0027]2.2活抗原制備取將5型副豬嗜血桿菌單克隆接種到TSA培養(yǎng)平板上，置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-18小時，在超凈臺用PBS (0.15M, pH為7.2)洗平皿，將洗下的菌體測定濃度，制成109CFU/mL濃縮抗原備用。
[0028]5弗氏完全佐劑抗原和弗氏不完全佐劑抗原的配制
弗氏完全佐劑抗原:弗氏油佐劑3mL加卡介苗60mg加抗原3mL。
[0029]弗氏不完全佐劑抗原:弗氏油佐劑3mL加抗原3mL。
[0030]上述佐劑抗原均在免疫接種前配制，并充分混合乳化。
[0031]3免疫程序取上述充分乳化的弗氏完全佐劑抗原，于每只兔兩后腿足部皮下，胭淋巴結處及背部皮下多點接種，接種總量為1.5mL，21日后仍以上述抗原和劑量由背部皮下多點接種，進行第二次免疫；隔11日后，以上述弗氏不完全佐劑抗原，由每只兔肩部肌肉兩點，背部皮下多點接種，接種總量為3mL，為其第三次免疫；11日后，取活抗原由每只兔耳靜脈注射lmL，以加強免疫。
[0032]4試血隔14日后由耳緣靜脈采血分離血清，以IHA試驗試血，若免疫兔血清IHA效價達1:128或以上，則正式采血。如免疫兔血清效價偏低，可按第三次的劑量和免疫途徑再進行一次加強免疫，隔7?14日再進行試血，如免疫兔血清效價達到要求，可按前述方法制備高免血清。否則棄之。
[0033]5采血將血清效價合格的兔無菌分別由頸動脈放血。
[0034]6提取血清用自然凝結法無菌分離血清。
[0035]分離到血清用硫酸銨沉淀法純化得到的IgG用于制備質(zhì)控線。
[0036]試紙條組裝操作按如下步驟進行在PVC背襯板I上由上至下分別將樣品墊5、膠體金墊4，包括檢測線7和質(zhì)控線6的硝酸纖維素膜2以及吸收墊3按順序裝配，將PVC襯板I設在最底部，襯板I上部中段設有硝酸纖維素膜2，硝酸纖維素膜2上部左端貼有吸收墊3，硝酸纖維素膜2上部右端設有金標墊4，金標墊4的上部右端設有樣品墊5，再分別用噴槍將前述得到的紅純化的副豬嗜血桿菌5型全菌抗原和IgG在硝酸纖維素膜2上制出檢測線和質(zhì)控線，在本發(fā)明中檢測線與質(zhì)控線兩線間距離保持在0.Smm0再將試紙切割成4_寬的條狀，即制成如附圖1的結構本發(fā)明的副豬嗜血桿菌5型膠體金定型檢測試紙條。
[0037]本發(fā)明的試紙條分別對陽性血清和陰性血清進行檢測，結果見附圖3，由附圖3可見，陽性顯示檢測線和質(zhì)控線均為紅色，陰性檢測線和質(zhì)控線兩線均不變色。
[0038]對田間樣品檢測的結果見附圖4，同樣，陽性樣品的檢測線和質(zhì)控線均為紅色，而第八個陰性樣品的兩線均不顯示。
[0039]經(jīng)對副豬嗜血桿菌5型血清、豬傳胸血清、豬肺炎支原體血清和巴氏桿菌陽性血清進行檢測的結果見附圖5，從中可見只有副豬嗜血桿菌5型血清的第一個樣品顯示出兩條紅線，其余三個樣品均未發(fā)生反應。
[0040]經(jīng)對副豬嗜血桿菌15個標準血清型高免血清進行檢測結果圖6，只有5型血清有陽性結果，其余均為陰性。
[0041]運用瓊脂糖擴散試驗與本發(fā)明的試紙檢測進行了對比，進行分型血清檢測同樣OPPA蛋白高免的血清可達到1:32，而運用本發(fā)明的試紙條可達到1:1024，敏感性明顯高于瓊脂糖擴散試驗。
【權利要求】
1.一種檢測副豬嗜血桿菌5型試紙條，包括依次連接固定于PVC板上的由吸水材料構成的樣品墊、包被有抗原的膠體金墊、硝酸纖維素膜、吸收墊，以及位于硝酸纖維素膜上且相互分開的檢測線和質(zhì)控線，其特征在于膠體金墊包被的抗原是副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白，檢測線是副豬嗜血桿菌5型全菌抗原，質(zhì)控線是副豬嗜血桿菌全菌抗原的多抗IgG。
2.權利要求1所述的副豬嗜血桿菌試紙條制備方法，其特征在于: a.用副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白包被膠體金，制備出膠體金； b.在PVC條上依次固定吸水材料構成的樣品墊、包被有抗原的膠體金墊、硝酸纖維膜、吸收墊 c.取副豬嗜血桿菌5型全菌抗原，經(jīng)過超聲波破碎，反復凍融之后3000轉/分鐘離心10分鐘，取上清在硝酸纖維膜上制備檢測線； d，用得到的副豬嗜血桿菌5型全菌抗原多抗IgG，在硝酸纖維膜上制備檢測線； e.按要求切割得到副豬嗜血桿菌試紙條。
3.根據(jù)權利要求2所述的副豬嗜血桿菌試紙條制備方法，其特征在于抗原結合金標墊的pH值為7.0，且在抗原結合的過程中需要加入18% BSA 50ul/ml、l%PEG 20000 50ul/ml進行封閉，封閉時間為30分鐘，離心后的重懸液其配方為:0.02M四硼酸鈉、0.5% BSA、5%蔗糖、0.05%吐溫20，重懸后鋪金，37°C干燥I小時，然后進行試紙條的組裝。
4.權利要求2或3所述的副豬嗜血桿菌試紙條所用的制備方法，其特征在于副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白是以副豬嗜血桿菌DNA為模板，以SEQ ID Ns I和SEQ ID Ns 2為引物進行PCR擴增，將經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物連接入pMD18-T simple vector，再按常規(guī)方法轉化DH5 α感受態(tài)細，經(jīng)酶切后陽性重組質(zhì)粒命名為為pMD-OppA，分別用I和ZAo I雙酶切重組質(zhì)粒pMD-OppA與pET-30a-c (+)載體,酶切后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切下所需的目的條帶，回收純化目的片段和載體片段，用T4 Iigase連接，再將連接產(chǎn)物轉化到DH5CI大腸桿菌感受態(tài)細胞中得到陽性重組質(zhì)粒命名為pET-30a-0ppA，再將重組表達質(zhì)粒pET-30a_0ppA轉化大腸桿菌BL21得到DE3-HPS-0ppA工程菌種，DE3-HPS_0ppA工程菌誘導表達后層析柱純化后得到副豬嗜血桿菌OPPA融合蛋白。
【文檔編號】G01N33/569GK104251905SQ201410437671
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權日:2014年9月1日
【發(fā)明者】賀英, 逯忠新, 趙萍, 儲岳峰, 陳勝利, 張建軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所