專利名稱：共表達(dá)人p53基因和人細(xì)胞因子基因的重組腺病毒及其制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種新的共表達(dá)人p53基因和細(xì)胞因子(如人白細(xì)胞介素2)基因的重組腺病毒，該重組腺病毒的制備方法和用途，以及含有該重組腺病毒的藥物組合物。
p53基因被認(rèn)為是腫瘤抑制基因家族中的主要成員，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因。人類p53基因定位于人染色體17q13.1，全長16kb-20kb，有11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子。p53基因的表達(dá)產(chǎn)物為p53蛋白，它是一種磷酸化核蛋白，由393個(gè)氨基酸殘基組成，相對分子量為53kD。
野生型p53基因在維持細(xì)胞正常生長、抑制惡性繁殖中起重要作用。眾所周知，環(huán)境中的紫外線、放射線和化學(xué)物質(zhì)均可引起DNA的損傷。如果損傷的DNA沒有得到修復(fù)而繼續(xù)進(jìn)行復(fù)制并隨染色體分離，那么染色體組中將產(chǎn)生大量的突變和染色體畸變，這些突變?nèi)绻M(jìn)一步累積將會(huì)發(fā)展為癌細(xì)胞。野生型p53蛋白的作用即是在體內(nèi)發(fā)揮類似“基因衛(wèi)士”(guardian of genome)的生物學(xué)功能，時(shí)刻監(jiān)視著基因組的完整性。一旦細(xì)胞DNA遭受損害，p53蛋白即與p21基因上的特異序列結(jié)合，活化P21基因的轉(zhuǎn)錄，還可與TATA結(jié)合蛋白(TATA binding protein，TBP)結(jié)合，抑制c-fos、c-jun、Rb、IL-6、PCNA及p53本身的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞分裂停滯在G1期節(jié)點(diǎn)，同時(shí)與RPA(replicationfactor A，復(fù)制因子A)相互作用，參與DNA的復(fù)制和修復(fù)；如果修復(fù)失敗，p53蛋白又能夠啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡過程誘導(dǎo)細(xì)胞自殺，阻止具有癌變傾向的基因突變細(xì)胞產(chǎn)生從而起到防癌作用。1996年發(fā)現(xiàn)p53蛋白有時(shí)可跨越P21蛋白，直接作用與E2F，促使E2F從Rb蛋白結(jié)合的復(fù)合物上解離下來，將細(xì)胞分裂停滯于G1/S節(jié)點(diǎn)處。
p53基因突變是人類腫瘤特別是惡性腫瘤中最為常見的遺傳改變，與腫瘤的惡性程度有相當(dāng)?shù)年P(guān)聯(lián)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，不表達(dá)正常p53蛋白的小鼠在出生后6～9個(gè)月，100％發(fā)生腫瘤。大約有50％的人類腫瘤與p53基因突變有關(guān)。其中，約70％的結(jié)腸癌，50％的肺癌和30％～40％的乳腺癌中含有p53基因的突變，在小細(xì)胞肺癌中p53基因突變幾乎為100％。這些突變可分為兩類；體細(xì)胞突變和性細(xì)胞突變，其中，體細(xì)胞p53基因的突變在腫瘤中極為常見。此外，具有p53基因的突變的腫瘤對放療和化療的敏感性差，生存時(shí)間短。研究表明，通過導(dǎo)入野生型p53基因，可顯著提高這些耐受細(xì)胞對放療和化療的敏感性。
鑒于p53基因有很強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長與啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的能力，p53基因突變與人類腫瘤特別是惡性腫瘤及其惡性程度有如此密切的關(guān)系，早在1989年，人們就設(shè)想能否給p53缺陷型腫瘤細(xì)胞一個(gè)野生型p53基因拷貝，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。1990年Baker等首先觀察到野生型p53導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞明顯地出現(xiàn)凋亡，Roth等于1993年提出了利用p53等手段治療非小細(xì)胞肺癌的臨床方案。嗣后，p53用于各種腫瘤基因治療的報(bào)道越來越多，總結(jié)這些報(bào)道可以得出p53基因治療的特點(diǎn)，即毒副作用較小。目前已有多例I/II期臨床治療報(bào)告認(rèn)為，p53基因治療安全而有效。
大量的有關(guān)轉(zhuǎn)染p53基因抑制腫瘤細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)報(bào)道，多選用重組腺病毒作為轉(zhuǎn)染載體。其中包括Roth研究組有關(guān)重組腺病毒導(dǎo)入野生型p53對頭頸腫瘤，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長抑制(Liu1994Yung 1995)，治療頭頸鱗癌微小殘留病灶(Clayman 1995)，腹腔膀胱癌(Werthman 1996；Badie 1995)獲得療效的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)道。程金科等的工作表明，介到p53的重組腺病毒Ad-p53轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并抑制細(xì)胞生長70％左右；光學(xué)顯微鏡，流式細(xì)胞儀和凋亡細(xì)胞原位檢測表明p53的導(dǎo)入引起腫瘤細(xì)胞的凋亡。SKOV-3細(xì)胞裸鼠移植瘤模型瘤內(nèi)注射Ad-p53，腫瘤生長抑制達(dá)76％。Ad-p53對人肺癌細(xì)胞系也顯示同樣作用。近年來研究顯示，p53也參與血管形成的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，野生型p53的導(dǎo)入，不僅阻滯腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還可通過調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄降低腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，從而使腫瘤內(nèi)血管形成受到抑制。Nishizaki(1999)的研究表明，重組腺病毒介導(dǎo)p53(Ad5CMV-p53)導(dǎo)入人非小細(xì)胞肺癌A226Br細(xì)胞內(nèi)，36小時(shí)可明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子VEGF和誘導(dǎo)一種新的血管生成抑制因子BAI1的表達(dá)。Western印跡檢測同樣表明轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)下降77％。的Ad-p53轉(zhuǎn)染人p53基因治療后，腫瘤中血管減少約60％，這個(gè)發(fā)現(xiàn)解釋了p53基因治療旁觀者效應(yīng)的部分原因?；蛟诰S持細(xì)胞正常生長、抑制惡性繁殖中起重要作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)導(dǎo)入p53基因的方法有多種，常見的有直接瘤內(nèi)注射，也有經(jīng)氣管、腹腔內(nèi)動(dòng)靜脈注射等途徑。Neilsen(1998)等報(bào)道，對腹腔腫瘤移植模型采用腹腔注射Ad-p53，對肺轉(zhuǎn)移癌采用局部輸注-靜脈注射Ad-p53，結(jié)果顯示腫瘤負(fù)荷明顯小于對照組。該結(jié)果提示腹腔注射重組腺病毒為臨床治療腹腔癌癥提供了一種新途徑?？傊?，野生型p53導(dǎo)入治療惡性腫瘤的方法備受人們關(guān)注，大量的實(shí)驗(yàn)從療效、作用機(jī)制、用藥方式等方面進(jìn)行研究，并獲得了大量數(shù)據(jù)，為p53基因臨床治療奠定了基礎(chǔ)。
腺病毒因能獲得高滴度、感染能力強(qiáng)、靶細(xì)胞可以是分裂或非分裂、細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因不整合進(jìn)入基因組以及瞬時(shí)表達(dá)等特點(diǎn)而受到青睞。目前常用的腺病毒載體是一種E1和E3區(qū)缺失的復(fù)制缺陷型的5型腺病毒載體，用其構(gòu)建的Ad-p53對正常細(xì)胞無毒性，對小鼠無明顯毒性，表明其在臨床應(yīng)用中相對安全。作為“基因組衛(wèi)士”的p53蛋白，有很強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長與啟動(dòng)細(xì)胞凋亡從而穩(wěn)定細(xì)胞基因組的能力。當(dāng)細(xì)胞基因組受到損傷時(shí)，p53可使細(xì)胞分裂暫停，直到損傷被修復(fù)，若損傷不能修復(fù)則p53啟動(dòng)細(xì)胞自殺程序；細(xì)胞內(nèi)有外源DNA合成(如病毒DNA復(fù)制)時(shí)，p53也會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞自殺程序。因此，病毒在細(xì)胞中的復(fù)制必須首先克服p53這一障礙。腺病毒中執(zhí)行這一功能的主要是E1B-55kD蛋白，E1B-55kD蛋白可與p53蛋白結(jié)合，抑制p53正常發(fā)揮作用，這一結(jié)合是腺病毒復(fù)制所必需?；诖?，Bischoff等推測，E1B-55KD缺陷型腺病毒將能在p53缺陷的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，但不能在正常細(xì)胞中復(fù)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持他們的假設(shè)，這就意味著這種E1B缺陷型腺病毒能選擇性地在p53缺陷型腫瘤細(xì)胞中復(fù)制。除了選擇性地在p53缺陷型腫瘤細(xì)胞中復(fù)制從而殺死腫瘤細(xì)胞具有治療腫瘤的價(jià)值外，由于重組腺病毒作為載體是目前在腫瘤基因治療中的首選載體，因此這種能在p53缺陷型腫瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的E1B缺陷型腺病毒，在腫瘤基因治療中的應(yīng)用具有廣闊的前景。
盡管腺病毒介導(dǎo)的p53基因治療在某些腫瘤的臨床試驗(yàn)中取得了良好的療效，但從p53腺病毒治療腫瘤的機(jī)理上，進(jìn)一步提高其療效必須是使Ad-p53感染每個(gè)腫瘤細(xì)胞，而這是目前基因?qū)胂到y(tǒng)難以逾越的障礙。另外，Ad-p53的導(dǎo)入，只是抑止腫瘤生長并誘導(dǎo)其調(diào)亡，并沒有有效地激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，難以誘導(dǎo)出對機(jī)體腫瘤特異性的殺傷活性，這從另一方面影響了p53基因治療的療效。
白細(xì)胞介素-2(interlukin-2，IL-2)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體的免疫應(yīng)答中起重要作用，IL-2蛋白的分子量為15-17.2kD，人IL-2含133個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)pI6.8-8.2，有一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(Cys58-Cys105)，Cys125則與IL-2形成二聚體或多聚體有關(guān)，二硫鍵異常配對的IL-2沒有活性。人IL-2以單體存在，二級結(jié)構(gòu)有4個(gè)反平行α螺旋區(qū)。人IL-2有6個(gè)α螺旋，N端30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的螺旋A與結(jié)合IL-2Rβ鏈有關(guān)。其中Asp20和Leu17高度保守，與IL-2的活性有關(guān)。IL-2基因位于染色體4q26-28，長度為3662bp，有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子。外顯子1編碼5’非翻譯區(qū)、20個(gè)信號肽和前29個(gè)氨基酸，外顯子2、3分別編碼20和48個(gè)氨基酸，第四個(gè)外顯子編碼最后36個(gè)氨基酸和3’非翻譯區(qū)。
IL-2通過與多種細(xì)胞膜上的受體IL-2R結(jié)合，經(jīng)IL-2Rαβγ轉(zhuǎn)導(dǎo)信號發(fā)揮其多種活性。IL-2最重要的作用是誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖(從G0期進(jìn)入S期)和分化，同時(shí)也具有增強(qiáng)B細(xì)胞、NK細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答在體內(nèi)抗腫瘤和抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。研究表明IL-2對T細(xì)胞的作用還包括增強(qiáng)CTL的細(xì)胞毒活性，增加細(xì)胞內(nèi)pH，誘導(dǎo)c-myz、c-myb和IL-2受體表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)，增強(qiáng)細(xì)胞間的接觸和誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-4、TNF和CFS等)。IL-2能誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)LAK細(xì)胞和TIL，并刺激它們產(chǎn)生細(xì)胞因子。高劑量IL-2能引起單核巨噬細(xì)胞增殖和分化，并增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞殺腫瘤細(xì)胞的作用。IL-2是目前在腫瘤免疫與基因治療領(lǐng)域療效最為確實(shí)的細(xì)胞因子之一。
盡管IL-2的基因治療取得了較為理想的療效，但僅限于黑色素瘤、腎癌等免疫原性較高的腫瘤細(xì)胞，因此，如何增強(qiáng)IL-2基因治療的療效也是目前研究的一個(gè)難點(diǎn)。
因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)新的、更高效的、用于腫瘤基因治療的藥物。
本發(fā)明的目的就是提供一種新穎的在臨床上施用p53基因和細(xì)胞因子(如IL-2)基因治療的方法和相關(guān)制劑，從而克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺點(diǎn)，提高療效、降低成本、方便使用。
本發(fā)明的意義在于，構(gòu)建了一種共表達(dá)人p53基因和人免疫相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-2)基因的重組腺病毒載體，使受感染腫瘤細(xì)胞表達(dá)p53基因，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡，另一方面IL-2基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性的提高，表達(dá)IL-2有效激活體內(nèi)腫瘤特異性的CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞及LAK細(xì)胞的活性，同時(shí)由于p53基因的導(dǎo)入而調(diào)亡的腫瘤細(xì)胞可釋放出多種腫瘤抗原，在IL-2的參與下，協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫和非特異性免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種共表達(dá)人p53基因和人細(xì)胞因子(如人IL-2)基因的重組腺病毒，該腺病毒的基因組缺失E1區(qū)和E3區(qū)，且在腺病毒基因組DNA的兩端結(jié)合有末端肽TP，并且在E1區(qū)位置插入了人p53基因和人細(xì)胞因子(如IL-2)基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒依次包括啟動(dòng)子序列，人p53和人細(xì)胞因子(如IL-2)基因編碼序列，和聚腺苷酸化信號序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該腺病毒為Ad5型腺病毒，且所述的人細(xì)胞因子包括IL-2、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-3、IL-4、IL-6、TNF。
在另一優(yōu)選例子中，該人p53基因和人細(xì)胞因子(如人IL-2)基因表達(dá)盒中還含有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)IRES，而且p53編碼序列位于IRES之前，人細(xì)胞因子(如IL-2)編碼序列位于IRES之后。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，它包括有效量的表達(dá)人p53基因和人細(xì)胞因子(如IL-2)基因的重組腺病毒和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，其中該重組腺病毒的基因組缺失E1區(qū)和E3區(qū)，且在腺病毒基因組DNA的兩端結(jié)合有末端肽TP，并且在E1區(qū)位置插入了人p53和人細(xì)胞因子(如IL-2)表達(dá)盒，該表達(dá)盒依次包括啟動(dòng)子序列，人p53基因和人細(xì)胞因子(如人IL-2)基因編碼序列和聚腺苷酸化信號序列。
在本發(fā)明的又一方面，提供一種制備共表達(dá)人p53和人細(xì)胞因子(如IL-2)的重組腺病毒的方法，該方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP復(fù)合物，在該腺病毒DNA基因組缺失E1區(qū)和E3區(qū)，并且在腺病毒基因組DNA的兩端結(jié)合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因組的粘粒載體，在該粘粒載體中的腺病毒基因組缺失了E1區(qū)和E3區(qū)，并且在E1區(qū)位置插入了人p53基因和人細(xì)胞因子(如人IL-2)基因表達(dá)盒，其中該表達(dá)盒依次包括啟動(dòng)子序列，人p53和人細(xì)胞因子(如人IL-2)編碼序列，和聚腺苷酸化信號序列；(c)將步驟(a)中的腺病毒DNA-TP復(fù)合物和步驟(b)中的粘粒載體共轉(zhuǎn)染表達(dá)E1區(qū)基因的宿主細(xì)胞；
(d)篩選陽性克?。?e)從陽性克隆中分離純化重組腺病毒。


圖1.pCIcc真核表達(dá)載體的物理圖譜；圖2.人p53基因和人IL-2基因共表達(dá)載體pCI-p53IL20構(gòu)建流程圖；圖3.人p53基因和人IL-2基因的融合基因及所編碼的氨基酸序列，中間用小寫字母表示的是IRES序列；圖4.pAx1cw腺病毒載體的結(jié)構(gòu)簡圖；圖5.COS/TPC同源重組法產(chǎn)生人p53-IL-2重組腺病毒的構(gòu)建示意圖；圖6.人p53-IL-2重組腺病毒克隆的酶切鑒定分析，其中泳道1為分子量標(biāo)記物，泳道2為LacZ-293的ClaI酶切產(chǎn)物，泳道3為人p53-IL-2腺病毒克隆的ClaI酶切產(chǎn)物。
圖7.人p53-IL-2重組腺病毒體外表達(dá)的Western印跡分析，從左至右為泳道1-3。泳道1為分子量標(biāo)記物，泳道2為LacZ重組腺病毒，泳道3為人p53-IL-2重組腺病毒。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人p53基因編碼序列”指天然存在的或人工合成的人p53編碼序列。
“人細(xì)胞因子基因編碼序列”指天然存在的或人工合成的人細(xì)胞因子編碼序列，人細(xì)胞因子的編碼序列可以編碼各種具有免疫活性的天然的細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素(IFN)、白細(xì)胞介素-3(IL-3)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子(TNF)，及其變異形式(例如IL-2的保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體，或其活性片段)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人p53和人細(xì)胞因子表達(dá)盒”指含有人p53和人細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素-2)編碼序列以及表達(dá)所需元件的序列組件，表達(dá)所需的組件包括啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號序列。此外，該表達(dá)盒還可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于增強(qiáng)子、分泌信號肽序列等。
以IL-2為例，在本發(fā)明中，可以適用于人p53和白細(xì)胞介素-2表達(dá)盒的啟動(dòng)子可以是任何一種常見的啟動(dòng)子，它可以是組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。較佳地，該啟動(dòng)子是組成型的強(qiáng)啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、牛乳頭瘤病毒啟動(dòng)子等其它適用于真核表達(dá)的啟動(dòng)子。
在本發(fā)明中，可供使用重組腺病毒可以是任何一種血清型的腺病毒，較佳地，為了防止在制備過程產(chǎn)生親本的復(fù)制型腺病毒，宜采用E1區(qū)缺失型腺病毒。更佳地，使用E1區(qū)和E3區(qū)都缺失的腺病毒。此外，宜采用已研究得較為透徹的腺病毒類型，例如Ad2和Ad5型腺病毒。
下面以IL-2為例，詳細(xì)描述本發(fā)明的可用于臨床的復(fù)制缺陷型人p53-IL-2重組腺病毒和相關(guān)藥物組合物(制劑)的制備過程和方法。
1、腺病毒的病毒生物學(xué)和分子生物學(xué)特性腺病毒是一種無包膜的DNA病毒，病毒顆粒呈正二十面體，直徑為80-90nm。腺病毒主要有三種結(jié)構(gòu)蛋白六鄰體，構(gòu)成20面體的表面；五鄰體，位于蛋白質(zhì)外殼中的12個(gè)頂角；纖維蛋白，每個(gè)五鄰體上的一條纖維突起。
腺病毒基因組為雙螺旋線性雙鏈DNA，約有36000個(gè)堿基對(bp)，在兩端結(jié)合有55kDa末端肽(Terminal peptide，TP)。傳統(tǒng)上將病毒基因組劃分100個(gè)基因圖距單位(mu)，1mu相當(dāng)360bp。基因組兩端各有一個(gè)約100bp的末端倒置反向重復(fù)DNA序列(ITR)。在基因組左端載有病毒包裝信號。基因組分為早期轉(zhuǎn)錄區(qū)(分為E1-E4)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)(分為L1-L5)，每個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)在病毒生活周期中都起重要作用。此外，還有幾個(gè)小的中間區(qū)和晚期區(qū)。
人腺病毒有近50種血清型，其中Ad2和Ad5基因組結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的研究較為廣泛和深入，現(xiàn)已確定這兩型腺病毒的全部核苷酸序列，目前構(gòu)建的腺病毒載體大多源于這兩種血清型。
腺病毒基因組中的E1區(qū)，在病毒基因組一進(jìn)入宿主細(xì)胞核中即被激活，從而編碼起始因子，調(diào)節(jié)病毒的早期活動(dòng)，因此E1區(qū)為病毒復(fù)制所必需。
E2區(qū)編碼的蛋白與病毒DNA的復(fù)制有關(guān)，包括病毒DNA末端結(jié)合蛋白(TP)，DNA結(jié)合蛋白(DBP)和DNA聚合酶，DBP與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。
E3區(qū)編碼的多肽與病毒逃避宿主抗病毒免疫反應(yīng)有關(guān)，比如，E3編碼的一個(gè)19kDa糖蛋白，可抑制I類主要組織相容性抗原(MHC)提呈到感染細(xì)胞表面，使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)不能有效識別和殺傷感染細(xì)胞；此外，E3編碼的10.4kDa、24.5kDa、14.7kDa蛋白可抑制腫瘤壞死因子α(TNF-α)的細(xì)胞毒作用。E3區(qū)缺失對腺病毒的感染性無明顯影響。
E4區(qū)編碼產(chǎn)物參與病毒DNA復(fù)制、晚區(qū)基因表達(dá)、病毒蛋白合成和宿主蛋白合成終止等活動(dòng)。主要晚期基因產(chǎn)物是病毒結(jié)構(gòu)蛋白，而由pIX編碼的小結(jié)構(gòu)蛋白，有助于大于34kb的基因組包裝。
腺病毒通過經(jīng)介導(dǎo)吸附和介導(dǎo)內(nèi)吞的兩種不同受體而進(jìn)入宿主細(xì)胞。病毒先通過纖維蛋白與未知的某種受體結(jié)合從而吸附到細(xì)胞表面。介導(dǎo)病毒內(nèi)吞入內(nèi)體(endosomes)的受體已被鑒定為αv整合素(αv integrins)。在內(nèi)吞過程中，內(nèi)體的酸化引起病毒外殼蛋白構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致病毒沖破內(nèi)體進(jìn)入胞漿，進(jìn)一步在外殼蛋白的核靶向信號引導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞核。E1區(qū)編碼的蛋白質(zhì)首先上調(diào)自身表達(dá)和激活其他早期區(qū)基因表達(dá)，8小時(shí)后，病毒DNA開始復(fù)制，隨后晚期蛋白表達(dá)并在感染細(xì)胞核中進(jìn)行子代病毒顆粒的裝配。腺病毒可抑制宿主細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，而促進(jìn)自身的蛋白合成。被感染約30-40小時(shí)后，宿主細(xì)胞溶解，釋放出子代病毒顆粒。臨床上，腺病毒一般可引起上呼吸道感染、角結(jié)膜炎、胃腸炎、肺炎、支氣管炎、肝炎和膀胱炎，多數(shù)為輕度的自限性疾病。近20年來，腺病毒口服活疫苗已被廣泛使用，從使用過的一千多萬人的結(jié)果來看，療效顯著且無明顯的毒副作用。
2、腺病毒載體的特點(diǎn)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和導(dǎo)入途徑是影響基因治療效果的重要因素。雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒載體仍是目前基因轉(zhuǎn)移和基因治療中應(yīng)用最廣的載體系統(tǒng)，具有穩(wěn)定整合表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，但它只能感染分裂期的細(xì)胞，感染效率較低，一般不能用于體內(nèi)(in vivo)途徑，臨床應(yīng)用中難免受到限制。
腺病毒載體是繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體后在基因治療方面應(yīng)用開發(fā)得較早的一種基因載體，由于其本身的特點(diǎn)及載體系統(tǒng)不斷改進(jìn)，近年來在基因治療中得到日益廣泛的應(yīng)用。腺病毒載體首先應(yīng)用于纖維囊性變(Cystic Fibrosis，CF)和al抗胰蛋白酶缺陷型肺氣腫的基因治療，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于其他疾病的治療，如嗜血桿菌A和B、Duehene肌營養(yǎng)不良、家族性膽固醇血病、血管成形術(shù)后動(dòng)脈再狹窄、表面活性蛋白B缺乏、紅細(xì)胞生成素缺陷和各種腫瘤，顯示其具有良好的應(yīng)用前景和開發(fā)價(jià)值。1995年，美國食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)腺病毒介導(dǎo)的p53基因療法進(jìn)入臨床，試用于晚期腫瘤病人的治療，收到顯著療效，且無明顯的毒副作用。
腺病毒載體具有以下幾個(gè)特點(diǎn)①其宿主范圍廣，感染率高，包括靜息細(xì)胞和終末細(xì)胞；②病毒的滴度高，可達(dá)109～1010空斑形成單位(pfu)/ml，由于其理化性質(zhì)較穩(wěn)定，可以通過沉積、柱層析或超離心純化獲得高滴度病毒載體；③腺病毒無胞膜，對補(bǔ)體介導(dǎo)的滅活作用不敏感，體內(nèi)更穩(wěn)定；④目前應(yīng)用的腺病毒載體多為Ad2和Ad5，對嚙齒動(dòng)物無致瘤性，臨床上通常僅引起輕度的上呼吸道反應(yīng)，甚至對于免疫抑制病人亦如此；⑤腺病毒通常不整合入宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，適用于基因的短期表達(dá)，理論上講就不會(huì)引起宿主細(xì)胞的插入突變，比逆轉(zhuǎn)錄病毒更為安全。
3、腺病毒載體的構(gòu)建策略目前的腺病毒載體大多來源于腺病毒Ad2和Ad5這兩種血清型。適用于基因治療應(yīng)用的腺病毒載體屬于復(fù)制缺陷型病毒。由于E1編碼的蛋白功能是其他所有腺病毒基因有效表達(dá)所必須的，因此最常見的策略就是用外源DNA替代病毒E1區(qū)序列，通過包裝細(xì)胞反式提供E1區(qū)序列而產(chǎn)生的復(fù)制缺陷腺病毒載體。
可用于本發(fā)明的宿主包裝細(xì)胞是可以表達(dá)腺病毒E1區(qū)基因的任何宿主細(xì)胞，因?yàn)樵摷?xì)胞能夠提供復(fù)制缺陷型腺病毒復(fù)制所需的E1區(qū)基因表達(dá)產(chǎn)物。一種優(yōu)選的常用包裝細(xì)胞是293細(xì)胞，該細(xì)胞由人胚腎細(xì)胞經(jīng)Ad5腺病毒DNA片段轉(zhuǎn)化而成，載有整合入細(xì)胞基因組的腺病毒E1區(qū)等病毒基因片段，并持續(xù)表達(dá)E1區(qū)蛋白，能為E1區(qū)置換型腺病毒載體提供反式補(bǔ)償。
利用E3區(qū)缺失不影響病毒感染性，切去E3區(qū)可增加載體外源性DNA容量。切去E1和E3區(qū)，外源基因插入容量可達(dá)約8kb。而克隆更大的外源DNA片段則需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通過互補(bǔ)細(xì)胞系或輔助病毒反式提供。
本發(fā)明的重組腺病毒的方法可以用多種方法產(chǎn)生，其中主要有以下四種共轉(zhuǎn)染入互補(bǔ)細(xì)胞系通過體內(nèi)同源重組而產(chǎn)生重組腺病毒的方法更為常用，更佳地是用COS/TPC共轉(zhuǎn)染同源重組法產(chǎn)生的。
(1).細(xì)胞外病毒DNA直接連接法(也稱Stow方法)此法是選d1309腺病毒基因組在3.7mu(E1區(qū)內(nèi))的XbaI限制內(nèi)切酶點(diǎn)，切斷和分離3.7-100mu病毒基因組大片段(稱XbaI片段)，然后將載有外源DNA的腺病毒基因組的最左端0-1.3mu，用連接酶連到XbaI大片段上。連接產(chǎn)物可用于轉(zhuǎn)染293細(xì)胞以制備重組腺病毒。
(2).細(xì)胞內(nèi)病毒DNA同源性重組與Stow方法很類似，將載有外源DNA的腺病毒基因左端0-1.3/9.8-16mu片段與XbaI大片段同時(shí)轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞內(nèi)，通過同源性重組來制備病毒載體。
(3).細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組此法利用質(zhì)粒的形式，將腺病毒基因組DNA的倒置末端相連形成環(huán)狀，能在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制，從而簡化了XbaI大片段的制備手續(xù)。環(huán)狀腺病毒DNA由于細(xì)菌質(zhì)粒插入其總基因組長度超過包裝限度，在細(xì)胞內(nèi)不會(huì)被包裝成病毒顆粒，僅提供病毒DNA同源重組的所需片段。構(gòu)建E1替代型腺病毒載體時(shí)，首先將外源DNA插入細(xì)菌質(zhì)粒(如pΔElsp1A)中，該質(zhì)粒含腺病毒基因組左端序列(包括ITR、包裝信號和部分缺失的E1區(qū))。含外源DNA的穿梭質(zhì)粒與含腺病毒基因組其余序列的DNA共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過體內(nèi)的同源重組產(chǎn)生重組腺病毒。這種含其余序列、用于同源重組的腺病毒基因組DNA可有不同的形式，或是通過體外經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化無感染性的病毒DNA，或者來源于重組質(zhì)粒pJM17或pBHG系列質(zhì)粒。該方法目前較為常用，但缺點(diǎn)是重組效率還不構(gòu)理想。
(4).COS/TPC共轉(zhuǎn)染同源重組腺病毒DNA的兩端各共價(jià)結(jié)合有一個(gè)55kDa的末端肽(Terminal peptide，TP)，結(jié)合有末端肽的腺病毒DNA導(dǎo)入允許細(xì)胞后產(chǎn)生的空斑數(shù)是裸腺病毒DNA的100倍以上(Horwitz M.FundamentalVirolgy，2nd edition，edited by Fields B et al.Raven Press，Ltd.NewYork，1991；771)，表明TP的存在對腺病毒DNA的感染能力有著重要的影響。傳統(tǒng)的重組腺病毒制備方法中常用蛋白酶將腺病毒DNA的末端肽切除，Miyake等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996，931320)首先采用含有TP的腺病毒DNA-TP復(fù)合物(TPC)進(jìn)行同源重組，建立了COS/TPC同源重組法制備重組腺病毒，并且證明該法的重組效率可提高近百倍，而且?guī)缀醪划a(chǎn)生親代病毒。在該方法中，首先構(gòu)建了一種含Ad5基因組(其E1或E4區(qū)含克隆位點(diǎn))的E1區(qū)替代型粘粒(粘粒)載體，將含外源基因的表達(dá)單元(expression cassette)克隆入粘粒腺病毒基因組。然后將其與腺病毒DNA-TP復(fù)合物共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，其中腺病毒DNA-TPC事先用限制性內(nèi)切酶消化以減少其感染性，在粘粒和腺病毒DNA重疊序列間進(jìn)行同源重組而產(chǎn)生重組腺病毒。用EcoT 22I消化DNA-TPC(E3區(qū)缺失的腺病毒DNA有7個(gè)EcoT22I位點(diǎn))時(shí)，重組發(fā)生在最右側(cè)EcoT22I以右的腺病毒DNA和粘粒載體中的同源部分，同源長度達(dá)23.2kb，而傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA同源重組方案是同腺病毒DNA中XhoI酶切后的左末端重組，同源長度僅2.2kb，可發(fā)生重組的同源片段長度的增加無疑提高了重組效率。
在構(gòu)建共表達(dá)載體時(shí)通?？刹捎靡韵?種策略其一是用RNA剪接信號將兩目的基因連接，同一啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的一個(gè)mRNA前體分子經(jīng)剪接加工形成兩個(gè)成熟的mRNA分子，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中將目的基因之一替代env序列，雖能實(shí)現(xiàn)共表達(dá)，但剪接效率受其上下游序列的影響，較難控制；其二運(yùn)用內(nèi)部啟動(dòng)子，使兩個(gè)編碼基因受不同啟動(dòng)子控制，轉(zhuǎn)錄合成兩個(gè)獨(dú)立的mRNA分子，其缺點(diǎn)是由于啟動(dòng)子之間的相互競爭干擾，往往難以使兩個(gè)目的基因都得到有效表達(dá)；其三是運(yùn)用mRNA 5’端非編碼序列中的內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)(IRES)，在一個(gè)mRNA分子上進(jìn)行兩種不同機(jī)制的蛋白轉(zhuǎn)譯，產(chǎn)生兩種蛋白(Ghattas et al.Mol Cell Biol.991，115848)。目前該策略曾經(jīng)應(yīng)用于逆轉(zhuǎn)錄病毒共表達(dá)載體的構(gòu)建(IRES載體，Morgan R，et al.Nucl Acids Res，1992，201293)，但是由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染效率較低，不適合in vivo途徑直接體內(nèi)應(yīng)用，且穩(wěn)定整合于宿主基因組中，表達(dá)持續(xù)時(shí)間長，應(yīng)用于免疫基因治療存在明顯不足。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，應(yīng)用COS/TPC同源重組法來制備本發(fā)明的重組腺病毒，具體如下首先通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)克隆人p53和IL-2的全長編碼cDNA，并與IRES相連，將融合后的基因置于巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的控制之下，插入E1區(qū)替代的腺病毒載體pAx1cw，通過與經(jīng)EcoT22I酶切、結(jié)合末端肽的Ad5腺病毒DNA在293細(xì)胞中的同源重組獲得共表達(dá)人p53基因和人IL-2基因的復(fù)制缺陷性重組腺病毒，滴度達(dá)9.5×1010pfu/ml；并證明了所制備的共表達(dá)人p53基因和人IL-2基因重組腺病毒體外能有效表達(dá)具有生物學(xué)活性的人IL-2和p53蛋白。
此外，考慮到親本病毒產(chǎn)生的主要原因是最左端的兩個(gè)EcoT22I片段發(fā)生意外的連接，因此DNA-TPC中存在E1區(qū)可能會(huì)增加產(chǎn)生親本病毒的機(jī)率。為此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中選用了E1和E3區(qū)都缺失的DNA-TPC，從而進(jìn)一步降低(消除)了產(chǎn)生親本病毒的可能性，保證了制備的重組腺病毒是缺少E1和E3區(qū)的復(fù)制缺陷型，并可安全地應(yīng)用于臨床治療。
在制得本發(fā)明的共表達(dá)人p53基因和人IL-2基因重組腺病毒之后，就可以將所需純度的重組腺病毒與任選的生理上可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.，Ed.，)，以凍干形式或水溶液形式進(jìn)行混合，可以制得本發(fā)明的重組腺病毒的治療制劑。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑對接受者而言在所用的劑量和濃度下應(yīng)是無毒的，并且可含有緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機(jī)酸緩沖液；抗氧化劑如維生素C；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的反荷離子如鈉；和/或非離子型表面活性劑如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。作為最常見的例子，水和生理鹽水就可作為本發(fā)明重組腺病毒制劑中的載體。
本發(fā)明制備的共表達(dá)人p53基因和人IL-2基因復(fù)制缺陷型重組腺病毒具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在以下幾方面(1).通過瘤體內(nèi)直接注射p53-IL-2重組腺病毒等體內(nèi)途徑直接導(dǎo)入體內(nèi)，用于腫瘤、感染等疾病的治療，較單純使用p53腺病毒或單純使用IL-2腺病毒具有更好的療效，不僅可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡，同時(shí)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，誘導(dǎo)腫瘤特異性和非特異性免疫應(yīng)答。
(2)體外感染腫瘤細(xì)胞，制備人p53基因和人IL-2基因轉(zhuǎn)染的腫瘤瘤苗，進(jìn)行腫瘤的主動(dòng)免疫治療，腫瘤細(xì)胞可來源于腫瘤患者的新鮮瘤體標(biāo)本或腫瘤細(xì)胞株。
(3).作為細(xì)胞因子或佐劑一起注射，與DNA疫苗或其他疫苗聯(lián)合進(jìn)行免疫接種，以增強(qiáng)免疫效果。
(4)治療成本低，比直接注射IL-2等細(xì)胞因子進(jìn)行治療低至少50％，較佳地可低至少80％?？捎行У剡M(jìn)行局部施用，從而大大降低了施用IL-2時(shí)的毒性。
(5)減少注射次數(shù)和注射量，可以減少注射腺病毒量至少50％，從而減少了進(jìn)行注射治療的痛苦，并便于使用。
(6)具有更明顯的“旁觀者效應(yīng)”，誘導(dǎo)機(jī)體免疫殺傷未感染病毒的腫瘤細(xì)胞。
(7)通過感染細(xì)胞而在細(xì)胞內(nèi)較長時(shí)期地局部表達(dá)IL-2，與生理?xiàng)l件下生物體局部分泌IL-2的情況更為接近，從而可高效和長期地發(fā)揮IL-2的功效。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，比如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1.人p53 cDNA的克隆收集外周血白細(xì)胞，異硫氰酸胍一步法抽提總RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈，以其為模板分別進(jìn)行人p53 cDNA的PCR擴(kuò)增p53引物上游引物5’atctagaggtcactgcc ATG GAG GAG CCG CAG 3’下游引物5’gggatccggggaacaagaagtggagaatg 3’p53的PCR產(chǎn)物的預(yù)計(jì)大小為1.2kbp，PCR反應(yīng)體積為50μl，引物濃度為0.4μM，擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 1’、60℃ 1’、72℃ 2’，20個(gè)循環(huán)后產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后，克隆至pGEM-3Z(Promega)載體，進(jìn)行全自動(dòng)測序，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Stratagene公司)，陽性克隆經(jīng)全自動(dòng)測序(ABI373，PE公司)分析，結(jié)果表明克隆到的人p53的cDNA與報(bào)道一致，包括完整的編碼序列。
實(shí)施例2 人IL-2 cDNA的克隆分離健康人外周血淋巴細(xì)胞，經(jīng)ConA刺激后異硫氰酸胍一步法抽提總RNA，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈，以其為模板分別進(jìn)行人p53 cDNA的PCR擴(kuò)增IL-2 物上游引物5’GAATTCGCTAGCTACCATGTACAGGATGCAACTCCT 3’下游引物5’GAATTCATCAAGTCAGTGTTGAGAT GATGC 3’IL-2的PCR產(chǎn)物的預(yù)計(jì)大小為485bp，PCR反應(yīng)體積為50μl，引物濃度為0.4μM，擴(kuò)增參數(shù)為94℃ 1’、50℃ 1’、72℃ 2’，20個(gè)循環(huán)后產(chǎn)物行2％瓊脂糖凝膠電泳分析。PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后，克隆至pBluescript II-SK(美國Stratagene公司)進(jìn)行全自動(dòng)測序，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Stratagene公司)，陽性克隆經(jīng)全自動(dòng)測序(ABI373，PE公司)分析，結(jié)果表明克隆到的人IL-2的cDNA與報(bào)道一致，包括完整的編碼序列。
實(shí)施例3.pCIcc載體的改建為將人p53和人IL-2 cDNA置于CMV啟動(dòng)子的控制之下，選用了pCIcc載體。pCIcc載體系由真核表達(dá)載體pCI(Promega公司)改建而來。pCI載體含有CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和SV40 polyA， 在CMV啟動(dòng)子與目的基因克隆位點(diǎn)之間含有β珠蛋白的內(nèi)含子，有助于提高目的基因表達(dá)水平。在pCI載體的SV40polyA下游有一個(gè)單一的ClaI位點(diǎn)，改建目的是在CMV啟動(dòng)子上游再產(chǎn)生一個(gè)新的ClaI位點(diǎn)，便于將表達(dá)單元克隆至腺病毒載體的ClaI位點(diǎn)。改建的過程為，將pCI載體進(jìn)行BglII酶切、T4 DNA聚合酶(BioLab公司)補(bǔ)平后，用T4 DNA連接酶(BioLab公司)連接，這樣就使原來的BglII位點(diǎn)失活，產(chǎn)生一個(gè)新的ClaI位點(diǎn)(圖1)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061(美國ATCC公司)，篩選陽性重組子pCIcc。
實(shí)施例4.人p53和人IL-2 cDNA的融合及人p53-IL-2腺病毒載體的構(gòu)建在該實(shí)施例中，將人p53和IL-2 cDNA加以融合，然后克隆至真核表達(dá)載體pCIcc，構(gòu)建流程見圖2。
采用PstI從pIRES1neo載體(Clontech公司)切下IRES片段，插入pBlueScript SK載體；得到pKS-IRES，將XbaI/BamHI酶切的cDNA片段插入pKS-IRES，得到pKS-p53IRES，將RI酶切的人IL-2cDNA插入pKS-p53IRES，得到pKS-p53IREShIL2，采用BamHI/NheI酶切鑒定插入方向，再用XbaI鑒定；采用NotI/EcoRV酶切得到p53IREShIL2片段，補(bǔ)平后于SmaI位點(diǎn)插入pCIcc載體，得到重組載體pCI-p53IL2，融合基因p53-IRES-IL-2的序列見圖3，pCI-p53IL2重組載體中，人p53和人IL-2的cDNA由IRES連接，其轉(zhuǎn)錄受CMV啟動(dòng)子的控制，后接SV40 polyA信號肽序列，p53和IL-2的蛋白合成分別受帽子依賴性和非依賴性機(jī)制控制指導(dǎo)。
所采用的腺病毒載體pAx1cw購自日本Takara公司。pAx1cw系E1區(qū)替代的cosmid載體，攜帶E1區(qū)(mu 1.3-9.3)和E3區(qū)(mu 79.6-84.8)缺失的Ad5腺病毒基因組DNA，在缺失的E1區(qū)插入了ClaI-SwaI-ClaI-SalI-NruI連接子，其中含有SwaI和ClaI兩個(gè)供外源基因插入的克隆位點(diǎn)(圖4)。將含人p53和IL-2表達(dá)盒(表達(dá)單元)的ClaI片段(4.7kbp)與經(jīng)去磷酸化的pAx1cw載體ClaI大片段于14℃連接過夜，同時(shí)挑DH5a菌落于含0.2％麥芽糖的5ml LB培養(yǎng)基中，振蕩過夜，離心收集菌體重懸于2.5ml TM緩沖液(10mM Tris.HCl(pH7.5)，10mM MgSO4)中備用。12.5ml的連接反應(yīng)液與噬菌體包裝蛋白(Strategene公司)混合，室溫孵育90分鐘，加入100ml TM緩沖液。取DNA溶液和DH5a菌各50ml混合，室溫孵育15分鐘后，加入1ml氨芐陰性LB培養(yǎng)基，37℃振蕩30分鐘，取10～100ml涂布于Amp陽性LB平板，37℃過夜。挑取陽性轉(zhuǎn)化子，堿裂法小量制備DNA，酶切分析陽性重組子，重組腺病毒載體記為pAx1cw.CIp53IL2。
用高濃度肉湯TB培養(yǎng)基500～1000ml大量擴(kuò)增陽性克隆菌，堿裂法抽提粘粒DNA，溶于4ml TE中，加入44.4g CsCl(購自美國Gibco公司)、0.4ml溴化乙錠(10mg/ml)混合，置5ml離心管(Beckman)梯度離心(VTi65.1轉(zhuǎn)頭，55,000rpm，20℃，16h)，收集超螺旋條帶，用等體積Butanol(Sigma)抽提4～6遍，4℃下用TE透析過夜，或直接加入3倍體積無菌去離子水、8倍體積無水乙醇，于4℃沉淀DNA(3～5小時(shí))，干燥后DNA溶于無菌TE，用分光光度計(jì)檢測其濃度和純度。
實(shí)施例5.腺病毒DNA-TPC的制備收集經(jīng)E1和E3區(qū)缺失的Ad5腺病毒(序列早已公開)感染的293細(xì)胞(表達(dá)腺病毒E1A、E1B蛋白的人胚腎細(xì)胞株293細(xì)胞(ATCC CRL-1573))，超聲破碎后，離心去除細(xì)胞碎片，病毒上清經(jīng)CsCl梯度離心(25,000rpm，4℃，2h)，濃縮的病毒液進(jìn)行第二次CsCl梯度離心(35,000rpm，4℃，3h)，收集病毒液，對含10％甘油的PBS緩沖液透析過夜。透析后的病毒液加入等體積8M鹽酸胍(pH7.4)破碎病毒，經(jīng)CsCl梯度離心(55,000rpm，20℃，16h)純化Ad5 DNA，所純化的Ad5 DNA末端帶有共價(jià)結(jié)合的末端肽，經(jīng)EcoT22I(購自Biolab公司)酶切后分裝備用。
實(shí)施例6.COS-TPC共轉(zhuǎn)染pAx1cw.Cip53IL2與Ad5 DNA-TPC經(jīng)磷酸鈣DNA共沉淀法共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，經(jīng)同源重組產(chǎn)生人p53-IL-2重組腺病毒(圖5)。轉(zhuǎn)染前一天，待轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)基。于500μl體積中將40μg pAx1cw.CIp53IL2與0.5μg Ad5DNA-TPC、CaCl2(終濃度為0.25M)混合后，加入500μl的2×BBS緩沖液(50mM BES(N，N-bis(2-hydroxyethl)-2-aminoethane-sulfonic acid)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(pH6.95))，混合后置室溫作用10～20分鐘，逐滴加入293細(xì)胞，置37℃、5％CO2培養(yǎng)12～24小時(shí)。將共轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞與未經(jīng)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞按1∶1、1∶10和1∶100等不同比例混合，分別接種至96孔培養(yǎng)板(100μl/孔)，此后的第4天和第8天各補(bǔ)加DMEM培養(yǎng)基(50μl/孔)。于共轉(zhuǎn)染后的第12-14天，從3塊96孔板的共轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆中陸續(xù)得到246個(gè)細(xì)胞病變死亡的克隆；收集陽性克隆孔的細(xì)胞及其培養(yǎng)液，超聲破碎后的病毒上清為第一代種子病毒(1st seed)，于-80℃保存。
第一代種子病毒用病毒上清(10μl/孔)感染24孔培養(yǎng)板中的293細(xì)胞，每個(gè)克隆設(shè)2個(gè)復(fù)孔；3～4天收集一個(gè)復(fù)孔的細(xì)胞行細(xì)胞基因組DNA的酶切分析，對其中7個(gè)克隆進(jìn)行了酶切鑒定，全部為陽性重組克隆(圖6)。另一復(fù)孔中的細(xì)胞經(jīng)超聲破碎后收集病毒上清，為第二代種子病毒(2nd seed)，留作擴(kuò)增用。
實(shí)施例7.人p53-IL-2重組腺病毒Ad.p53-IL-2的制備、擴(kuò)增與滴度檢測酶切鑒定正確的重組克隆的第二代種子病毒上清(2nd seed)，用于感染293細(xì)胞擴(kuò)增病毒，3～4天后，超聲破碎細(xì)胞，離心去除細(xì)胞碎片，病毒上清經(jīng)CsCl梯度離心(25,000rpm，4℃，2h)，濃縮的病毒液進(jìn)行第二次CsCl梯度離心(35,000rpm，4℃，3h)純化，最后將收集病毒液對含10％甘油的PBS緩沖液透析過夜，過濾除菌后分裝，速凍保存于-80℃。
以293細(xì)胞為靶細(xì)胞、用微量細(xì)胞病變法檢測病毒滴度。96孔板中先加入50ml培養(yǎng)液/孔，前8孔加入25ml經(jīng)104稀釋的病毒液，開始行3倍的倍比稀釋，共11個(gè)稀釋度，每一稀釋度設(shè)8復(fù)孔，每孔加50μl 293細(xì)胞，F(xiàn)CS的終度為5％，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對照，此后第4天和第8天分別補(bǔ)加50μl含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基，12～14天后判定結(jié)果。對其中的一個(gè)陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，所制備的人p53-IL-2重組腺病毒，記為Ad.p53-IL-2，滴度為9.5×1010pfu/ml。收獲后的重組腺病毒用注射用水稀釋、分裝成5×1010pfu/ml，保存于-80℃。
該腺病毒被命名為“共表達(dá)人p53基因和人白細(xì)胞介素2基因的重組5型腺病毒Ad.p53-IL-2”，并于2001年4月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，中國，武漢，保藏編號為CCTCC No.V200101。
實(shí)施例8.人p53-IL-2重組腺病毒Ad.p53-IL-2的體外表達(dá)對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞HepG2(購自美國ATCC公司)或人皮肝成纖維細(xì)胞棄培養(yǎng)液后，按100∶1的重復(fù)感染度(Multiplicity of Infection，MOI)加入人p53-IL-2的重組腺病毒，1小時(shí)后加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時(shí)后，收集培養(yǎng)上清。檢測人p53-IL-2重組腺病毒Ad.p53-IL-2的體外表達(dá)IL-2。
人p53表達(dá)的檢測，采用Western-blot方法，將Ad.p53-IL-2感染H1299細(xì)胞，采用Ad-LacZ病毒作為對照，感染24小時(shí)后，收集細(xì)胞，裂解后行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，采用抗人p53作為一抗，HRP標(biāo)記的?？寡蜃鳛槎梗饔煤笥肵射線片曝光，如圖7所示，Ad.p53-IL-2感染H1299細(xì)胞檢測到p53的表達(dá)。
人IL-2的生物學(xué)活性檢測采用CTLL細(xì)胞株，采用3H-TdR法檢測，以hIL-2標(biāo)準(zhǔn)品作為對照。野生型及轉(zhuǎn)染LacZ基因的細(xì)胞不分泌人IL-2，而感染人p53-IL-2腺病毒后分別不同程度地表達(dá)人IL-2(表1)。
表1.感染Ad.p53-IL-2重組腺病毒的細(xì)胞表達(dá)IL-2水平感染細(xì)胞 不同MOI值IL-2的表達(dá)水平(U/106細(xì)胞/24h)0 50 100 200HepG2 0 798±33.9 1636±137.3 2859±239.3皮膚成纖維細(xì)胞0 681±82.4 1299±104.4 2678±262.5實(shí)施例9.重組腺病毒Ad.p53-IL-2的體內(nèi)抗腫瘤作用將小鼠乳腺癌細(xì)胞接種于小鼠皮下，隨機(jī)分為6組，3天后，每組小鼠分別注射(1)生理鹽水；(2)表達(dá)LacZ的腺病毒Ad.LacZ 1×109PFU；(3)單純表達(dá)野生型p53的重組腺病毒Ad.p53 1×109PFU；(4)單純表達(dá)IL-2的重組腺病毒Ad.IL-21×109PFU，(5)共表達(dá)p53和IL-2的重組腺病毒Ad.p53-IL-21×109PFU，(6)聯(lián)合注射Ad.p53 5×108PFU及Ad.IL-25×108PFU，觀察腫瘤的生長速度，于治療后2周。測量腫瘤大小，檢測小鼠脾淋巴細(xì)胞對小鼠乳腺癌細(xì)胞特異性的殺傷活性，并觀察荷瘤小鼠的生存期。結(jié)果表明(見表2)，Ad.p53-IL-2組腫瘤的生長速度明顯較其它對照組慢，第14天腫瘤大小明顯小于其它組，生存期明顯延長，50％的小鼠未形成腫瘤而長期存活，另外CTL活性的檢測結(jié)果表明，Ad.p53-IL-2組脾淋巴細(xì)胞檢測出針對細(xì)胞較強(qiáng)的殺傷活性，而對照組均未檢出明顯CTL活性。
表2.Ad.p53-IL-2小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種共表達(dá)人p53基因和人細(xì)胞因子的重組腺病毒，其特征在于，該腺病毒的基因組缺失E1區(qū)和E3區(qū)，且在腺病毒基因組DNA的兩端結(jié)合有末端肽TP，并且在E1區(qū)位置插入了人p53基因和人白細(xì)胞介素2基因表達(dá)盒，該表達(dá)盒依次包括啟動(dòng)子序列，人p53以及人白細(xì)胞介素2和多聚腺苷酸化信號序列。
2.如權(quán)利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于，人p53基因和人細(xì)胞因子表達(dá)盒中還含有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)IRES，而且p53編碼序列位于IRES之前，而人細(xì)胞因子編碼序列位于IRES之后，所述的細(xì)胞因子選自下組IL-2、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-3、IL-4、IL-6、TNF。
3.如權(quán)利要求1或2所述重組腺病毒，其特征在于，該腺病毒為Ad5型腺病毒，所述的細(xì)胞因子是人白細(xì)胞介素2。
4.如權(quán)利要求1或2所述的重組腺病毒，其特征在于，人p53基因和人細(xì)胞因子表達(dá)盒中所含的啟動(dòng)子序列選自巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、牛乳頭瘤病毒啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求4所述的重組腺病毒，其特征在于，該腺病毒是表達(dá)人p53基因和人白細(xì)胞介素2基因的重組5型腺病毒Ad.p53-IL-2，CCTCC No.V200101。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它包括有效量的權(quán)利要求1所述的共表達(dá)人p53基因和人細(xì)胞因子基因的重組腺病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，該重組腺病毒為Ad5型腺病毒，所述的細(xì)胞因子包括人白細(xì)胞介素2，且該人p53基因和人細(xì)胞因子基因表達(dá)盒中還含有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)IRES，而且p53編碼序列位于IRES之前，而人白細(xì)胞介素2基因編碼序列位于IRES之后。
8.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，該腺病毒是表達(dá)人p53基因和人白細(xì)胞介素2基因的重組5型腺病毒Ad.p53-IL-2，CCTCC No.V200101。
9.一種制備共表達(dá)人p53基因和人細(xì)胞因子基因的重組腺病毒的方法，其特征在于，該方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP復(fù)合物，在該腺病毒DNA基因組缺失E1區(qū)和E3區(qū)，并且在腺病毒基因組DNA的兩端結(jié)合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因組的粘粒載體，在該粘粒載體中的腺病毒基因組缺失了E1區(qū)和E3區(qū)，并且在E1區(qū)位置插入了人p53基因和人細(xì)胞因子基因表達(dá)盒，其中該表達(dá)盒依次包括啟動(dòng)子序列，人p53基因和人細(xì)胞因子基因編碼序列，和聚腺苷酸化信號序列；(c)將步驟(a)中的腺病毒DNA-TP復(fù)合物和步驟(b)中的粘粒載體共轉(zhuǎn)染表達(dá)E1區(qū)基因的宿主細(xì)胞；(d)篩選陽性克??；(e)從陽性克隆中分離純化重組腺病毒。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中共轉(zhuǎn)染方法是磷酸鈣DNA共沉淀轉(zhuǎn)染法，該宿主細(xì)胞是293細(xì)胞，而且人p53基因和人細(xì)胞因子基因表達(dá)盒中所含的啟動(dòng)子序列選自巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、牛乳頭瘤病毒啟動(dòng)子，且該人p53基因和人細(xì)胞因子基因表達(dá)盒中還含有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)IRES，而且人p53基因編碼序列位于IRES之前，而人細(xì)胞因子基因編碼序列位于IRES之后，且所述的細(xì)胞因子選自下組IL-2、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-3、IL-4、IL-6、TNF。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的共表達(dá)人p53基因和人細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素2)基因的重組腺病毒、該重組腺病毒的制備方法和用途、以及含有該重組腺病毒的藥物組合物。將這種新的重組腺病毒用于臨床,具有成本低、使用方便、效率高等優(yōu)點(diǎn),尤其適用于結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等癌癥的治療。
文檔編號A61P35/00GK1380392SQ01105969
公開日2002年11月20日 申請日期2001年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月12日
發(fā)明者王建莉 申請人:上海華康生物技術(shù)有限公司