專利名稱：菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程，具體的說是一種菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子(cytokine)由免疫活性細(xì)胞和其它細(xì)胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱，是參與固有免疫應(yīng)答功能最多樣且最重要的一類免疫效應(yīng)分子。目前已發(fā)現(xiàn)上百種細(xì)胞因子，并對(duì)其來源、分子結(jié)構(gòu)、相應(yīng)的受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物學(xué)功能以及與臨床關(guān)系進(jìn)行了大量研究，特別是利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組細(xì)胞因子已成功應(yīng)用于腫瘤、 炎癥、造血功能障礙等疾病治療，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。鑒于細(xì)胞因子廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用、在病害防治方面潛在的巨大應(yīng)用價(jià)值及其在揭示免疫系統(tǒng)演化等方面的重要意義，在更低等的生物中尋找細(xì)胞因子，一直是免疫學(xué)的熱點(diǎn)問題。近年來，通過基因組學(xué)的研究，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)果蠅、海膽、海鞘中存在一種重要細(xì)胞因子類型一腫瘤壞死因子(TNF)。TNF是機(jī)體免疫調(diào)控的關(guān)鍵組分，其功能活性包括誘發(fā)細(xì)胞凋亡、介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)、提高吞噬細(xì)胞吞噬活性、誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞因子和免疫效應(yīng)物質(zhì)的表達(dá)等多種功能，在機(jī)體的正常或病理?xiàng)l件下均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。然而，與高等動(dòng)物廣泛深入的研究狀態(tài)相比，無脊椎動(dòng)物TNF的研究剛剛起步，目前除了個(gè)別物種中的基因序列， TNF其他信息嚴(yán)重匱乏，尤其缺乏對(duì)其功能的明確認(rèn)識(shí)。貝類是我國(guó)優(yōu)勢(shì)海水養(yǎng)殖對(duì)象，2007年的產(chǎn)量達(dá)1067萬噸，占全國(guó)海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的77%，其中雙殼貝類產(chǎn)量占海水貝類養(yǎng)殖產(chǎn)量的95%以上。貝類養(yǎng)殖在我國(guó)沿海經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展中占據(jù)舉足輕重的地位，并具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，但良種缺乏和病害問題的困擾一直是產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的主要制約因素。從貝類自身的免疫防御系統(tǒng)入手，闡明重要效應(yīng)分子TNF的基因結(jié)構(gòu)和功能，將有助于深入探討貝類免疫防御機(jī)制，為病害防治和良種選育提供新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白及其制備和應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白=RpTNF基因重組蛋白為序列表SEQ ID NO. 1 中氨基酸序列所示。菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白的制備1)以菲律賓蛤仔RpTNF編碼區(qū)為模板，采用Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用；2) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與PMD18-T載體通過T4連接酶連接，而后將連接產(chǎn)物與pET21a載體經(jīng)Nde，XhoI雙酶切后連接；3)將上述構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)plysS菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化、復(fù)性， 即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白R(shí)pTNF ；
所述因?yàn)镻l 和 P2 分別為 Pl :5，-CATATGAAACCAGCTGCAAAACT-3，;P2 :5，-CTCGAGT TAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTATCAGATTTACTCC-3’。所述步驟幻經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后采用鎳柱純化獲得變性重組蛋白，而后透析復(fù)性。所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白R(shí)pTNF具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)1.適用范圍廣。本發(fā)明可用于多種具有潛在活性蛋白的重組表達(dá)。2.過程簡(jiǎn)單高效。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，只需常規(guī)的連接、轉(zhuǎn)化以及測(cè)序篩選就可完成載體構(gòu)建的過程；且獲得的重組蛋白活性特征明顯，如本發(fā)明中的RpTNF蛋白就是第一個(gè)有生物學(xué)活性的海洋無脊椎動(dòng)物細(xì)胞因子。3.構(gòu)建的載體對(duì)表達(dá)蛋白干擾小。利用本發(fā)明獲得的重組蛋白沒有表達(dá)載體上多余肽段或氨基酸殘基，不影響其活性，且不需要酶切就可以直接進(jìn)入下一步實(shí)驗(yàn)，如抗體制備，晶體結(jié)構(gòu)分析等。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例采用MTT法檢測(cè)不同濃度RpTNF重組蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)例1菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白，序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示。SEQ ID NO. 1MDKKLKNISMFVLLLVVVCLMAVLALVWSMPDIPKTVKTSELCLPSEIGLLKCGSTVDLLHDYLEREIATKYDEVKRQNQKKQENHLKEVSARLMNIYDKSFWEMKPAAKLTGKEQPDLRKTDSNADMVPIREWRNGRELYDTKGFIRYGIRYRNGRLVVPVDGTYFIYSNIDFFESCNPSSGLPDIKDINKPIKHGIFKFNILEGEENELVSNVQPHTISTNRYYNSYSSYVSSLAELKA⑶ELSVKVSNITYIRYTRDNYFGVNLI(a)序列特征 長(zhǎng)度268個(gè)氨基酸 類型蛋白 鏈型雙鏈(b)分子類型雙鏈DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源菲律賓蛤仔(f)特異性名稱PRT菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白的構(gòu)建1.重組載體的構(gòu)建本發(fā)明中采用的重組載體為Novagen公司的pET21a(+)原核表達(dá)載體。通過PCR技術(shù)，使用末端分別添加了 NdeJhoI特定酶切位點(diǎn)的基因特異性引物 Pl(5，-CATATGAAACCAGCTGCAAAACT-3，)和 P2(5，-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTATCAGATTTACTCC-3’)擴(kuò)增菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF基因含TNF結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)片段。反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性5分鐘，然后進(jìn)入下列循環(huán)94°C變性30秒，60°C退火30秒，72°C 延伸30秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7分鐘。將PCR產(chǎn)物純化回收，與pMD18_T載體連接。轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆利用上述載體引物M13-47 5' CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3 ‘和RV-M 5 ‘ GAGCGGATAACAATTTCACACAGG進(jìn)行菌落PCR篩選并測(cè)序，驗(yàn)證測(cè)序正確后用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性克隆質(zhì)粒(大連寶生物工程有限公司)，待用；使用Nde，XhoI雙酶切亞克隆質(zhì)粒，用膠回收純化試劑盒(大連寶生物工程有限公司)對(duì)酶切產(chǎn)物純化回收； 純化片段與經(jīng)Nde，XhoI雙酶切的表達(dá)載體pET-21a連接，完成載體的構(gòu)建。2.重組蛋白的表達(dá)以BL21(DE3)-plysS為重組表達(dá)菌株，將上述構(gòu)建的重組載體和空載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證讀碼框正確。挑取單克隆， 接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩搖床中培養(yǎng)12-16小時(shí)，然后以1 100的比例接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至0D600 = 0. 5-0. 7。加入IPTG，使終濃度達(dá)到 Immol/mL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。4°C，5000rpm，離心lOmin，收集菌體，于_20°C凍存?zhèn)溆?。取Iml菌液離心，棄去上清后，加入80 μ L水和20yL 5X蛋白上樣緩沖液(購(gòu)自碧云天生物公司)， 100°C沸水煮沸10分鐘，離心，SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。3.重組蛋白的純化與復(fù)性將上述所得蛋白采用鎳瓊脂糖凝膠FF純化獲得了變性重組蛋白，用透析緩沖液透析復(fù)性。用具體操作步驟如下鎳瓊脂糖凝膠FF色譜分離帶His標(biāo)簽的重組蛋白(1)鎳瓊脂糖凝膠FF裝柱，1. 6 X 20cm,柱床體積為IOml ；(2)用緩沖液 1 (1. 14g L-lNaH2P04,14. 5g L-1 Na2HP04,29. 3g L,aCL，480g L—1 尿素；.平衡2-5個(gè)床體積，流速為2mLmirT1 ；(3)將 20ml 細(xì)胞破碎液(50mM PBS, ρΗ7· 4，0. 5Μ NaCl) 0. 45 μ m 濾膜過濾，上樣， 流速為ImL mirT1 ；(4)用緩沖液1再洗2-5個(gè)床體積，流速為mL mirT1 ；(5)用分別含10、20、50、100、200、300、400mM的咪唑的緩沖液3進(jìn)行階段洗脫，流速為2mL mirT1，收集各階段洗脫峰，用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)；(6)用純水流洗5個(gè)柱床體積，再用20 %的乙醇流洗3個(gè)柱床體積，流速為2mL mirT1，柱子置于4°C環(huán)境中保存變性狀態(tài)下提純的重組蛋白需要在適當(dāng)?shù)膹?fù)性緩沖液中通過透析除去尿素，使蛋白重新正確折疊。變性純化產(chǎn)物經(jīng)2mM的還原谷胱甘肽、0. 2mM氧化谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris-HClUOOmM NaCl、10%甘油、1 %甘氨酸及梯度降低的尿素透析復(fù)性，尿素濃度從起始的6M逐漸替換到4M、3M、2M、0M，最后一次透析至無尿素的透析液時(shí)不加甘油。每次在4°C透析12h，即得到菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白。實(shí)例2重組蛋白的抗腫瘤生長(zhǎng)活性分析以腫瘤細(xì)胞7402為靶細(xì)胞，檢測(cè)實(shí)施例1所得RpTNF蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度為l_5X105/ml，取96孔板每孔加入IOOul細(xì)胞懸液，置37°C， 5% CO2及飽和濕度條件的培養(yǎng)箱孵育過夜；第2天預(yù)先將不同濃度的重組蛋白為加入細(xì)胞培養(yǎng)液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(無任何添加)和空白孔(只加培養(yǎng)基)；將培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱，在37°C，5% C02及飽和濕度條件下，培養(yǎng)72h ；每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10ul，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，避光；終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入 150ul DMS0，輕微振蕩IOmin ；在酶標(biāo)儀上選擇490nm波長(zhǎng)，以空白孔調(diào)零，測(cè)定各孔吸光值 (A值)。結(jié)果如圖1。本發(fā)明序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白R(shí)pTNF可作為飼料添加劑。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白，其特征在于=RpTNF基因重組蛋白為序列表 SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示。
2.一種按權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白的制備，其特征在于1)以菲律賓蛤仔RpTNF編碼區(qū)為模板，采用Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用；2)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pMDIS-T載體通過T4連接酶連接，而后將連接產(chǎn)物與pET21a載體經(jīng) Nde, XhoI雙酶切后連接；3)將上述構(gòu)建載體轉(zhuǎn)入BL21(DE3)plysS菌株中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，而后純化、復(fù)性，即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白R(shí)pTNF ；所述因?yàn)?Pl 和 P2 分別為 Pl :5，-CATATGAAACCAGCTGCAAAACT-3，;P2 :5，-CTCGAGTTAGT GGTGGTGGTGGTGGTGTATCAGATTTACTCC-3’。
3.按權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白的制備，其特征在于所述步驟3)經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后采用鎳柱純化獲得變性重組蛋白，而后透析復(fù)性。
4.一種按權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重組蛋白R(shí)pTNF具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程，具體的說是一種菲律賓蛤仔RpTNF基因重組蛋白及其制備和應(yīng)用。RpTNF基因重組蛋白為序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。采用通過PCR技術(shù)擴(kuò)增菲律賓蛤仔腫瘤壞死因子RpTNF基因cDNA全長(zhǎng)，并對(duì)其TNF結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了原核重組表達(dá)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，只需常規(guī)的連接、轉(zhuǎn)化以及測(cè)序篩選就可完成載體構(gòu)建的過程；且獲得的重組蛋白活性特征明顯，如本發(fā)明中的RpTNF蛋白就是第一個(gè)有生物學(xué)活性的海洋無脊椎動(dòng)物細(xì)胞因子。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102372772SQ20101024887
公開日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者宋林生, 王玲玲, 趙建民, 邱麗梅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所