專利名稱：一種重組腺病毒及其在纖維性疾病防治中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，具體地說是涉及一種攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒及其在纖維性疾病防治中的應用纖維性疾病如肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化及疤痕的形成等，是嚴重影響人類生命健康的疾病之一。肝纖維化是慢性肝病最主要的病理特征之一，也是慢性病毒性肝炎、代謝紊亂或慢性酒精中毒等疾病進一步發(fā)展的主要原因之一。目前國內(nèi)對肝纖維化的治療還僅僅停留在延緩和阻斷纖維化過程方面，而對于已經(jīng)形成的肝纖維化，尚無有效手段能夠逆轉(zhuǎn)纖維化過程，達到治療肝纖維化的效果。國外最近雖有用裸露質(zhì)粒治療肝纖維化的文獻報道(1)，但由于存在需要量大、多次反復用藥等缺點而難以在臨床廣泛應用。應用重組腺病毒治療肝纖維化國內(nèi)外尚未見報道。
疤痕的形成是創(chuàng)傷愈合的產(chǎn)物和象征。然而過度的疤痕增生則是一種病態(tài)表現(xiàn)，是創(chuàng)傷外科的一種重要并發(fā)癥?？捎绊懲庥^，影響機體功能，疤痕晚期還可發(fā)生癌變。目前人們對疤痕增生后的治療主要靠手術、加壓、冷凍等方法，均不是理想的手段，所以對疤痕的預防有著極其重要的意義。目前國內(nèi)外尚無用生物工程外用藥物預防疤痕的報道。
鑒于細胞因子在纖維性疾病中發(fā)揮的重要作用，目前有關細胞因子與纖維形成和控制之間的研究倍受人們的關注。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)最初被認為是一種肝細胞有絲分裂原，后來發(fā)現(xiàn)其對多種組織細胞的分裂、擴散和形態(tài)發(fā)生起重要的調(diào)解作用。尤其在肝臟的發(fā)育和再生中，HGF起著至關重要的作用。作為一種間質(zhì)細胞來源的細胞因子，HGF能夠明顯地抑制轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ)的產(chǎn)生和增強膠原酶的活性，而對成纖維細胞的增殖則無刺激活性，因而能夠有效降低組織中TGFβ的水平、降解膠原纖維，具有防治纖維性疾病的作用。
重組腺病毒因其可介導目的基因高效地轉(zhuǎn)染各種細胞的特性而倍受矚目，已作為重要的基因載體系統(tǒng)迅速發(fā)展且用于基因治療的臨床實驗。由于通過靜脈輸入的腺病毒大多數(shù)集中在肝臟，因而成為以肝臟為靶器官的基因的理想載體。傷口局部應用重組腺病毒，其轉(zhuǎn)染效率很高，優(yōu)于基因槍方法的轉(zhuǎn)染效率。
綜上所述，纖維性疾病的防治尚無實用有效的手段，目前仍是醫(yī)學中的一大難題。
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種重組腺病毒，該重組腺病毒攜帶人肝細胞生長因子基因。
本發(fā)明的第二個目的是應用該攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒在臨床上可以制成一定滴度的注射液、涂抹液或噴霧劑等，用于纖維性疾病防治的藥物。
本發(fā)明的具體實施方案如下1、將從人胎肝cDNA文庫分離得到的人肝細胞生長因子編碼區(qū)cDNA克隆到pBLUSCRIPT載體的BamHⅠ和SalⅠ多克隆位點上(pBLUSCRIPT-HGF)；將HGF cDNA由pBLUSCRIPT-HGF的ApaⅠ和NotⅠ位點切出，克隆至pXCJL1-CMV/PA載體的HindⅢ和NotⅠ位點上，該載體含有CMV啟動子和polyA信號，以及腺病毒基因組左端序列，從而獲得攜帶人肝細胞生長因子基因表達盒以及腺病毒基因組左端序列的穿梭質(zhì)粒(pXCJL1-CMV/PA-HGF)。見

圖1。
2、將穿梭質(zhì)粒pXCJL1-CMV/PA-HGF和含有E1區(qū)、E3區(qū)及包裝信號區(qū)缺失的復制缺陷型5型腺病毒基因組的質(zhì)粒GT4050共轉(zhuǎn)染293細胞(以腺病毒E1基因轉(zhuǎn)化的人胚腎細胞系)，通過在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組獲得攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒。該重組腺病毒的結(jié)構(gòu)為5TTR CMV/HGF/polyA Ad3328-3TTR
見圖2。
3．將該重組腺病毒通過大鼠尾靜脈注射入用DMN(二硝基亞硝胺)法建立的大鼠致死性肝纖維化模型，通過組織病理學方法觀察到注射該重組腺病毒組(治療組)肝細胞空泡變性程度輕、數(shù)量較少，纖維組織薄且短(圖3(d),(e))，而對照組顯示明顯的纖維增生和多而嚴重的肝細胞空泡變性，并可見假小葉(圖3(a),(b),(c))。從而證實該重組腺病毒對大鼠肝纖維化有治療作用。
4．用新西蘭大白兔通過顯微外科的方法建立兔耳疤痕模型，在手術同時將該重組腺病毒涂抹于創(chuàng)口表面(預防組)，結(jié)果表明預防組較對照組創(chuàng)面愈合快，炎性反應輕，疤痕的形成小(圖4(a),(b))；HE染色顯示預防組較對照組表皮角化輕、真皮層厚度小，纖維組織薄(圖5(a),(b))。從而證實該重組腺病毒對疤痕形成有一定的預防作用。
本發(fā)明提供一種攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒，該重組腺病毒可以以液體形式用生理鹽水或注射用水被配制成注射液、涂抹液(用于體表)等用于防治纖維性疾病。纖維性疾病的類型可以是肝纖維化，也可以是疤痕，也可以是身體其他組織器官的纖維化。實施例將通過描述攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒對肝纖維化和皮膚疤痕的基因治療來進一步闡述本發(fā)明。
應用本發(fā)明提供的重組腺病毒防治纖維性疾病是從纖維形成機制入手，利用腺病毒高效轉(zhuǎn)染及嗜肝性特點，向患者體內(nèi)導入人肝細胞生長因子基因，通過抑制TGFβ的產(chǎn)生和增強基質(zhì)降解酶如膠原酶的活性，來降低組織中TGFβ的水平和降解膠原纖維，達到防治纖維性疾病的目的。因此應用本發(fā)明提供的重組腺病毒防治纖維性疾病比以往的防治手段更具有科學性，療效更明確，更徹底，而且能夠逆轉(zhuǎn)纖維化過程。若本發(fā)明得以應用，將為目前尚無有效防治手段的纖維性疾病的臨床治療提供一種有效的防治手段。
結(jié)合附圖進一步說明本發(fā)明圖1攜帶人肝細胞生長因子基因及含腺病毒基因組左端序列的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建示意2載導人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒構(gòu)建示意3肝細胞生長因子治療肝纖維化的組織病理學切片(a)(H.E.染色，100×)(b)(H.E.染色，100×)(c)(H.E.染色，100×)(d)(H.E.染色，100×)(e)(H.E.染色，100×)圖4肝細胞生長因子預防疤痕形成的大體外觀圖(a)對照組(b)預防組圖5肝細胞生長因子預防疤痕作用的組織切片(a)(H.E.染色，100×)對照組(b)(H.E.染色，100×)預防組參考文獻(1)Takahiro Ueki,Yasufumi Kaneda,Hiroko Tsutsui,et al.Hepatocyte growth factorgene therapy of liver cirrhosisin rats.Nature Medicine,1999；5(2):226-230實施例一、重組腺病毒的構(gòu)建、擴增及純化1、重組腺病毒的構(gòu)建攜帶人肝細胞生長因子基因的穿梭質(zhì)粒(pXCJL1-CMV/HGF/polyA)的構(gòu)建過程如圖1所示。將pXCJL1-CMV/HGF/polyA與攜帶腺病毒基因組DNA的重組質(zhì)粒GT4050共轉(zhuǎn)染293細胞，二者在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組，形成攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒(命名為Ad-HGF)，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示。2、重組腺病毒的制備與純化將293細胞接種于650ml細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至90％匯合狀態(tài)時，按10個空斑形成單位(pfu)/細胞的量加入病毒，36-48小時后，細胞出現(xiàn)完全病變效應(CPE)，收集細胞并凍存于-80℃，累計30-40瓶時一次純化。
將出現(xiàn)細胞病變效應的293細胞于-80℃和37℃間反復凍融三次，2500轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集上清；制備氯化銫密度梯度依次將用無菌PBS配制的0.5ml 1.5g/ml氯化銫溶液、2.5ml 1.35g/ml氯化銫溶液和2.5ml 1.25g/ml氯化銫溶液加入超速離心管中；將6 ml待純化病毒上清加于各管氯化銫梯度液之上；35000轉(zhuǎn)/分鐘10℃離心1小時，于1.35g/ml氯化銫溶液和1.25g/ml氯化銫溶液之間出現(xiàn)白色霧狀病毒帶，收集病毒帶并與1.35g/ml氯化銫溶液混合，35000轉(zhuǎn)/分鐘10℃離心18小時，吸出病毒帶，以1-2倍的Hanks液稀釋病毒，以Hanks液為透析液4℃透析病毒，每2小時更換一次透析液，共換液5次；取出純化的病毒液，加終濃度為10％的無菌甘油，分裝后-80℃保存?？瞻邔嶒灤_定其滴度為8.6×1010空斑形成單位/毫升(pfu/ml)。二、重組腺病毒介導人肝細胞生長因子基因?qū)Υ笫蟾卫w維化治療的評價1、大鼠肝纖維化模型的制備Wistar雄性大鼠30只，體重200-250克。隨機抽取26只大鼠制備纖維化模型將1克二硝基亞硝胺(DMN)溶于100毫升無菌生理鹽水中，使終濃度達1％。大鼠皮下給藥，每次1ml/kg體重，每周兩次，連續(xù)4周；另外4只大鼠作為正常組，除不給藥外，其余條件均與模型組相同。末次給藥后10天，隨機取模型組和正常組各兩只大鼠，取肝組織做HE切片染色，觀察肝纖維化大鼠肝臟的病理形態(tài)變化；肝臟病理學檢查模型組大鼠的肝臟明顯腫大，邊緣鈍，質(zhì)韌；在光鏡下可見肝細胞空泡壞死，有較多的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，匯管區(qū)成纖維細胞增多，纖維組織增生，有些還有出血性病變。正常組大鼠則無上述病變，證明肝纖維化模型制成。2、重組腺病毒對肝纖維化的治療作用取12只模型組大鼠，隨機分為治療和對照兩組，通過尾靜脈注給治療組大鼠100μl 8.6×107pfu/μl的Ad-HGF病毒，而給對照組大鼠注射300μl 2.8×107pfu/μl的Ad-GFP病毒，次日重復給藥一次。給藥40天后，取大鼠肝組織做HE染色，觀察兩組大鼠肝臟的病理形態(tài)。治療組大鼠的肝細胞空泡變性程度較輕，數(shù)量較少，未見有中性粒細胞浸潤，僅見少量的淋巴細胞，更沒有出血性病變；匯管區(qū)成纖維細胞數(shù)量較少，纖維組織層次較薄且延伸范圍較短；有的大鼠肝標本，細胞變性程度較輕沒有炎性細胞的浸潤，匯管區(qū)看不到明顯的纖維增生，達到了基本治愈的效果。而對照組大鼠肝組織病理形態(tài)與治療前相比無明顯改變。如圖3所示。三．重組腺病毒介導人肝細胞生長因子基因?qū)Π毯坌纬傻念A防作用1．疤痕動物模型新西蘭雌性大白兔，體重2.5-3.5kg。耳腹側(cè)無血管處剃毛消毒后，一環(huán)鉆以顯微外科方法切除全層皮膚直至軟骨表面，圓形切口的直徑偽0.6cm，每側(cè)4-6個。2．效果評價切除皮膚的同時將重組腺病毒涂抹于傷口表面，每次8ul(8.6×107pfu/μl)(Ad-HGF組)，每天一次，連續(xù)3天；對照組傷口則涂抹同劑量Ad-GFP。術后第22天將創(chuàng)面與鄰近無創(chuàng)傷處皮膚一并切下，做石蠟切片，行HE染色。結(jié)果表明涂抹Ad-HGF組較涂Ad-GFP組創(chuàng)面愈合快，炎性反應輕，疤痕的形成小，如圖4所示；HE染色顯示涂Ad-HGF組較涂Ad-GFP表皮角化輕、真皮層厚度小，纖維組織薄。如圖5所示。
權利要求
1．一種用于防治纖維性疾病的重組腺病毒，其特征在于該重組腺病毒載導人肝細胞生長因子基因的全長編碼區(qū)cDNA，人肝細胞生長因子基因受CMV啟動子的調(diào)控。該重組腺病毒的結(jié)構(gòu)為5TTRCMV/HGF/polyAAd3328-3TTR
構(gòu)建過程如下
2．根據(jù)權利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于該重組腺病毒可以是攜帶人肝細胞生長因子基因的E1、E3缺失的復制缺陷型5型腺病毒。
3．根據(jù)權利要求1所述的重組腺病毒，其特征在于該重組腺病毒可以是攜帶人肝細胞生長因子基因的與權利要求2所述的腺病毒具有同等功能的類似腺病毒(例如gutless腺病毒等)。
4．根據(jù)權利要求1、2、3所述的重組腺病毒，其特征是該重組腺病毒在臨床上可以制成一定滴度的注射液、涂抹液或噴霧劑等，作為纖維性疾病防治的藥物。
5．根據(jù)權利要求4所述的重組腺病毒，其特征在于該重組腺病毒防治的纖維性疾病可以是肝纖維化，通過靜脈注射注射液達到治療肝纖維化的目的。
6．根據(jù)權利要求4所述的重組腺病毒，其特征在于該重組腺病毒防治的纖維性疾病可以是疤痕，通過創(chuàng)口表面涂或噴涂抹液達到預防疤痕的目的。
7．根據(jù)權利要求4所述的重組腺病毒，其特征在于該重組腺病毒防治的纖維性疾病可以是身體中其他器官的纖維化(例如肺纖維化等)，通過吸入霧化的噴霧劑達到治療肺纖維化的目的。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域,具體地說是涉及一種攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒及其在纖維性疾病防治中的應用。將人肝細胞生長因子全長編碼區(qū)cDNA插入到復制缺陷型腺病毒載體GT4050上,獲得一載導人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒。該重組腺病毒尾靜脈注射入大鼠體內(nèi),對大鼠肝纖維化有治療作用。該重組腺病毒涂抹于創(chuàng)口表面有預防疤痕的功效。
文檔編號C07K14/475GK1307102SQ00100739
公開日2001年8月8日 申請日期2000年2月2日 優(yōu)先權日2000年2月2日
發(fā)明者哈小琴, 吳祖澤, 郭樹華 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院百環(huán)生物醫(yī)學研究中心