專利名稱：穩(wěn)定化的含多肽的液體藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及藥物組合物，更具體涉及通常在液體藥物組合物中不穩(wěn)定的含有多肽的藥物組合物。
背景技術(shù)：
基因工程技術(shù)開發(fā)中的最近進(jìn)展提供了大量足以用作藥物地各種各樣的生物活性多肽。然而多肽由于物理不穩(wěn)定性(包括變性，形成可溶和不溶的聚集物)以及各種化學(xué)不穩(wěn)定性(例如水解，氧化和脫氨基作用)會喪失活性。pH、離子強(qiáng)度、溫度、凍融的重復(fù)循環(huán)和機(jī)械剪切力作用(如在加工中發(fā)生的)等因素都可影響液體藥物制劑中多肽的穩(wěn)定性。還可能由于物理性攪動和在儲藏小瓶中和在溶液中液氣界面的各多肽分子相互作用，也可發(fā)生聚集物形成和生物活性喪失。由于運(yùn)輸過程中的振蕩作用等在各種界面上的壓縮-伸展過程中吸附在氣液和固液界面上的多肽還可能進(jìn)一步發(fā)生的構(gòu)形變化。這些振蕩作用可導(dǎo)致蛋白質(zhì)纏卷、聚集、形成顆粒和最終與其它吸附的蛋白質(zhì)一起沉淀。關(guān)于蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的綜述，參見例如Manning等(1989)Pharm.Res.6903-918和Wang和Hanson(1988)J.ParenteralSci.Tech.42S14。
含多肽的液體藥物制劑的不穩(wěn)定性促使將這些制劑與合適的液體介質(zhì)一起以凍干形式包裝，在使用時再重新配制。雖然凍干改善了組合物的儲藏穩(wěn)定性，但許多多肽顯示不論在干燥狀態(tài)下儲藏(Pikal(1990)Biopharm.2726-30)或由于作為液體制劑重建后聚集形成或喪失催化活性(見例如，Carpenter等(1991)Develop.Biol.Standard 74225-239；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206；Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.1112-20；Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25459-470；和Roser(1991)Biopharm.447-53)，導(dǎo)致活性下降。雖然用添加劑改善了干燥蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，但是許多重新水合的制劑仍然具有在數(shù)量上不可接受的或不適當(dāng)?shù)臒o活性的聚集蛋白質(zhì)(見例如Townsend和DcLuca(1983)J.Pharm.Sci.8063-66；Hora等，(1992)Pharm.Res.933-36；Yoshiaka等(1993)Pharm.Res.10687-691)。另外，需要重新配制是一件麻煩事，還有可能無法準(zhǔn)確掌握劑量。
雖然已配制了許多液體藥物組合物來穩(wěn)定其中所含多肽的生物活性，但是液體制劑中多肽的降解仍然為醫(yī)務(wù)工作者帶來各種問題。因此，需要含有能夠促進(jìn)多肽成分穩(wěn)定性的在生理學(xué)上有兼容性的穩(wěn)定劑的另一類藥物組合物，以維持其療效。
發(fā)明簡述
提供了含有作為治療活性成分的多肽的各種組合物，以及用于制備它們的方法。這些組合物是穩(wěn)定化的液體藥物組合物，它包括多肽，其作為治療活性成分的效力通常在液體制劑儲藏中由于多肽聚集而受損。本發(fā)明的穩(wěn)定化液體藥物組合物除了在液體制劑內(nèi)在儲藏過程中顯示形成聚集物的多肽外，還含有其量足夠減少儲藏過程中多肽聚集的氨基酸堿，其中氨基酸堿是一種氨基酸或一組氨基酸，任何給定的氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。這類組合物還含有緩沖劑，以將液體組合物的pH維持在多肽穩(wěn)定性可接受的范圍內(nèi)，其緩沖劑是一種基本上不含其鹽形式的酸、一種作為鹽形式的酸或一種酸及其鹽形式的混合物。
氨基酸堿起到了穩(wěn)定多肽，防止液體藥物組合物儲藏過程中聚集物形成的作用，同時使用一種基本不含其鹽形式的酸、一種以其鹽形式存在的酸或一種酸及其鹽形式的混合物作為緩沖劑，得到克分子滲透壓濃度接近等滲的液體組合物。液體藥物組合物還可以摻入其它穩(wěn)定劑，尤其是用甲硫氨酸，非離子型表面活性劑例如聚山梨酸酯80和EDTA，來進(jìn)一步提高多肽的穩(wěn)定性。這種液體藥物組合物被認(rèn)為具有穩(wěn)定性，因?yàn)榧尤氚被釅A與一種基本不含其鹽形式的酸，一種以鹽形式存在的酸或一種酸及其鹽形式的混合物，導(dǎo)致組合物的儲藏穩(wěn)定性相對于不存在這兩種成分的情況下配制的液體藥物組合物有所提高。
還提供了提高液體藥物組合物中多肽的穩(wěn)定性和提高這種藥物組合物的儲藏穩(wěn)定性的方法。方法包括在液體藥物組合物中摻入其量足夠減少組合物儲藏過程中多肽聚集物形成的氨基酸堿，和一種緩沖劑，該緩沖劑是基本不含其鹽形式的酸，一種作為鹽形式存在的酸或一種酸及其鹽形式的混合物。這類方法可用于制備本發(fā)明的液體藥物組合物。
附圖簡述


圖1顯示了用RP-HPLC分析，在40℃儲藏時穩(wěn)定樣品中可溶性IL-2的剩余百分?jǐn)?shù)。制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸鈉和270mM山梨糖醇或蔗糖或甘露醇。
圖2顯示了用RP-HPLC分析，50℃儲藏時穩(wěn)定樣品中可溶性IL-2的剩余百分?jǐn)?shù)。制劑含有0.1毫克/毫升IL-2、10mMpH6的琥珀酸鈉和150mM如圖所示的各種氨基酸。
圖3顯示了用RP-HPLC分析，40℃儲藏時穩(wěn)定樣品中可溶性IL-2的剩余百分?jǐn)?shù)。制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、10mMpH6的琥珀酸鈉和50、100或270mM的山梨糖醇。
圖4顯示了用RP-HPLC分析，50℃儲藏時穩(wěn)定樣品中可溶性IL-2的剩余百分?jǐn)?shù)。制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、10mMpH6的琥珀酸鈉和50、100或150mM精氨酸。
圖5顯示了用RP-HPLC分析，在50℃作為pH函數(shù)的剩余可溶性IL-2的半衰期(t1/2，天)。制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM緩沖液(甘氨酸、乙酸鈉、檸檬酸鈉、琥珀酸鈉、磷酸鈉、硼酸鈉)和150mMNaCl、270mM山梨糖醇或150mM精氨酸。
圖6顯示了半衰期(t1/2)對儲藏在50℃的穩(wěn)定樣品的初始蛋白質(zhì)濃度的Ln-Ln曲線圖。制劑含有0.1、0.2或0.5毫克/毫升IL-2和10mMpH6的琥珀酸鈉，以及150mM L-精氨酸。
圖7顯示了在用從-70℃到環(huán)境溫度經(jīng)1、3和5輪凍融處理的樣品中用RP-HPLC分析的可溶性IL-2的剩余百分?jǐn)?shù)。制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、10mMpH6的琥珀酸鈉、150mM精氨酸和0-0.1％聚山梨醇酯80。
圖8顯示了通過在冰上從Emeryville，California運(yùn)到St.Louis，Missouri和從St.Louis運(yùn)回Emeryville的處理樣本，用RP-HPLC分析的可溶性IL-2的剩余百分?jǐn)?shù)。用了兩種含不同量的聚山梨醇酯80的制劑精氨酸制劑，含0.2毫克/毫升IL-2的10mM pH6.5的琥珀酸鈉和150mM精氨酸；NaCl制劑，含0.2毫克/毫升IL-2的10mM檸檬酸鈉(pH6.5)溶液和200mM NaCl。
圖9顯示了50℃下，作為精氨酸濃度函數(shù)，用IEX-HPLC分析的在4種制劑中剩余可溶性TFPI的半衰期(t1/2，天)。所有制劑含有0.15毫克/毫升TFPI和L-精氨酸堿或L-精氨酸HCl，用檸檬酸或10mM檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖到pH5.5。具體TFPI制劑含有(a)20-150mM L-精氨酸HCl，10mM檸檬酸和檸檬酸鈉作為緩沖劑，(b)20-150mM L-精氨酸堿，用檸檬酸滴定；(c)100-300mM L-精氨酸HCl，10mM檸檬酸和檸檬酸鈉作為緩沖劑；(d)100-300mM用檸檬酸滴定的L-精氨酸堿。
圖10顯示了50℃下，作為精氨酸濃度函數(shù)，用IEX-HPLC分析的在4種制劑中剩余可溶性TFPI的半衰期(t1/2，天)。所有制劑含有0.15毫克/毫升TFPI和L-精氨酸堿或L-精氨酸HCl，用琥珀酸或10mM琥珀酸和琥珀酸鈉緩沖到pH5.5。具體TFPI制劑含有(a)20-150mM L-精氨酸HCl，10mM琥珀酸和琥珀酸鈉作為緩沖劑，(b)20-150mM L-精氨酸堿，用琥珀酸滴定；(c)100-300mM L-精氨酸HCl，10mM琥珀酸和琥珀酸鈉作為緩沖液；(d)100-300mM用琥珀酸滴定的L-精氨酸堿。
圖11顯示50℃下，作為精氨酸濃度函數(shù)，用IEX-HPLC分析的在4種制劑中剩余可溶性TFPI的半衰期(t1/2，天)。所有制劑含有0.15毫克/毫升TFPI和L-精氨酸堿，用琥珀酸或檸檬酸滴定到pH5.5。具體TFPI制劑含有(a)20-150mM L-精氨酸堿，用檸檬酸滴定，(b)20-150mM L-精氨酸堿，用琥珀酸滴定；(c)100-300mML-精氨酸堿，用檸檬酸滴定；(d)100-300mM用琥珀酸滴定的L-精氨酸堿。
發(fā)明詳述
本發(fā)明針對含有多肽作為治療活性成分的液體藥物組合物，及其制備的方法。為了本發(fā)明的目的，關(guān)于藥物組合物或制劑的術(shù)語“液體”指包括術(shù)語“水相”。本文所用的術(shù)語“多肽”包括天然存在的(天然的)、合成的和重組多肽和蛋白質(zhì)，及其生物活性變體，如本文中另行限定的?！爸委熁钚猿煞帧敝付嚯奶禺愋缘膿饺虢M合物，當(dāng)藥物組合物被施給個體時，對治療、預(yù)防或診斷個體內(nèi)的疾病或病況帶來理想的治療反應(yīng)。
更具體的，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定化的液體藥物組合物，其治療活性成分包括一種多肽，它通常在液體藥物組合物儲藏過程中顯示聚集物形成?！熬奂纬伞敝付嚯姆肿又g的物理作用，導(dǎo)致形成寡聚物，它保持可溶狀態(tài)，或從溶液中沉淀出來的大的可見聚集物。“儲藏過程”指液體藥物組合物或制劑一旦制備后，未立即施用于個體。而是在制備后以液體形式、冷凍狀態(tài)或干燥形式包裝，用于以后重新配制成液體形式，或適用于施給病人的其它形式?！案稍镄问健敝赣美鋬龈稍?即凍干；見例如Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.3848-59)，噴霧干燥(見Masters(1991)Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientificand Technical，Essez，U.K.)，491-676頁；Broadhead等(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206和Mumenthaler等(1994)Pharm.Res.1112-20)或風(fēng)干(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25459-470；和Roser(1991)Biopharm.447-53)等方式進(jìn)行干燥處理的液體藥物組合物或制劑。液體藥物組合物儲藏過程中多肽形成的聚集物可以對該多肽的生物活性造成不良影響，導(dǎo)致該藥物組合物的療效喪失。另外，聚集形成可以導(dǎo)致其它問題，例如當(dāng)在輸液系統(tǒng)施用含有多肽的藥物組合物時，可使管道、膜或泵堵塞。
本發(fā)明的穩(wěn)定化液體藥物組合物還含有其量足夠減少組合物儲藏過程中多肽聚集物形成的氨基酸堿?！鞍被釅A”指一種氨基酸或多種氨基酸的組合，其中任何給定的氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。當(dāng)使用氨基酸組合時，所有各種氨基酸可以以其游離堿形式存在，也都可以以其鹽形式存在，或一部分可以以其游離堿形式存在，而另一部分可以以其鹽形式存在。用于制備本發(fā)明的組合物的優(yōu)選氨基酸是帶有帶電側(cè)鏈的氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在本發(fā)明的藥物組合物中可存在特定氨基酸的任何立體異構(gòu)體(即L、D或DL異構(gòu)體)或這些立體異構(gòu)體的組合，只要特定的氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。優(yōu)選使用L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明的組合物還可以用這些優(yōu)選氨基酸的類似物配制?！鞍被犷愃莆铩敝柑烊淮嬖诘陌被岬难苌?，它帶來在本發(fā)明的液體藥物組合物儲藏過程中減少聚集物形成的理想作用。合適的精氨酸類似物包括例如氨基胍和L-精氨酸N-一乙酯。與優(yōu)選氨基酸一樣，氨基酸類似物以游離堿形式或其鹽形式摻入組合物。
聯(lián)合本文定義的氨基酸堿，本發(fā)明的穩(wěn)定化液體藥物組合物還含有基本不含其鹽形式的酸，以其鹽形式存在的酸或酸及其鹽形式的混合物，來維持溶液pH。優(yōu)選用氨基酸堿和基本不含其鹽形式的酸聯(lián)合維持pH。這種組合使溶液克分子滲透壓濃度比如果用酸及其鹽形式作為緩沖劑與氨基酸聯(lián)合，來配制穩(wěn)定化的藥物組合物更低。這種組合的優(yōu)點(diǎn)是可以在藥物組合物中摻入更高濃度的氨基酸堿穩(wěn)定劑，而不超過溶液的等滲性?！盎静缓潲}形式的酸”指在液體藥物組合物中作為緩沖劑的酸在沒有任何其鹽形式的條件下存在。通常用于液體藥物組合物的含有酸的緩沖劑用該酸的鹽或酸與其鹽形式的組合制備。因此例如用酸與其抗衡離子，如鈉、鉀、銨、鈣或鎂制備緩沖液。這樣琥珀酸緩沖液通常含有琥珀酸的鹽，例如琥珀酸鈉或琥珀酸和琥珀酸鈉的混合物。雖然在本發(fā)明的穩(wěn)定化的液體藥物組合物中用作緩沖劑的酸可以是酸的鹽形式或酸與其鹽形式的混合物，優(yōu)選作為緩沖劑的酸應(yīng)完全是其酸形式。適合用于配制本發(fā)明的穩(wěn)定化的含多肽的液體藥物組合物的酸包括但不限于琥珀酸、檸檬酸、磷酸、谷氨酸、馬來酸、蘋果酸、乙酸、酒石酸和天冬氨酸，更優(yōu)選的是琥珀酸和檸檬酸，最優(yōu)選的是琥珀酸。
本發(fā)明的含多肽的液體藥物組合物是“穩(wěn)定化的”組合物?！胺€(wěn)定化的”指如本文公開的，液體組合物具有與不存在氨基酸堿和緩沖劑相混合制備的組合物相比，具有提高的儲藏穩(wěn)定性。在該液體制劑中觀察到這種儲藏穩(wěn)定性增加，不論是直接以該形式儲藏以備后用，還是以冷凍狀態(tài)儲藏，在使用前融化，還是以干燥狀態(tài)制備，如凍干、風(fēng)干或噴霧干燥形式，隨后在使用前重建成液體形式或其它形式。優(yōu)選本發(fā)明的組合物直接以液體形式儲藏，來充分利用液體形式儲藏穩(wěn)定性提高的優(yōu)點(diǎn)，不需重新配制就可以方便施用，如果制劑與制菌劑兼容，還能提供預(yù)填充的，即用型針筒制劑或作為多劑型制備物。
本發(fā)明的組合物涉及發(fā)現(xiàn)加入游離堿形式或鹽形式的精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸或谷氨酸等氨基酸，聯(lián)合基本不含其鹽形式的酸、鹽形式的酸或酸及其鹽形式的混合物，可得到含有多肽的液體藥物組合物，它相對于不用這兩種成分組合制備的含多肽的液體藥物組合物，具有提高的儲藏穩(wěn)定性。組合物提高的儲藏穩(wěn)定性是通過氨基酸對治療活性肽的穩(wěn)定性的影響實(shí)現(xiàn)的，更具體是通過在液體制劑儲藏過程對其中的多肽聚集過程的影響實(shí)現(xiàn)的。另外，如本文所定義的，在含多肽的液體制劑中摻入氨基酸堿和基本不含其鹽形式的酸得到接近等滲，而不需要另外加入其它等滲劑，如氯化鈉的液體藥物組合物?！敖咏葷B”指液體組合物具有約240-360毫摩爾/千克，優(yōu)選240-340毫摩爾/千克，更優(yōu)選約250-330毫摩爾/千克，甚至更優(yōu)選約260-320毫摩爾/千克，最優(yōu)選約270-310毫摩爾/千克的克分子滲透壓濃度。
摻入本發(fā)明的穩(wěn)定化的液體藥物組合物的氨基酸堿保護(hù)治療活性多肽不聚集，從而提高了多肽在組合物儲藏過程中的穩(wěn)定性。“提高穩(wěn)定性”指液體藥物組合物儲藏過程中多肽聚集物形成比不存在該特殊穩(wěn)定劑時多肽聚集物形成少。加入氨基酸堿使得聚集物形成減少具有濃度依賴關(guān)系。即當(dāng)不存在氨基酸堿時，液體制劑儲藏過程中通常顯示多肽聚集物形成時，氨基酸堿濃度的增加導(dǎo)致液體藥物組合物中多肽穩(wěn)定性提高。確定在液體藥物組合物中加入特定氨基酸堿的量，以減少聚集物形成，從而提高多肽穩(wěn)定性，并因此提高組合物的儲藏穩(wěn)定性，可以輕易的對任何特定感興趣的多肽進(jìn)行，而不需要用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法進(jìn)行不必要的實(shí)驗(yàn)。
因此例如，可通過測量溶液中可溶性多肽隨時間的改變輕易的確定特定氨基酸堿在液體組合物儲藏過程中對多肽聚集的作用。可用適合檢測感興趣的多肽的測定法定量溶液中的可溶性多肽量。這些測定法包括例如反相(RP)-HPLC、尺寸排阻(SEC)-HPLC和紫外吸收法，如下文實(shí)施例所述。當(dāng)感興趣的多肽同時在液體制劑儲藏過程中形成可溶和不可溶的聚集物時，可用RP-HPLC和SEC-HPLC的組合分辨作為可溶性聚集物存在的可溶性多肽部分，和作為非聚集物存在的生物活性分子形式的可溶性多肽部分，如下文實(shí)施例1所述。
就聚集物形成而言，在含多肽的液體藥物組合物摻入有效量的氨基酸堿，以獲得穩(wěn)定化的藥物組合物可視為導(dǎo)致聚集物形成隨時間減少，從而更好的將溶液中的可溶性多肽維持在其非聚集的生物活性分子形式的量。因此例如，當(dāng)多肽是單體蛋白，如下文實(shí)施例所述的白細(xì)胞介素-2(IL-2)或組織因子通道抑制蛋白(TFPI)時，用于制備本發(fā)明的穩(wěn)定化組合物的穩(wěn)定劑的有效量是導(dǎo)致IL-2或TFPI更多保留在其單體分子形式的量。
本發(fā)明的穩(wěn)定化的含多肽的液體藥物組合物儲藏穩(wěn)定性的提高還可以與氨基酸堿對儲藏過程中治療活性多肽內(nèi)谷氨酰胺和/或天冬酰胺殘基的脫氨基作用產(chǎn)生抑制作用有關(guān)?？呻S時間監(jiān)測以脫氨基形式存在的多肽量輕易的確定液體組合物儲藏過程中特定氨基酸堿對這些殘基的脫氨基作用。測定存在于溶液相中的特定多肽的分子種類，即天然或脫氨基形式是本領(lǐng)域一般已知的。這些方法包括層析分離分子種類并用多肽分子量標(biāo)準(zhǔn)鑒定，如下文實(shí)施例所述的RP-HPLC。
使用用基本不含其鹽形式的酸緩沖氨基酸堿的新穎組合方法，為提高本發(fā)明的穩(wěn)定化含多肽的液體藥物組合物中多肽的穩(wěn)定性，提供了比例如用琥珀酸/琥珀酸鈉緩沖系統(tǒng)中的氨基酸更好的優(yōu)點(diǎn)。該新穎組合能夠制備比使用酸及其鹽形式的混合物緩沖系統(tǒng)得到的接近等滲的制劑穩(wěn)定化的氨基酸濃度更高的制劑。更高濃度的穩(wěn)定氨基酸能夠更好的提高多肽穩(wěn)定性，從而提高制劑的儲藏穩(wěn)定性。
例如，當(dāng)用琥珀酸緩沖加在含有蛋白質(zhì)白細(xì)胞介素-2(IL-2)和具有蛋白質(zhì)最佳pH(pH5.8)的液體制劑中的精氨酸堿時，精氨酸濃度可以提高到230mM，而仍然保持制劑的等滲性。這導(dǎo)致作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定性量度的50℃下IL-2的儲藏期增加了一倍。雖然可用相同的精氨酸濃度和用琥珀酸/琥珀酸鈉作為緩沖劑實(shí)現(xiàn)相似的IL-2儲藏期，但是必須加入酸形式的精氨酸來實(shí)現(xiàn)類似的pH，得到的制劑是高滲的(見實(shí)施例1，表1)。
類似的，當(dāng)用檸檬酸緩沖加入含有蛋白質(zhì)組織因子通道抑制蛋白(TFPI)的液體制劑的，并僅具有適合該蛋白質(zhì)的pH(pH5.5)的精氨酸殘基時，精氨酸濃度可提高到300mM，而仍然維持制劑的等滲性。這導(dǎo)致50℃時TFPI的儲藏期幾乎增加了50％。雖然可用同樣的精氨酸濃度和檸檬酸/檸檬酸鈉作為緩沖劑實(shí)現(xiàn)類似的TFPI儲藏期，仍然必須以其酸形式加入精氨酸實(shí)現(xiàn)類似的pH，而得到的制劑仍是高滲的(見實(shí)施例8，表18)。用更高濃度的氨基酸作為主要穩(wěn)定劑避免了使用傳統(tǒng)的多肽穩(wěn)定劑，如牛血清白蛋白或人血清白蛋白的需要，它們較不利于作為穩(wěn)定劑，因?yàn)榭赡軙胁《疚廴尽?br> 另外，液體藥物組合物的等滲性是良好的，因?yàn)樗鼘?dǎo)致給藥后疼痛減少，并大大減少因使用高滲或低滲組合物而可能引起的溶血作用。因此，與使用其它更常規(guī)的由酸和酸的鹽形式構(gòu)成的緩沖系統(tǒng)的制劑相比，本發(fā)明的穩(wěn)定化組合物不僅具有提高的儲藏穩(wěn)定性，還具有給藥時疼痛大大減輕的優(yōu)點(diǎn)。例如，在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，當(dāng)穩(wěn)定化的液體藥物組合物與注射生理鹽水相比，注射后引起的類似燒灼和蜇叮感的疼痛減輕(見實(shí)施例7)。
認(rèn)識到用氨基酸堿作為主要穩(wěn)定劑和基本不含其鹽形式的酸作為緩沖劑來制備本發(fā)明的液體藥物組合物的優(yōu)點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不必進(jìn)行不必要的實(shí)驗(yàn)就可確定上述各種成份摻入含有感興趣的治療活性的多肽(該多肽如本文所示顯示聚集物形成)的液體藥物組合物的優(yōu)選濃度，來提高組合物儲藏過程中多肽的穩(wěn)定性。根據(jù)公開的方法，例如下文實(shí)施例1，技術(shù)人員可以評估用于本文所述的液體藥物組合物的一定范圍濃度的氨基酸堿和各種緩沖用酸。優(yōu)選摻入組合物的氨基酸堿量在約100-400mM范圍內(nèi)，優(yōu)選約130-375mM，更優(yōu)選約150-350mM，甚至更優(yōu)選約175-325mM，仍然更優(yōu)選約180-300mM，甚至更優(yōu)選約190-280mM，最優(yōu)選約200-260mM，視存在于組合物中的蛋白質(zhì)而定。鑒于本文所公開的有利理由，雖然緩沖劑可以是鹽形式的酸，或酸及其鹽形式的混合物，優(yōu)選緩沖劑是基本不含其鹽形式的酸。用作緩沖劑的酸優(yōu)選以約40-250mM，約50-240mM，約60-230mM，約70-220mM，更優(yōu)選約80-210mM，最優(yōu)選約90-200mM的范圍內(nèi)加入，視用作緩沖劑的酸和用于對抗聚集物形成穩(wěn)定化多肽的最佳pH而定。
在一個實(shí)施例中，氨基酸堿是濃度約230mM的精氨酸堿，而用作緩沖劑的酸是濃度約128mM的琥珀酸。這能夠制備具有接近等滲的克分子滲透壓濃度和約5.8pH的含多肽的液體藥物組合物。在另一個實(shí)施例中，氨基酸堿是濃度約300mM的精氨酸堿，用作緩沖劑的酸是濃度約120mM的檸檬酸。這能夠制備具有接近等滲的克分子滲透壓濃度和約5.5pH的含多肽的液體藥物組合物。在另一個實(shí)施例中，氨基酸堿是濃度約200-300mM的精氨酸堿，用作緩沖劑的酸是濃度約120-180mM的琥珀酸。這能夠制備克分子滲透壓濃度約256-363毫摩爾/千克和約5.5pH的含多肽的液體藥物組合物。
因此在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，穩(wěn)定化的液體藥物組合物含有作為多肽的IL-2或其變體，濃度約150-350mM的精氨酸堿和濃度約80-190mM的琥珀酸。在一個優(yōu)選例中，存在于IL-2液體藥物組合物中的精氨酸堿濃度約230mM，琥珀酸濃度約128mM。該優(yōu)選的IL-2組合物具有約5.8的pH和約250-330毫摩爾/千克的克分子滲透壓濃度。這些組合物中IL-2或其變體的濃度是約0.01-2.0毫克/毫升，優(yōu)選約0.02-1.0毫克/毫升，更優(yōu)選約0.03-0.8毫克/毫升，最優(yōu)選約0.03-0.5毫克/毫升。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，穩(wěn)定化的液體藥物組合物中含有作為多肽的TFPI或其變體，濃度約100-400mM的精氨酸堿，和濃度約80-190mM的琥珀酸。在一個優(yōu)選例中，存在于TFPI中的精氨酸堿濃度是約200-300mM，琥珀酸濃度約120-180mM。該優(yōu)選的TFPI組合物具有約5.5的pH和約240-360毫摩爾/千克的克分子滲透壓濃度。這些組合物中TFPI或其變體的濃度是約0.01-5.0毫克/毫升，優(yōu)選0.05-2.0毫克/毫升，更優(yōu)選約0.10-1.0毫克/毫升，最優(yōu)選約0.10-0.60毫克/毫升。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，穩(wěn)定化的液體藥物組合物含有TFPI或其變體作為多肽，濃度為約175-400mM的精氨酸堿，或濃度約40-200mM的檸檬酸。在一個優(yōu)選例中，精氨酸堿以約250-350mM的濃度存在于TFPI液體藥物組合物中，檸檬酸的濃度約100-150mM。該優(yōu)選的TFPI組合物具有約5.0-6.5的pH和約240-360mmol/kg的克分子滲透壓濃度。在另一個實(shí)施例中，精氨酸堿的濃度是約300mM，檸檬酸濃度約120mM。該TFPI組合物具有約5.5的pH和約240-360mmol/kg的克分子滲透壓濃度。這些組合物中TFPI或其變體的濃度是約0.01-5.0毫克/毫升，優(yōu)選約0.05-2.0毫克/毫升，更優(yōu)選約0.10-1.0毫克/毫升，最優(yōu)選約0.10-0.60毫克/毫升。
如下文實(shí)施例所示，含多肽的液體藥物制劑主要通過它對多肽聚集物形成的作用，影響其中所含的多肽的穩(wěn)定性。因此存在于本發(fā)明的藥物組合物中的緩沖酸量將視感興趣的具體多肽穩(wěn)定性的最佳pH而定?？捎帽绢I(lǐng)域一般可得的方法確定該最佳pH，在本文的實(shí)施例中進(jìn)一步說明。本發(fā)明組合物的優(yōu)選pH范圍是約4.0-9.0，更具體是pH5.0-6.5，視多肽性質(zhì)而定。例如在一個實(shí)施例中，pH是約5.8，更特別是當(dāng)多肽是IL-2或其變體。在另一個實(shí)施例中，pH是約5.5，更特別當(dāng)多肽是TFPI或其變體。
穩(wěn)定化的藥物組合物(含有基本不含其鹽形式的酸、酸的鹽形式或酸及其鹽形式的混合物緩沖的氨基酸堿)還可含有其它穩(wěn)定劑，它進(jìn)一步增強(qiáng)其中治療活性多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別感興趣的穩(wěn)定劑包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，它保護(hù)多肽對抗甲硫氨酸的氧化作用；和非離子型表面活性劑，它保護(hù)多肽不由于凍融或機(jī)械剪切而產(chǎn)生聚集。
因此，當(dāng)作為治療劑的多肽是一種含有至少一個對這種氧化作用敏感的甲硫氨酸殘基的多肽時，可加入甲硫氨酸來抑制甲硫氨酸殘基氧化成甲硫氨酸亞砜?！耙种啤敝鸽S時間使甲硫氨酸氧化的產(chǎn)物積聚盡量減少。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致多肽更好的保留在其原有的分子形式?？墒褂眉琢虬彼岬娜魏瘟Ⅲw異構(gòu)體(L、D或DL異構(gòu)體)或其組合。加入的量應(yīng)當(dāng)足以抑制甲硫氨酸殘基的氧化過程，使甲硫氨酸亞砜量可被管理部門接受。通常這意味著組合物含有不超過約10％-30％的甲硫氨酸亞砜。通常這可以通過加入甲硫氨酸來實(shí)現(xiàn)，加入的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基比例范圍是約1∶1-1000∶1，最優(yōu)選10∶1-100∶1。
加入甲硫氨酸的優(yōu)選量可輕易的通過制備含有感興趣的多肽和不同濃度的甲硫氨酸的組合物，并按實(shí)施例2所述用例如層析(如用RP-HPLC)分離不同分子，并用多肽分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，測定氧化物形成對多肽的相對作用，憑經(jīng)驗(yàn)確定要加入甲硫氨酸的優(yōu)選量。可最大限度抑制甲硫氨酸殘基的氧化，而對與氨基酸相關(guān)的多肽聚集作用沒有不良作用的甲硫氨酸濃度，將代表要加入組合物，進(jìn)一步改善多肽穩(wěn)定性的甲硫氨酸的優(yōu)選量。
可通過在本發(fā)明的含多肽的液體藥物組合物中摻入表面活性劑，降低液氣界面的表面張力，在本發(fā)明的液體組合物的加工過程中抑制由于凍融或機(jī)械剪切的作用引起的多肽降解。使用的典型表面活性劑是非離子型表面活性劑，包括聚氧乙烯山梨醇酯，如聚山梨醇酯80(Tween 80)和聚山梨醇酯20(Tween 20)；聚氧丙烯-聚氧乙烯酯，例如Pluronic F68；聚氧乙烯醇，如Brij 35；二甲基硅油；聚乙二醇，例如PEG-400；溶血磷酯酰膽堿；和聚氧乙烯-p-t-辛烷基苯酚，例如Triton X-100。描述了表面活性劑或乳化劑對藥物的典型穩(wěn)定化作用，例如在Levine等(1991)J.Parenteral Sci.Technol.45(3)160-165，在此引入以供參考。本發(fā)明實(shí)施中使用的優(yōu)選表面活性劑是聚山梨醇酯80。
除了上述公開的試劑，還可加入其它穩(wěn)定劑，如白蛋白，乙二胺四乙酸(EDTA)或它的一種鹽，如EDTA二鈉鹽，來進(jìn)一步增強(qiáng)液體藥物組合物的穩(wěn)定性?？梢约s1.0％w/v或以下的濃度加入白蛋白。EDTA作為已知催化多種氧化反應(yīng)的金屬離子凈化劑，從而提供了另一種穩(wěn)定劑。
在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，穩(wěn)定化的液體藥物組合物含有IL-2或其變體作為多肽，濃度約150-350mM的精氨酸堿，濃度約80-190mM的琥珀酸，濃度約0.5-10mM的甲硫氨酸，約0.1-5.0mM EDTA和約0.001％-0.2％的聚山梨醇酯80。在一個優(yōu)選例中，精氨酸堿以約230mM的濃度存在，和琥珀酸以約128mM的濃度存在于IL-2液體藥物組合物中。優(yōu)選IL-2組合物具有約5.8的pH和約250-330mmol/kg的克分子滲透壓濃度。這些組合物中IL-2的濃度或其變體是約0.01-2.0毫克/毫升，優(yōu)選約0.02-1.0毫克/毫升，更優(yōu)選約0.03-0.8毫克/毫升，最優(yōu)選約0.03-0.5毫克/毫升。
當(dāng)需要時，可在本發(fā)明的穩(wěn)定化的含多肽的液體藥物組合物中包含糖或糖醇?？墒褂萌魏翁?，例如單糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、右旋糖酐、支鏈淀粉、糊精、環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素鈉。蔗糖是最優(yōu)選的糖添加劑。糖醇定義成具有-OH基團(tuán)的C4-C8烴類，包括例如甘露醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)茅醇、木糖醇和阿拉伯糖醇，甘露醇是最優(yōu)選的糖醇添加劑。上述糖或糖醇可單獨(dú)或組合使用。用量無固定的限制，只要糖或糖醇可溶于液體制劑，對用本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)的穩(wěn)定化作用不產(chǎn)生不良影響。優(yōu)選糖或糖醇濃度在約1.0-15.0w/v％之間，更優(yōu)選在約2.0-10.0w/v％之間。
本發(fā)明的穩(wěn)定化的含多肽的液體藥物組合物可含有其它化合物，可提高或促進(jìn)作為治療活性成分的感興趣的多肽的效果或所需品質(zhì)，只要氨基酸堿實(shí)現(xiàn)的初始穩(wěn)定作用不受不良影響。該組合物選擇的給藥途徑必須是安全的，必須是無菌的，必須保持其所需的治療活性。
本發(fā)明的組合物的制備優(yōu)選通過預(yù)先混合穩(wěn)定劑和緩沖劑以及其它賦形劑，然后摻入感興趣的多肽。為了進(jìn)一步穩(wěn)定本發(fā)明的組合物可加入的任何其它賦形劑必須對初始穩(wěn)定劑(即氨基酸堿)與緩沖劑(即基本不含其鹽形式的酸、酸的鹽形式或酸及其鹽形式的混合物)結(jié)合的穩(wěn)定作用沒有不良影響，如用于獲得本文公開的新穎組合物。加入優(yōu)選量的氨基酸堿實(shí)現(xiàn)感興趣的多肽聚集形成減少后，用緩沖劑調(diào)節(jié)液體組合物的pH，優(yōu)選在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)，更優(yōu)選到感興趣的多肽最佳的pH。雖然可在將感興趣的多肽加到組合物中后調(diào)節(jié)pH，優(yōu)選在加入該多肽前調(diào)節(jié)，因?yàn)檫@可以減少多肽變性的危險。然后用合適的機(jī)械裝置實(shí)現(xiàn)組分的充分混合。
雖然本發(fā)明的特別實(shí)施例針對穩(wěn)定化的組合物，它們含白細(xì)胞介素-2(IL-2)或其變體、或組織因子通道抑制蛋白(TFPI)或其變體，是特別容易通過聚集物形成降解的蛋白質(zhì)的例子，本發(fā)明的實(shí)用性可普遍擴(kuò)大到任何含多肽或其變體，在液體制劑儲藏過程中顯示聚集物形成的藥物組合物。因此適合用于本發(fā)明實(shí)施的多肽包括例如白細(xì)胞介素(如IL-2)、干擾素包括β-干擾素(IFN-β)及其突變蛋白，如IFN-βser17(如歐洲專利申請?zhí)?8549B1和美國專利號4,588,585，在此引入以供參考)，組織因子通道抑制蛋白(TFPI)，人生長激素(hGH)，胰島素和其它類似的顯示在液體制劑中聚集物形成的多肽，及其任何生物活性變體。
存在于本發(fā)明的穩(wěn)定化的液體藥物組合物中的多肽可以是天然的或以重組技術(shù)獲得的，并可以來自任何來源，包括哺乳動物來源，如小鼠、大鼠、家兔、靈長類、豬和人，條件是它們符合本文所述的標(biāo)準(zhǔn)，即它們能在液體制劑儲藏過程中形成聚集物。優(yōu)選這些多肽衍生自人類來源，更優(yōu)選是重組的來自微生物宿主的人蛋白。
本文所用的術(shù)語“多肽”還包括作為本發(fā)明藥物組合物中治療活性成分的感興趣的多肽的生物活性變體。這些變體應(yīng)保留天然多肽的所需生物活性，即當(dāng)施給病人時，含有變體多肽的藥物組合物與含有天然多肽的藥物組合物具有相同的療效。即變體多肽將在藥物組合物中作為治療活性成分，其方式與天然多肽表現(xiàn)的情況相似。本領(lǐng)域已有能測定變體多肽能否維持所需的生物活性，從而在藥物組合物中發(fā)揮其治療活性成分的方法?？捎脤ｉT設(shè)計(jì)的試驗(yàn)方法用于測量天然多肽或蛋白質(zhì)活性，包括本發(fā)明所描述的試驗(yàn)方法以測量生物活性。另外，可對有生物活性的天然多肽所引發(fā)產(chǎn)生的抗體測試其與變體多肽結(jié)合的能力，其有效結(jié)合是多肽具有與天然多肽相似構(gòu)型的指標(biāo)。
天然或天然存在的感興趣的多肽的合適生物活性變體可以是片段、類似物和該多肽的衍生物?！捌巍敝竷H具有完整多肽序列或結(jié)構(gòu)一部分的多肽，可以是天然多肽的C-末端缺失物或N-末端缺失物?！邦愃莆铩敝柑烊欢嚯幕蛱烊欢嚯牡钠蔚念愃莆?，其中具有一個或多個氨基酸被取代、插入或缺失的天然多肽序列和結(jié)構(gòu)。本文所述的“突變蛋白”和具有一個或多個類肽(肽模擬物)的肽也包括在術(shù)語“類似物”中(見國際出版號WO 91/04282)?！把苌敝父信d趣的天然多肽、天然多肽的片段或其各類似物的修飾，如糖基化，磷酸化或加入其它外源基團(tuán)，只要能保留該天然多肽的所需生物活性。制備多肽片段、類似物和衍生物的方法是本領(lǐng)域一般可得的。
例如，可通過在編碼感興趣的天然多肽的克隆DNA序列中產(chǎn)生突變，來制備多肽的氨基酸序列變體。誘變和核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域熟知的，見例如Walker和Gaastra編(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillianPublishing Company，New York)；Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488-492；Kunkel等(1987)Methods Enzymol.154367-382；Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，New York)；美國專利號4,873,192；及其中的參考文獻(xiàn)；在此引入以供參考?？稍贒ayhoff等(1978)于Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.Washington，D.C.)的模型中找到不影響感興趣的多肽的生物活性的合適氨基酸取代物的指標(biāo)，在此引入以供參考?？赡軆?yōu)選的是保守取代，例如用另一個具有相似特性的氨基酸取代另一個。保守取代的例子包括但不限于GlyAla，ValIlcLeu，ASpGlu，LysArg，AsnGln和PheTrpTyr。
在構(gòu)建感興趣的多肽的變體時，可進(jìn)行修飾，使變體繼續(xù)保留其所需的活性。明顯任何在編碼變體多肽的DNA中制造的突變體都必須不可使其序列超出閱讀框外，優(yōu)選不產(chǎn)生可形成二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。見歐洲專利申請公開號75,444。
感興趣的多肽的生物活性變體將與作為比較基礎(chǔ)的參比多肽分子的氨基酸序列具有至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選至少90％-95％或更多，和最優(yōu)選約98％或以上的氨基酸序列相同性。任何感興趣的天然多肽的生物活性變體可以和天然多肽有至少1-15個氨基酸，至少1-10，例如6-10，至少5，至少4、3、2甚至1個氨基酸殘基的差異。“序列相同性”指當(dāng)將變體的氨基酸的特定連續(xù)區(qū)段并與參比分子的氨基酸序列排列比較時，在變體多肽和作為參比的多肽分子中發(fā)現(xiàn)相同的氨基酸殘基。通過確定存在于兩條序列中的相同氨基酸殘基的位置數(shù)得到匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以與參比分子比較的區(qū)段位置總數(shù)，并乘以100，得到序列相同性百分?jǐn)?shù)。
為了兩條序列的最佳排列，變體氨基酸序列的連續(xù)區(qū)段相對于參比分子的氨基酸序列可以附加一些氨基酸殘基或缺失一些氨基酸殘基。用于與參比氨基酸序列比較的連續(xù)區(qū)段將含有至少20個連續(xù)氨基酸殘基，可能有30、40、50、100或更多殘基?？赏ㄟ^確定缺口數(shù)來增加與變體的氨基酸序列中的缺口相同的序列進(jìn)行校正。對于氨基酸序列和編碼氨基酸序列的核苷酸序列的序列排列方法是本領(lǐng)域熟知的。
因此，可以用數(shù)學(xué)算法確定任何兩條序列之間的相同性百分?jǐn)?shù)。一個可用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS411-17的算法。這種算法用于ALIGN程序(2.0版)，它是GCG序列排列軟件包的一部分。當(dāng)比較氨基酸序列時，可與ALGN程序一起使用缺口長度損失為12和缺口損失為4的PAM120重量剩余表。用于比較兩條序列的另一個數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選非限制性例子是Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的算法，在Karlin和Altsuchul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中作了改良。這種算法包括在Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸檢索可用NBLAST程序進(jìn)行，評分＝100，詞長＝12，獲得與編碼感興趣的多肽的核苷酸序列類似的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)檢索可用XBLAST程序進(jìn)行，評分＝50，詞長＝3，以獲得與感興趣的多肽同類的氨基酸序列。為了獲得可供比較的帶缺口的排列，可如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res253389所述利用檢索缺口BLAST。另外，可用PSI-Blast進(jìn)行重復(fù)檢索，檢測分子之間的遙遠(yuǎn)關(guān)系。見Altschul等(1997)，見上。當(dāng)利用BLAST、檢索缺口的BLAST和PSI-BLAST程序時，可用各程序的缺省參數(shù)(如XBLAST和NBLAST)。見http∥www.ncbi.blm.nib.gov。另見ALIGN程序(Dayhoff(1978)于Atlas ofProtein Sequence and Structure5Suppl.3)(National Biomedical ResearchFoundation，Washington，D.C.)和Wisconsin序列分析包，8版(從GeneticsComputer Group，Madison，Wisconsin)中的程序，例如GAP程序，其中利用程序的缺省參數(shù)。
當(dāng)考慮氨基酸序列相同性百分?jǐn)?shù)時，一些氨基酸殘基位置由于保守氨基酸取代可以不同，不影響蛋白質(zhì)功能的特性。在這些例子中，可上調(diào)序列相同性百分?jǐn)?shù)，至與保守取代的氨基酸相同的程度。這樣的調(diào)節(jié)是本領(lǐng)域熟知的。見例如Myers和Miller(1988)Computer Applic.Biol.Sci.411-17。
多肽的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)依賴于許多因素。由于可離子化的氨基和羧基存在于分子中，可獲得作為酸性或堿性鹽式，或中性的多肽。所有這些制備物在合適的環(huán)境條件下時，就可保持其生物活性。這些特性都包含在本文所引用的多肽類定義中。另外，多肽的初級氨基酸序列可用糖基團(tuán)(糖基化)或其它補(bǔ)充分子，如脂類、磷酸、乙?；日T導(dǎo)而擴(kuò)大，還可以與糖類結(jié)合而擴(kuò)大。這些擴(kuò)大作用的一些方面是通過產(chǎn)生這類作用的宿主的翻譯后加工系統(tǒng)來完成的；其它修飾可體外引入。無論如何，這些修飾都包含在本文所引用的多肽定義中，只要多肽的活性未曾破壞。預(yù)期這種修飾可以通過在各種試驗(yàn)中增強(qiáng)或減少多肽的活性而定量或定性的影響其活性。另外，鏈上的各氨基酸殘基可以通過氧化、還原或其它衍生修飾，可切割多肽獲得保持其活性的片段。這種不破壞活性的改變不會將多肽序列排除在本文所用的感興趣的多肽的定義之外。
本領(lǐng)域提供了關(guān)于制備和使用多肽變體的基本方針。在制備多肽變體中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易的確定對天然蛋白質(zhì)核苷酸或氨基酸序列的哪種修飾將得到適合用于本發(fā)明藥物組合物的治療活性組分的變體，而且如本文所述，其聚集物形成可在氨基酸堿、基本不含其鹽形式的酸、酸的鹽形式、酸與其鹽形式的混合物存在下減少。
在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，在本發(fā)明的液體藥物組合物中作為治療活性組分存在的多肽是白細(xì)胞介素-2(IL-2)或其變體，優(yōu)選重組IL-2。白細(xì)胞介素-2是一種正常外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，以低濃度存在于身體內(nèi)。它誘導(dǎo)抗原或促分裂素刺激的T-細(xì)胞在接觸植物凝血素、抗原或其它刺激后增殖。Morgan等(1976)Science 1931007-1008首先描述了IL-2，最初被稱為T-細(xì)胞生長因子，因?yàn)樗苷T導(dǎo)受刺激的T淋巴細(xì)胞增殖。它是一種據(jù)報(bào)道分子量在13,000-17,000范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)(Gillis和Watson(1980)J.Exp.Med.1591709)，具有范圍在6-8.5的等電點(diǎn)。現(xiàn)在認(rèn)識到除了它的生長因子特性，它調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的各種體外和體內(nèi)功能。IL-2是幾種淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的介導(dǎo)細(xì)胞相互作用和功能的信使-調(diào)節(jié)分子之一。已顯示這種天然存在的淋巴因子單獨(dú)或與淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞組合，具有對抗許多惡性腫瘤的抗腫瘤活性(見例如，Rosenberg等(1987)N.Engl.J.Med.316889-897；Rosenberg(1988)Ann.Surg.208121-135；Topalian等，(1988)J.Clin.Oncol.6839-853；Rosenberg等(1988)N.Engl.J.Med.3191676-1680；和Weber等(1992)J.Clin.Oncol.1033-40)。雖然在專利中已經(jīng)描述了IL-2對轉(zhuǎn)移性黑素瘤和腎細(xì)胞癌的抗腫瘤活性，但是其它疾病，特別是淋巴瘤看來也對IL-2治療有反應(yīng)。
“重組IL-2”指與天然序列的IL-2具有相當(dāng)?shù)纳锘钚缘陌准?xì)胞介素-2，是通過如Taniguchi等(1983)Nature 302305-310和Devos(1983)Nucleic AcidsResearch 114307-4323所述的重組DNA技術(shù)來制備的或如Wang等(1984)Science2241431-1433所述的經(jīng)突變而改變的IL-2。通常，克隆編碼IL-2的基因，然后在轉(zhuǎn)化的生物，優(yōu)選微生物，最優(yōu)選大腸桿菌中如本文所述表達(dá)。宿主生物在表達(dá)條件下表達(dá)外源基因來產(chǎn)生IL-2。合成的重組IL-2還可以在真核細(xì)胞中制備，如酵母或人細(xì)胞。從細(xì)胞生長、收集、破碎或抽提IL-2的方法基本在例如美國專利號4,604,377；4,738,927；4,656,132；4,569,790；4,748,234；4,530,787；4,572,298和4,931,543中所述，在此引入以供參考。
對于變體IL-2蛋白的例子，見歐洲專利申請?zhí)?36,489；1983年2月3日提交的歐洲專利申請?zhí)?3101035.0(1983年10月19日以出版號91539出版)；1982年12月22日提交的歐洲專利申請?zhí)?2307036.2(1983年9月14日以88195出版)；1983年10月13日提交的歐洲專利申請?zhí)?3306221.9(1984年5月30日以109748出版)所述的重組IL-2突變蛋白，它相當(dāng)于比利時專利號893,016，具有美國專利號4,518,584；美國專利號4,752,585和WO 99/60128所述的突變蛋白；和用于本文例子和美國專利號4,931,543的IL-2突變蛋白質(zhì)；所有這些都在此引入以供參考。另外，可用聚乙二醇修飾IL-2，提供增強(qiáng)的可溶性和改變的藥物動力學(xué)性質(zhì)(見美國專利號4,766,106，全部在此引入以供參考)。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，在本發(fā)明的液體藥物組合物中作為治療活性成分存在的多肽是一種干擾素，更具體是纖維上皮β-干擾素(IFN-β)或其變體，優(yōu)選用本領(lǐng)域描述的重組DNA技術(shù)制備的重組IFN-β。干擾素是哺乳動物細(xì)胞響應(yīng)接觸各種誘導(dǎo)物，例如分裂素、多肽、病毒等產(chǎn)生的。這些相對較小，物種特異性的單鏈多肽顯示免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗增殖性質(zhì)。干擾素作為治療抗病毒疾病和癌癥防治的治療劑受到關(guān)注。
編碼人IFN-β基因的DNA序列是本領(lǐng)域可得的(見Goedel等(1980)NucleicAcids Res.84057和Tanguchi等(1979)Proc.Japan.Acad.Sci.855464)，基因在大腸桿菌(Tanguchi等(1980)Gene 1011-15)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(見例如美國專利號4,966,843和5,376,567)中表達(dá)。IFN-β的變體在歐洲專利申請?zhí)?8549B1中所述，美國專利號4,518,584、4,588,585和4,737,462描述了變體蛋白，例如大腸桿菌中表達(dá)的IFN-βser17，所有在此引入以供參考。
在另一個實(shí)施例中，在本發(fā)明的液體藥物組合物中作為治療活性成分存在的多肽是組織因子通道抑制蛋白(TFPI)或其變體，優(yōu)選重組TFPI。該多肽是凝血級聯(lián)的抑制蛋白，還稱為脂蛋白關(guān)聯(lián)的凝血抑制蛋白(LACI)、組織因子抑制蛋白(TFI)和外源性途徑抑制蛋白(EPI)。TFPI首次從人肝細(xì)胞瘤細(xì)胞HepG2中(Broze和Miletich(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841886-1890)，隨后從人血漿(Novotny等(1989)J.Biol.Chem.26418832-18837)；和Chang肝和SK肝細(xì)胞瘤細(xì)胞(Wun等，(1990)J.Biol.Chem.26516096-16101)中純化出來的。已從胎盤和內(nèi)皮cDNA文庫中分離了TFPI cDNA(Wun等(1988)J.Biol.Chem.2636001-6004；Girard等(1989)Thromb.Res.5537-50)。對于綜述，見Rapaport(1989)Blood 73359-365(1989)；Broze等(1990)Biochemistry297539-7546。美國專利號4,966,852中進(jìn)一步描述了編碼TFPI的276個氨基酸殘基蛋白的TFPI cDNA的克隆方法；另見美國專利號5,773,251和5,849,875；在此引入以供參考。
TFPI的變體是本領(lǐng)域已知的，見例如美國專利號5,212,091，其中已從大腸桿菌產(chǎn)生并分離了一種非糖基化的重組TFPI形式；美國專利號5,106,833，其中公開了同類物和片段；和美國專利號5,378,614，其中描述了在酵母中產(chǎn)生TFPI同類物；所有在此引入以供參考。
將藥物學(xué)有效量的本發(fā)明的穩(wěn)定化、含多肽的液體藥物組合物施給個體?！八幬飳W(xué)有效量”指可有效治療，預(yù)防或診斷疾病或病況的量。典型的給藥途徑包括但不限于口腔給藥和胃腸外給藥，包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)和腹膜內(nèi)注射或輸液。在一個這樣的實(shí)施例中，給藥通過注射，優(yōu)選皮下注射。本發(fā)明組合物的可注射形式包括但不限于溶液、懸液和乳液。
含有感興趣的多肽的穩(wěn)定化液體藥物組合物可配制成單劑，還可配制成可注射或可輸液形式，例如溶液、懸液或乳液。另外，它可冷凍儲藏或制備成干燥形式，例如凍干粉末，它可再重新配制成液體溶液、懸液或乳液，用各種方法任一，包括口腔或胃腸外途徑給藥。優(yōu)選采用液體制劑儲藏，利用下文描述的本發(fā)明的各種方法以提高其儲藏穩(wěn)定性。優(yōu)選用膜滲濾滅菌穩(wěn)定化的藥物組合物，以單劑或多劑容器，例如密封指管或安瓿儲藏?？捎闷渌渲票绢I(lǐng)域已知的藥物組合物的方法進(jìn)一步提高本文公開的液體藥物組合物的儲藏穩(wěn)定性，只要它們對本發(fā)明的方法公開的優(yōu)選穩(wěn)定劑和緩沖劑的益處沒有不良影響?？稍赗emington’s PharmaceuticalSciences(1990)(第18版，Mack Pub.Co.，Eaton，Pennsylvania)找到有關(guān)藥物學(xué)上可接受的載體的配制和選擇的全面討論，在此引入以供參考。
“個體”指任何動物。優(yōu)選個體是哺乳動物，最優(yōu)選個體是人類。除了人以外特別重要的哺乳動物包括但不限于犬、貓、牛、馬、羊和豬。
當(dāng)為了治療給藥時，給藥可以是為了預(yù)防或治療目的。當(dāng)預(yù)防性給藥時，藥物應(yīng)在任何癥狀出現(xiàn)之前提供。預(yù)防性給藥可防止或減輕任何隨后的癥狀。當(dāng)為了治療給藥時，藥物應(yīng)在出現(xiàn)癥狀時或其后立即提供。治療給藥可減輕任何急性癥狀。
因此例如，為了治療、預(yù)防和診斷許多對該多肽的治療有反應(yīng)的臨床適應(yīng)征，可用含有有效量的天然序列IL-2或其變體的本發(fā)明藥物組合物的制劑?？梢蕴烊恍蛄械腎L-2的相同方式配制和使用天然序列的IL-2的生物活性變體，例如保持IL-2活性的IL-2突變蛋白，特別是突變蛋白IL-2.sub.ser125和其它位置125的半胱氨酸被另一種氨基酸取代的其它突變蛋白。因此，本發(fā)明含有天然序列的IL-2或其變體的制劑可用于診斷、預(yù)防和治療(局部或全身)細(xì)菌、病毒、寄生蟲、原生動物和真菌感染；增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；刺激淋巴因子激活的殺傷(LAK)細(xì)胞活性；介導(dǎo)淋巴細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)；增強(qiáng)同種抗原的應(yīng)答性；有利于在獲得性免疫缺陷狀態(tài)下的免疫功能恢復(fù)；在老齡人類和動物中重建正常的免疫功能；開發(fā)各種診斷試驗(yàn)，例如酶擴(kuò)增法、放射性標(biāo)記法、放射性顯影法和其它本領(lǐng)域已知的監(jiān)測疾病狀態(tài)下IL-2水平的方法；促進(jìn)在體外用于治療和診斷目的的T-細(xì)胞生長；封閉淋巴因子的受體位點(diǎn)；以及各種其它治療、診斷和研究用途。已調(diào)查研究了人IL-2或其變體，例如IL-2的突變蛋白的各種治療和診斷應(yīng)用，并在Rosenberg等(1987)N.Engl.J.Med.316889-897；Rosenberg等(1988)Ann.Surg.208121-135；Topalian等(1988)J.Clin.Oncol.6839-853；Rosenberg等(1988)N.Engl.J.Med.3191676-1680；Weber等(1992)J.Clin.Oncol.1033-40；Grimm等(1982)Cell Immunol.70(2)248-259；Mazumder(1997)Cancer J.Sci.Am.3(Suppl.1)S37-42；Mazumder和Rosenberg(1984)J.Exp.Med.159(2)495-507；和Mazumder等(1983)Cancer Immunol.Immunother15(1)1-10中報(bào)道。本發(fā)明含有IL-2或其變體的制劑可用作唯一的治療活性劑，或與其它免疫相關(guān)B或T細(xì)胞或其它治療劑聯(lián)用。相關(guān)細(xì)胞的例子是B或T細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、LAK細(xì)胞等，可用于聯(lián)合IL-2或其變體的示范性的治療劑是各種干擾素，尤其是γ干擾素、B-細(xì)胞生長因子、IL-1和抗體，例如抗-HER2或抗-CD20抗體。本發(fā)明含IL-2或其變體的制劑可由醫(yī)師認(rèn)可，通過口腔、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、或肺部等途徑施給人或動物。施用的IL-2(天然序列或其保持IL-2生物活性的變體，例如本文公開的突變蛋白)量范圍可以在約0.1-15mlU/m2之間。對于腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性黑素瘤這樣的適應(yīng)征，IL-2或其生物活性變體可以高劑量的靜脈內(nèi)濃縮藥用劑以300,000-800,000IU/kg/8小時施用。
本發(fā)明含有有效量的含有天然序列組織因子通道抑制蛋白(TFPI)或其變體的藥物組合物制劑可用于診斷、預(yù)防和治療(局部和全身)對該多肽起反應(yīng)的臨床適應(yīng)征。這些臨床適應(yīng)征包括例如與嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的合成增加和釋放有關(guān)的適應(yīng)征，例如炎癥，包括嚴(yán)重急性胰腺炎、肺氣腫、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多器官功能衰竭、囊性纖維變性、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)和膿毒癥；以及診斷和治療與IL-8的合成提高和釋放有關(guān)的疾病，例如炎癥疾病如ARDS、回灌注損傷(包括肺回灌性損傷)、膿毒癥和關(guān)節(jié)炎。見WO 96/40224，在此引入以供參考。對人或動物施用IFN-β或其突變蛋白可通過口腔、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)，或任何醫(yī)師認(rèn)為合適的肺部輸送。
本發(fā)明含有有效量的含有β-干擾素(IFN-β)或其變體，例如IFN-βser17的藥物組合物制劑用于診斷、預(yù)防和治療(局部和全身)對該多肽起反應(yīng)的臨床適應(yīng)征。這些臨床適應(yīng)征包括例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)、大腦和/或脊髓有關(guān)的異常和疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森癥、Lewy體癡呆、多發(fā)性硬化、癲癇、小腦性共濟(jì)失調(diào)、進(jìn)行性核上性麻痹、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化、情感性精神病，焦慮性精神障礙、強(qiáng)迫觀念行為障礙、人格障礙、注意力缺陷性障礙、注意力不缺陷性亢奮、圖雷特綜合征、泰-薩二氏病、尼曼-匹克病和精神分裂癥；腦血管疾病(如腦和脊髓中風(fēng))，總數(shù)神經(jīng)系統(tǒng)感染(包括腦膜炎和HIV)，腦和脊髓腫瘤或朊病毒疾病的神經(jīng)損傷；自身免疫疾病，包括獲得性免疫缺陷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、克羅恩氏病、斯耶格侖綜合征、肌萎縮性側(cè)索硬化、和狼瘡；和癌癥，包括乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌和結(jié)腸癌。對人或動物施用IFN-β或其突變蛋白可通過口腔、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、或任何醫(yī)師認(rèn)為合適的肺部傳遞。
本發(fā)明還提供了提高液體藥物組合物中多肽的穩(wěn)定性的方法，其中多肽作為治療活性成分，在液體制劑中儲藏過程中顯示聚集物形成。方法包括在液體藥物組合物中摻入其量足夠減少多肽在液體組合物儲藏過程中聚集物形成的氨基酸堿和基本不含其鹽形式的酸、鹽形式的酸或酸及其鹽形式的混合物，其中酸作為將液體組合物的pH維持在可接受的范圍內(nèi)的緩沖劑，如本文之前所述。
摻入一種氨基酸堿，或一種氨基酸堿加上一種或多種本文所述的其它穩(wěn)定劑，聯(lián)合本文公開的緩沖劑，即基本不含其鹽形式的酸、酸的鹽形式、或酸及其鹽形式的混合物，就可提高含多肽的液體藥物組合物在儲藏中的穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明還提供了一種當(dāng)組合物含有在液體制劑儲藏中形成聚集物的多肽時，提高液體藥物組合物儲藏穩(wěn)定性的方法。“提高儲藏穩(wěn)定性”指藥物組合物在儲藏過程中顯示將多肽或其變體更好的保持在準(zhǔn)確、非聚集的生物活性構(gòu)型，因此在沒有氨基酸堿或氨基酸堿加一種或多種其它本文所述的附加穩(wěn)定劑，聯(lián)合本文公開的穩(wěn)定劑存在下制備的液體藥物組合物相比，其療效很少下降。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的含多肽的藥物組合物的穩(wěn)定性，可以用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法評估。通常用穩(wěn)定性分布圖評估這些組合物的儲藏穩(wěn)定性。這類分布圖可通過監(jiān)測以非聚集的生物活性分子形式存在的多肽量的變化，及其隨時間對感興趣的變量，如pH濃度、穩(wěn)定劑、穩(wěn)定劑濃度等反應(yīng)的能力而獲得，如下文實(shí)施例中所述?？稍趲讉€代表可能儲藏條件的溫度，如冷凍溫度、冷藏溫度、室溫或升高溫度，例如40-50℃下產(chǎn)生這些穩(wěn)定性分布圖。然后通過測定例如感興趣的多肽的非聚集的生物學(xué)活性形式的半衰期比較其分布情況之間的儲藏穩(wěn)定性?！鞍胨テ凇敝父信d趣的多肽非聚集的生物活性分子形式減少50％所需的時間。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的含有精氨酸堿和基本不含其鹽形式的酸的組合物，與在無氨基酸堿，或氨基酸堿加上一種或多種本文所述的其它穩(wěn)定劑，聯(lián)合基本不含其鹽形式的酸，酸的鹽形式或酸及其鹽形式的混合物的情況下制備的液體組合物相比較，其半衰期高至少約2-10倍，優(yōu)選至少約3-10倍，更優(yōu)選至少4-10倍，最優(yōu)選至少約5-10倍。為了本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明制備得到的具有提高的儲藏穩(wěn)定性的藥物組合物被視為“穩(wěn)定化”的藥物組合物。這些穩(wěn)定化的組合物當(dāng)儲藏在2-8℃時，優(yōu)選具有至少約18個月，更優(yōu)選至少約20個月，更優(yōu)選至少約22個月，最優(yōu)選至少約24個月的儲藏壽命。
提供下列實(shí)施例是為了說明而不是為了限制。
實(shí)驗(yàn)
IL-2是一種刺激T細(xì)胞增殖的強(qiáng)有絲分裂原。它作為癌癥轉(zhuǎn)移的治療方法，作為癌癥治療的佐劑，作為感染性疾病的聯(lián)合藥物，有著廣泛的治療用途。
隨著使用IL-2治療的各種臨床試驗(yàn)的進(jìn)展，已認(rèn)識到該蛋白質(zhì)的穩(wěn)定液態(tài)制劑的開發(fā)是非常需要的。這種制劑比傳統(tǒng)的凍干制劑用途更多，因?yàn)樗梢愿鶕?jù)各種給藥方案提供不同強(qiáng)度的劑型。液體制劑對于給藥者更便利，因?yàn)椴恍枰亟āＨ绻軐?shí)現(xiàn)與抑菌劑相容，可以提供預(yù)填充的現(xiàn)成針筒，或作為多劑量制劑提供。
已報(bào)道IL-2在液體制劑中的儲藏過程中至少通過三種途徑降解聚集、甲硫氨酸氧化和脫氨基作用(Kunitani等(1986)J.Chromatography 359391-401；Kenney等(1986)Lymphokine Res.5523-527)。另外，IL-2容易受到冷凍和機(jī)械剪切力作用而急劇破壞。因此，IL-2制劑的開發(fā)需要同時克服急劇破壞和慢性降解。
因此，已開發(fā)了一種新的穩(wěn)定的單體rhIL-2制劑。在該制劑中，蛋白質(zhì)分子以其單體形式而不是聚集形式存在于溶液中。因此，不存在rhIL-2的共價或疏水的寡聚物或聚集物。該制劑含有幾種穩(wěn)定劑，最重要的是精氨酸和甲硫氨酸，來穩(wěn)定蛋白質(zhì)抵抗長期儲藏過程中的物理和化學(xué)性破壞作用，例如聚集、甲硫氨酸氧化和脫氨基。另外，在制劑中包含了一種非離子型表面活性劑聚山梨醇酯80，來防止蛋白質(zhì)受到凍融或機(jī)械剪切力導(dǎo)致的急劇破壞。如下面的各實(shí)施例所示，在rhIL-2制劑中加入本發(fā)明的穩(wěn)定劑可提高其儲藏穩(wěn)定性。
這些實(shí)施例中使用的IL-2分子是重組人IL-2突變蛋白aldesleukin，其半胱氨酸125被絲氨酸取代(去-丙氨?；?1，絲氨酸-125人白細(xì)胞介素-2)。如美國專利號4,931,543所述，它在大腸桿菌中表達(dá)，隨后通過滲濾和陽離子交換層析純化。用于開發(fā)使用的純化部分是約3毫克/毫升IL-2，以10mM pH6的檸檬酸鈉，200-250mM NaCl(CM組合緩沖液)或在含有10mM pH6的琥珀酸鈉和150mM L-精氨酸的緩沖液配制。
組織因子通道抑制蛋白(TFPI)是另一種顯示在液體藥物制劑的儲藏過程中通過聚集而降解的蛋白質(zhì)(Chen等(1999)J.Pharm.Sci.88881-888)。下文實(shí)施例8針對液體制劑，它顯示用游離堿形式的酸減少聚集物形成和用基本不含其鹽形式的酸提供的緩沖系統(tǒng)的效力。
用下列方法在實(shí)施例中證明具體的穩(wěn)定劑對IL-2或TFPI降解過程的作用，從而證明在液體制劑的儲藏過程中對該蛋白的穩(wěn)定性。
紫外吸光測定
用Hewlett Packard Diode Array分光光度計(jì)(8452型)測量了蛋白質(zhì)溶液的紫外吸光度。用合適的制劑緩沖液作為該儀器的空白對照。用1.0厘米光通路長度的石英比色杯記錄280納米處的吸光度。用0.70(毫克/毫升)-1cm-1消光系數(shù)將吸光度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成毫克/毫升的IL-2濃度。
RP-HPLC(反相高效液相層析)
在裝有717自動取樣機(jī)的Waters 626 LC系統(tǒng)(Water Corporation，Milford，Maine)上用Vydac 214BTP54C4柱和Vydac 214GCC54預(yù)柱(Seperation Group，Hesparia，California)進(jìn)行RP-HPLC操作。各層析柱先用流動相A(10％乙腈，0.1％TFA)預(yù)先平衡。然后加入20微克IL-2樣品，通過以1.0ml/min的流速在50分鐘內(nèi)加入0-100％的流動相B(100％乙腈，0.1％TFA)洗脫蛋白質(zhì)。在約32分鐘時洗脫出主要的可溶性IL-2組分，用Waters486檢測儀在UV214納米檢測。在Perkins-ElmerTurbochrom系統(tǒng)(PE Nelson，Cupertino，Califpornia)上進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和加工。
該RP-HPLC法檢測了作為峰B的主要單體IL-2，作為峰A的甲硫氨酸氧化物(大部分是氧化的Met104)，作為峰B’的脫酰胺組分(可能是Asn88)和其它在這些峰前后洗脫出的未知組分。
SEC-HPLC(尺寸排阻高效液相層析)
在TOSOHAAS G2000Wxl柱和TSK SWxl保護(hù)(guard)柱(TOSOHAAS，Montgomeryville，Pennsylvania)上進(jìn)行尺寸排阻HPLC。以1.0ml/min的流速提供了含有10mM pH7的磷酸鈉和200mM硫酸銨的單一流動相。在約14分鐘時洗脫出單體IL-2，用Waters 486檢測儀在214納米處檢測。在Perkin-Elmer Turbochrom系統(tǒng)上進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和加工。
用特別為監(jiān)測IL-2開發(fā)的天然SEC-HPLC方法，rhIL-2主要作為單一物質(zhì)(單體形式相似)洗脫出來，由于加入聚集物分離劑，如SDS、脲和DTT，不影響該組分的洗脫。
IEX-HPLC(離子交換高效液相層析)
在Pharmacia Mono-S HR 5/5玻璃柱上用Waters 626 LC系統(tǒng)和717加熱器/冷卻機(jī)自動采樣器進(jìn)行離子交換(IEX)-HPLC，如Chen等(1999)J.Pharm.Sci.88881-888所述。用80％流動相A(70∶30v/v，20mM pH5.4的乙酸鈉∶乙腈)和20％流動相B(70∶30v/v，20mM乙酸鈉和1M pH5.4氯化銨∶乙腈)平衡柱。注入后，在21分鐘內(nèi)以0.7ml/min的流速將流動相B提高到85％，洗脫重組人(rh)TFPI。在約16.5分鐘時作為單峰洗脫rhTFPI，并用Waters 486型吸光度檢測儀在280納米處通過紫外吸光度檢測。在Perkin-Elmer Turbochrom系統(tǒng)上進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和加工。通過整合峰面積并和已知濃度樣品產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，估計(jì)蛋白質(zhì)濃度。
SDS-PAGE
根據(jù)Laemmli方案進(jìn)行SDS-PAGE。將約5微克IL-2加到預(yù)制的18％NorvexTris-甘氨酸凝膠的各泳道中，在100伏特進(jìn)行電泳。用考馬斯藍(lán)染料對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行染色，通過裝有Imagequan T系統(tǒng)的Molecular Dynamics密度計(jì)(MolecularDynamics，Sunnyvale，California)分析。
IL-2生物活性的HT-2細(xì)胞增殖和MTT染色
通過使用HT-2細(xì)胞增殖和MTT染色(Gillis等(1978)J.Immunology1202027-2032；Watson(1979)J.Exp.Med.150(6)1510)的體外生物試驗(yàn)測定IL-2的效力。簡單說，將依賴IL-2生長的1×104小鼠HT-2細(xì)胞加到含有標(biāo)準(zhǔn)、對照或樣品的組織培養(yǎng)板的孔中。37℃培育22-26小時后，在孔中加入MTT染料，繼續(xù)37℃培養(yǎng)3-4小時。然后加入20％SDS脫色，在室溫下過夜。在570納米段讀取各孔的吸光度，并根據(jù)WHO的國際標(biāo)準(zhǔn)換算成IL-2的生物活性。
pH和克分子滲透壓濃度測量
用Orion的pH計(jì)(611型，Orion Research Incorporated Laboratory ProductsGroup，Boston，Massachusetts)測量各種制劑溶液的pH。用廠商建議的雙緩沖液標(biāo)定法，用pH4的標(biāo)準(zhǔn)(Fisher Scientific，目錄號SB101-500)和pH7的標(biāo)準(zhǔn)(Fisher Scientific，目錄號SB107-500)標(biāo)定pH計(jì)。
用Wescor的蒸汽壓滲透壓計(jì)(5500型，Wescor Inc.，Logan，Utah)測量這些制劑的溶液克分子滲透壓濃度。用廠商提供的兩種標(biāo)準(zhǔn)290mmol/kg的標(biāo)準(zhǔn)(Wescor，記錄器號OA-010)和1,000mmol/kg的標(biāo)準(zhǔn)(Wescor，記錄器號OA-029)標(biāo)定滲透壓計(jì)。
用這些方法定量各種穩(wěn)定劑對rhIL-2通過蛋白質(zhì)聚集、甲硫氨酸氧化和脫氨基的降解。
實(shí)施例1各種增溶劑對rhIL-2的蛋白質(zhì)聚集和儲藏穩(wěn)定性的影響
蛋白質(zhì)聚集是rhIL-2在弱酸性到堿性pH條件范圍內(nèi)的液體介質(zhì)中主要的降解途徑。當(dāng)在升溫條件下儲藏時，這些pH條件下配制的溶液中的rhIL-2迅速發(fā)生蛋白質(zhì)聚集，產(chǎn)生可見的沉淀。濾過0.2微米濾膜除去沉淀的蛋白質(zhì)。可用許多分析試驗(yàn)，如RP-HPLC、SEC-HPLC和紫外吸光度定量溶液中剩余的可溶性蛋白質(zhì)。聚集還導(dǎo)致生物活性下降，可通過本文所述的體外生物試驗(yàn)測定。
用本文所述的分析程序，通過監(jiān)測可溶性rhIL-2以在升溫條件下培養(yǎng)時間的函數(shù)發(fā)生的數(shù)量變化，跟蹤rhIL-2在幾種條件下的儲藏穩(wěn)定性。
1.A.糖和氨基酸的作用
檢測了山梨糖醇、蔗糖和甘露醇在含有0.2毫克/毫升rhIL-2、10mM pH6的琥珀酸鈉和270mM這些糖之一的制劑中，糖對rhIL-2儲藏穩(wěn)定性的作用。將穩(wěn)定性樣品中剩余的可溶性rhIL-2的量，如圖1所示對培養(yǎng)時間作圖。彼此疊加的蔗糖和甘露醇曲線表明，它們對IL-2儲藏穩(wěn)定性的作用是相似的。山梨糖醇曲線比其它兩種糖稍高，提示山梨糖醇比另兩種糖具有稍高的穩(wěn)定作用。
圖2顯示了氨基酸對儲藏穩(wěn)定性的作用。各制劑含有0.1毫克/毫升的IL-2，10mM pH6的琥珀酸鈉和150mM的9種所選的氨基酸之一。如圖2所示，穩(wěn)定性級別是Arg＞Asp＞Lys＞Met＞Asn＞Leu＝Ser＝Pro＝Gly。
在進(jìn)一步的研究中肯定了山梨糖醇和精氨酸的穩(wěn)定性作用，顯示rhIL-2的儲藏穩(wěn)定性以濃度依賴性方式而受到影響。rhIL-2儲藏穩(wěn)定性隨著山梨糖醇濃度從50mM增加到150mM，最終增加到270mM而逐步增強(qiáng)的(圖3)。類似的，rhIL-2儲藏穩(wěn)定性隨著制劑中的精氨酸濃度增加而提高(圖4)。
1.B.制劑pH的作用
檢測了在含有NaCl、山梨糖醇和精氨酸的制劑中rhIL-2的pH儲藏穩(wěn)定性情況。圖5顯示在50℃下剩余的可溶性IL-2的半衰期對pH的曲線圖。半衰期(t1/2)在本文中定義為在穩(wěn)定性樣品中的可溶性蛋白質(zhì)50％減少所需的時間。半衰期越長表明儲藏穩(wěn)定性越好。
如圖5所示，防治穩(wěn)定性rhIL-2發(fā)生蛋白質(zhì)聚集的最佳pH，由溶液中存在的穩(wěn)定劑決定。在pH4的條件下，rhIL-2在NaCl中可達(dá)到最大的儲藏穩(wěn)定性，其中rhIL-2在50℃具有約23天的半衰期。在山梨糖醇制劑中的rhIL-2顯示隨pH下降而穩(wěn)定性增加，最大穩(wěn)定性出現(xiàn)在pH5，50℃時的半衰期是約26天。用精氨酸作為穩(wěn)定劑時，在pH約6.0的制劑中可獲得最大穩(wěn)定性(即最長半衰期)，其中蛋白質(zhì)在50℃的半衰期是約32天。這些結(jié)果提示相對于山梨糖醇或NaCl精氨酸是一種優(yōu)選的穩(wěn)定劑，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定性的最佳pH在生理學(xué)上更可接受的pH水平。
1.C.緩沖系統(tǒng)的作用
在制劑中為提供準(zhǔn)確的pH并維持一定量的緩沖能力，使用10mM的緩沖系統(tǒng)是十分常用的。例如，用10mM琥珀酸及其鹽形式，例如琥珀酸鈉的混合物，可使制劑維持pH5.8。如果選擇了這樣的緩沖系統(tǒng)，可用150mM精氨酸HCl(但不用150mM精氨酸堿)作為制劑中的主要穩(wěn)定劑，因?yàn)?50mM精氨酸堿可抑制10mM緩沖液將pH調(diào)低到5.8。
然而精氨酸HCl可比精氨酸堿達(dá)到更高的克分子滲透壓濃度。因此，含有150mM精氨酸HCl和10mM琥珀酸和琥珀酸鈉緩沖液的調(diào)節(jié)到pH5.8的制劑已經(jīng)接近等滲，具有約253mmol/kg的克分子滲透壓濃度和50℃時約8天的半衰期(表1)。但是制劑中更高濃度的精氨酸也是理想的，因?yàn)閮Σ胤€(wěn)定性隨著該穩(wěn)定劑的增加而增加。當(dāng)精氨酸的濃度通過加入精氨酸HCl增加到230mM，用10mM琥珀酸和琥珀酸鈉緩沖液將pH調(diào)節(jié)到5.8時，50℃時的半衰期加倍(約17天)，但溶液是高滲的，具有約372mmol/kg的克分子滲透壓濃度。
當(dāng)用琥珀酸作為緩沖系統(tǒng)，將溶液pH調(diào)至5.8，而精氨酸作為精氨酸堿存在時，精氨酸堿濃度增加到230mM，同樣可使50℃的半衰期加倍，即增加到約16天。然而，該儲藏穩(wěn)定性的增加是要同時保持溶液接近等滲而實(shí)現(xiàn)的，制劑具有約271mmol/kg的克分子滲透壓濃度(見表1)。以這種方式，可在制劑中使用230mM精氨酸堿，增加rhIL-2的儲藏穩(wěn)定性，而不超過制劑的等滲點(diǎn)。
表1rhIL-2制劑的溶液克分子滲透壓濃度和儲藏穩(wěn)定性。儲藏穩(wěn)定性表示成50℃儲藏后用RP-HPLC測定的剩余可溶性rhIL-2的半衰期(t1/2)。精氨酸HCl制劑含有0.5毫克/毫升rhIL-2，1mM EDTA和150mM或230mM L-精氨酸HCl和10mM的琥珀酸和琥珀酸鈉調(diào)節(jié)到pH5.8。精氨酸堿制劑含有0.5毫克/毫升rhIL-2、1mMEDTA和150mM或230mM L-精氨酸堿和用81mM或128mM琥珀酸將pH調(diào)節(jié)到5.8。
用其它緩沖系統(tǒng)檢測了這兩種pH調(diào)節(jié)法(表2)。當(dāng)在制劑中使用150mM精氨酸HCl，并用10mM酸及其鈉鹽將pH調(diào)至5.8時，所有的制劑在等滲以下，約290mmol/kg。rhIL-2在這些制劑中50℃時的半衰期范圍是約15-20天。當(dāng)在制劑中使用230mM精氨酸堿，并用基本不含其鹽形式的酸作為緩沖系統(tǒng)將pH調(diào)至5.8時，用檸檬酸或琥珀酸調(diào)節(jié)pH的制劑仍顯示低滲，雖然其它制劑或稍高于等滲，例如用磷酸時；或高滲，例如用谷氨酸或乙酸時。然而，所有的制劑的在50℃時的半衰期延長到30天以上。因此，使用基本無鹽形式的檸檬酸或琥珀酸作為緩沖系統(tǒng)時，用精氨酸堿可將精氨酸濃度提高到230mM，導(dǎo)致rhIL-2的儲藏穩(wěn)定性增加。
表2rhIL-2制劑的溶液等滲性和儲藏穩(wěn)定性。儲藏穩(wěn)定性表示成50℃儲藏后用RP-HPLC測定的剩余可溶性rhIL-2的半衰期(t1/2)。所有制劑含有0.2毫克/毫升rhIL-2，5mM甲硫氨酸、1mMEDTA二鈉鹽、0.1％聚山梨醇酯80和150mM L-精氨酸HCl，用10mM酸及其鈉鹽調(diào)節(jié)pH至5.8；或230mM L-精氨酸堿并用基本不含其鹽形式的酸滴定調(diào)節(jié)到pH5.8。
1.D.蛋白質(zhì)濃度的影響
在含有10mM pH6的琥珀酸鈉和150mM精氨酸的制劑中檢測蛋白質(zhì)濃度對儲藏穩(wěn)定性的影響。如圖6所示，其中用可溶性rhIL-2在50℃的半衰期對初始的蛋白質(zhì)濃度作圖，rhIL-2儲藏穩(wěn)定性隨蛋白質(zhì)濃度下降而增加。該發(fā)現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果一致，即聚集是rhIL-2在液體制劑中的主要降解途徑。
1.E.非離子型表面活性劑聚山梨醇酯80的作用
在含有0.5毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸堿、128mM琥珀酸調(diào)節(jié)到pH5.8，1mM EDTA和0、0.02和0.1％聚山梨醇酯80的制劑中測試聚山梨醇酯80(Tween80或Tw80)對rhIL-2儲藏穩(wěn)定性的影響。如表3所示，兩種含有聚山梨醇酯80的制劑顯示50℃時可溶性IL-2半衰期的減少，如RP-HPLC測量的從16天減少到9天。因此，在制劑中包含聚山梨醇酯80，單看其對蛋白質(zhì)聚集的作用就可認(rèn)為并不合適。然而，該添加劑對于由凍融和機(jī)械剪切作用引起的急劇蛋白質(zhì)破壞具有穩(wěn)定作用，在含該蛋白的液體制劑加工過程中是有益的，如下文實(shí)施例所公開的。
還檢測了兩種基于山梨糖醇制劑的儲藏穩(wěn)定性。雖然RP-HPLC檢測其半衰期和生物活性與精氨酸制劑相當(dāng)，但是據(jù)SEC-HPLC估計(jì)的半衰期則小得多，提示在這些制劑中的rhIL-2蛋白可能有大部分以可溶性聚集物形式存在。
表3RP-HPLC、SEC-HPLC和體外生物試驗(yàn)對在50℃儲藏的rhIL-2中測量得到的半衰期(t1/2)或剩余的可溶性rhIL-2(峰B)
在表3中，用RP-HPLC測定的含精氨酸堿-琥珀酸rhIL-2制劑的半衰期，比用SEC-HPLC法測定的略小，比用體外生物測定法測定的更小得多。還評估了主要rhIL-2成分在SEC-HPLC中的洗脫量，來進(jìn)一步檢測這些差異。用或不用SDS、尿素和DTT處理的樣品，在主要成分的洗脫時間方面沒有變化，表明這些制劑中rhIL-2以單體組分存在。然而，SEC-HPLC方案可能無法判別其它單體成分，例如峰A甲硫氨酸氧化物與峰B的完整的主要單體成分的差別。因此，希望有辦法能確定半衰期的小差異。
用0.1％SDS在試驗(yàn)稀釋劑中進(jìn)行的體外試驗(yàn)確定了表3所示數(shù)據(jù)中的生物活性。因此，用含有0.1％SDS的試驗(yàn)稀釋劑稀釋樣品，然后將樣品加到組織培養(yǎng)板中與小鼠HT-2細(xì)胞接觸?？赡苡肧DS稀釋會使這些樣品中的一些rhIL-2聚集物分離還原成原來的單體形式，導(dǎo)致該制劑的生物活性估計(jì)過高。因此，用添加(+S)和不添加(-S)SDS的試驗(yàn)稀釋劑來評估穩(wěn)定性樣品。樣品還用(+F)或不用(-F)0.2微米過濾處理的方法進(jìn)行測定，因?yàn)檫^濾能除去可目測判斷的大團(tuán)蛋白質(zhì)聚集物。表4中顯示了經(jīng)過這些處理的樣品測量的生物活性值，與用RP-HPLC法獲得的儲藏穩(wěn)定性結(jié)果進(jìn)行了比較。以在-70℃儲藏的同類樣品所獲得的生物活性值的百分?jǐn)?shù)表示其數(shù)值。
總的說，在與HT-2細(xì)胞接觸前，用SDS稀釋，而未過濾的制劑，顯示比在試驗(yàn)稀釋劑中沒有SDS并在進(jìn)行測定前經(jīng)過過濾的制劑具有更高的生物活性值。在這些生物活性結(jié)果中，用過濾和不用SDS稀釋而獲得的生物活性數(shù)值與RP-HPLC的結(jié)果十分相近。因此，推薦該方法用于對單體rhIL-2進(jìn)行準(zhǔn)確的生物活性測定。
表4可溶性rhIL-2的RP-HPLC分析和在40℃或50℃儲藏2周的穩(wěn)定性樣品的體外生物活性分析結(jié)果之間的比較。全部結(jié)果表示成各自的-70℃樣品獲得的百分?jǐn)?shù)。制劑含0.5毫克/毫升rhIL-2、230mM L-精氨酸堿、128mM pH5.8的琥珀酸和1mM EDTA，含(#1)和不含(#2)0.1％的聚山梨醇酯80。在用含或不含0.1％SDS的稀釋劑稀釋之前用和不用0.22微米過濾處理生物測定的樣品。
a“-F”是未過濾的，“+F”是過濾的。“-S”是不用SDS稀釋的，“+S”是用SDS稀釋的。
b這是對單體IL-2的推薦方法。
1.F.防腐劑適用性
由于需要開發(fā)多劑量的制劑，調(diào)查了防腐劑適用性。在兩項(xiàng)速成研究中評估了各種防腐劑對IL-2穩(wěn)定性的影響。研究1在含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸鈉和160mM精氨酸的制劑中篩選了苯甲醇、m-甲苯酚和苯酚。研究2在含有0.2毫克/毫升IL-2、230mM L-精氨酸堿、128mM pH5.8的琥珀酸、1mM EDTA二鈉鹽的制劑中篩選芐索氯銨、苯扎氯銨、對羥苯甲酸甲酯/對羥苯甲酸丙酯和氯丁醇。表5中列出了儲藏在40℃的這些制劑用RP-HPLC測定的可溶性rhIL-2的半衰期。
所有測試的防腐劑在升溫條件下降低了rhIL-2的穩(wěn)定性。在研究1中，不含任何防腐劑的可溶性rhIL-2在40℃時的半衰期是約74天。加入苯甲醇或m-甲苯酚或苯酚將該半衰期顯著減少5-10倍。在研究2中，防腐劑的作用小得多。可溶性rhIL-2的半衰期由于芐索氯銨下降不到一半，而其它防腐劑下降了2倍以上?？偟恼f，芐索氯銨在測試的防腐劑中減少rhIL-2穩(wěn)定性最少。
表5對于含有防腐劑的制劑在40℃下可溶性rhIL-2的半衰期(t1/2)。研究1制劑含有0.2毫克/毫升rhIL-2、10mM pH6的琥珀酸鈉、150mM L-精氨酸和防腐劑。研究2制劑含有0.2毫克/毫升rhIL-2、230mM L-精氨酸堿、128mM pH5.8的琥珀酸堿、1mM EDTA二鈉、0.1％聚山梨醇酯80和防腐劑。
雖然防腐劑對rhIL-2在升溫條件下具有顯著的去穩(wěn)定作用，還檢測到它們對rhIL-2在4℃或25℃下的短期儲藏穩(wěn)定性的影響。進(jìn)行了新的研究，來檢測在含有0.2毫克/毫升rhIL-2、230mM L-精氨酸堿、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸和0.1％pH5.8的聚山梨醇酯80的制劑中的6種防腐劑的作用。表6報(bào)道了儲藏1年后保留的可溶性rhIL-2量的結(jié)果。當(dāng)與對照比較時，所有制劑用RP-HPLC和體外生物試驗(yàn)兩種方法測定都不顯示顯著的可溶性rhIL-2水平喪失，除了含有0.25％m-甲苯酚的制劑，它顯示可檢測的喪失。
表6.在4℃或25℃含防腐劑的制劑經(jīng)1年儲藏的穩(wěn)定性用RP-HPLC整合峰面積和體外生物活性測定的剩余總可溶性rhIL-2的百分?jǐn)?shù)表示。對照制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、230mM L-精氨酸堿、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸和0.1％pH5.8的聚山梨醇酯80。
實(shí)施例2各種因素對rhIL-2的甲硫氨酸氧化作用和儲藏穩(wěn)定性的影響
之前已確定了IL-2中甲硫氨酸氧化的特征(Kunitani等(1986)J.Chromatography 359391-402；Sasaoki等(1989)Chem.Pharm.Bull.37(8)2160-2164)。IL-2在多肽鏈上的殘基位置23、39、36和104處具有4個甲硫氨酸殘基。在這些中，Met104在蛋白質(zhì)表面，最容易氧化。該甲硫氨酸氧化物可作為比主要的IL-2成分(峰B)從RP-HPLC層析中更早洗脫的成分(峰A)而分離出來。Met23和Met29都較難以氧化，只有在極限氧化條件下發(fā)生，可能是由于其存在于蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部。這些MET殘基的氧化物在RP-HPLC上比Met104早洗脫。Met45深埋在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，不易于氧化，除非蛋白質(zhì)完全展開。
對IL-2中甲硫氨酸氧化的調(diào)查著重于Met104的氧化，而且它是最容易氧化的甲硫氨酸殘基，防止它氧化也抑制了其它甲硫氨酸殘基氧化。
2.A.pH的作用
在3-9的pH范圍內(nèi)，含有0.2毫克/毫升IL-2、150mM NaCl和10mM各種緩沖物質(zhì)的制劑中，研究了甲硫氨酸的氧化作用。通過在t＝0和t＝3個月時以百分率定量IL-2樣品中峰A成分(即Met104氧化的成分)，檢測這些制劑中的甲硫氨酸氧化作用。如表7所報(bào)道的，pH的影響，除了用檸檬酸鹽在pH6緩沖的樣品，在t＝0時并不明顯。與其它具有5％峰A成分的樣品比較，檸檬酸鹽樣品顯示峰A水平提高到6％。
在t＝3個月時，在更高的pH條件下峰A的水平提高，提示對于Met104的甲硫氨酸氧化作用具有堿催化機(jī)制。在pH6時，在使甲硫氨酸氧化最少化方面琥珀酸鹽是比檸檬酸鹽更好的緩沖液，因?yàn)樵阽晁嶂苿┲杏^察到更低的峰A值。
表7甲硫氨酸氧化作用的RP-HPLC法分析，以t＝0和3個月時pH3-9的制劑樣品中作為甲硫氨酸氧化的峰A成分存在的可溶性IL-2(峰A+峰B)總量的百分?jǐn)?shù)表達(dá)。制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、150mM NaCl和用各10mM緩沖成分調(diào)節(jié)的pH。
2.B.EDTA、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80和MgCl2的影響
表8報(bào)道了一種金屬螯合劑、兩種非離子型表面活性劑、和一種二價金屬離子對甲硫氨酸氧化的影響。制劑中聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80的存在在t＝0和t＝1個月時同時提高了甲硫氨酸氧化物的水平。相反，EDTA和MgCl2在40℃和50℃儲藏1個月后降低甲硫氨酸氧化物的水平。
表8在t＝0和t＝1個月時IL-2樣品中存在的甲硫氨酸氧化的峰A成分(％峰A)占可溶性IL-2(峰A+峰B)總量的百分?jǐn)?shù)。對照樣品含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸鈉和150mM的精氨酸。
2.C.甲硫氨酸的影響
調(diào)查了在制劑中加入甲硫氨酸防止IL-2的甲硫氨酸氧化作用。表9報(bào)道了含有不同量的甲硫氨酸的制劑在50℃儲藏2周后峰A和可溶性IL-2(峰A+峰B)總量的變化。制劑中甲硫氨酸濃度的提高可在t＝0和2周時顯著降低峰A的水平，但是在儲藏2周以后不影響保留的可溶性IL-2量。在5mM甲硫氨酸調(diào)節(jié)下，在t＝2周時峰A值可下降3倍。因此，加入甲硫氨酸導(dǎo)致蛋白質(zhì)的甲硫氨酸氧化顯著減少，對IL-2聚集幾乎沒有影響。
表950℃下t＝0和t＝2周的IL-2樣品中峰A和總可溶性蛋白的變化。制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸、128mM pH5.8的琥珀酸、1mM EDTA、0.1％聚山梨醇酯80和0-10mM的甲硫氨酸。
除了高溫結(jié)果，還記錄了含或不含5mM甲硫氨酸的制劑在4℃和25℃儲藏3個月后甲硫氨酸的氧化水平。如表10所示，制劑中5mM甲硫氨酸的存在導(dǎo)致4℃和25℃下峰A水平都下降3倍。因此，加入5mM甲硫氨酸可有效防止Met104氧化。
表10甲硫氨酸氧化水平，以甲硫氨酸氧化的峰A成分(總可溶性IL-2的％峰A)在可溶性IL-2(峰A+峰B)總量的百分?jǐn)?shù)表示和4℃或25℃儲藏3個月后樣品中剩余的可溶性IL-2的百分?jǐn)?shù)。制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸、128mM pH5.8的琥珀酸、1mM EDTA、0.1％聚山梨醇酯80和0或5mM甲硫氨酸。
2.D.氮?dú)馔夂兔摎獾娜パ踝饔?br> 測試了在IL-2樣品小管中進(jìn)行除氧試驗(yàn)，以最大限度減少甲硫氨酸氧化作用。氣對含有1毫升IL-2樣品的3-cc指管頂部空間充入氮?dú)怛?qū)除空氣。以真空脫氣除去溶解的分子氧。表11顯示了這些樣品在50℃儲藏1周后峰A和可溶性IL-2總量(峰A+峰B)的變化。單獨(dú)通入氮?dú)饪蓪⒓琢虬彼嵫趸锏陌俜謹(jǐn)?shù)稍微從6.7％減少到6.2％。溶液脫氣與氮?dú)忭敳客夥ㄏ嘟Y(jié)合可進(jìn)一步減少峰A的水平約1個百分點(diǎn)。另一方面，用氮?dú)馔饣蛎摎饪扇苄訧L-2總量百分?jǐn)?shù)都保持不變。
表11可溶性IL-2總量(峰A+峰B)百分?jǐn)?shù)的變化，以甲硫氨酸氧化的峰A成分(％峰A)的百分?jǐn)?shù)和50℃時t＝0和t＝1周樣品中剩余的可溶性IL-2的百分?jǐn)?shù)用氮?dú)馔饣蛎摎?。制劑含?.3毫克/毫升IL-2、230mM精氨酸、128mM琥珀酸、1mM EDTA和0.1％聚山梨醇酯80。
2.E.防腐劑的作用
檢測了防腐劑對甲硫氨酸氧化的作用。表12顯示4℃和25℃儲藏6和12個月后含或不含6種防腐劑之一的制劑樣品峰A的改變。所有含防腐劑的制劑顯示峰A水平與對照類似，表明防腐劑對甲硫氨酸氧化沒有可感知的作用，除了在含有0.25％的m-甲苯酚的制劑中，它顯示峰A水平顯著增加。
表12可溶性IL-2總量的百分?jǐn)?shù)(峰A+峰B)，以4℃和25℃儲藏6個月和12個月的含各種防腐劑的制劑中甲硫氨酸氧化的峰A成分(％峰A)表示。對照制劑含0.2毫克/毫升IL-2、230mM L-精氨酸堿、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸、0.1％聚山梨醇酯80，pH5.8。
實(shí)施例3各種因素對IL-2脫氨基的影響
之前已報(bào)道了IL-2脫氨基(Kunitani等(1986)J.Chromatography 359391-402)。已發(fā)現(xiàn)Asp88是IL-2中脫氨基的主要位點(diǎn)(Sasaoki等(1992)Chem.Pharm.Bull.40(4)976-980)?？捎肦P-HPLC檢測作為主要成分(峰B)的后側(cè)峰(峰B’)的脫氨基物。在含有精氨酸、NaCl和山梨糖醇的制劑中研究IL-2脫氨基。表13顯示在升溫條件下保溫2周后，脫氨基物僅可在含山梨糖醇和NaCl的制劑中檢測出來，而在含有精氨酸的制劑中未能檢測出來?？墒牵跃彼岱€(wěn)定化的IL-2不會通過脫氨基作用而降解。
表13在含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸鈉和150mM精氨酸、150mM NaCl或270mM山梨糖醇的制劑中峰B’用RP-HPLC檢測的脫氨基作用
實(shí)施例4凍融對IL-2穩(wěn)定性的影響
冷凍引起的蛋白質(zhì)破壞通常由于三種機(jī)制造成(1)蛋白質(zhì)在低溫構(gòu)型不穩(wěn)定(冷變性)；(2)蛋白質(zhì)在冰-水界面容易變性；(3)蛋白質(zhì)由于冷凍后鹽濃度的改變或pH改變而破壞。
對IL-2而言，在凍融過程中的蛋白質(zhì)損失，可能是由于冰水界面上的變性和聚集引起的，因?yàn)榉请x子型表面活性劑聚山梨醇酯80有效保護(hù)IL-2免受凍融作用的破壞。如圖7所示，在含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸鈉和150mM精氨酸的制劑中可溶性IL-2量在每一輪凍融后的減少情況。在制劑中加入聚山梨醇酯80可提高IL-2對多次凍融處理的穩(wěn)定性。當(dāng)聚山梨醇酯80的濃度達(dá)到0.05％或以上時，IL-2完全被保護(hù)不受凍融作用的破壞。
實(shí)施例5機(jī)械剪切力對IL-2穩(wěn)定性的影響
5.1.聚山梨醇酯80、EDTA、蛋白質(zhì)濃度和填充物體積的影響
進(jìn)行了研究來檢測剪切力引起的可溶性IL-2損失。評估了兩種剪切力在軌道式搖床(VWR Scientific，目錄號57018-754)振搖和在攪拌器(FisherScientific，Genie 2型，速度定為4)上攪拌。在3毫升指管中填充1毫升的各種IL-2制劑。這些制劑保存在冷藏室(對照樣品)，置于實(shí)驗(yàn)工作臺過夜(靜態(tài)樣品)、200RPM振搖過夜(振搖樣品)，或攪拌1分鐘(攪拌樣品)。表14顯示了這些樣品中可溶性IL-2量的改變結(jié)果。
與冷藏的對照樣品比較，靜態(tài)樣品和振搖樣品顯示IL-2不損失。因此，在環(huán)境溫度下IL-2是穩(wěn)定的，而且對于振搖處理是穩(wěn)定的。另一方面，當(dāng)這些制劑進(jìn)行1分鐘攪拌，檢測到不同量的損失。含有0.1-0.5毫克/毫升IL-2或1和5mM EDTA或低濃度的聚山梨醇酯80(0.005-0.05％)的制劑都顯示損失了25-50％的可溶性IL-2。因此，1分鐘攪拌比振搖過夜對于IL-2分子更有害。在制劑中將聚山梨醇酯80的濃度提高到等于或大于0.1％，就可防止IL-2損失。另外，在頂部沒有留下空氣的完全填充的指管經(jīng)1分鐘攪拌后也極少有可溶性IL-2損失，表明氣-液界面是導(dǎo)致破壞的主要因素。
表14在環(huán)境溫度下儲藏過夜(靜態(tài))、200RPM振搖過夜(振搖)和攪拌1分鐘(攪拌)的樣品可溶性IL-2量與儲藏在4℃的樣品相比的改變情況。對照制劑含有0.2毫克/毫升IL-2、10mM pH6的琥珀酸鈉和150mM精氨酸。制劑以1毫升裝入3毫升玻璃指管中，以完全填充到3毫升指管頂部不留空氣作為對照樣品。用RP-HPLC定量可溶性IL-2。
5.2.精氨酸的影響
表15報(bào)道了精氨酸在防止對IL-2的穩(wěn)定性攪拌破壞作用的影響。將精氨酸濃度從150mM提高到230mM可使可溶性IL-2的量在1分鐘攪拌后從65％到69％提高3％。因此，精氨酸對IL-2抵抗剪切力破壞有微小的影響，雖然之前顯示它對于IL-2抵抗由于聚集物形成的降解有很大的穩(wěn)定作用。
對聚山梨醇酯80在230mM精氨酸制劑中的作用進(jìn)行了試驗(yàn)。加入低濃度的聚山梨醇酯80(0.02％)可消除，而加入高濃度的聚山梨醇酯80(0.1％)則可提高IL-2對攪拌破壞作用的穩(wěn)定性。
表15RP-HPLC分析1分鐘攪拌后各種制劑中剩余的可溶性IL-2的百分?jǐn)?shù)
5.3.運(yùn)輸研究
在實(shí)際運(yùn)輸研究中調(diào)查了產(chǎn)品運(yùn)輸過程中對IL-2的剪切力破壞作用。制備了精氨酸制劑和NaCl制劑的IL-2，都具有不同量的聚山梨醇酯80。這些IL-2樣品在冰上從Emeryville，California空運(yùn)到St.Louis，Missouri，和從St.Louis運(yùn)回Emeryville。圖8顯示了這些樣品中可溶性IL-2量的RP-HPLC分析。在制劑中不存在聚山梨醇酯80的情況下，在精氨酸和NaCl配制的樣品中觀察到約10％的IL-2喪失。精氨酸制劑和NaCl制劑之間的穩(wěn)定性差異是可忽略的，約1％。在制劑中存在聚山梨醇酯80的情況下，IL-2損失減少。在0.1％聚山梨醇酯80時，觀察不到損失，表明IL-2在該表面活性劑濃度被完全保護(hù)。因此，0.1％聚山梨醇酯80在制劑中有效防止IL-2在運(yùn)輸過程中受到急劇剪切力的破壞。
總的說，精氨酸可在長期儲藏過程中作為液體IL-2藥物制劑的主要穩(wěn)定劑，來減少IL-2的聚集作用和脫氨基作用。為了進(jìn)一步提高制劑中的精氨酸濃度，從而實(shí)現(xiàn)更高的IL-2穩(wěn)定性而仍然保持溶液等滲性，優(yōu)選用琥珀酸將精氨酸堿滴定到pH5.8。另外，可在制劑中包含甲硫氨酸和EDTA來防止蛋白質(zhì)的甲硫氨酸氧化。最后，可在制劑中包含非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇酯80，來防止IL-2受到凍融和機(jī)械剪切力的破壞。
實(shí)施例6防腐劑效果試驗(yàn)
對幾種含有抗微生物防腐劑的制劑按美國藥典(USP)進(jìn)行了防腐劑效力測試。表6列出了結(jié)果。不含防腐劑的對照樣品未能通過測試，而所有含防腐劑的制劑都通過了測試。
表16rhIL-2各制劑的USP防腐劑效力試驗(yàn)。對照制劑含有0.1毫克/毫升rhIL-2、230mM L-精氨酸堿、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸、0.1％聚山梨醇酯80，pH5.8。
實(shí)施例7測試疼痛的性質(zhì)
用University of Florida，College of Dentistry，OMSDS神經(jīng)科學(xué)部的大鼠模型評估產(chǎn)生疼痛的性質(zhì)，更具體的是制劑產(chǎn)生的灼痛和刺痛。該模型是基于對攜帶疼痛信息的感覺細(xì)胞中引起電流的試驗(yàn)。為了進(jìn)行該試驗(yàn)，分離感覺細(xì)胞(脊根神經(jīng)節(jié))分別置于標(biāo)記的容器。從根據(jù)感受傷害(產(chǎn)生疼痛)的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)選的各細(xì)胞作出記錄。對于測試的制劑記錄計(jì)算灼痛、刺痛和標(biāo)準(zhǔn)化的疼痛評分。灼痛評分定義為對測試制劑相對于辣椒辣素(500nM)的的反應(yīng)。辣椒辣素廣為人知能在人體內(nèi)產(chǎn)生強(qiáng)烈灼痛(Cooper等(1986)Pain 2493-116)。刺痛評分是測試制劑產(chǎn)生的電流與緩沖到pH5.0的溶液產(chǎn)生的電流之比。標(biāo)準(zhǔn)化疼痛評分是評價制劑產(chǎn)生的電流相對于已知產(chǎn)生刺痛感的生理鹽水(0.9％NaCl，未緩沖處理)，這種醫(yī)院中常用的非經(jīng)胃腸用藥產(chǎn)生的電流之比。
一種液體L-精氨酸堿-琥珀酸制劑通過該模型進(jìn)行了疼痛分析。表17顯示了這兩種測試溶液的結(jié)果。基于灼痛、刺痛和標(biāo)準(zhǔn)化疼痛評分計(jì)算的分?jǐn)?shù)，L-精氨酸-琥珀酸制劑與生理鹽水比較，顯示卓越的性質(zhì)。還觀察到施用制劑過程中測試的電流減小(時間依賴性的下降)，而用生理鹽水則不消失。這證明如本試驗(yàn)評估的，該制劑比鹽水具有更好的耐受性。
表17液體制劑和0.9％NaCl的灼痛、刺痛和標(biāo)準(zhǔn)化疼痛評分。液體制劑含有230mM L-精氨酸堿、128mM琥珀酸、1mM EDTA、5mM甲硫氨酸、0.1％聚山梨醇酯80，pH5.8。
實(shí)施例8對TFPI的穩(wěn)定性研究
對各種制劑中的TFPI進(jìn)行的穩(wěn)定性和可溶性研究已證明，L-精氨酸堿是TFPI的穩(wěn)定劑(數(shù)據(jù)未顯示)，而帶電緩沖成分(例如檸檬酸鹽離子)具有更突出的增溶作用。在該研究中，檢測了各種制劑中L-精氨酸濃度和緩沖系統(tǒng)對TFPI穩(wěn)定性的影響。特別是如前所述對于IL-2制劑在前述實(shí)施例中測試的用基本不含其鹽形式的酸形式的緩沖系統(tǒng)與用酸及其鹽形式的混合物的緩沖系統(tǒng)相比較的影響。
材料和方法
用20mM檸檬酸鈉和300mM L-精氨酸(pH5.5)配制了0.6毫克/毫升的THPI溶液。用Spectral Por#7濾膜(MWCO 3，500，ID#132-110)在4℃進(jìn)行透析，將該溶劑緩沖交換到各種用檸檬酸或琥珀酸系統(tǒng)緩沖到pH6.5的L-精氨酸制劑中。在透析后，用UV/Vis分光光度計(jì)測量各溶液的TFPI濃度。然后用合適的緩沖液將各溶液稀釋到0.15毫克/毫升。然后將制備的溶液等分到(各1毫升)3-毫升指管中，穩(wěn)定儲藏。在該時間點(diǎn)(T＝0)放置足夠的指管。將剩余的指管置于50℃的溫箱內(nèi)，進(jìn)行促進(jìn)穩(wěn)定性研究。取時間點(diǎn)3、7、14和30天。為了各時間點(diǎn)的分析，將各指管的內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到1.7毫升微量離心管中，然后在10K rpm離心約2分鐘。從該試管中取出離心上清液，用從先前的研究已知是穩(wěn)定性指示試驗(yàn)的IEX-HPLC(所需描述)分析樣品離心后上清液。
結(jié)果和討論
將TFPI配制成0.15毫克/毫升最終濃度的含L-精氨酸堿或L-精氨酸HCl的制劑。用10mM檸檬酸或琥珀酸及與其各自的鈉鹽相結(jié)合，將L-精氨酸HCl制劑緩沖到pH5.5。用檸檬酸或琥珀酸將L-精氨酸堿制劑滴定到pH5.5。如下進(jìn)行了總共8次研究
1)20-150mM用10mM檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖到pH5.5的L-精氨酸HCl；
2)20-150mM用檸檬酸緩沖到pH5.5的L-精氨酸堿；
3)100-300mM用10mM檸檬酸和檸檬酸鈉緩沖到pH5.5的L-精氨酸HCl；
4)100-300mM用檸檬酸緩沖到pH5.5的L-精氨酸堿；
5)20-150mM用10mM琥珀酸和琥珀酸鈉緩沖到pH5.5的L-精氨酸HCl；
6)20-150mM用琥珀酸緩沖到pH5.5的L-精氨酸堿；
7)100-300mM用10mM琥珀酸和琥珀酸鈉緩沖到pH5.5的L-精氨酸HCl；和
8)100-300mM用琥珀酸緩沖到pH5.5的L-精氨酸堿；
先前確定TFPI的主要降解途徑是蛋白質(zhì)聚集/沉淀(Chen等(1999)J.Pharm.Sci.88881-888)?？杀O(jiān)測穩(wěn)定性樣品中的剩余可溶性蛋白質(zhì)跟蹤TFPI的降解過程。將配成不同L-精氨酸濃度的TFPI溶液儲藏在50℃，進(jìn)行加速穩(wěn)定性的研究。在預(yù)定的時間間隔取樣。從聚集/沉淀的蛋白質(zhì)中通過在微量離心管中離心分離樣品中的可溶性蛋白。用IEX-HPLC法確定可溶性蛋白質(zhì)量(Chen等(1999)J.Pharm.Sci 88881-888)。然后通過單指數(shù)動態(tài)等式(Y＝Y(jié)oEXP(-klt))將數(shù)據(jù)擬合成儲藏時間的函數(shù)，用KaleidaGraph圖形軟件(Synergy Software，Reading Pennsylvania)來計(jì)算剩余可溶性蛋白質(zhì)的半衰期。
加入檸檬酸或檸檬酸鈉緩沖的制劑的剩余可溶性TFPI的半衰期(t1/2)值如表18所示。表19顯示了用琥珀酸或琥珀酸鈉緩沖的制劑中的剩余可溶性TFPI的t1/2值。這些數(shù)據(jù)顯示半衰期隨著這些制劑中L-精氨酸的濃度增加而提高。這些數(shù)據(jù)也分別對于檸檬酸鹽和琥珀酸鹽緩沖系統(tǒng)繪出曲線圖，如圖9和圖10。半衰期值繪成拋物線，并按精氨酸濃度的函數(shù)而增加。這確定了L-精氨酸是對于TFPI的穩(wěn)定劑。
在兩種緩沖系統(tǒng)之間，TFPI穩(wěn)定性的差異可忽略不計(jì)。雖然檸檬酸緩沖系統(tǒng)看來更可行(圖9)，對于琥珀酸鹽緩沖系統(tǒng)的兩條半衰期對精氨酸濃度的曲線基本上是可疊加的(圖10)。TFPI在相似的L-精氨酸濃度達(dá)到相似的穩(wěn)定性，不論使用何種緩沖系統(tǒng)調(diào)節(jié)pH。圖11還比較了琥珀酸緩沖系統(tǒng)和檸檬酸緩沖系統(tǒng)之間的半衰期對精氨酸濃度的曲線。該圖顯示在TFPI穩(wěn)定性中沒有重大差異，只要精氨酸濃度在制劑中保持相同。這些數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性作用主要?dú)w功于精氨酸。
然而，用琥珀酸或檸檬酸滴定可在制劑中提高精氨酸濃度(因此提高了穩(wěn)定性)而同時維持等滲。因此例如，表18中的制劑3-3和4-3在制劑中都含有300mM L-精氨酸，它們的半衰期是相似的。然而，3-3制劑用10mM檸檬酸和檸檬酸鈉將300mML-精氨酸HCl緩沖到pH5.5，具有497mOsm/kg的溶液克分子滲透壓濃度。這是高滲制劑，不是可注射制劑優(yōu)選的。另一方面，4-3制劑使用121mM檸檬酸聯(lián)合300mML-精氨酸堿將pH調(diào)節(jié)到5.5，并具有295mOsm/kg的溶液克分子滲透壓濃度。該制劑非常接近等滲溶液(290mOsm/kg)，因此是更優(yōu)選的可注射制劑。如果使用常規(guī)的pH調(diào)節(jié)方法，例如用10mM檸檬酸和檸檬酸鈉，就只能在制劑中加入150mM多一點(diǎn)的L-精氨酸，不超過等滲。150mM L-精氨酸制劑(編號1-6)的半衰期是16天，而相對300mM L-精氨酸制劑(編號4-3)是23天。因此，用酸堿(即精氨酸-堿)作為穩(wěn)定劑和基本不含其鹽形式的酸(即琥珀酸)的緩沖劑配制TFPI，可提供更有效的條件以加入更多穩(wěn)定劑(即精氨酸)，來使對TFPI的作用達(dá)到最大限度。
結(jié)論
該實(shí)施例證明L-精氨酸通過延長其儲藏期穩(wěn)定TFPI。通過使用酸滴定，可在制劑中加入更多精氨酸以最大程度提高儲藏效果，而不超過等滲，這是可注射制劑優(yōu)選的。
表18TFPI精氨酸-檸檬酸pH5.5制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。
用單指數(shù)動力學(xué)方程擬合50℃時的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)獲得半衰期(t1/2)。
表19TFPI精氨酸-琥珀酸pH5.5制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。
用單指數(shù)動力學(xué)方程擬合50℃時的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)獲得半衰期(t1/2)。
本說明書中提到的所有出版物和專利申請指明了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域中技術(shù)人員的水平。所有出版物和專利申請?jiān)诖艘韵嗤某潭纫胍怨﹨⒖?，如同特別和唯一指定各出版物或?qū)＠暾埵窃诖艘胍怨﹨⒖肌?br> 雖然為了明白理解已通過說明和實(shí)施例詳細(xì)描述了本發(fā)明，明顯可在權(quán)利要求范圍內(nèi)進(jìn)行某些變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種穩(wěn)定化的液體藥物組合物，其特征在于，該組合物含有
作為治療活性組分的多肽或其變體，其中所述多肽或其變體在液體制劑中儲藏的過程中顯示聚集物形成；
一定量的氨基酸堿，所述氨基酸堿的量足以減少所述組合物儲藏過程中所述多肽或其變體的聚集物形成，其中所述氨基酸堿含有至少一種選自精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸；和
緩沖劑，其中所述緩沖劑選自基本不含其鹽形式的酸、鹽形式的酸和酸與其鹽形式的混合物。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述多肽選自白細(xì)胞介素-2、組織因子通道抑制蛋白和β-干擾素。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有每千克約240毫摩爾-每千克約360毫摩爾的克分子滲透壓濃度。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有約pH4.0-約pH9.0范圍內(nèi)的pH。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述酸選自乙酸、琥珀酸、檸檬酸、磷酸和谷氨酸。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述酸是琥珀酸。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述氨基酸堿是濃度約100mM-400mM的游離堿形式的精氨酸，其中所述琥珀酸在所述組合物中以約80mM-190mM的濃度范圍存在。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述多肽是白細(xì)胞介素-2或其變體，所述游離堿形式的精氨酸以約150-350mM的濃度存在。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其特征在于，所述游離堿形式的精氨酸以約230mM的濃度存在，所述琥珀酸以約128mM的濃度存在。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述白細(xì)胞介素-2是重組的人白細(xì)胞介素-2或其變體。
11.如權(quán)利要求9所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有約5.0-6.5的pH，和每千克約250-300毫摩爾的克分子滲透壓濃度。
12.如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述多肽是組織因子通道抑制蛋白或其變體，所述游離堿形式的精氨酸以約175-325mM的濃度存在。
13.如權(quán)利要求12所述的組合物，其特征在于，所述游離堿形式的精氨酸以約200-300mM的濃度存在，所述琥珀酸以約120-180mM的濃度存在。
14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組織因子通道抑制蛋白是重組人組織因子通道抑制蛋白或其變體。
15.如權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有約5.0-6.5的pH，和每千克約240-360毫摩爾的克分子滲透壓濃度。
16.如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述酸是檸檬酸。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其特征在于，所述氨基酸堿是濃度約175mM-400mM的游離堿形式的精氨酸，其中所述檸檬酸在所述組合物中以約40mM-200mM的濃度范圍存在。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述多肽是組織因子通道抑制蛋白或其變體。
19.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述組織因子通道抑制蛋白是重組人組織因子通道抑制蛋白。
20.如權(quán)利要求18所述的組合物，其特征在于，所述游離堿形式的精氨酸以約250-350mM的濃度存在，所述檸檬酸以約100mM-150mM的濃度存在。
21.如權(quán)利要求20所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有約5.0-6.5的pH，和每千克約240-360毫摩爾的克分子滲透壓濃度。
22.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述多肽或其變體含有在液體制劑中儲藏的過程中發(fā)生氧化的至少一個甲硫氨酸殘基。
23.如權(quán)利要求22所述的組合物，其特征在于，該制劑還含有足量的甲硫氨酸，來抑制所述多肽中的所述至少一個甲硫氨酸殘基在所述組合物儲藏過程中發(fā)生氧化。
24.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還含有足量的非離子型表面活性劑，來抑制所述多肽或其變體在所述組合物儲藏過程中對凍融或機(jī)械剪切力發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生聚集。
25.如權(quán)利要求24所述的組合物，其特征在于，所述非離子型表面活性劑是聚山梨醇酯80。
26.一種穩(wěn)定化的液體藥物組合物，其特征在于，該組合物含有白細(xì)胞介素-2或其變體、游離堿形式的精氨酸和基本不含其鹽形式的琥珀酸，其中所述游離堿形式的精氨酸在所述組合物中以約150-350mM的濃度存在，所述琥珀酸在所述組合物中以約80-190mM的濃度存在。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其特征在于，所述游離堿形式的精氨酸在所述組合物中以約230mM的濃度存在，所述琥珀酸以約128mM的濃度存在，其中所述組合物具有約5.0-6.5的pH和每千克約250-330毫摩爾的克分子滲透壓濃度。
28.一種穩(wěn)定化的液體藥物組合物，其特征在于，該組合物含有組織因子通道抑制蛋白或其變體、游離堿形式的精氨酸和基本不含鹽形式的琥珀酸，其中所述游離堿形式的精氨酸在所述組合物中以約175-325mM的濃度存在，所述琥珀酸在所述組合物中以約80-190mM的濃度存在。
29.如權(quán)利要求28所述的組合物，其特征在于，所述游離堿形式的精氨酸在所述組合物中以約200-300mM的濃度存在，所述琥珀酸以約120-180mM的濃度存在，其中所述組合物具有約5.0-6.5的pH和每千克約240-360毫摩爾的克分子滲透壓濃度。
30.一種穩(wěn)定化的液體藥物組合物，其特征在于，該組合物含有組織因子通道抑制蛋白或其變體、游離堿形式的精氨酸和基本不含鹽形式的檸檬酸，其中所述游離堿形式的精氨酸在所述組合物中以約175-400mM的濃度存在，所述檸檬酸在所述組合物中以約40-200mM的濃度存在。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，其特征在于，所述游離堿形式的精氨酸在所述組合物中以約250-350mM的濃度存在，所述琥珀酸以約100-150mM的濃度存在，其中所述組合物具有約5.0-6.5的pH和每千克約240-360毫摩爾的克分子滲透壓濃度。
32.一種提高多肽或其變體在液體藥物組合物中的穩(wěn)定性的方法，所述多肽或其變體在液體制劑的儲藏過程中顯示有聚集物形成，其特征在于，該方法包括在所述組合物中摻入足量的氨基酸堿，以減少所述多肽或其變體的聚集物形成，和摻入一種緩沖劑，其中所述緩沖劑選自基本不含其鹽形式的酸、鹽形式的酸和酸及其鹽形式的混合物，其中所述氨基酸堿含有至少一種選自精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述組合物具有約每千克240-360毫摩爾的克分子滲透壓濃度。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述組合物具有在約pH4.0-9.0范圍內(nèi)的pH。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述酸選自乙酸、琥珀酸、檸檬酸、磷酸和谷氨酸。
36.如權(quán)利要求35所述的組合物，其特征在于，所述酸是琥珀酸。
37.一種提高含有多肽或其變體的藥物組合物儲藏穩(wěn)定性的方法，其中所述多肽或其變體在液體制劑中儲藏的過程中顯示有聚集物形成，其特征在于，該方法包括在所述組合物中摻入足量的氨基酸堿，以減少所述多肽或其變體的所述聚集物形成，和摻入一種緩沖劑，其中所述緩沖劑選自基本不含其鹽形式的酸、鹽形式的酸和酸及其鹽形式的混合物，其中所述氨基酸堿含有至少一種選自精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的氨基酸。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述酸是琥珀酸。
39.一種權(quán)利要求1所述的組合物的干燥形式，其特征在于，所述干燥形式選自凍干形式或噴霧干燥形式。
40.一種用于診斷、預(yù)防或治療對于白細(xì)胞介素-2、組織因子通道抑制蛋白或β-干擾素治療發(fā)生反應(yīng)的疾病的制劑，其特征在于，所述制劑含有權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中多肽選自白細(xì)胞介素-2、組織因子通道抑制蛋白和β-干擾素。
全文摘要
提供了穩(wěn)定化的含多肽液體藥物組合物。組合物都含有氨基酸堿，作為多肽的主要穩(wěn)定劑，和為了多肽的穩(wěn)定性，一種酸和/或其鹽形式來將溶液緩沖于可接受的pH范圍內(nèi)。組合物接近等滲。還提供了提高液體藥物組合物中多肽的穩(wěn)定性，和提高這些藥物組合物儲藏穩(wěn)定性的方法。
文檔編號A61K47/18GK1402640SQ00816328
公開日2003年3月12日 申請日期2000年10月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月4日
發(fā)明者B-L·陳, M·霍拉 申請人:希龍公司