本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一組新型肽，特別涉及在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的具有鎮(zhèn)痛作用的肽或它們藥學(xué)上可以接受的鹽。此外，本發(fā)明還涉及該組肽用于制備藥物組合物。

背景技術(shù)：

2000年，美國(guó)約州立大學(xué)Frederick Sachs博士從一種智利狼蛛(Chilean tarantula)毒液中成功分離出多肽GsMTx-4(Sachs F,et a.,J Gen Physiol.115,Po583-598,2000)，有報(bào)道指出，這是一種對(duì)機(jī)械力敏感離子通道具有特異抑制作用的多肽。GsMTx-4被發(fā)現(xiàn)可以用于阻止由細(xì)胞腫脹產(chǎn)生的充血性心力衰竭，特別在肺、肝、腿等部位(Sachs F.et al.,JGP 2000)。也有報(bào)告指出GsMTx-4可以抑制兔子心房顫動(dòng)而不對(duì)心臟的其它功能產(chǎn)生影響,因此它可以用于治療心臟病(Sachs,F.et al.,Nature 409,pp 35～36,2001；Hamill,0.P.,Martinac,B.,Physiol.Rev.81,pp 685～740,2001.)。此外，GsMTx-4可能可以治療腦瘤(Sachs,F.et al.,J.Gen.Physiol.115,pp 583～598,2000)。

美國(guó)專(zhuān)利12153942(16.07.2009)，10550102(12.10.2006)，04723309(28.12.2005)，能抑制離子通道活性的低分子量多肽(Low-molecular weight peptides inhibiting ion channel activity)。歐洲專(zhuān)利EP 1 609 861 B1(Pub.No.：WO/2004/085647)抑制離子通道活性的低分子量多肽(英語(yǔ)：Low-molecular weight peptides inhibiting ion channel activity；日語(yǔ)：イオンチャネルの活性を阻害する低分子ペプチド)以上內(nèi)容在日本也申請(qǐng)了專(zhuān)利。均系同一組研究人員及日本公司聯(lián)手申請(qǐng)。該發(fā)明提供了一系列從全長(zhǎng)GsMTx-4中衍生出來(lái)的短鏈多肽，這些低分子量的短鏈多肽被發(fā)現(xiàn)可以特異性地抑制雞心臟中機(jī)械力敏感大電導(dǎo)鉀離子通道SAKca的活性。

上述提到的多肽GsMTx-4，含有34個(gè)氨基酸，其分子量為1,094Da，其中有6個(gè)半胱氨酸殘基，形成三對(duì)半胱氨酸結(jié)(ICK：Inhibitor cysteine Knot motif)結(jié)構(gòu)的特性(Robert.et al.,J.Biol.Chem.277(37)：34443-34450,2002)。這種結(jié)構(gòu)限制了它化學(xué)合成和生物合成時(shí)的產(chǎn)量，原因在于難以折疊成正確的構(gòu)象。雖然最近有專(zhuān)利用于指導(dǎo)在酵母中合成全長(zhǎng)GsMTx-4多肽，但成本和產(chǎn)量仍然是藥物開(kāi)發(fā)的瓶頸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述和/或現(xiàn)有生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域中對(duì)鎮(zhèn)痛作用藥物開(kāi)發(fā)存在的問(wèn)題，提出了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明其中一個(gè)目的是提供一組具有鎮(zhèn)痛作用的短肽。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一組肽，其具有如(1)～(8)所示的任一氨基酸序列：(1)如序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；(2)如序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；(3)如序列表SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；(4)如序列表SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；(5)如序列表SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；(6)如序列表SEQ ID No.6所示的氨基酸序列；(7)如序列表SEQ ID No.7所示的氨基酸序列；(8)如序列表SEQ ID No.8所示的氨基酸序列；或，它們藥學(xué)上可以接受的鹽。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：在首端和末端半胱氨酸存在的基礎(chǔ)上，權(quán)利要求1所述(1)～(8)任一肽中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸被刪除、置換、或添加后仍具有鎮(zhèn)痛作用的多肽或，它們藥學(xué)上可以接受的鹽。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：所述(1)～(8)所示的任一具有鎮(zhèn)痛作用的氨基酸序列或它們藥學(xué)上可以接受的鹽，其中，首端和末端的兩個(gè)半胱氨酸形成環(huán)。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：其通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)重組技術(shù)獲得。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：其與蛋白融合。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：其與聚合物偶聯(lián)。

作為本發(fā)明所述肽的一種優(yōu)選方案，其中：所述肽與載體連接。

本發(fā)明另外一個(gè)目的是提供一種具有鎮(zhèn)痛作用的藥物組合物。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種藥物組合物，其特征在于，包括，(1)有效量的作為活性成分的所述的肽；(2)選擇性的藥學(xué)上可接受的載體。

作為本發(fā)明所述藥物組合物的一種優(yōu)選方案，其中：所述藥學(xué)上可接受的載體選自：溶劑、稀釋劑、懸浮劑、乳化劑、抗氧化劑、藥學(xué)防腐劑、著色劑、香味劑、介質(zhì)、油性基底、賦形劑中的一種或幾種。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一組肽或它們藥學(xué)上可以接受的鹽或藥物組合物在鎮(zhèn)痛方面的應(yīng)用。

本發(fā)明通過(guò)比較GsMTx-4、GsMTX-2等多種含半胱氨酸結(jié)(ICK)的多肽序列,并通過(guò)對(duì)大鼠疼痛模型的行為學(xué)檢測(cè),確定了在GsMTx-4多肽中起鎮(zhèn)痛作用的藥效團(tuán)(結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)GsMTx-4的部分多肽片段有不遜于全長(zhǎng)的抑制疼痛的作用。其原理是多肽GsMTx-4和GsMTx-2氨基酸序列僅有11％相同(28％相似)，但同屬機(jī)械力敏感離子通道的特異抑制劑，其它幾種毒素氨基酸序列雖然與GsMTx-4同源性更高(比如：GsMTx-4與Hanatoxin的氨基酸序列有近28％相同，37％相似)，但卻是其它不同類(lèi)型離子通道的阻斷劑。這樣本發(fā)明人基于多肽GsMTx-4關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的序列，通過(guò)商業(yè)化的化學(xué)合成了一系列短鏈多肽。通過(guò)多肽對(duì)大鼠傷害性疼痛模型的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)明人證實(shí)得到了具有鎮(zhèn)痛作用的多肽短鏈系列，完成本發(fā)明。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中：

圖1是利用足底局部注射給藥方式，SEQ ID No.1、GsMTx-4和嗎啡對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏的鎮(zhèn)痛效應(yīng)示意圖。為使數(shù)據(jù)可信度高，我們用普通生理鹽水(Saline)作為負(fù)性對(duì)照、嗎啡(Morphine)作為陽(yáng)性對(duì)照。本發(fā)明涉及所有實(shí)驗(yàn)均并采取雙盲測(cè)試方法。

圖2是利用腹腔注射給藥方式，SEQ ID No.1、GsMTx-4和嗎啡對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏的鎮(zhèn)痛效應(yīng)示意圖。

圖3是短鏈多肽SEQ ID No.1與全長(zhǎng)GsMTx-4通過(guò)足底(A)、腹腔(B)注射方式鎮(zhèn)痛效應(yīng)對(duì)比，以及SEQ ID No.1和GsMTx-4鎮(zhèn)痛作用劑量依賴(lài)性示意圖(C)。

圖4是SEQ ID No.2分別通過(guò)足底(A，B)或腹腔(C,D)注射給藥方式時(shí)對(duì)大鼠鎮(zhèn)痛作用示意圖，以及分別與全長(zhǎng)多肽GsMTx-4鎮(zhèn)痛效果的對(duì)比示意圖(B,D)。

圖5是SEQ ID No.3分別通過(guò)足底(A,B)或腹腔(C,D)注射方式給藥時(shí)對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏的鎮(zhèn)痛效益的示意圖，以及分別與全長(zhǎng)多肽GsMTx-4鎮(zhèn)痛效果的對(duì)比示意圖(B,D)。

圖6是SEQ ID No.4分別通過(guò)足底(A,B)或腹腔(C,D)注射給藥時(shí)對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏的鎮(zhèn)痛效益示意圖，以及分別與全長(zhǎng)多肽GsMTx-4鎮(zhèn)痛效果的對(duì)比示意圖(B,D)。

圖7是SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8分別通過(guò)大鼠單側(cè)后肢足底局部注射方式給藥時(shí)的鎮(zhèn)痛作用示意圖。

圖8是SEQ ID No.6(A,B)和SEQ ID No.8(C,D)分別通過(guò)腹腔注射方式時(shí)對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏抑制作用示意圖。

圖9是SEQ ID No.1、SEQ ID No.3以及全長(zhǎng)多肽GsMTx-4對(duì)正常大鼠(沒(méi)有建立疼痛模型時(shí))疼痛閾值沒(méi)有影響的示意圖，嗎啡作為對(duì)正常大鼠疼痛閾值具有影響的陽(yáng)性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式做詳細(xì)的說(shuō)明。

在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用不同于在此描述的其它方式來(lái)實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類(lèi)似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開(kāi)的具體實(shí)施例的限制。

其次，此處所稱(chēng)的“一個(gè)實(shí)施例”或“實(shí)施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個(gè)實(shí)現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說(shuō)明書(shū)中不同地方出現(xiàn)的“在一個(gè)實(shí)施例中”并非均指同一個(gè)實(shí)施例，也不是單獨(dú)的或選擇性的與其他實(shí)施例互相排斥的實(shí)施例。

根據(jù)一般約定書(shū)寫(xiě)本文提及的所有的肽序列，其中N端氨基酸在左邊，而C端氨基酸在右邊。在兩個(gè)氨基酸殘基之間的短線指示肽鍵。

本發(fā)明的化合物可以以藥用鹽的形式提供。優(yōu)選的鹽的實(shí)例是與藥用有機(jī)酸以及聚合酸形成的那些和與無(wú)機(jī)酸形成的鹽，所述有機(jī)酸如乙酸、乳酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、水楊酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸或雙羥萘酸，所述聚合酸如鞣酸或羧甲基纖維素，所述無(wú)機(jī)酸如氫鹵酸(例如，鹽酸、硫酸或磷酸等)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的獲得藥用鹽的任何方法。

為了描述本發(fā)明的方便，使用各種氨基酸殘基的常規(guī)和非常規(guī)縮寫(xiě)。這些縮寫(xiě)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的，但是為了清楚在下面列出：

Asp＝D＝天冬氨酸；Ala＝A＝丙氨酸；Arg＝R＝精氨酸；

Asn＝N＝天冬酰胺；Gly＝G＝甘氨酸；Glu＝E＝谷氨酸；

Gln＝Q＝谷氨酰胺；His＝H＝組氨酸；Ile＝I＝異亮氨酸；

Leu＝L＝亮氨酸；Lys＝K＝賴(lài)氨酸；Met＝M＝甲硫氨酸；

Phe＝F＝苯丙氨酸；Pro＝P＝脯氨酸；Ser＝S＝絲氨酸；

Thr＝T＝蘇氨酸；Trp＝W＝色氨酸；Tyr＝Y(jié)＝酪氨酸；

Val＝V＝纈氨酸；Cys＝C＝半胱氨酸。

概況

本公開(kāi)內(nèi)容的特征是用于治療疼痛(例如急性疼痛、慢性疼痛、癌癥痛等所有疼痛類(lèi)型)的新型肽。肽可降低疼痛敏感性，因此具有鎮(zhèn)痛作用。該肽可產(chǎn)生長(zhǎng)效鎮(zhèn)痛和/或抗傷害感受作用。本文還描述了這類(lèi)肽的具體應(yīng)用方法(例如用于治療疼痛)及含有這類(lèi)肽的藥或組合物。

疼痛和傷害感受

國(guó)際疼痛研究學(xué)會(huì)(International Association for the Study of Pain，IASP)將疼痛定義為“一種不愉快的感覺(jué)性、情緒性感受，我們主要將其與組織損害聯(lián)系在一起，或者從組織損害方面進(jìn)行描述，或者既與組織損害相聯(lián)系又從損害方面進(jìn)行描述”。疼痛可以是潛在疾病或病癥的癥狀，或者疼痛本身即為一種疾病。疼痛一般可分成兩個(gè)類(lèi)型：急性和慢性。主要的區(qū)別是急性疼痛在損害之后起保護(hù)作用，而慢性疼痛不起此作用。急性疼痛是疼痛癥狀；而慢性疼痛是疼痛疾病。

大部分急性疼痛由疾病、炎癥或組織損傷造成。該疼痛類(lèi)型一般在例如創(chuàng)傷或外科手術(shù)之后突然發(fā)生，并可伴有焦慮或情緒低落。通?？梢栽\斷出急性疼痛的原因并對(duì)其進(jìn)行治療，且疼痛常常是自限性的，也就是說(shuō)，它限于特定時(shí)間段并且嚴(yán)重。在一些情況下，急性疼痛可轉(zhuǎn)變成慢性疼痛。

普遍認(rèn)為慢性疼痛本身就是疾病。環(huán)境和心理因素可使之惡化。慢性疼痛比急性疼痛持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，并可對(duì)許多藥物治療具有抗性。

根據(jù)臨床特征，可推斷持續(xù)疼痛機(jī)制的主要類(lèi)型。基于推測(cè)的病理生理的分類(lèi)，在廣義上將疼痛綜合征分成傷害感受性、神經(jīng)病性、精神性、混合型或特發(fā)型。

鎮(zhèn)痛肽

本公開(kāi)內(nèi)容提供具有鎮(zhèn)痛性質(zhì)并可用于治療疼痛(例如急性疼痛、慢性疼痛或癌痛等)的肽。該肽可具有抗傷害感受作用。

本發(fā)明的其中一個(gè)目的在于提供一組具有鎮(zhèn)痛作用的肽(如SEQ ID No.1～SEQ ID No.8)。而該組肽的制備方法是通過(guò)合成、純化、洗脫，使得最終合成肽的樣品純度>99％，并采用電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)測(cè)定其分子量。

當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠了解到，在首端和末端半胱氨酸存在的基礎(chǔ)上，SEQ ID No.1～SEQ ID No.8任一肽中，一個(gè)或多個(gè)氨基酸被刪除、置換、或添加后仍具有鎮(zhèn)痛作用的多肽或，它們藥學(xué)上可以接受的鹽，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的肽其通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)重組技術(shù)獲得，其不但可以與蛋白融合也可以與聚合物偶聯(lián)，還可以與載體連接。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該組肽具有特殊的結(jié)構(gòu)，SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所示的任一具有鎮(zhèn)痛作用的氨基酸序列或它們藥學(xué)上可以接受的鹽，其中，首端和末端的兩個(gè)半胱氨酸形成環(huán)。如下述結(jié)構(gòu)：

實(shí)施例

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器和試劑

成年Sprague-Dawley雄性大鼠(8周以上)，體重180g-220g，購(gòu)買(mǎi)于山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

角叉菜膠(Carrageenan,簡(jiǎn)寫(xiě)為Carr)為美國(guó)sigma公司產(chǎn)品，分別配制1％角叉菜膠(0.1g角叉菜膠溶于10ml 0.9％生理鹽水溶液中，分裝至10個(gè)EP管)和2％角叉菜膠(0.2g角叉菜膠溶于10ml 0.9％生理鹽水溶液中，分裝至10個(gè)EP管)，于-20℃保存，使用前半小時(shí)取出放置冰上。

GsMTx-4從美國(guó)alomone labs購(gòu)買(mǎi)，SEQ ID No.1～SEQ ID No.8所有多肽均用高溫滅菌后的去離子水(DD water)配制成5mM或10mM的母液，并分裝在EP管后于-80℃保存，使用時(shí)用生理鹽水稀釋至實(shí)驗(yàn)所需的濃度。

38500-PAM壓力應(yīng)用測(cè)量系統(tǒng)(Μgo Basile Biological Research Apparatμs,Comerio–Varese,Italy)由兩部分組成，一部分為手持單元，另一部分為綜合電子單元。手持單元為力傳感器，該力傳感器是根據(jù)Randall-Selitto測(cè)痛儀而設(shè)計(jì)，綜合電子單元可自動(dòng)記錄施加在大鼠左側(cè)后足足底最大的機(jī)械縮足反射閾值。

2.炎性痛模型的制備：我們采取兩種不同的炎性痛模型制備方法，分別用于足底和腹腔藥物注射的鎮(zhèn)痛效果進(jìn)行檢測(cè)：

2-1：6μl 1％角叉菜膠炎性痛模型：按照文獻(xiàn)(Alessandri-Haber N,et al.Neurosci.Vol 29(19),pp 6217-6288,2009)；介紹的方法制備角叉菜膠炎性痛模型。該法用于足底注射給藥方式藥物鎮(zhèn)痛效果的檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說(shuō)：從大鼠左后足2、3趾之間進(jìn)針，注射1％角叉菜膠，注射量為6μl，該注射濃度可誘導(dǎo)產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏，即：在注射后半小時(shí)內(nèi)大鼠足底即出現(xiàn)腫脹和痛覺(jué)閾值的降低。機(jī)械縮足反射閾值在50gf以下者作為角叉菜膠炎性痛造模成功大鼠。炎性閾值在50gf以上的炎性模型大鼠給予剔除。

2-2：50μl 2％角叉菜膠炎性痛模型：按照文獻(xiàn)(Seung Pyo Park,et al.2008.Pain.137:208-217)介紹的方法制備2％角叉菜膠炎性痛模型。該法用于腹腔注射給藥方式藥物鎮(zhèn)痛效果的檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說(shuō)：從大鼠左后足2、3趾之間進(jìn)針，注射2％角叉菜膠50μl，該注射濃度可誘導(dǎo)產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏，即：在注射后半小時(shí)內(nèi)大鼠足底即出現(xiàn)較嚴(yán)重的腫脹和痛覺(jué)閾值的降低。機(jī)械縮足反射閾值降低在50gf以下的作為角叉菜膠炎性痛造模合格大鼠。炎性閾值在50gf以上的炎性模型大鼠給予剔除。

3.實(shí)驗(yàn)分組和動(dòng)物處理

所有實(shí)驗(yàn)大鼠從山東濟(jì)南朋悅動(dòng)物有限公司購(gòu)入的6周齡SD大鼠。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2～4周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～26℃，濕度30％～50％，適應(yīng)性飼養(yǎng)后每次選擇體重180～220g的大鼠10～12只，測(cè)量大鼠左側(cè)后足機(jī)械縮足閾值，取每只大鼠測(cè)量5次的均值作為該大鼠炎性造模前基礎(chǔ)值(Baseline,縮寫(xiě)為BL)，剔除基礎(chǔ)值差異大或?qū)C(jī)械刺激無(wú)反應(yīng)的大鼠；然后按照文獻(xiàn)介紹的方法于大鼠左側(cè)后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(用于足底注射加藥方式)或50μl 2％角叉菜膠(用于腹腔注射加藥方式)，1小時(shí)后檢測(cè)大鼠左側(cè)后足機(jī)械性縮足閾值，剔除造模失敗(炎性閾值在50gf以上)的大鼠，將造模成功的大鼠平均分為藥物組和生理鹽水組兩組。以上操作中凡是有出現(xiàn)造模不成功、大鼠被剔除的情況，再加做實(shí)驗(yàn)以確保每組用于統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的大鼠至少為5～8只。

4.GsMTx-4及其短肽在炎性誘發(fā)痛覺(jué)過(guò)敏中的作用——機(jī)械縮足反射閾值的測(cè)定

4.1足底注射嗎啡、GsMTx-4及短肽抑制炎性痛覺(jué)過(guò)敏的測(cè)定

用38500-PAM壓力應(yīng)用測(cè)量系統(tǒng)測(cè)定大鼠的左后足機(jī)械性縮足閾值來(lái)評(píng)價(jià)GsMTx-4及其短肽在大鼠機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏中的作用。所有大鼠行為學(xué)測(cè)試之前需對(duì)大鼠進(jìn)行縮足訓(xùn)練，直到每只大鼠都會(huì)縮足后開(kāi)始記錄大鼠基礎(chǔ)縮足閾值。將當(dāng)天需測(cè)的10～12只大鼠放入同一鼠籠中，在各只大鼠的尾巴上從1～10(或12)進(jìn)行編號(hào)，而后讓大鼠在測(cè)量房間適應(yīng)30min，待大鼠安靜后開(kāi)始測(cè)試。根據(jù)Randall-Selitto測(cè)痛儀設(shè)計(jì)的力傳感器安裝在38500-PAM壓力應(yīng)用測(cè)量系統(tǒng)的一個(gè)手持裝置單元中。測(cè)量系統(tǒng)設(shè)置最小的力值為0.45gf，最大的力值為450gf。操作人員運(yùn)用38500-PAM壓力應(yīng)用測(cè)量系統(tǒng)依次按編號(hào)數(shù)字大小依次測(cè)量每只大鼠左側(cè)后足機(jī)械縮足閾值。具體方法為先將手持單元中的錐形尖端放在大鼠左側(cè)后足足底中間部位，接著以恒定力率(30gf/s)給大鼠左側(cè)后足施加一個(gè)力，所施加力的最大時(shí)間為15s，15s時(shí)間內(nèi)當(dāng)受試大鼠后足回縮時(shí)，操作員停止施力，此時(shí)電子單元將自動(dòng)記錄施加在大鼠左側(cè)后足足底最大的機(jī)械性縮足閾值，若受試大鼠15s后左側(cè)后足仍未出現(xiàn)縮足反射，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)報(bào)警，操作者即停止測(cè)量，10min后重復(fù)測(cè)量。若某只大鼠多次15s后左側(cè)后足未出現(xiàn)縮足反射，剔除此大鼠。依次按照大鼠尾巴編號(hào)數(shù)字大小依次測(cè)量，重復(fù)測(cè)量5次(每次刺激間隔時(shí)間為10min)，取5次實(shí)驗(yàn)的平均值，。測(cè)量完畢后足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠，建立大鼠炎性疼痛模型。注射角叉菜膠1小時(shí)后檢測(cè)大鼠左側(cè)后足機(jī)械性縮足閾值，剔除閾值大小異常的大鼠(造模失敗)。將炎性閾值較高與閾值較低的大鼠混合平均分為2組：藥物組和生理鹽水組，每組5～6只，使得兩組大鼠炎性閾值分布相似。藥物組在大鼠左側(cè)后足足底皮內(nèi)注射1.2μg/5μl GsMTx-4(用前稀釋到合適濃度)或其中一種短肽，或5mg/kg嗎啡，或大鼠左側(cè)后足足底皮下相同位置注射5μl等體積的生理鹽水，注藥后分別于1h、3h、5h、7h及24h檢測(cè)各組大鼠左側(cè)后足機(jī)械縮足反射閾值，每只大鼠均重復(fù)測(cè)試5次(每次測(cè)試間隔時(shí)間為10min)，取5次縮足反射閾值的平均值為該大鼠實(shí)際縮足反射閾值(單位為：g)。

注：以上操作中凡是出現(xiàn)造模不成功、大鼠被剔除的情況，再加做實(shí)驗(yàn)以確保每組用于實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的大鼠至少為5～8只。

4.2腹腔注射GsMTx-4及其短肽抑制炎性痛覺(jué)過(guò)敏的測(cè)定

腹腔注射GsMTx-4及其短肽抑制炎性痛覺(jué)過(guò)敏的方法步驟與足底注射相似，但有幾點(diǎn)不同：

(1)該測(cè)量系統(tǒng)設(shè)置最小的力值為0.75gf，最大的力值為750gf

(2)考慮到腹腔注射嗎啡可能導(dǎo)致機(jī)械性縮足閾值大幅度上升，將所施加力的最大時(shí)間調(diào)為25s

(3)藥物組腹腔注射270μg/kg GsMTx-4或其中一種短肽或10mg/kg嗎啡，生理鹽水組的腹腔注射量為等質(zhì)量的無(wú)菌生理鹽水。

基于上述實(shí)驗(yàn)，圖1為GsMTx-4、嗎啡和SEQ ID No.1通過(guò)足底皮下注射給藥方式(注射體積均為6μl)對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏抑制效果的示意圖。其中，A圖所示為事先在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(Carr)誘導(dǎo)大鼠炎性模型后，在大鼠足底腫脹部位注射5μl的生理鹽水1h，3h，5h后，大鼠機(jī)械縮足閾值與炎性閾值無(wú)明顯差異；而與造模前機(jī)械縮足反射閾值相比，等體積量(5μl)的嗎啡(B)、GsMTx-4(C)或SEQ ID No.1(D)都明顯降低了大鼠機(jī)械縮足反射閾值。比如大鼠足底腫脹部位皮下注射等體積的GsMTx-4或短肽SEQ ID No.1(注射量為1.2μg/5μl)1h，3h，5h后，大鼠機(jī)械縮足閾值均有增高，且在注藥后3h達(dá)到最高。注意嗎啡在給藥1h后藥效達(dá)最大值，但大鼠機(jī)械縮足閾值的增高大大超過(guò)了大鼠基線(Base Line,簡(jiǎn)寫(xiě)為BL)時(shí)的機(jī)械縮足閾值。我們認(rèn)為超過(guò)基線部分可能與嗎啡的成癮性、賴(lài)受性和其毒性相關(guān)。E圖是以在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(Carr)誘導(dǎo)大鼠炎性模型后比較GsMTx-4、短肽SEQ ID No.1和生理鹽水以及嗎啡對(duì)大鼠機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏中的抑制作用。

圖2是GsMTx-4、嗎啡和SEQ ID No.1通過(guò)腹腔注射給藥方式(注射體積為50μl)對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏抑制作用的對(duì)比示意圖。我們得到了和前面圖1(足底注射)相似的對(duì)痛覺(jué)過(guò)敏抑制作用，但GsMTx-4和SEQ ID No.1具有比從足底皮內(nèi)注射給藥的方式時(shí)更強(qiáng)的抑制作用：它們?cè)?h后達(dá)到最大抑制效果，并且都可以完全翻轉(zhuǎn)由角叉菜膠(Carr：注射量為50μl 2％)誘導(dǎo)的炎性疼痛閾值(B,C)，而生理鹽水沒(méi)有作用(A)。此外，嗎啡(注射量為10mg/Kg)在注射1h后對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏抑制作用達(dá)到最高，雖然比GsMTx-4(注射量為270μg/Kg，50μl)和SEQ ID No.1(注射量為270μg/Kg)的鎮(zhèn)痛作用高出一倍(見(jiàn)E)，但是同足底注射給藥方式結(jié)果類(lèi)似：?jiǎn)岱入m然鎮(zhèn)痛作用更強(qiáng)，但卻對(duì)大鼠機(jī)械縮足閾值的提高已經(jīng)大大超過(guò)了大鼠基線閾值(Base Line,簡(jiǎn)寫(xiě)為BL)，我們認(rèn)為這部分與嗎啡的毒性相關(guān)。此外，3h后嗎啡的鎮(zhèn)痛作用迅速下降，達(dá)到與GsMTx-4和SEQ ID No.1具有相似鎮(zhèn)痛作用的效果(E)。由于本發(fā)明提出的即使具有最強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用的短鏈多肽對(duì)正常大鼠痛覺(jué)均沒(méi)有影響(見(jiàn)圖9)，因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的多肽有可能發(fā)展成為治療痛覺(jué)過(guò)敏的最好鎮(zhèn)痛藥物或混合劑。

圖3是SEQ ID No.1與全長(zhǎng)GsMTx-4鎮(zhèn)痛作用的對(duì)比示意圖。SEQ ID No.1和GsMTx-4通過(guò)足底注射方式給藥時(shí)，鎮(zhèn)痛作用沒(méi)有明顯差異(圖中A、C)，其中C是SEQ ID No.1(右)和全長(zhǎng)GsMTx-4(左)通過(guò)足底注射方式時(shí)鎮(zhèn)痛作用的劑量依賴(lài)圖。但當(dāng)兩者分別通過(guò)腹腔注射方式給藥時(shí)，SEQ ID No.1可能具有更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果(圖中B)。

圖4是SEQ ID No.2分別通過(guò)足底(A)、腹腔(C)給藥方式的鎮(zhèn)痛作用示意圖。為了更好比較短鏈多肽的鎮(zhèn)痛效果，等量全長(zhǎng)GsMTx-4的鎮(zhèn)痛效果由淺灰色表示作對(duì)比(B,D)。其中A圖示出在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(Carr)后，與造模前機(jī)械縮足反射閾值相比，明顯降低大鼠機(jī)械縮足反射閾值，足底皮下注射SEQ ID No.2(注射量為1.2μg/5μl)1h，3h，5h，7h后，大鼠機(jī)械縮足閾值增高，且在注藥后1-3h達(dá)到最高。C圖示意在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射50μl 2％角叉菜膠(Carr)后1h,腹腔注射SEQ ID No.2(注射量為270μg/Kg)1h，3h，5h，7h后大鼠機(jī)械縮足閾值均有增高，注藥3h時(shí)抑制作用最強(qiáng)，很明顯腹腔注射給藥的鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)于足底局部給藥方式。此外腹腔注射SEQ ID No.2具有與全長(zhǎng)GsMTx-4相似的鎮(zhèn)痛作用(D)。

圖5是SEQ ID No.3分別通過(guò)足底(A)、腹腔(C)給藥方式對(duì)痛覺(jué)過(guò)敏的抑制作用示意圖。其中，A圖所示在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(Carr)后，與造模前機(jī)械縮足反射閾值相比，足底皮下注射SEQ ID No.3(注射量為1.2μg/5μl)1h，3h，5h，7h后明顯降低大鼠機(jī)械縮足反射閾值，且在注藥后3h達(dá)到最高。B圖所示SEQ ID No.3與在足底皮下注射等質(zhì)量、等體積GsMTx-4(1.2μg/5μl)或生理鹽水1h，3h，5h，7h后大鼠機(jī)械縮足反射閾值的比較，SEQ ID No.3對(duì)痛覺(jué)過(guò)敏的抑制作用與全長(zhǎng)多肽GsMTx-4短肽沒(méi)有明顯差異(B)，生理鹽水組大鼠機(jī)械縮足閾值并未改變。C圖圖示在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射50μl 2％角叉菜膠(Carr)后，通過(guò)腹腔注射SEQ ID No.2(注射量為270μg/Kg)1h，3h，5h，7h后與造模前機(jī)械縮足反射閾值相比，大鼠機(jī)械縮足閾值均明顯增高，且在注藥后3h完全翻轉(zhuǎn)大鼠的機(jī)械縮足閾值，與大鼠基線(造模前的baseline:BL)沒(méi)有明顯差異。因此通過(guò)腹腔注射方式給藥時(shí)SEQ ID No.3可能具有比等質(zhì)量全長(zhǎng)多肽GsMTx-4更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛效果(D)。

圖6是SEQ ID No.4分別通過(guò)足底(A)、腹腔(C)給藥方式對(duì)痛覺(jué)過(guò)敏的抑制作用示意圖。其中，A圖所示在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射6μl 1％角叉菜膠(Carr)后，與造模前機(jī)械縮足反射閾值相比，足底皮下注射SEQ ID No.4(注射量為1.2μg/5μl)1h，3h，5h，7h后明顯降低大鼠機(jī)械縮足反射閾值，且在注藥后3h達(dá)到最高。B圖所示為SEQ ID No.4與在足底皮下注射等質(zhì)量/等體積GsMTx-4(1.2μg/5μl)或等體積(5μl)的生理鹽水1h，3h，5h，7h后大鼠機(jī)械縮足反射閾值的比較，SEQ ID No.4對(duì)痛覺(jué)過(guò)敏的抑制作用比全長(zhǎng)多肽GsMTx-4短肽稍弱。C圖示在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射50μl 2％角叉菜膠(Carr)誘導(dǎo)炎性腫脹后，通過(guò)腹腔注射SEQ ID No.4(注射量為270μg/Kg)與造模前機(jī)械縮足反射閾值相比，1h，3h，5h，7h后大鼠機(jī)械縮足閾值均明顯增高，且在注藥后3h后大鼠機(jī)械縮足閾值與大鼠基線(BL)沒(méi)有明顯差異。因此通過(guò)腹腔注射方式給藥時(shí)，SEQ ID No.4的鎮(zhèn)痛作用與等質(zhì)量全長(zhǎng)多肽GsMTx-4的鎮(zhèn)痛作用沒(méi)有明顯差異(D)。

圖7示出了SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7三種短肽通過(guò)腹腔注射方式給藥時(shí)對(duì)大鼠痛覺(jué)過(guò)敏的抑制作用。其中，A圖示出足底皮下注射SEQ ID No.5(1.2μg/5μl)1h，3h，5h，7h后，與Carr炎性模型大鼠機(jī)械縮足閾值相比，機(jī)械縮足閾值都有明顯的提高，且在3h達(dá)到最高。B圖示出了足底皮下注射SEQ ID No.6(1.2μg/5μl)1h，3h后，與Carr炎性閾值相比，機(jī)械縮足閾值都有明顯提高，且在3h達(dá)到最高。而C圖示出足底皮下注射SEQ ID No.7(1.2μg/5μl)1h，3h，5h，7h后，與Carr炎性閾值相比，機(jī)械縮足閾值都有明顯的提高，且在3h達(dá)到最高。D圖示出足底皮下注射SEQ ID No.8(1.2μg/5μl)1h，3h，5h，7h后，與Carr炎性閾值相比，機(jī)械縮足閾值都有明顯的提高，且在3h達(dá)到最高。

圖8示出了SEQ ID No.5和SEQ ID No.8通過(guò)腹腔注射方式給藥時(shí)對(duì)大鼠炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用。其中A和C圖分別表示在大鼠左后足足底皮內(nèi)注射50μl 2％角叉菜膠(Carr)誘導(dǎo)炎性疼痛后，再分別通過(guò)腹腔注射SEQ ID No.5(A圖)或SEQ ID No.8(C圖)(注射量均為270μg/Kg)。與大鼠炎性模型機(jī)械縮足反射閾值(Carr)相比，1h，3h，5h，7h后大鼠機(jī)械縮足閾值均明顯增高，且均在注藥后3h達(dá)最大值。因此，腹腔注射SEQ ID No.5(B圖)和SEQ ID No.8(D圖)與全長(zhǎng)GsMTx-4具有相似鎮(zhèn)痛作用，其中SEQ ID No.8作用略為更強(qiáng)，維持時(shí)間更長(zhǎng)。5h后與全長(zhǎng)多肽的鎮(zhèn)痛作用沒(méi)有明顯差異(D圖)。

圖9圖示GsMTx-4、SEQ ID No.1和SEQ ID No.3對(duì)正常大鼠的機(jī)械縮足閾值沒(méi)有影響。A圖示在正常大鼠左后足足底皮下直接注射嗎啡(注射量為5mg/kg,該劑量通常為嗎啡用藥量的最小劑量)1h后，嗎啡進(jìn)一步強(qiáng)烈抑制正常大鼠的機(jī)械縮足反射閾值一倍以上(閾值從正常大鼠的平均～250g增長(zhǎng)到550g)，我們認(rèn)為這與嗎啡發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，具有的成癮性和毒性相關(guān)。B,C,D圖分別圖示在正常大鼠左后足足底皮下直接注射GsMTx-4(A圖)、SEQ ID No.1(B圖)或SEQ ID No.3(C圖)(注射量均為1.2μg/5μl，該劑量為GsMTx-4和SEQ ID No.1通過(guò)足底注射方式給藥時(shí)抑制大鼠痛覺(jué)過(guò)敏的最大劑量)1h，3h，5h，7h后，均不影響正常大鼠的機(jī)械縮足反射閾值。由于GsMTx-4、SEQ ID No.1和SEQ ID No.3是本發(fā)明所涉及肽中具有最強(qiáng)鎮(zhèn)痛作用的多肽短鏈，因此該組實(shí)驗(yàn)從反面再次證明本發(fā)明涉及的多肽對(duì)正常大鼠沒(méi)有副(毒性)作用。

藥物組合物

本公開(kāi)內(nèi)容的肽可以配制成例如給予受治療者以治療疼痛的藥物組合物。肽可以單獨(dú)給予，或者可在同一組合物中或作為單獨(dú)的組合物，與其它疼痛療法聯(lián)合給予。

藥物組合物通常包括藥學(xué)上可接受的載體。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何及所有生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。組合物可包括藥學(xué)上可接受的鹽，例如酸加成鹽或堿加成鹽。

藥物制劑技術(shù)是普遍接受的技術(shù)，更多詳情參見(jiàn)例如Gennaro，The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Lippincott，Williams&Wilkins(2000)(ISBN：0683306472)；Ansel等，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippincott Williams&Wilkins Publishers(1999)(ISBN：0683305727)；以及Kibbe，Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association，第3版(2000)(ISBN：091733096X)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽與賦形劑材料(例如鹽水、氯化鈉、磷酸氫二鈉七水合物、磷酸二氫鈉)和穩(wěn)定劑一起配制。還可在例如緩沖溶液中按合適的濃度提供。

藥物組合物可呈各種形式。這些包括例如液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液劑(例如注射和輸注溶液劑)、分散劑或混懸劑、片劑、丸劑、散劑、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式可取決于既定的給藥方式和治療應(yīng)用。

可通過(guò)胃腸外方式(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射)給予組合物。本文所用術(shù)語(yǔ)“胃腸外給藥”和“經(jīng)胃腸外給予”是指腸內(nèi)和局部給藥以外的給藥方式，通常經(jīng)注射給藥，包括而不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、硬膜外及胸骨內(nèi)注射和輸注。

可經(jīng)腸內(nèi)途徑給予組合物，例如通過(guò)消化道，例如經(jīng)口服給藥。例如，可以片劑、膠囊劑、囊片劑、丸劑、散劑、滴劑、混懸劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑或其它口服劑型給予組合物。

腸內(nèi)途徑包括經(jīng)胃飼管、十二指腸飼管或胃造口或直腸給予，例如以栓劑或灌腸劑形式的組合物。

組合物可局部給藥，例如在疼痛部位。局部給藥包括例如表皮、鼻內(nèi)、吸入和陰道給藥?？蓪⒔M合物給予皮膚(例如燒傷、皰或破口)、唇、牙齦、牙、口腔、眼、耳、甲床或咽喉等，例如疼痛部位。局部給藥的組合物可為乳膏劑、凝膠劑、洗劑或軟膏劑等。

藥物組合物可包括“治療有效量”的本文所述的肽。該有效量可根據(jù)所給藥物(例如肽)的效果確定，或者如果使用一種以上藥物時(shí)，則根據(jù)聯(lián)用效果確定。治療有效量的藥物還可根據(jù)以下因素而變化：例如受治療者的疼痛類(lèi)型、疾病狀況、年齡、性別和體重以及藥物在受治療者體內(nèi)引起所需反應(yīng)(例如改善疼痛)的能力。治療有效量也是其中組合物的治療有益作用超過(guò)任何毒性或有害作用的量。

基于本發(fā)明，將來(lái)有可能獲得一種新型的、用于鎮(zhèn)痛的多肽藥物，或含有該多肽的有效鎮(zhèn)痛混合物。本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)：

1.原生蜘蛛毒素GsMTx-4多肽在水中形成四個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，合成時(shí)要求多肽必須折疊成保持該原生多肽的空間結(jié)構(gòu)才具有相應(yīng)藥效，因此合成工序繁瑣成本高。本發(fā)明找到了原生多肽中起鎮(zhèn)痛作用的藥效團(tuán)，因此降低了多肽的合成成本，使在工業(yè)上大批量生產(chǎn)變得高效而廉價(jià)；

2.由于本發(fā)明縮減了多肽長(zhǎng)度，降低了免疫原性，更易于人體吸收。在臨床應(yīng)用中更能充分發(fā)揮藥效。由于該多肽對(duì)正常大屬的疼痛閾值沒(méi)有影響，和嗎啡等藥物相比無(wú)成癮性、無(wú)賴(lài)藥性和無(wú)毒性。因此本發(fā)明可能被開(kāi)發(fā)為臨床上廣泛應(yīng)用的鎮(zhèn)痛藥物。

應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。

SEQUENCE LISTING

<110> 徐州醫(yī)科大學(xué)

<120> 一組肽及其藥物組合物和應(yīng)用

<130> 2016

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Trp Lys Cys Asn Pro Asn Asp Asp Lys Cys Cys Arg Pro Lys Leu Lys

1 5 10 15

Cys

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Trp Lys Cys Asn Pro Asn Asp Asp Lys Cys

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Trp Lys Cys Ala Pro Ala Asp Asp Lys Cys

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Trp Lys Cys Ala Pro Ala Asp Asp Lys Cys Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Trp Cys Asn Pro Asn Asp Asp Lys Cys Ala

1 5 10

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Trp Cys Lys Pro Asn Asp Asp Lys Cys

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

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1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Trp Cys Lys Asp Asp Lys Cys

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Trp Cys Lys Asp Asp Lys Trp

1 5