專利名稱：肽和多肽藥物的穩(wěn)定類似物的制作方法
背景技術(shù)：
多肽和肽藥物被廣泛應用于醫(yī)療實踐中，它們易于制備(或用重組DNA技術(shù)或肽合成的方法)，保證了它們在未來的數(shù)年內(nèi)仍然能夠在各種情況下使用。多肽藥物，如激素、細胞因子和生長因子是治療性藥物的重要組成部分。然而，某些天然多肽在體內(nèi)會因蛋白水解和異構(gòu)化作用迅速失活。當人們期待藥物一段時間內(nèi)在血中保持在一個恒定并持久的水平時，這種失活將帶來很大不便，因為必須反復給藥。在某些情況下，多肽的一個或多個水解產(chǎn)物還可能成為完整多肽活性的拮抗劑，在這種情況下，單純補充給藥是不足以克服水解產(chǎn)物的拮抗作用的。
進一步說，有一類肽類激素在血中存在較長時間是很有益處的，這類激素包括胰高血糖素樣肽1和肽2(GLP-1和GLP-2)、葡萄糖依賴的促胰島肽(GIP)、神經(jīng)肽Y(NPY)、胰多肽(PP)和肽YY(PYY)。GLP-1是在葡萄糖代謝和胃腸道分泌和代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的重要多肽激素，目前的研究表明GLP-1是胰腺β細胞生長因子，或許還與其他器官中的細胞分化有關(guān)。GLP-2是一個由33個氨基酸組成的肽，對胃腸道疾病有治療作用，特別是已知GLP-2是一種營養(yǎng)因子，有加強和維持胃腸道正常功能的作用，同時還能促進腸道組織的生長(見，例，美國專利序號5,834,428；5,789,379；和5,990,077；和國際公開號WO 98/52600)。GIP是由小腸內(nèi)分泌細胞合成并分泌的含42個氨基酸的肽(見R.A.Pederson，等，Endocrinology 99，780-785(1976)and T.B.Usdin，等，Endocrinology 133，2861-2870(1993))，灌注試驗顯示，GIP可抑制胰高血糖素對肝的作用而加強胰島素的作用。另外，GIP對肝臟血流有雙重作用，即增強門靜脈血流，抑制肝動脈血流。神經(jīng)肽Y是胰多肽家族中的一員，含36個氨基酸，在哺乳動物的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中呈高濃度存在，是已知的最強有力的增加食量的物質(zhì)，可能還與II型糖尿病有關(guān)(見美國專利6410701、6075009、5026685、5328899和K.Tatemoto，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，5485-5489(1982))。肽YY(PYY)和胰多肽(PP)是結(jié)構(gòu)上相關(guān)的肽類激素，與記憶力喪失、抑郁、焦慮、癲癇、疼痛、高血壓及睡眠和飲食障礙有關(guān)。
此類多肽激素和其他多肽類因子相信是由絲氨酸蛋白酶的脯氨酸后(post-proline)切割組成員降解的，如二肽基肽酶IV(DPP IV)。DPPIV是膜相關(guān)絲氨酸肽酶，切割肽鏈上N端二肽，肽鏈次末(P1)位最好是脯氨酸殘基，或如果N端(P2)是組氨酸或一個大芳香族氨基酸如酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸時，次末(P1)位最好為丙氨酸殘基。GLP-1、GIP和GLP-2的氨基端序列分別為His-Ala-Glu、Tyr-Ala-Glu和His-Ala-Asp。NPY、PP和PYY的氨基端序列分別為Tyr-Pro-Ser、Ala-Pro-Leu和Tyr-Pro-Ile。由此，提示了DPP IV在體內(nèi)對這類多肽類激素和其他多肽的調(diào)節(jié)作用。
DPP IV介導從上述有生物活性的肽激素的N端切除Xaa-Ala或Xaa-Pro二肽(這里Xaa為一個氨基酸殘基)導致激素失活或變?yōu)檗卓箘＝z氨酸蛋白酶導致的肽類激素被切割和失活是蛋白水解過程極大限制治療性多肽使用的一個例子。找到能夠在蛋白水解，如DPP IV介導的失活作用下仍保持穩(wěn)定的肽類藥物的類似物將有很大意義，也即是說，本領(lǐng)域有著對蛋白水解抗性肽類激素的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明總的來說提供了抗蛋白酶切割(如抗蛋白水解)的肽或多肽類似物(P′1類似物)的組合物。
本發(fā)明的一個方面關(guān)系到一個發(fā)現(xiàn)，即對脯氨酸后切割蛋白酶底物的P′1位置(酰胺切割位點的羧基端一側(cè)的殘基)進行修飾后，產(chǎn)生的底物類似物與天然底物相比，對酶介導的切割的敏感性有很大程度的降低，但卻保留了天然底物的生物學活性。例如，用一個氨基酸類似物修飾脯氨酸后切割絲氨酸蛋白酶DDP IV底物的P′1位殘基(具DPP IV切割位點)，得到一個對DDP IV的切割不敏感，但又保留了天然底物的生物學活性的底物類似物。
本發(fā)明的另一個方面關(guān)系到一個更普遍的觀察，即用一個具有四取代的Cβ碳的氨基酸類似物修飾蛋白酶底物的P′1位殘基(具切割位點)，得到的底物類似物在體內(nèi)的半衰期明顯延長，相對天然底物來說，其生物有效期可能延長和/或清除可能減緩?；诖税l(fā)現(xiàn)及它對多種蛋白酶切割底物的適用性，本發(fā)明提供了一個制備這些蛋白酶如絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶底物的P′1類似物的方法。
本發(fā)明還提供了含有一個或多個的題述P′1類似物的藥用組合物，示例性藥用組合物含一個或多個用藥學上可接受的載體或賦形劑配制的P′1類似物。
本發(fā)明的另一個方面是治療受試者疾病的方法，包括給予治療有效劑量的一個或多個的P′1類似物，該題述P′1類似物可以單獨給藥，也可作為包括適于治療特殊疾病適應癥的其他療法的治療方案的一部分來用藥。例如，P′1類似物可單獨用于治療糖尿病，也可在使用時結(jié)合飲食控制和運動，和/或聯(lián)合使用胰島素。更進一步，示例性的聯(lián)合治療方法包括給予P′1類似物的同時，也給予切割其天然多肽的特定酶的抑制劑，這樣的抑制劑可能是某種特殊的酶特異性的(如DDP IV特異性抑制劑)或更寬泛地針對一類酶(如，絲氨酸酶抑制劑)。
本發(fā)明的另一個方面是關(guān)于題述P′1類似物在診斷方面的用途。
本發(fā)明的另一個方面是關(guān)于題述P′1類似物在生產(chǎn)提供蛋白酶抗性肽的藥物方面的用途。
本發(fā)明的另一個方面是P′1類似物在生產(chǎn)治療性藥物方面的用途。
本發(fā)明還有的一個方面是關(guān)于實施商業(yè)計劃的方法，包括P′1類似物及其藥用組合物、和/或含有P′1類似物的試劑盒的鑒別、生產(chǎn)、推銷、發(fā)放和給予準許。
在上述諸方面中，本發(fā)明料想到P′1類似物作為多肽類激素類似物，如胰高血糖素樣肽、NPY、PPY、腸泌素、GLP-1、GLP-2和GIP的類似物的組合物和方法，本發(fā)明認識到可以在任何可被蛋白酶切割的多肽或肽類激素的切割位點上進行修飾而生成一個具有蛋白酶抗性的P′1類似物。更進一步，本發(fā)明認識到根據(jù)我們對酶的切割位點的認識和本申請中提供的方法，能夠很容易地設計出具有多種多樣蛋白酶抗性的P′1類似物。這類蛋白酶的例子包括金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。
附圖簡述

圖1為天然GLP-1被DPP IV降解的圖解。
圖2為兩個不同的GLP-1(7-37)類似物抵抗DDP IV切割的HPLC/MS結(jié)果概述。
圖3顯示出3-二甲基-天冬氨酸取代的GLP-1類似物保持天然GLP-1的功能活性。左邊的圖形顯示GLP-1和GLP-1(3-DMA)以相似但不相同的親和力與其受體結(jié)合。右邊的圖形顯示GLP-1和GLP-1(3-DMA)具有基本相同的信號轉(zhuǎn)導能力，這一點是暴露于GLP-1和GLP-1類似物后，通過測定cAMP的產(chǎn)生得出的。
圖4顯示3-丁基-甲基-甘氨酸取代的GLP-1(GLP-1(BM))類似物保持天然GLP-1的功能活性。圖形顯示GLP-1和GLP-1(BM)具有基本相同的信號轉(zhuǎn)導能力，這一點是暴露于GLP-1和GLP-1類似物后，通過測定cAMP的產(chǎn)生得出的。圖5顯示GLP-1(7-37)酰胺用人DDP IV處理2小時后(下)與未處理過的肽(上)的HPLC/MS結(jié)果比較。注意GLP-1(7-37)被DDP IV處理后出現(xiàn)時間依賴的肽損失。
圖6顯示含有叔-亮氨酸(TLE)殘基替代P′1谷氨酸的GLP-1類似物用人DDP IV處理2小時后(下)與未被DDP IV處理過的肽(上)的HPLC/MS結(jié)果比較。注意該TLE-GLP-1類似物對DPP IV的降解有抗性。
圖7顯示叔-亮氨酸(TLE)在一個絲氨酸蛋白酶凝血酶的模型底物的P′1位置上的取代導致了一個具有凝血酶抗性的肽類似物的生成。
圖8顯示使用三個不同劑量(40μg、4μg、0.4μg)的毒蜥外泌肽-4的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖9顯示使用40μg劑量的GLP-1(TPA1B4)類似物的糖尿病小鼠與生理鹽水對照或GLP-1對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖10顯示使用三個不同劑量(800μg、80μg、8μg)的GLP-1(TPA1B4)類似物的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖11顯示使用20mg/kg劑量的GLP-1(TPA1B4)類似物的糖尿病小鼠與生理鹽水對照或GLP-1對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖12顯示使用20mg/kg劑量的GLP-1(TPA1B4)類似物的糖尿病小鼠與生理鹽水對照或GLP-1對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間的血糖水平。
圖13顯示使用三個不同劑量(8μg、0.8μg、0.08μg)的毒蜥外泌肽-4的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖14顯示使用800μg劑量的GLP-1的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖15顯示使用8μg和0.8μg兩個劑量的GLP-1類似物(P1732)的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖16顯示式(II)的示例性實施方案，其中天然存在的氨基酸在β-位(3-位)用R1和R2修飾。
發(fā)明詳述
I.概況本發(fā)明總的來說涉及肽和因?qū)Φ鞍姿饷傅那懈蠲舾行越档投w內(nèi)半衰期延長，且保留了天然底物的活性的P′1類似物。本發(fā)明中的P′1類似物包括其活性和/或體內(nèi)半衰期通常由蛋白水解調(diào)節(jié)的生長因子、細胞因子、肽類激素和其他多肽和肽的類似物。
本發(fā)明的一個方面涉及發(fā)現(xiàn)對脯氨酸后切割蛋白酶底物的P′1位(酰胺切割位點羧基端的一側(cè)的氨基酸殘基)進行修飾能產(chǎn)生較之天然底物對酶切割的敏感性大大降低了的底物類似物，而且天然底物的生物活性仍然存在。例如，用一個氨基酸類似物對脯氨酸后切割絲氨酸蛋白酶DPP IV底物的P′1位(DPP Ive切割位點)進行修飾，生成一個極大降低了對DDP IV切割敏感性的底物類似物，而且天然底物活性還被保留了下來。
用另一個天然氨基酸替代P′1位氨基酸殘基是一種選擇，在優(yōu)選實施方案中，取代P′1位氨基酸殘基是一個非天然的氨基酸類似物，甚至更優(yōu)選的，是用一個保留了與其相似的立體構(gòu)型和/或電荷性狀的結(jié)構(gòu)類似物來取代。本發(fā)明的某些實施方案提供了一個修飾過的多肽，經(jīng)修飾后該多肽對脯氨酸后切割蛋白酶，如對二肽基肽酶IV(DPP IV)水解作用的敏感性降低，該多肽在P′1位的殘基被一個氨基酸或式I的氨基酸類似物所修飾。
其中，R1和R2獨立選自低級烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、羧基、氨基甲?；?carboxamide)、羰基、鹵素、羥基、胺或氰基，或R1和R2也可一起形成一個4-7元的環(huán)；
R3選自低級烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、氨基、烷氧基、鹵素、羧基、酰胺基、羰基、氰基、硫代烷基(thioalkyl)、?；被Ⅴ０被?、氰基、硝基、疊氮基、硫酸酯基、磺酸酯基、亞磺酰氨基、-(CH2)mR4、-(CH2)mOH、-(CH2)mCOOH、-(CH2)mO-低級烷基、-(CH2)mO-低級烯基、-(CH2)nO(CH2)mR4、-(CH2)mSH、-(CH2)mS-低級烷基、-(CH2)mS-低級烯基、-(CH2)nS(CH2)m-R4、(CH2)mNH2、(CH2)mNC(＝NH)NH2、-(CH2)mC(＝O)NH2或-(CH2)mNH2；R4每次出現(xiàn)獨立代表芳基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或雜環(huán)；m為0、1或2；n為0、1或2。
在某些優(yōu)選實施方案中，R1和R2各自獨立地代表一個小疏水基團，如一個低級烷基(優(yōu)選甲基、乙基或丙基，更優(yōu)選的是甲基)、鹵素或一個鹵化的低級烷基。
在某些優(yōu)選實施方案中，R3代表低級烷基，更優(yōu)選甲基、乙基或丙基，甚至更優(yōu)選的是甲基。在另一個優(yōu)選實施方案中，R3代表一個芳基，如苯基或羥苯基(優(yōu)選對羥基)。在其他的優(yōu)選實施方案中，R3代表一個羥基基團。在還有的優(yōu)選實施方案中，R3代表-(CH2)mCOOH，優(yōu)選的m為0或1。
在某些優(yōu)選實施方案中，n為0。
在某些底物類似物的優(yōu)選實施方案中，P′1位是具有四取代的Cβ碳的氨基酸類似物，如式式II表示的那樣 其中R1和R2獨立代表一個低級烷基或鹵素；R3代表一個低級烷基、芳基、羥基、-(CH2)mCOOH、-(CH2)mNH2、-(CH2)mNC(＝NH)NH2、-(CH2)mC(＝O)NH2、-SH或-(CH2)m-S-CH3；m為0、1或2。
在某些優(yōu)選實施方案中，R1和R2獨立地選自甲基、乙基或丙基，甚至更優(yōu)選的是甲基。
在某些優(yōu)選實施方案中，R3代表一個低級烷基，更優(yōu)選為甲基、乙基或丙基，甚至更優(yōu)選的是甲基。在其它優(yōu)選實施方案中，R3代表芳基，如苯基、羥苯基(優(yōu)選對羥基)、吲哚或咪唑。在又一個優(yōu)選實施方案中，R3代表一個羥基。在某些優(yōu)選實施方案中，R3代表-COOH或-CH2COOH。在再一個優(yōu)選實施方案中，R3代表-CH2CH2NC(＝NH)NH2、-CH2C(＝O)NH2、-CH2CH2C(＝O)NH2、-SH或-CH2SCH3。
本發(fā)明的另一個方面涉及一個更普遍的觀察，即用一個具有四取代的Cβ碳的氨基酸類似物修飾蛋白酶底物的P′1位殘基(具酶切位點)，得到的底物類似物在體內(nèi)的半衰期明顯延長，相對野生型多肽來說，其生物有效期可能較長，清除可能較緩?；诖税l(fā)現(xiàn)及它對多種蛋白酶切割底物的適用性，本發(fā)明提供了一個制備這些蛋白酶底物的P′1類似物的方法，這些蛋白酶包括絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。
在某些優(yōu)選實施方案中，P′1為氨基酸類似物，具四取代的Cβ碳，如式II中表示的那樣 其中R1和R2各自獨立地代表一個低級烷基或鹵素；R3代表低級烷基、芳基、羥基基團、-(CH2)mCOOH、-(CH2)mNC(＝NH)NH2、-(CH2)mC(＝O)NH2、-(CH2)mNH2、-SH、-(CH2)mSCH3；m為0、1或2。
在某些優(yōu)選實施方案中，R1和R2各自獨立代表甲基、乙基或丙基，甚至更優(yōu)選的是甲基。
在某些優(yōu)選實施方案中，R3代表低級烷基，更優(yōu)選甲基、乙基或丙基，甚至更優(yōu)選的是甲基。在另一個優(yōu)選實施方案中，R3代表芳香基團，如苯基、羥苯基(優(yōu)選對羥基)、吲哚或咪唑。在另有的優(yōu)選實施方案中，R3代表一個羥基基團。在某些優(yōu)選實施方案中，R3代表-COOH或-CH2COOH。在還有的優(yōu)選實施方案中，R3代表-CH2CH2NC(＝NH)NH2、-CH2C(＝O)NH2、-CH2CH2C(＝O)NH2、-SH或-CH2SCH3。修飾天然氨基酸的優(yōu)選實施方案的例子見圖16。
II.定義術(shù)語“底物”指被酶催化并發(fā)生化學轉(zhuǎn)變而生成產(chǎn)物的酶底物。
肽底物的結(jié)合位點由一系列分布在酶表面的“特異性亞位點”組成，術(shù)語“特異性亞位點”指酶分子上能夠與該酶的底物的某部分相互作用的口袋或其他位點。
在討論肽和蛋白底物與蛋白酶如絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶等相互作用時，本發(fā)明采用了Schechter and Berger命名法[(1967)Biochem.Biophys.Res.Commun.27157-162]]。底物或抑制劑上的各氨基酸殘基被標示為-P2-P1-P′1-P′2等，酶分子上的對應亞位點被標示為S2、S1、S′1、S′2等。底物上易裂的鍵為連接P1和P′1殘基的酰胺鍵。
“P′1殘基”指底物多肽的氨基酸主鏈經(jīng)過蛋白酶切割以后形成的產(chǎn)物多肽上的新氨基端的氨基酸殘基，為了進一步闡明，底物多肽包括用以下通式來代表的對蛋白水解反應敏感的酰胺骨架鍵。
術(shù)語“氨基酸殘基”指氨基酸，這里所用的命名天然氨基酸的縮寫是以IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(seeBiochemistry(1972)111726-1732)的推薦為依據(jù)的。例如Met、Ile、Leu、Ala和Gly分別代表甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸和甘氨酸殘基。用殘基來表示對應的α-氨基酸的羧基上失去了一個OH，氨基上失去了一個H后衍生而來的基團。
術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈”是指氨基酸殘基除了主鏈的部分，正如Kopple在，″Peptides and Amino Acids″，W.A.Benjamin Inc.，New York andAmsterdam，1966，第2和33頁中定義的。例如，普通氨基酸的側(cè)鏈為CH2CH2SCH3(甲硫氨酸側(cè)鏈)、-CH2(CH3)-CH2CH3(異亮氨酸側(cè)鏈)、-CH2CH(CH3)2(亮氨酸側(cè)鏈)或H-(甘氨酸側(cè)鏈)。這些側(cè)鏈連在主鏈的Cα碳上。
術(shù)語“四取代的Cβ碳”指一個碳原子，該碳原子(i)是直接連在氨基酸主鏈的Cα碳上；(ii)含4個側(cè)取代基(包括Cα碳在內(nèi))，其中沒有一個是氫。
這里所用的“蛋白質(zhì)”指基本由20種氨基酸中的任何氨基酸組成的多聚體，雖然多肽常被用來指相對較大的蛋白質(zhì)，肽用于指較小的蛋白質(zhì)，這些術(shù)語在本領(lǐng)域的使用是重疊的和變化的。如果內(nèi)容上沒特別表明，這里的“肽”、“蛋白質(zhì)”和“多肽”是混用的。
正如這里所用，術(shù)語“核酸”指多核苷酸，如脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。應該明白，該術(shù)語同樣包括由核苷類似物生成的RNA或DNA類似物，同時也適用于方案中描述的單鏈(正義或反義)或雙鏈多核苷酸。
The International Union of Biochemistry and Molecular Biology(1984)推薦用“肽酶”來稱呼肽鍵水解酶(亞類E.C 3.4)的亞類。廣泛應用的術(shù)語“蛋白酶”是“肽酶”的同義詞，它們在此是混用的。肽酶包括兩組酶內(nèi)切肽酶和外切肽酶。內(nèi)切肽酶從蛋白的內(nèi)部某點切割肽鍵，外切酶從蛋白的N端或C端連續(xù)切除氨基酸。
術(shù)語“蛋白酶”也是內(nèi)切肽酶的同義詞。蛋白酶根據(jù)其催化機理分類，The International Union of Biochemistry and Molecular Biology已經(jīng)認可了四類不同機理的酶絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。
“絲氨酸蛋白酶”類包括兩個獨特的家族，一為糜蛋白酶家族，包括哺乳動物酶如糜蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶或激肽釋放酶，另一為枯草蛋白酶家族，包括了細菌酶如枯草蛋白酶。兩個家族有著不同的總體三維結(jié)構(gòu)但其活性位點的幾何構(gòu)型相同，通過相同的機理發(fā)揮催化作用。該絲氨酸蛋白酶展現(xiàn)不同的底物特異性，這和與底物殘基相互作用的各種酶的亞位點上的氨基酸取代有關(guān)(見，thenomenclature of Schechter and Berger)。形成催化三聯(lián)體的三個殘基為催化過程所必須，它們是His-57、Asp-102和Ser-195(糜蛋白酶原上的位數(shù))。
“半胱氨酸”家族包括植物肽酶如木瓜蛋白酶、獼猴桃堿或菠蘿蛋白酶，幾個哺乳動物溶酶體組織蛋白酶，胞質(zhì)鈣蛋白酶(鈣激活的)，和一些寄生蟲肽酶(如錐蟲，血吸蟲)。木瓜蛋白酶是這類酶中的天然類型，也是研究得最透徹的一個。
大多數(shù)“天冬氨酸蛋白酶”屬于胃蛋白酶家族，該胃蛋白酶家族包括消化酶如胃蛋白酶和凝乳酶，同時還有溶酶體組織蛋白酶D，加工酶如腎素，和某些真菌肽酶(青霉天冬酰蛋白酶、根酶蛋白酶(rhizopuspepsin)、內(nèi)座殼蛋白酶(endothiapepsin))。第二個家族包括病毒蛋白酶如愛滋病毒肽酶，又叫反轉(zhuǎn)錄肽酶(retropepsin)。
“金屬蛋白酶”在細菌、霉菌和較高級的生物體中均有發(fā)現(xiàn)，它們在序列和結(jié)構(gòu)上大不相同，但大多數(shù)此類酶都含有一個具有催化活性的鋅原子，許多酶含有HEXXH序列，該序列為鋅提供了兩個組氨酸配體，第3個配體要么為谷氨酸(嗜熱芽胞菌蛋白酶、中性溶酶、丙氨酰氨基肽酶)要么為組氨酸(蝦紅素)。
術(shù)語“激動劑”在這里指一種肽或P′1類似物，該肽或P′1類似物保留了天然目的底物的生物活性，當用于動物體后能產(chǎn)生相似的生物效應。
術(shù)語“拮抗劑”指一種肽或P′1類似物，該肽或P′1類似物不再具有原有目的底物的生物活性，或至少相對天然底物來說活性水平有所降低，并抑制天然底物的生物學活性。
術(shù)語“類似物”指一個在功能上與一個完整的受體分子或其片段基本相似的分子。
關(guān)于母體化合物的“微小修飾的衍生物”的術(shù)語，用于指化學性狀與母體化合物相似的化合物，例如一個氨基酸類似物。最好，微小修飾衍生物在結(jié)構(gòu)上有微小修飾，這樣可被認為是原有化合物的“結(jié)構(gòu)類似物”。
“心臟相關(guān)疾病”包括任何涉及到心臟和/或相關(guān)組織(如心包膜、主動脈、和其他相關(guān)血管)的慢性或急性病理變化，包括缺血-再灌注損傷；充血性心衰；心臟驟停；心肌梗死；由化合物如藥物(鹽酸多柔比星、赫賽汀、鹽酸硫利達嗪和西沙必利)引起的心臟毒性；由于寄生蟲感染(細菌、真菌、立克次氏體，病毒，例如梅毒，慢性克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)感染)引起的心臟損害；暴發(fā)性心臟淀粉樣變性、心臟外科手術(shù)；心臟移植；心臟外傷(如穿透性或鈍性心外傷和動脈瓣破裂)；胸主動脈瘤外科修復、腎上腺動脈瘤；由心肌梗塞或心衰引起的心源性休克；神經(jīng)源性休克和過敏反應。
這里所用的“說明書”指描述涉及試劑盒或封裝的藥品使用方法和材料相關(guān)的產(chǎn)品標簽和/或文件。這些材料可包括下述任何內(nèi)容的組合背景信息、內(nèi)容物清單、推薦劑量、可能的負作用警告、用藥說明，技術(shù)支持和其他任何相關(guān)文件。
短語“藥學上可接受的”用在這里指那些配體、材料、組合物和/或劑型。在一個良好的醫(yī)學判斷所及的范圍內(nèi)，適合于用來與人或動物組織接觸，而基本無熱原反應，無過量毒性、刺激、過敏反應，無其他問題和/或并發(fā)癥，與合適的效益/危險比相稱。
用于這里的短語“藥學上可接受的載體”指藥學上可接受的涉及到攜帶或運輸目標化學物質(zhì)從身體的一個器官或部位到另一個器官或部位的材料、組合物或媒介物，如液體或固體的填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或膠囊化材料。各種載體必須在可與制劑中的其他成份配伍，不傷害病人，基本無熱原的概念上可接受。藥學上可接受的材料的例子包括(1)糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基鈉纖維素、乙基纖維素和乙酸纖維素；(4)粉狀西黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，如可可緩沖液和支撐蠟；(9)油，如花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄欖油玉米油和豆油；(10)甘醇，如丙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原水(17)等滲鹽；(18)Ringer’s溶液；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖液；和(21)其他用于藥物制劑中的無毒相容物質(zhì)。在某些實施方案中，本發(fā)明中的藥物組合物是無熱原的，即用于病人后不會引起病人體溫升高。
術(shù)語“藥學上可接受的鹽”指抑制劑的無毒的、無機和有機的酸加成鹽，這些鹽可在分離或純化該抑制劑的過程中在原位制備，也可用該純化的抑制劑的游離堿與合適的有機或無機酸進行反應，再分離生成的鹽。代表性的鹽包括氫溴化物、氫氯化物、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘酸鹽、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽和月桂基磺酸鹽等等(見，例，Bergeet al(1977)″Pharmaceutical Salts″，J.Pharm.Sci.661-19)。
在其他情況下，本發(fā)明中的抑制劑可以含一個和/或多個酸性功能基團，能夠與藥學上可接受的堿形成藥學上可接受的鹽。在這些例子里術(shù)語“藥學上可接受的鹽”指抑制劑的相對無毒的無機和有機堿加成鹽。這些鹽同樣能夠在最后分離和純化抑制劑的過程中原位制備而成，或另行用純化的游離酸形式的抑制劑與合適的堿反應，如一種藥學上可接受的金屬離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽與氨或與藥學上可接受的有機一級、二級或三級胺反應。堿或堿土鹽的代表包括鋰、鈉、鉀、鈣、等鎂和鋁鹽等。用于形成堿加成鹽的有機胺包括乙基胺、二乙基胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺哌嗪等(見，例，Berge等，supra)。
術(shù)語“預防”是本領(lǐng)域認可的，當用于涉及如局部復發(fā)(疼痛)的病癥、如癌癥等疾病、如心衰等復合綜合征、或其他任何醫(yī)學癥狀時，其意義在本領(lǐng)域是人盡皆知的。預防包括將一種藥物組合物用于一個受試者，使用過該組合物的受試者相對未用過該組合物的受試者來說，其醫(yī)學癥狀發(fā)生的頻率降低，發(fā)作時間延遲。由此，預防癌癥包括，例如，接受過預防措施的病人群體相對未接受過預防措施的病人群體，可檢測出的癌細胞生長被降低到有統(tǒng)計學或臨床意義的量，或接受過預防措施的病人群體較之未接受過預防措施的病人群體，可檢測到的癌性生長的出現(xiàn)被延遲到有統(tǒng)計學或臨床意義的量。預防感染包括，例如，接受過治療的群體相對未接受過治療的群體，被確診為感染的人數(shù)降低，或接受過治療的群體相對未接受過治療的群體，感染癥狀的發(fā)作被延遲。預防疼痛包括，例如，接受過治療的群體相對未接受過治療的群體，其疼痛的程度降低，痛感的出現(xiàn)延遲。
一種化合物，如本發(fā)明中的多肽或肽的類似物的“治療有效量”，應用在治療方面指制劑中的多肽或肽，作為理想劑量方案(用于哺乳動物，優(yōu)選人體)的一部分使用時，根據(jù)臨床上可以接受的對疾病或病癥進行治療的標準或美容目的的標準，能減輕癥狀，改善狀況，或延遲疾病發(fā)作，如有一個適合于各種醫(yī)療治療的合理的效益/危害比。
術(shù)語“烷基”指完全飽和的指明有若干碳原子的含側(cè)鏈或不含側(cè)鏈的碳鏈基，或如果沒有特別指明碳鏈可長達30個碳原子。例如，“低級烷基”指含1到10個碳原子的烷基，如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基，及這些烷基的位置異構(gòu)體。含有10到30個碳原子的烷基包括癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、二十三烷基和二十四烷基。在優(yōu)選實施方案中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈上有30或少于30個碳原子(如直鏈1到30個，支鏈3到30個)，更優(yōu)選的為20個或少于20個碳原子。同樣，優(yōu)選環(huán)烷基在其環(huán)狀結(jié)構(gòu)上有3到10個碳原子，更優(yōu)選的為5、6、或7個碳原子。
此外，貫穿于本說明和權(quán)利要求的術(shù)語“烷基”(或“低級烷基”)有意把未取代的和取代的烷基鏈均包含于其中，取代的烷基鏈指烷基的烴主鏈上的一個或多個碳原子上的氫被取代基取代。這些取代基包括，如鹵素、羥基、羰基(如羧基、烷氧羰基、甲?；蝓；?、硫代羰基(如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯基、膦酸酯基、次膦酸酯基、氨基、酰氨基、脒、氰基、硝基、硫氫基、烷硫基、硫酸酯基、磺酸酯基、氨磺酰、磺酰氨基、磺酰基、雜環(huán)基、芳烷基、或芳香或雜芳香基團。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道，如果合適，烴鏈上的取代基團本身也可被取代。例如，被取代烷基上的取代基可以包括取代和未取代形式的氨基、疊氮基、亞氨基、酰氨基、磷?；?包括膦酸酯基和次膦酸酯基)、磺?；?包括硫酸酯基、亞磺酰氨基、氨磺酰和磺酸酯基)和甲硅烷基基團，還有醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸鹽和酯)、-CF3、-CN等。示例性的取代烷基在下面描述。環(huán)烷基可進一步被烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CF3、-CN等取代。
除非特別指明碳原子數(shù)，這里所用的“低級烷基”，指一個烷基基團，正如以上定義的，含1到10個碳原子，更優(yōu)選的含1到6個碳原子在其主鏈結(jié)構(gòu)上，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、二級丁基、三級丁基。類似，“低級烯基”和“低級炔基”有著相似的鏈長度。貫穿整個申請，優(yōu)選的烷基基團是低級烷基。在優(yōu)選實施方案中，指明的烷基取代基為低級烷基。
這里所用的術(shù)語“碳環(huán)”指環(huán)中的各個原子均為碳原子的芳香或非芳香環(huán)。
這里所用的術(shù)語“芳基”包括5-、6-和7元單環(huán)芳基，這些芳基可含有0到4個雜原子，例如，苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪、嘧啶等。在環(huán)結(jié)構(gòu)上含有雜原子的芳基又被稱為“芳基雜環(huán)”或“雜芳基”。芳環(huán)在其環(huán)上一個或更多的位置可被以上描述的取代基取代，例如，鹵素、疊氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、硫氫基、亞氨基、酰氨基、膦酸鹽根、次膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚、烷硫基、磺?；?、亞磺酰氨基、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳基或雜芳基、-CF3、-CN等。術(shù)語“芳基”也包括含有兩個或多個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的多環(huán)系統(tǒng)，該多環(huán)系統(tǒng)的兩個相鄰的環(huán)共用兩個或更多的碳原子(“稠環(huán)”)，其中至少一個環(huán)是芳香環(huán)，如其他環(huán)可以是環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基和/或雜環(huán)基。
“烯基”指任何支鏈或直鏈的不飽和碳鏈基，其碳原子數(shù)可以是已指定的，如未特別指明，碳原子數(shù)可多達26個，且含有一個或更多的雙鍵。典型的6個至26個碳原子的烯基的實例為己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一烯基、十二烯基、十三烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、十九烯基、二十烯基、二十二烯基、二十三烯基和二十四烯基，和它們的各種異構(gòu)體，其不飽和鍵可以位于基團的任何位置，其可形成關(guān)于雙鍵的(Z)或(E)構(gòu)型。
術(shù)語“炔基”指與烯基范圍一樣的烴基，但是，炔基含有一個或多個三鍵。
這里所用的術(shù)語“烷氧基”指一個如以下定義的含有一個與之相連的氧基的烷基基團。代表性的烷氧基團包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等?！懊选庇蓛蓚€烴基與一個氧原子共價結(jié)合而成。因此，使烷基成為醚的取代基是或者類似于烷氧基，如-O-烷基、-O-烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R1的其中之一，這里m和R將在下面描述。
術(shù)語“雜環(huán)”或“雜環(huán)基團”指3到10元環(huán)結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的是3到7元環(huán)，其環(huán)結(jié)構(gòu)上包括1到4個雜原子。雜環(huán)也可以是多環(huán)。雜環(huán)基團包括，例如，噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯并呋喃、色烯、呫噸、氧硫雜蒽(phenoxathiin)、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡唑、嘧啶、噠嗪、吲嗪、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、carboline、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋喃、吩噁嗪、吡咯烷、氧雜環(huán)戊烷、硫雜環(huán)戊烷、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內(nèi)酯、內(nèi)酰胺如氮雜環(huán)丁烷酮和吡咯烷酮、磺內(nèi)酰胺、磺內(nèi)酯等。雜環(huán)基團可以在一個或更多的位置被以上描述過的取代基取代，例如，被鹵素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、硫氫基、亞氨基、酰氨基、磷酸鹽、磷酸酯、膦酸鹽、羰基、羧基、硅烷基、氨磺?；喠蝓；⒚?、烷硫基、甲酮、醛、酯、雜環(huán)、芳香和雜芳香基團、-CF3、-CN等。
術(shù)語“烷硫基”指一個以上定義的烷基，含有一個與之結(jié)合的硫基。在優(yōu)選實施方案中，烷硫基基團以-(S)-烷基、-(S)-烯基、-(S)-炔基和-(S)-(CH2)m-R1中的一個為代表，其中m和R1將在下面定義。代表性的烷硫基基團包括甲硫基、乙硫基等。
如這里所用，術(shù)語“硝基”指-NO2；術(shù)語“鹵素”指氟、氯、溴、碘；術(shù)語“巰基”指-SH；術(shù)語“羥基”指-OH；術(shù)語“磺?；敝?SO2-。
術(shù)語“胺”和“氨基”是本領(lǐng)域認可的術(shù)語，指無取代和取代的胺，例如一個可用以下式表示的基團 或
其中，R3、R5和R6分別獨立地代表氫原子、烷基、烯基、-(CH2)m-R1，或R3和R5與連接它們的氮原子一起形成4到8個原子的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，R1代表烯基、芳基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、雜環(huán)基或多環(huán)基。M為零或1到8的整數(shù)。在優(yōu)選實施方案中，R3或R5中只有一個是羰基，如R3、R5和氮原子一起不形成二酰亞胺。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，R3和R5(任選R6)各自獨立地代表氫原子、烷基、烯基、-(CH2)m-R1。這樣，術(shù)語“烷基胺”在這里指一個胺基，如上面所定義的，含有一個取代的或未取代的烷基與之結(jié)合在一起，即至少R3和R5中的一個是烷基。在某些實施方案中，氨基或烷基胺是堿性的，意味著其PKa≥7.00，這些功能基團的質(zhì)子化形式溶與水時Pka都在7.00以上。
術(shù)語“羰基”是本領(lǐng)域認可的，包括可用以下通式表示的基團 或 其中X是鍵，或代表一個氧或一個硫。R7代表氫原子烷基、烯基、-(CH2)m-R1或其藥學上可接受的鹽。R8代表氫原子、烷基、烯基、-(CH2)m-R1，此處的m和R1如以上所定義。當X是氧，R7、R8不是氫，該式代表“酯”。當X是氧，R7如以上所定義，該基團這里指羧基，特別是當R7是氫時，該式代表“羧酸”。當X是氧，R8是氫，該式代表“甲酸酯”。一般來說，當上述式的氧原子被硫取代，該式代表“硫代羰基”基團。當X是硫，R7和R8不是氫，該式代表“硫酯”基團。當X是硫，R7和R8是氫，該式代表“硫代羧酸”基團。當X是硫，R8是氫，該式代表“硫代甲酸酯”基團。另一方面，當X是一個鍵，R7不是氫，上述式代表“酮”基團。當X是一個鍵，R7是氫，上述式代表“醛”基團。
如這里所用，術(shù)語“取代”涵蓋所有允許的有機化合物的取代基，廣義地說，允許的取代基包括有機化合物的無環(huán)和環(huán)狀，支鏈和直鏈，碳環(huán)和雜環(huán)，芳香和非芳香取代基。說明性的取代基包括以上描述的那些。對合適的有機化合物，取代基可以有一個或多個、可以是相同的也可以是不同的。為了本發(fā)明的目的，雜原子，如氮，可以有氫取代基和/或任何這里描述的能滿足雜原子的化合價的有機化合物的允許取代基。不能以任何方式用化合物的允許取代基限制本發(fā)明。應該明白，“取代”或“被取代”包括了未明講的限制性條文，即這樣的取代應該與被取代原子和取代基的化合價相對應，取代應該導致生成一個穩(wěn)定的化合物，即該化合物不應該如通過重排、環(huán)化和消除等發(fā)生自發(fā)的轉(zhuǎn)化。
術(shù)語“氨磺?！笔潜绢I(lǐng)域認可的，包括一個能被以下通式表示的基團 其中R3和R5如以上所定義。
術(shù)語“硫酸酯基”是本領(lǐng)域認可的，包括一個能被以下通式表示的基團 其中R7如以上定義。
術(shù)語“磺酰氨基”是本領(lǐng)域認可的，包括一個能被以下通式表示的基團 其中R2和R4如以上定義。
術(shù)語“磺酸酯基”是本領(lǐng)域認可的，包括一個能被以下通式表示的基團 其中R7是電子對、氫、烷基、環(huán)烷基或芳基。
這里所用的術(shù)語“亞砜基”或“亞硫酰基”，指一個能被以下通式表示的基團 其中R12選自氫、烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)基、芳烷基或芳基。
可以對烯基和炔基基團進行類似取代而生成氨基烯基、氨基炔基、酰氨基烯基、酰氨基炔基、亞氨基烯基、亞氨基炔基、硫代烯基、硫代炔基、羰基取代的烯基或羰基取代的炔基。
如這里所用，各種表達的定義，如烷基、m、n等，當其在任何結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)一次以上時，表示其獨立于在同一結(jié)構(gòu)的其他地方的定義。
為了本發(fā)明，化學元素根據(jù)CAS version，Handbook of Chemistryand Physics，67th Ed.，1986-87，內(nèi)封面的元素周期表鑒別。也為了本發(fā)明，術(shù)語“烴”基意在包括所有的含有至少一個氫原子和一個碳原子的化合物。更廣泛地講，允許的烴基包括非環(huán)狀和環(huán)狀、支鏈和直鏈、碳環(huán)和雜環(huán)、芳香和非芳香的有機化合物，它們可以是取代的或未取代的。
III.示例性實施方案(a)P′1類似物本發(fā)明提供了抗蛋白酶介導的切割的肽和P′1類似物的生產(chǎn)和使用方法。天然的多肽通常能被某種特殊的蛋白酶(如，金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或絲氨酸蛋白酶)切割，人們能很容易地確定天然多肽上酶切割的位置(切割位點)。一旦酶切位點被確定，就可根據(jù)本發(fā)明的方法很容易地制備P′1類似物。隨著對酶學領(lǐng)域理解的深入，大量蛋白酶的優(yōu)選酶切位點已經(jīng)被鑒別。要鑒別一個天然多肽的酶切位點，通過對其氨基酸序列進行分析就可很快很容易地完成。
在一個特殊多肽的酶切位點未知的情況下，或簡單地分析氨基酸序列難以確定的情況下，可以通過將該多肽與蛋白酶共孵育，使切割反應發(fā)生，分離被切割的多肽(如，用電泳法)，對切割后的多肽片段進行序列分析，并將測得的片段的序列與天然多肽的全序列進行比較，這樣，人們就能快速、輕易地鑒別和確認蛋白酶作用在天然多肽上的切割位點。
另一個快速確定蛋白酶的底物特異性的典型方法在PCT公開號第WO0061789號上有公開。
本發(fā)明提供了構(gòu)建蛋白酶抗性P′1類似物的一般方法。本發(fā)明涉及抗金屬蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的P′1類似物的設計和用法。例如，可以使目標類似物可以獲得針對選自下述蛋白酶的切割的抗性氨肽酶(EC3.4.11.-)、二肽酶(EC3.4.13.-)、二肽基肽酶或三肽基肽酶(EC3.4.14.-)、肽基二肽酶(EC3.4.15.-)、絲氨酸型羧基肽酶(EC3.4.16.-)、金屬蛋白羧基肽酶(EC3.4.17-)、半胱氨酸型羧基肽酶(EC 3.4.18.-)、Ω肽酶(EC3.4.19.-)、絲氨酸蛋白酶(EC3.4.21.-)、半胱氨酸蛋白酶(EC3.4.22.-)、天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23.-)、金屬蛋白酶(EC 3.4.24.-)或機理未知的蛋白酶(EC3.4.99.-)。各類蛋白酶后面的EC為International Union of Biochemistryand Molecular Biology(1984)推薦的標識，在這里用作參考。
為了進一步闡明蛋白酶抗性P′1類似物所針對的示例性的蛋白酶，無盡數(shù)的蛋白酶可以列舉，包括亮氨酰氨肽酶、膜丙氨酸氨肽酶、半胱氨酸氨肽酶、三肽氨肽酶、脯氨酰氨肽酶、氨肽酶B、谷氨酰氨肽酶、Xaa-Pro氨肽酶、細菌亮氨酸氨肽酶、梭菌氨肽酶、細胞溶膠丙氨酰氨肽酶、賴氨酰氨肽酶、Xaa-Trp氨肽酶、色氨酰氨肽酶、甲硫氨酰氨肽酶、D-立體特異性氨肽酶、氨肽酶Ey、液泡氨肽酶I、Xaa-His二肽酶、Xaa-Arg二肽酶、Xaa-甲基-His二肽酶、Cys-Gly二肽酶、Glu-Glu二肽酶、Pro-Xaa二肽酶、Xaa-Pro二肽酶、Met-Xaa二肽酶、非立體特異性二肽酶、細胞溶膠非特異性二肽酶、膜二肽酶、β-Ala-His二肽酶、二肽基肽酶I(DPP I)、二肽基肽酶II(DPP II)、二肽基肽酶III(DPP III)、二肽基肽酶IV(DPP IV)、二肽基二肽酶、三肽基肽酶I、三肽基肽酶II、Xaa-Pro二肽基肽酶、肽基二肽酶A、肽基二肽酶B、肽基二肽酶Dcp、溶酶體Pro-X羧基肽酶、絲氨酸型D-Ala-D-Ala羧基肽酶、羧基肽酶C、羧基肽酶D、羧基肽酶A、羧基肽酶B、賴氨酸(精氨酸)羧基肽酶、Gly-X羧基肽酶、丙氨酸羧基肽酶、胞壁酰五肽羧基肽酶、羧基肽酶H、谷氨酸羧基肽酶、羧基肽酶M、胞壁酰四肽羧基肽酶、鋅D-Ala-D-Ala羧基肽酶、羧基肽酶A2、膜Pro-X羧基肽酶、微管蛋白-Tyr羧基肽酶、羧基肽酶T、熱穩(wěn)定羧基肽酶1、羧基肽酶U、谷氨酸羧基肽酶II、金屬蛋白羧基肽酶D、半胱氨酸型羧基肽酶、酰基氨?；?肽酶、肽基-甘氨酰胺酶、焦谷氨酰肽酶I、β-天冬氨酰-肽酶、焦谷氨酰肽酶II、N-甲酰甲硫氨酰肽酶、蝶酰聚-γ-谷氨酸羧基肽酶、γ-谷氨酰水解酶、γ-D-谷氨酰-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸-肽酶I、糜蛋白酶、糜蛋白酶C、metridin、胰蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、纖溶酶、腸肽酶、頂體素、α-裂解-內(nèi)肽酶、谷氨酰內(nèi)肽酶、組織蛋白酶G、凝血因子VIIa、凝血因子IXa、黃瓜素、脯氨酰寡肽酶、凝血因子XIa、brachyurin、血漿激肽釋放酶、組織激肽釋放酶、胰腺彈性蛋白酶、白細胞彈性蛋白酶、凝血因子XIIa、胃促胰酶、補體成份Clr、補體成份Cls、經(jīng)典補體旁路C3/C5轉(zhuǎn)化酶、補體因子I、補體因子D、選擇性補體旁路C3/C5轉(zhuǎn)化酶、干酵母菌、下丘泌素C、賴氨酰內(nèi)肽酶、內(nèi)肽酶La、γ-腎素、venombin AB、亮氨酰內(nèi)肽酶、類胰蛋白酶、scutelarin、kexin、枯草蛋白酶、oryzin、蛋白激酶K、嗜熱霉菌素、thermitase、內(nèi)肽酶So、T-血纖溶酶原激活物、蛋白C(激活的)、胰腺內(nèi)肽酶E、胰腺彈性蛋白酶II、IgA-特異的絲氨酸內(nèi)肽酶、U-血纖溶酶原激活物、venombin A、弗林蛋白酶、成髓細胞蛋白酶、semenogelase、顆粒酶A、顆粒酶B、sreptogrisin B、谷氨酰內(nèi)肽酶、寡肽酶B、鱟凝血因子B、鱟凝集酶、omptin、阻抑物LexA、信號肽酶I、togavirin、flavirin、內(nèi)肽酶Clp、前蛋白轉(zhuǎn)化酶1、前蛋白轉(zhuǎn)化酶2、蛇毒因子V激活物、lactocipin、組織蛋白酶B、木瓜蛋白酶、ficain、糜木瓜蛋白酶、蘿蛋白酶、梭菌蛋白酶、鏈霉菌蛋白酶、actinidain、組織蛋白酶L、組織蛋白酶H、鈣蛋白酶、組織蛋白酶T、甘氨酰內(nèi)肽酶、腫瘤前凝血物、組織蛋白S、picornain3C、picornain2A、caricai、nananain、干菠蘿蛋白酶、果菠蘿蛋白酶、legumain、溶組織素、胱冬酶-1、gingipainR、組織蛋白酶K、胃蛋白酶A、胃蛋白酶B、胃亞蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶D、neopenthesin、腎素、反轉(zhuǎn)錄肽酶、阿片黑皮質(zhì)素前體轉(zhuǎn)化酶、曲霉蛋白酶I、曲霉蛋白酶II、青霉天冬蛋白酶、根酶蛋白酶、內(nèi)座殼蛋白酶、毛霉肽酶(mucoropepsin)、念珠菌肽酶(candidapepsin)、糖肽酶、rhodotorulapepsin、似絨泡菌蛋白酶(physaropepsin)、acrocylindropepsin、多孔菌蛋白酶(polyporopepsin)、pycnoporopepsin、小柱孢肽酶(scytalidopepsin)A、小柱孢肽酶B、黃桿菌蛋白酶(xanthomonapepsin)、組織蛋白酶E、barrierpepsin、信號肽酶II、假單孢菌蛋白酶、plasmepsin I、plasmepsin II、phytepsin、atrolysin A、微生物膠原酶、溶白細胞素、間質(zhì)膠原酶、neprilysin、envelysin、IgA-特異的金屬蛋白內(nèi)肽酶、前膠原N-內(nèi)肽酶、甲拌磷寡肽酶、溶神經(jīng)素、溶基質(zhì)素1、meprin A、前膠原C-內(nèi)肽酶、肽基-Lys金屬蛋白內(nèi)肽酶、蝦紅素、溶基質(zhì)素2、matrilysin、明膠酶A、氣單孢菌蛋白酶、pseudolysin、嗜熱菌蛋白酶、芽孢桿菌蛋白酶、aureolysin、coccolysin、溶真菌酶(mycolysin)、β-裂解金屬蛋白內(nèi)肽酶、肽基-Asp金屬蛋白內(nèi)肽酶、中性白細胞膠原酶、明膠酶B、利什曼蛋白酶、糖蛋白酶、自溶素、deuterolysin、serralysin、atrolysin B、atrolysin C、atroxase、atrolysin E、atrolysin F、adamalysin、horrilysin、ruberlysin、bothropasin、bothrolysin、ophiolysin、trimerelysin I、trimerelysin II、mucrolysin、pitrilysin、insulysin、O-唾液糖蛋白、內(nèi)肽酶、russellysin、線粒體中間肽酶、dactylysin、nardilysin、magnolysin、meprin B、線粒體加工肽酶、噬菌體彈性蛋白酶、絨毛膜蛋白酶L、絨毛膜蛋白酶H、tentoxilysin、bontoxilysin、寡肽酶A、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1、蛇毒溶栓酶、jararhagin、fragilysin和多催化內(nèi)肽酶復合物。
本發(fā)明的一個方面是編碼多肽類激素的蛋白酶抗性類似物的多肽序列，該序列的N末端選自NH2-Xaa-Ala-Yaa-和NH2-Xaa-Pro-Yaa-，這里Xaa和Yaa各自代表一個氨基酸殘基。在某些實施方案中，Xaa為帶有一個芳香族側(cè)鏈的氨基酸。在某些實施方案中，Xaa選自組氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。在某些實施方案中，Yaa是一個帶有酸性側(cè)鏈的氨基酸殘基。在某些實施方案中，Yaa選自天冬氨酸和谷氨酸。
通過舉例，在某些實施方案中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。在某些實施方案中，蛋白酶是二肽基肽酶。示例性的二肽基肽酶的二肽基肽酶IV(DPP IV)。DPP IV活性改變大量生物活性蛋白和生物活性多肽的生物學活性。除美國專利6,090,786中公開的DPP IV的潛在底物外，本發(fā)明還涉及GLP-1、GLP-2和GIP的類似物。在某些實施方案中，該肽類激素是哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然存在變種。在某些實施方案中，該肽類激素是天然的、或天然存在的肽類激素(野生型)的人工突變變種。因此，天然和合成的肽類激素都在考慮被修飾的肽類激素的范圍之內(nèi)。于是在某些實施方案中，本發(fā)明提供上述肽類激素的DPP IV蛋白水解抗性類似物。
為了進一步說明具有蛋白酶抗性的P′1類似物，表1提供了幾種作為DPP IV底物的人類激素清單。各肽類激素的P′1氨基酸用星號標記。代表性類似物也被列于表1中，其中X為帶有以上式II代表的側(cè)鏈的氨基酸類似物。人們能輕易地建立一個含其他絲氨酸蛋白酶底物的類似表格，并輕易地鑒別P′1氨基酸。同樣，人們能輕易地建立一個含天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、或金屬蛋白酶的底物的表格，并鑒別P′1氨基酸。
表1示例性DPP IV底物類似物
在GLP-1(7-37)、GLP-1(7-36)NH2、GLP-1(7-36)-毒蜥外泌肽尾-NH2、GLP-2、GIP和毒蜥外泌肽-3類似物的某些方案中，X為式II的氨基酸類似物，其中R1和R2獨自代表甲基、乙基或丙基。在最優(yōu)選的實施方案中，X為式II的氨基酸類似物，其中R1和R2均為甲基，R3選自-COOH或-CH2-COOH。
在某些NPY類似物的優(yōu)選實施方案中，X為式II的氨基酸類似物，在優(yōu)選實施方案中，X為式II的氨基酸類似物，其中R1和R2各自獨立地代表甲基、乙基、或丙基。在最優(yōu)選的實施方案中，X為式II的氨基酸類似物，其R1和R2二者均為甲基，R3代表-OH。
在某些胰腺多肽PP和肽YY(PYY)類似物的優(yōu)選實施方案中，X為式II的氨基酸類似物。在優(yōu)選實施方案中，X為式II的氨基酸類似物，其中R1、R2和R3各自獨立地代表甲基、乙基、或丙基。在最優(yōu)選實施方案中，X為式II的氨基酸類似物，其中R1和R2為甲基，R3代表-CH(CH3)2或-CH2CH3。
在某些毒蜥外泌肽-4類似物的優(yōu)選實施方案中，X為式II代表的氨基酸類似物。在優(yōu)選實施方案中，X為式II的氨基酸類似物，其中R1和R2各自獨立地代表甲基、乙基、或丙基，R3代表-(CH2)m-C(＝O)NH2(其中m為0、1或2)。在最優(yōu)選的方案中，X為式II的氨基酸類似物，其中R1和R2均為甲基，R3代表-CH2-C(＝O)NH2。
更通常的，本發(fā)明特別著重于制備含有Xaa-Ala-Yaa-R或Xaa-Pro-Yaa-R′氨基酸序列的肽和多肽因子類似物。
其中Xaa和Yaa代表氨基酸殘基，R和R’相互獨立地代表含1到100個氨基酸殘基的多肽鏈，其中在類似物序列的Yaa被式I或式II的代表的氨基酸殘基置換。本發(fā)明進一步著重于修飾序列不同于野生型多肽的多肽變種，以制備變種P′1類似物。這些變種至少與野生型多肽有80％、85％、90％、95％、97％、99％，或大于99％相同。
在某些實施方案中，R是含有選自下列序列的多肽GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR，GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS-NH2，GTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2，GSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD，andGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ，或與以上序列有5個或少于5個的殘基不同的序列，甚至更優(yōu)選的是不同殘基少于4個、3個或2個的序列。
在某些優(yōu)選實施方案中，R是含有選自下列序列的多肽KPDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY，EPVYPGDNATPEQMAQYAADLRRY，KPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY，或與以上序列有5個或少于5個的不同殘基的序列，甚至更優(yōu)選的是不同殘基少于4個、3個或2個的序列。
蛋白酶抗性的GHRH類似物是對本發(fā)明的一般方法和組合物的進一步說明。生長激素途徑的調(diào)節(jié)性表達為最佳線性生長所必需，也是保持碳水化合物、蛋白和脂肪代謝穩(wěn)定所必需。生長激素釋放激素(GHRH)刺激生長激素的合成和從垂體前葉脈沖式地分泌，而促生長素抑制素抑制其合成和釋放，這兩者均為下丘腦激素。生長激素增強胰島素樣生長因子-I(IGF-I)的產(chǎn)量，主要在肝臟，也在其他靶器官。
線性增長的速度和身體組分對GH或GHRH替代療法的反應在人體和家畜均有許多不同的情況，這些情況出現(xiàn)的原因各不相同。50％的人GH缺陷其GHRH-GH-IGF-I軸在功能上是完好的，但卻不能在其靶組織誘導出合適的生物學反應。GH軸不同環(huán)節(jié)上的基因缺陷產(chǎn)生的表現(xiàn)相似，在非GH缺陷的矮小癥也同樣。幾種以生長受阻為特征且其GHRH-GH-IGF-I軸功能正常的狀況，如Turner’s綜合癥、軟骨發(fā)育欠缺、節(jié)段性回腸炎(Crohn’s病)、宮內(nèi)生長遲緩、或慢性腎功能不全的情況，用GHRH或GH治療顯示可促進生長。
在老年人，GHRH-GH-IGF-I軸的功能大大減低，導致GH分泌減少和IGF-I產(chǎn)量降低。這些變化與骨骼肌組織喪失(少肌癥)、骨質(zhì)疏松、脂肪集聚和瘦肌肉組織流失有關(guān)。已有證據(jù)表明，用重組GH治療可抵消這些變化。
然而現(xiàn)有的GH治療有幾個缺陷，包括頻繁的皮下或靜脈注射、胰島素抗性和糖耐受受損。兒童使用GH易引起骨骺過早閉合和股骨頭骨骺滑脫。對牲畜，GHRH和GH刺激奶產(chǎn)量、提高從飼料到奶的轉(zhuǎn)化率、維持生長、主要增加瘦肉組織、提高整個喂養(yǎng)的效益。GHRH增加熱和冷胴體重量，降低胴體脂肪(軟組織百分比)。
雖然GHRH蛋白療法誘導和刺激GH的正常周期性分泌且?guī)缀鯚o負作用，但該激素在體內(nèi)短暫的半衰期使其必須頻繁(每天1到3次)的靜脈、皮下和鼻內(nèi)(高出300倍的劑量)用藥。所以，作為慢性治療，重組GHRH是不適用的。
GHRH的天然序列如下，其R’氨基酸(為天冬氨酸)為黑體并用星號標示。
YAD*AIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARLGHRH被脯氨酸后切割酶脯氨酰內(nèi)肽酶切割(PEP)。PEP為胞質(zhì)內(nèi)肽酶，該酶切割大量的底物，除GHRH以外還有神經(jīng)活性肽，如精氨酸加壓素、黃體生成激素釋放激素、促甲狀腺激素釋放激素、α-黑色素分泌激素、底物P、縮宮素、緩激肽、神經(jīng)降壓素、血管緊張素(Ag)I和II。
所以，在某個方案中，本發(fā)明著重于含以下式代表的氨基酸序列的GHRH類似物。
Tyr-Ala-Yaa-R其中Yaa代表含有式I或式II代表的側(cè)鏈序列的氨基酸，R代表含有以下序列的多肽鏈AIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL，或與其序列有5個或少于5個的不同殘基的序列，甚至更優(yōu)選的是不同殘基少于4個、3個或2個的序列。在某些優(yōu)選實施方案中，R1和R2各自獨立地代表甲基、乙基或丙基，更為優(yōu)選的為甲基。R3代表-COOH或-CH2COOH。
另一個例子是血管緊張素(ANG)-(1---7)，血管緊張素(ANG)-(1---7)的主要作用部位是微血管系統(tǒng)和腎，ANG-(1---7)最初在肺膜被水解為ANG-(1---5)。ANG轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑賴諾普利阻斷ANG-(1---5)和其更小的代謝物生成。因此，抗切割的ANG-(1---7)肽類似物與ACE抑制劑有著相同和/或相似的作用。換句話說，這樣的肽類似物將增加ANG-(1---7)的有效濃度和/或半衰期。
對生產(chǎn)治療疾病的藥物有著重要應用價值的另一個例子是IGFBP-3，血清和其他體液中的IGFBP-3被蛋白酶水解，被水解后的產(chǎn)物對IGF的結(jié)合力大大降低或完全喪失。在多種臨床和生理狀況包括懷孕和某些癌癥時均觀察到IFGBP-3的水解增強。因此，設計出蛋白酶抗性的IGFBP-3類似物可能在維持IGFBP-3的正常水平，如在癌癥引起IGFBP-3水解加強的情況下有特殊作用。
上述引用的例子只是為了說明問題。本發(fā)明提供了一個一般性的方法，根據(jù)該方法，基本上所有的蛋白酶底物都能通過在其酶切割位點的四取代修飾而產(chǎn)生蛋白酶抗性的P′1類似物。示例性的蛋白酶底物且經(jīng)修飾其酶切位點后可產(chǎn)生蛋白酶抗性的P′1類似物的包括但不限于腦啡肽、Leu-腦啡肽、Met-腦啡肽、血管緊張素I、血管緊張素II、血管加壓素、內(nèi)皮素、血管活性腸肽、神經(jīng)降壓素、內(nèi)啡肽、胰島素、gaarnicidin、paracelsin、δ-睡眠誘導肽、促性腺激素釋放激素、甲狀旁腺激素(1-34)、Wrighton等描述的紅細胞生成素的截斷類似物(Wrighton等，1996，Science 273458-463)、特殊的EMP-1、心鈉肽(ANP、ANF)、人腦鈉肽(hBNP)、抗菌肽、運動升壓素、europhysins、彈力素、guamerin、心房肽I、心房肽II、心房肽III、δ啡肽I、δ啡肽II、血管升壓素、緩激肽、強啡肽、強啡肽A、強啡肽B、生長激素釋放因子、生長激素、生長激素釋放肽、縮宮素、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、降鈣素基因相關(guān)肽II、生長激素釋放肽、速激肽、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、腦鈉多肽、膽囊收縮素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、diazeparn結(jié)合抑制劑片段、FMRF-酰胺、甘丙肽、胃腸釋放多肽、胃腸抑制多肽、胃泌素、胃泌素釋放肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-2、LHRH、黑色素聚集激素、促黑素(MSH)、α-MSH、嗎啡調(diào)節(jié)肽、促胃動素、神經(jīng)激肽-A、神經(jīng)激肽-B、神經(jīng)介素13、神經(jīng)介素C、神經(jīng)介素K、神經(jīng)介素N、神經(jīng)介素U、神經(jīng)肽K、神經(jīng)肽Y、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)、胰多肽、肽YY、肽組氨酸-甲硫氨酸酰胺(PHM)、腸泌素、生長抑素、底物K、促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、京都啡肽、促黑素抑制素(MIF-1)、血小板生成素類似物、特別是AF 12505、胰島素樣生長因子I(57-70)、胰島素樣生長因子I(30-41)、胰島素樣生長因子I(24-41)、胰島素樣生長因子II(33-40)、胰島素樣生長因子II(33-40)、胰島素樣生長因子II(69-84)、生長激素(GH)-釋放肽-6(GHRP-6)、β-白介素1(163-171)、β-白介素II(44-56)、白介素II(60-70)、表皮生長因子、雙價水蛭素(水蛭肽)、水蛭肽-I、C-型利尿鈉肽、鳥氨酸加壓素(也稱8-鳥氨酸-加壓素)、奧曲肽、eptifibatide、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、內(nèi)嗎啡肽-1；內(nèi)嗎啡肽-2、傷害感受肽、血管緊張素原、腎上腺髓質(zhì)素、抗心律失常肽(AA-P)、拮抗劑G、indolicidin、骨鈣蛋白、cortistatin 29、cortistatin 14、PD-145065、PD-142893、纖維蛋白原結(jié)合抑制肽、瘦體素、GR 83074、副甲狀腺激素相關(guān)多肽、血管緊張素原、亮抑酶肽、以及它們的任何修飾的或截斷的類似物。
在許多實施方案中，會選擇保留類似物的天然底物在體內(nèi)或體外的一個或多個功能。測定體內(nèi)或體外功能可用任何一個可用的適合于各特殊多肽的技術(shù)方法。確定P′1類似物是否保留了相同或相似活性的可測定的典型功能活性包括在細胞實驗或非細胞實驗中該多肽與其受體的結(jié)合能力、該多肽在與其反應的細胞中誘導變化的能力(如，增生、分化、存活、生長、遷移)、該多肽在與其反應的細胞中調(diào)節(jié)一個多個基因或蛋白表達的能力。
在某些實施方案中，該類似物與天然多肽的活性基本相似(如是天然多肽活性的80％、90％、100％、110％、120％)。在一些方案中，類似物的活性不如天然多肽(如與天然多肽約50％、60％、70％、75％活性相同)。我們注意到，如在體內(nèi)或細胞培養(yǎng)物中，活性稍低可能無礙，如果降低了的活性仍然能夠在足夠的時間內(nèi)提供一個足夠的局部濃度，蛋白酶抗性引起的半衰期延長可能能夠彌補因為構(gòu)建類似物而造成的活性下降。在另一些方案中，類似物的活性較天然多肽更高(如是天然多肽活性的130％、150％、175％、200％、300％、500％、800％或甚至1000％)。在任何前述內(nèi)容中，“活性”指天然多肽的一個或多個功能。例如，多肽的活性(如生物功能)可以是受體結(jié)合，協(xié)同因子反應、結(jié)合DNA的能力、作為轉(zhuǎn)錄激活物或抑制物的能力、參與某個特殊的信號傳導途徑的能力和影響細胞行為(如增殖、分化、存活或遷移)的能力。
這些活性可以被表示為，例如，相對結(jié)合常數(shù)(如對受體結(jié)合而言)、有效濃度(EC50)和/或有效劑量(ED50)。
示例性的P′1類似物因?qū)νǔ？梢郧懈钐烊欢嚯牡牡鞍酌府a(chǎn)生了抗性，與天然多肽相比(體外和體內(nèi))半衰期延長。但是，各種P′1類似物具有不同的半衰期(與天然多肽相比半衰期有不同變化)是可以接受的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可很容易地用標準方法對體外和/或體內(nèi)半衰期進行測定。某些方案中，在相似測定條件下，類似物的體外或體內(nèi)半衰期可以是天然多肽的0.5、0.6、0.7、0.8、.09、1.0、1.3、1.5、2、3、5、10、25、30、50、75、100或甚至超過100倍。
(b)肽類激素類似物的合成本發(fā)明中的肽可用標準的固相合成方法制備。參見，例如Stewart，J.M.等.，Solid Phase Synthesis(Pierce Chemical Co.，2d ed.1984)。
本發(fā)明中的肽可用標準固相肽合成技術(shù)制備。眾所周知，一定長度的多肽可用商業(yè)化的儀器和試劑，并根據(jù)廠家提供的說明書，通過阻斷干擾基團、保護擬反應的氨基酸、連接、去保護和戴帽未反應的殘基的步驟來制備。合適的儀器可以從，例如，AppliedBioSystems in Foster City，Calif.，或Biosearch Corporation in SanRaphael，Calif.獲得。
在一個優(yōu)選方法中，采用標準的自動固相合成方法，用帶有合適側(cè)鏈保護的叔丁氧羰基-α氨基酸進行肽合成。已完成的肽從固相支撐上取下，并用氟化氫的標準方法進行同步側(cè)鏈去保護。粗制的肽進一步用0.1％三氟乙酸(TFA)配制的乙腈梯度洗脫液在半制備的反相HPLC(Vydac C18)上純化，合成的肽用真空干燥的方法去除乙腈，然后溶于0.1％三氟乙酸水溶液中凍干。純度用分析用RP-HPLC確定。合成的肽可被凍干，然后用水或0.01M的乙酸溶解制成1-2mg/ml濃度的溶液。
當肽含有非編碼氨基酸或D-氨基酸時，前述合成方法是必需的。然而，對于基因編碼的肽，可以借助重組技術(shù)，用合成的DNA序列在商業(yè)化的表達系統(tǒng)表達。
本發(fā)明的一個方面是制備多肽類似物的方法，其中所說的多肽對選自金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶的一組蛋白酶有抗性。在一個方案中，該絲氨酸蛋白酶是一個二肽基肽酶，如一個脯氨酸后切割二肽基肽酶。在另一個方案里，該二肽基肽酶是DPP IV。在任何上述描述中，制備蛋白酶抗性肽類似物可包括用以上式I或式II代表的氨基酸殘基取代該肽類激素的一個或多個殘基。
本發(fā)明的另一個方面是制備肽類激素類似物的方法，其中該肽類激素的氨基端序列為Xaa-Ala-Yaa-R，或Xaa-Pro-Yaa-R’，序列中的Xaa和Yaa代表氨基酸殘基，R和R’各自獨立地代表1到100個氨基酸殘基(優(yōu)選為約＜90、＜80、＜70、＜60、＜50、＜40、＜30、＜20或甚至＜10個氨基酸殘基)，類似物上的Yaa被以上式I或式II代表的氨基酸殘基所取代。
正如這里所詳細概括的，本發(fā)明提供一個通用的制備蛋白酶抗性P′1類似物的方法，根據(jù)對已知底物上的某個特殊酶的酶切位點的了解，根據(jù)這里提供的制備蛋白酶抗性類似物的指導原則，可以很容易地構(gòu)建出大量的抗切割P′1類似物，例如，抗絲氨酸蛋白酶、抗金屬蛋白酶、抗天冬氨酸蛋白酶、和抗半胱氨酸蛋白酶切割的類似物。一旦制備出候選P′1類似物、可很容易地對其活性(如是否能作為蛋白酶的底物)進行測定并與天然多肽活性進行比較。
本領(lǐng)域有眾多測定候選P′1類似物是否抗蛋白水解的方法，例如，特殊蛋白酶切割P′1類似物的能力可以在體外用無細胞系統(tǒng)進行測定。在一個這樣的無細胞測定系統(tǒng)方案中，用可檢測到的標記物，如放射性物質(zhì)，對候選底物(如P′1類似物和/或天然多肽)進行末端標記，標記過的底物與蛋白酶一起孵育。一段時間后，終止反應取樣品進行電泳，其發(fā)射性條帶大小的改變提示該多肽已被蛋白酶切割，這種改變發(fā)生的比率提示了該多肽被蛋白酶切割的比率。可以將該比率與用天然多肽觀察到的比率進行比較。
為進一步說明，測試P′1類似物的典型實驗可以涉及到以下方法，天然多肽與認定的P′1類似物各自用放射性物質(zhì)標記(注意標記的目的是使多肽被切割后產(chǎn)生與標記的全長多肽在大小上有所不同的放射性片段)，標記后的天然多肽與P′1類似物與某種特殊的蛋白酶共孵育，繼共孵育后，用電泳的方法對天然多肽和P′1類似物進行分離，并分析被標記片段的遷移。人們可期待看到天然多肽(與蛋白酶共孵育前和后)的標記片段在大小上的變化，其較小的片段為被酶切割后的產(chǎn)物。然而，如果P′1類似物抗蛋白水解，在與酶進行共孵育后，要么不發(fā)生這種遷移改變，要么與天然多肽相比遷移改變的速度要慢得多。
也可用體外細胞實驗來測定蛋白酶切割P′1類似物與切割天然多肽的相對能力。在一個這樣的細胞實驗中，在表達已知蛋白酶的細胞中加入天然多肽或P′1類似物，使天然多肽或P′1類似物進入細胞中，與以上描述的無細胞實一樣，天然多肽與P′1類似物已被標記，對天然多肽或P′1類似物的切割的檢測和對比可通過提取細胞蛋白、測定標記蛋白的遷移來進行。
在另一個細胞實驗的例子里，在一種不表達已知蛋白酶的細胞中加入天然多肽或P′1類似物，使天然多肽或P′1類似物進入細胞中，在該細胞中進一步加入某種特殊蛋白酶，使該酶進入細胞內(nèi)，通過對提取的細胞蛋白中標記蛋白的遷移的檢測和對比來檢測天然多肽或P′1類似物被切割的情況。
在任何以上提到的細胞實驗中，本發(fā)明著重于使用各種原代細胞或細胞系中的任何一種，在某些例子里，選擇一種特殊的細胞或細胞系來進行體外分析可能會有優(yōu)勢，例如，在某些例子里選用一個與P′1類似物擬應用于的細胞類型很接近的細胞系進行實驗可能會有優(yōu)勢。然而，另一些例子里，在一些根據(jù)方便選用的非相關(guān)細胞或細胞系中進行候選P′1類似物的初步篩選和測試，在更特異的細胞系和必要時動物模型里進行后期的安全性和有效性實驗可能更適用。
除了無細胞檢測和細胞檢測外，P′1類似物的蛋白酶抗性可以在許多動物模型中任何一種的體內(nèi)進行。初步測試P′1類似物的蛋白水解反應可在野生型動物體內(nèi)進行，在這樣的初步測試中，P′1類似物的潛在陽性或陰性作用并不重要，重要的是P′1類似物是否能夠抗蛋白水解。一旦一個特殊的P′1類似物在任何以上描述的無細胞試驗、細胞試驗、或體內(nèi)試驗中顯示出蛋白酶抗性，可進行進一步的體外和體內(nèi)試驗以確定P′1類似物的治療效果。
其他試驗可用于評估蛋白酶抗性P′1類似物的特異功能活性，這些試驗可根據(jù)特殊的P′1類似物來選擇。例如，當多肽是一種生長因子，該生長因子類似物的功能活性可通過無細胞試驗或細胞試驗測定其與生長因子受體的結(jié)合能力并與天然多肽進行比較來檢測。當多肽是一種肽類激素，該肽類激素的功能活性可通過無細胞試驗或細胞試驗測定其與受體的結(jié)合能力并與天然多肽進行比較來檢測。當多肽是一種轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子類似物的功能活性可通過測定其與合適DNA契合序列的結(jié)合能力或是否激活含有契合序列的報告重組子，并天然多肽進行比較來檢測。在任何這些例子中，功能檢測也可在動物模型中進行。
以下說明性例子提供了測定特殊多肽的P′1類似物的潛在方法。
1.促胰島素活性試驗在某種方案中，本發(fā)明的P′1類似物是肽類激素類似物?；钚訥LP-1肽，7-34、7-35、7-36、7-37有促胰島素活性，本發(fā)明提供了制備這些活性GLP-1肽的肽類似物的方法，GLP-1肽類似物的蛋白水解抗性能夠很容易地被測定。另外，GLP-1肽類似物的功能活性可以通過檢測該肽類激素類似物的促胰島素特征來展示。促胰島素活性能夠通過，例如，將該已知多肽類似物加入到動物細胞中，或注射于動物體內(nèi)，然后分別監(jiān)測釋放到培養(yǎng)基或動物循環(huán)系統(tǒng)中的免疫反應性胰島素(IRI)。IRI的存在可通過一個特異性檢測胰島素的放射免疫試驗來檢測。
db/db小鼠是一種肥胖和糖尿病基因工程鼠品系，該db/db鼠在有高血糖和高胰島素血癥同時伴有肥胖，因此可作為肥胖2型糖尿病(NIDDM)的動物模型。可以從，例如Jackson實驗室，購買到db/db小鼠。在一個示例性實施方案中，用一個包含有肽類激素類似物或?qū)φ盏姆桨笇b/db小鼠進行治療，給藥前和給藥后的一定時間(如60分鐘)從個小鼠的下眼眶采血。血糖測定可以用數(shù)種常規(guī)方法進行，如用血糖測定儀。然后對比對照組和肽類激素類似物組的血糖水平。
外源性GLP-1類似物的代謝途徑的跟蹤也可用非糖尿病小鼠和2型糖尿病小鼠模型的任一種來進行，候選類似物的效果的確定也一樣。例如，高效液相(HPLC)、特異性放射免疫(RIAs)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的聯(lián)合使用，可檢測GLP-1類似物的完整生物學活性和其代謝。參見，實例Deacon等(1995)Diabetes 441126-1131。在給予GLP-1后，可用NH2端導向的RIA和ELISA來測定完整的肽，以檢測其在各試驗之間的濃度差異，CO2H端特異性RIA可用來檢測NH2端被截斷的代謝產(chǎn)物。如果是非類似物，皮下注射后，GLP-1呈時間依賴性地迅速降解，形成一個在HPLC與GLP-1(9-36)同洗脫的代謝產(chǎn)物，并與GLP-1有同樣的免疫反應譜。例如，給糖尿病病人皮下注射GLP-1后30分鐘(n為8)，代謝產(chǎn)物占用CO2H端RIA測得的血漿免疫反應增高的88.5+1.9％，其水平較健康受試者高(78.4+3.2％；n＝8；P＜0.05)。參見Deacon等，supra。靜脈滴注后，GLP-1也大量降解。
測定GLP-1的促胰島素釋放活性的其他方法在U.S.Patent5,545,618上有公開。
(d)藥物制劑作為治療用藥，選定的P′1類似物與藥學上可接受的載體一起制成制劑，以一個治療有效量給予受試者，該有效治療量根據(jù)不同的給藥途徑而定，如口服、靜脈、或胃腸外給藥，以將肽運達理想組織。在某些實施方案中，類似物是無熱原的，即不會導致病人體溫上升到臨床上不能接受的水平。合適的藥學上可接受的載體為那些常規(guī)用于肽類藥物的物質(zhì)，如稀釋劑、賦形劑或相似物，參考可見″Remington′s Pharmaceutical Sciences″，17th Ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.，1985中藥物制劑的一般指導原則。在本發(fā)明的一個實施方案中，該化合物被制成滴注制劑，如用作完全胃腸外液體營養(yǎng)補充治療，或注射制劑，如皮下、肌肉或靜脈注射，并且相應地制成無菌和無熱原的水溶液，選擇性地調(diào)節(jié)pH到人體可接受的范圍，如微酸性或生理pH。所以，該化合物可以與載體，如蒸餾水，生理鹽水、磷酸鹽緩沖液或5％的葡萄糖溶液一同給藥。如果愿意，P′1類似物水溶液可以結(jié)合一種可溶性增強劑，如乙酸和氫氧化鈉，來加強其效果。
本發(fā)明中的類似物可以以藥學上可接受的鹽的形式給藥。這些鹽的例子包括，但不限于，那些與有機酸(如乙酸、乳酸、馬來酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、甲磺酸、或甲苯磺酸)形成的鹽，與無機酸(如鹽酸、硫酸或磷酸)形成的鹽，與高分子酸(如鞣酸、羧甲基纖維素、多聚乳酸(polylactic)、多聚甘油酸(polyglycolic)或多聚乳酸甘油酸共聚物)形成的鹽。
本發(fā)明中的P′1類似物的有效治療劑量及其藥學上可接受的載體物質(zhì)(如碳酸鎂、乳糖、或治療性類似物可與其形成微球的磷脂)一起形成治療性組合物(如丸劑、片劑、膠囊或液體劑)，通過口服、靜脈、透皮、肺部、陰道、皮下、鼻腔、離子滲透、氣管內(nèi)、顱內(nèi)、心內(nèi)、心包內(nèi)、肌肉內(nèi)給藥給受試者。通過口服給藥的丸劑、片劑或膠囊可以用保護性物質(zhì)包裹，以保護活性組合物在胃內(nèi)停留的時間內(nèi)不受胃酸和腸酶的消化而順利到達小腸。該治療性組合物也可以生物降解或非生物降解持續(xù)釋放制劑的形式皮下或肌肉給藥。參見，例如美國專利序號3,773,919和4,767,628PCT申請?zhí)朩O 94/15587。持續(xù)給藥也可以植入或體外泵入(如INFUSAIDTM泵)的方法來完成。給藥方式可以試間歇性的，如每日注射，或連續(xù)低劑量，如持續(xù)釋放制劑。
本發(fā)明的治療或診斷組合物以足以治療或診斷疾病的量給予機體。本發(fā)明中的肽治療以上提到的疾病或紊亂的有效劑量取決于給藥的方式、受試者的年齡、體重和治療情況，最終由參與治療的醫(yī)生或獸醫(yī)決定。
以上提到的肽制劑用于治療糖代謝、脂肪代謝和進食紊亂有關(guān)疾病也在本發(fā)明關(guān)注的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點顯見于詳述和權(quán)利要求中。
(v)使用方法(1)診斷用途本發(fā)明的肽類激素類似物可以以放射性標記或非標記的形式用于診斷或治療疾病，這些疾病包括但不限于與糖代謝、脂肪代謝、進食和高血壓有關(guān)的疾病。
優(yōu)選用本發(fā)明的化合物的放射性標記復合體診斷和治療疾病。在放射性標記方案中，本發(fā)明中的化合物可用于放射性同位素指引的外科手術(shù)，如WO 93/18797 and in Woltering，等(1994)Surgery116，1139-1147中所描述的。在一個優(yōu)選實施方案中，發(fā)射γ射線的放射性核素，如99Tc，與本發(fā)明中的化合物形成的復合物被用于診斷SSTR-表達性腫瘤，繼之，發(fā)射β射線的放射性核素，如188Re或186Re，與本發(fā)明中的化合物形成的復合物被用于治療該腫瘤。
為了進行診斷，有效診斷劑量的本發(fā)明中的診斷或放射性診斷劑被使用，優(yōu)選靜脈給藥。診斷有效劑量被定義為用常規(guī)的方法，如磁源、計算機化的斷層攝影、γ閃爍成像、SPECT、PET和類似技術(shù)能夠在體內(nèi)有效定位或測到該診斷或放射性診斷劑的量。
閃爍成像用于診斷為優(yōu)選，99Tc標記的本發(fā)明中的化合物以單一單位注射劑量用于機體，本發(fā)明提供的99Tc標記化合物可以與任何常規(guī)用于靜脈注射的介質(zhì)，如生理鹽水介質(zhì)或血漿介質(zhì)一起給藥。一般來講，使用的單位劑量的放射性強度約為0.01mCi到100mCi，優(yōu)選1mCi到50mCi。注射液單位劑量的體積約為0.01mL到10mL。注射用藥后數(shù)分鐘內(nèi)體內(nèi)顯象即發(fā)生。然而，如果需要，顯象也可在該放射性標記的化合物注射病人體內(nèi)后數(shù)小時或更長的時間發(fā)生。在大多數(shù)例子中，約在0.1小時的時間內(nèi)，給藥劑量中的足夠量將聚集于成象部位以便進行閃爍攝影。依據(jù)本發(fā)明，任何閃爍攝影成像技術(shù)均可使用。
(2)治療方法多肽在體內(nèi)通常被蛋白酶水解，對于能夠被已知治療性多肽組合物治療的疾病和狀況，P′1類似物提供了一個改良的治療方法。由于治療性多肽因水解而降低或清除，及在一些情況下水解導致功能性拮抗物的產(chǎn)生，致使許多多肽藥物在治療某些特殊疾病或狀況時的安全性和有效性大打折扣。因此，抗蛋白酶的P′1類似物的方法和組合物為各種疾病和病況的治療提供了改良的方法。
為更清楚地闡明P′1類似物適用于治療各種疾病和狀況。我們提供了下述無限性例子，在某些實施方案中，本發(fā)明中的P′1類似物是肽類激素類似物。在某些實施方案中，這些肽類激素具有降低血糖水平、減肥、緩解受損的血糖耐受、抑制肝糖再生、抑制血脂水平和抑制醛糖還原酶的功能。它們因此可用于預防和/或治療充血性心衰、高血糖癥、肥胖、高脂血癥、糖尿病并發(fā)癥(包括糖尿病視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病變、白內(nèi)障、冠心病和動脈粥樣硬化)，進而治療肥胖有關(guān)的高血壓和骨質(zhì)疏松。所以，本發(fā)明的一個方面是治療疾病的方法，該方法給予病人或受試者含有效治療劑量的一個或多個肽類激素類似物，如這里公開的肽類激素類似物。
在某些實施方案中，用于治療的抗蛋白水解類似物包括活性GLP-1肽的P′1類似物，具有生物學活性的各種長度的GLP-1肽包括GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)，以下是其序列
GLP-1(7-37)HAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFI AWLVKGRG；GLP-1(7-36)HAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFI AWLVKGR(-NH2)；GLP-1(7-35)HAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFI AWLVK；andGLP-1(7-34)HAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFI AWLV.
在某些實施方案中，本發(fā)明涉及到改良血糖代謝的方法。GLP-1肽的P′1類似物可用于糖尿病病人，糖尿病是一種以胰島素分泌的相對或絕對降低、胰島素敏感性降低或胰島素抵抗引起的高血糖癥為特征的疾病，該疾病的發(fā)病和死亡主要由血管、腎、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥引起?？诜咸烟悄褪茉囼炘谂R床用于診斷糖尿病，在口服葡萄糖耐受試驗中，病人對葡萄糖裝載或攻擊的生理反應被評估。在進食葡萄糖后，評估病人對葡萄糖攻擊的生理反應，一般來講，在幾個預先設定的時間點測定病人的血糖水平(病人血漿、血清或全血中的葡萄糖濃度)。
這樣，一方面，本發(fā)明涉及到治療，涉及到蛋白酶抗性P′1類似物用于治療心臟疾病、高血糖癥、肥胖、高脂血癥、糖尿病病發(fā)癥(包括糖尿病視網(wǎng)膜病、腎病、神經(jīng)病變、白內(nèi)障、冠心病和動脈粥樣硬化)，進而治療肥胖有關(guān)的高血壓和骨質(zhì)疏松。
在某些實施方案中，該受試P′1類似物可用作治療各種心臟有關(guān)疾病的治療方案的一部分，示例性的心臟相關(guān)疾病包括心肌梗、缺血-再灌注損傷、充血性心衰、和心臟停博。該受試P′1類似物也可用于心臟疾病的預防。
在某些實施方案中，該受試類似物可用于誘導對抑郁、睡眠窒息癥、情感性分裂癥、伴有精力不集中注意力缺陷綜合癥、記憶力喪失、健忘和發(fā)作性睡病的治療和改善的喚醒。
在某些實施方案中，治療有效劑量的蛋白酶抗性GLP-2類似物可以用于患有胃腸道疾病的病人。已經(jīng)確定GLP-2可以用作營養(yǎng)劑，促進胃腸道組織的生長。GLP-2的效果尤其明顯地表現(xiàn)在促進小腸生長的方面，這里稱其為“腸道營養(yǎng)”效果。
這樣，一方面，本發(fā)明涉及到治療并涉及到使用GLP-2來促進胃腸道組織的生長和增殖，特別是小腸組織。例如，該方法可被用作創(chuàng)傷、炎癥或腸道組織切除后的治療方案的一部分，如需要強化腸道粘膜上皮的生長和修復時。
關(guān)于小腸組織，這樣的生長可以很方便地通過與未治療的對照組比較其小腸組織重量和長度的增加來測定。受試GLP-2類似物對小腸的作用也表現(xiàn)在增加隱窩加絨毛軸的高度方面。這里稱這種活性為“腸營養(yǎng)”活性。受試方法的效果也可以用增加隱窩細胞的增殖和/或降低小腸細胞的程序性死亡來檢測。這些細胞效果在空腸最為明顯，包括空腸后段，特別是空腸前段。當實驗動物用化合物治療(或通過基因工程操作后自身表達該化合物)后出現(xiàn)小腸重量明顯增加、隱窩加絨毛軸高度增加、或增加隱窩細胞的增殖增強、或小腸細胞的程序性死亡降低，該化合物被認為具有“腸營養(yǎng)作用”。一個可用于確定這種胃腸道生長的模型在US Patent 5,834,428中有公開。
通常，能夠從增加小腸組織和繼而增加小腸粘膜功能中的任一種受益的病人是該受試方法的候選者。可被治療的特殊情況包括各種形式的腹瀉，包括由小麥中的α-谷膠毒性反應引起的、以大量腸絨毛喪失為特征的乳糜性腹瀉；低γ球蛋白血癥性腹瀉，這種腹瀉常見于伴有各種常見的免疫缺陷或低γ球蛋白血癥的病人，特征是絨毛高度降低。治療效果可以通過腸道活檢檢查絨毛性狀、通過生化試驗檢測營養(yǎng)吸收、通過病人體重的增加與病情有關(guān)的癥狀的減輕來監(jiān)測。其他可以用本方法治療的情況，或可用本方法進行預防的情況包括放射性腸炎、感染或感染后腸炎、節(jié)段性回腸炎、毒素和其他化學治療劑引起的腸道損傷及短腸綜合征。
更普遍的，本發(fā)明提供了一個治療消化道疾病的治療方法。用于此處的術(shù)語“消化道”指食物通過的管道，包括胃和腸。這里所用的術(shù)語“消化道疾病”指伴有消化道粘膜的質(zhì)量或數(shù)量異常的疾病，包括潰瘍或炎癥性腸道疾??；先天的或后天獲得的消化和吸收紊亂，包括吸收不良綜合征、腸粘膜屏障功能喪失引起的疾病、蛋白喪失胃腸綜合征；潰瘍性疾病，包括胃潰瘍、十二指腸潰瘍、小腸潰瘍、結(jié)腸潰瘍和直腸潰瘍；炎癥性腸道疾病，包括食道炎、胃炎、十二指腸炎、腸炎、結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎、直腸炎、胃腸的Behcet病、放射性腸炎、放射性結(jié)腸炎、放射性直腸炎、腸炎和藥物性腸炎；吸收不良綜合征，包括基礎(chǔ)性吸收不良綜合征，如二糖-分解酶缺乏、葡萄糖-半乳糖吸收不良、果糖吸收不良，繼發(fā)性吸收不良綜合征，如由靜脈或胃腸道外營養(yǎng)或成份進食引起的消化道粘膜萎縮，小腸截斷和分流引起的疾病，如短腸綜合征，結(jié)膜穹隆(cul-de-sac)綜合征；不消化性吸收不良綜合征，如胃切除引起的疾病，如傾倒綜合征。
這里所用的術(shù)語“消化道疾病藥物”指用于消化道疾病的預防和治療的藥劑，包括如消化道潰瘍藥物、消化道炎癥治療藥物、消化道粘膜萎縮治療藥物和消化道損傷治療藥物，消化道功能改善藥物，包括胃腸道粘膜屏障功能的恢復和消化吸收功能改善藥物。潰瘍包括消化性潰瘍和腐蝕性急性潰瘍，又名急性粘膜損傷。
該方法因為促進腸粘膜增生，可用于消化和吸收不良的病理狀況的預防和治療，即粘膜萎縮的治療和預防或消化道組織發(fā)育不全和外科切除導致的組織減少的治療，同時改善消化和吸收。進一步，該方法可用于由于炎性疾病如腸炎、節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎引起的粘膜病理狀態(tài)的治療，還可用于消化道手術(shù)后引起的功能減低的治療，例如，傾倒綜合征，另可與抑制胃蠕動及食物從胃到空腸的快速移動一道用于十二指腸潰瘍的治療。進一步，胰高血糖素樣肽可被有效地用于促進外科侵入的愈合并改善消化道功能。所以，本發(fā)明也提供了消化道粘膜萎縮的治療藥物、消化道損傷的治療藥物和含有胰高血糖素樣肽作為活性成份的改善消化道功能的藥物。
另外，本發(fā)明的方法能用于轉(zhuǎn)變胰腺肽、肽YY和神經(jīng)肽Y的藥代動力學，它們都是胰腺多肽家族的成員。特別是已證明DPP IV以改變其受體選擇性的方式涉及到這些肽的加工過程，可很容易地設計出這些具有DPP IV抗性的類似物。
神經(jīng)肽(NPY)被認為作用于血管平滑肌緊張度以及血壓的調(diào)節(jié)。NPY也降低心臟收縮力。NPY也是已知的最強的食欲刺激劑(Wilding等，(1992)J Endocrinology 132299-302)。該中樞性激活進食(刺激食欲)效應主要由NYP Y1受體介導，并引起體內(nèi)脂肪聚集(Stanley等，(1989)Physiology and Behavior 46173-177)。例如，一個NPY類似物的可能用途就是生產(chǎn)刺激食欲的藥物。雖然大半個世界都在努力減肥，但也有以增肥為目的情況發(fā)生。進食障礙的病例在世界范圍內(nèi)有增高趨勢。隨時間推移，患進食障礙的個體出現(xiàn)病理性食欲喪失，這種食欲喪失使再進食變得極端困難，這種進食困難常常在患者的體重低至甚至威脅生命的水平時仍然持續(xù)。因此，食欲刺激劑的使用將極大地加強健康護理者鼓勵和支持嚴重營養(yǎng)不良的進食障礙病人再進食的能力。
試圖在長時間營養(yǎng)不良后再進食遭遇困難的個體不只限于進食障礙者。任何原因引起的營養(yǎng)不良都可導致嚴重的食欲壓抑，這給快速和容易地補充適當?shù)臓I養(yǎng)給這些患者設置了障礙。刺激食欲的藥物在治療營養(yǎng)不良的患者方面將會有很多用途。
食欲喪失和消耗綜合征常與其他疾病和狀況有關(guān)，例如，各種癌癥患者和AIDS患者常伴有消耗。這種嚴重的體重減輕和肌肉組織喪失可導致各種其他的并發(fā)癥，包括能量喪失和免疫系統(tǒng)的進一步抑制。因此，有助于克服伴隨其他疾病的食欲喪失和消耗的療法和治療將極大地改善那些正在與各種疾病搏斗的病人的生活質(zhì)量。
最后的關(guān)于使用藥物來刺激食欲和增加體重的例子涉及到農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，這些藥物將有助于飼養(yǎng)動物，如商用牲畜，使它們有較高的平均重量和平均脂肪含量。例如，這樣的治療劑可通過喂食和喂水的方式給予牛、豬、雞、羊、火雞、山羊、水牛、鴕鳥等，以生產(chǎn)出較大的動物在食品工業(yè)中銷售。
肽YY(PYY)和胰腺肽(PP)涉及到進食障礙、胃腸道紊亂和胰腺腫瘤(參見U.S.Patent 5,574,010)。
DPP IV已證明與生長激素釋放激因子(GHRF)有關(guān)聯(lián)，GHRF是一類同源肽包括胰高血糖素、腸泌素、血管活性腸肽(VIP)、組氨酸異亮氨酸肽(PHI)、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)、抑胃肽(GIP)和毒蜥皮肽(Kubiak等(1994)Peptide Res 7153)家族中的成員。GHRF由下丘腦分泌，刺激垂體前葉釋放生長激素(GH)。因此，該方法可用于改善對某些生長激素缺陷的兒童的臨床治療，在成人的臨床治療方面可改善營養(yǎng)和改變身體組成(肌肉對脂肪)。該方法也可用于動物方面，如提高奶產(chǎn)量和生產(chǎn)產(chǎn)量更高、瘦肉更多的牲畜。
本發(fā)明著重于在治療方法中使用P′1類似物，方法中P′1類似物可單獨構(gòu)成治療方案，也可是一個或多個P′1類似物作為一個更復雜的多因子治療方案的一部分。例如，在治療糖尿病和/或糖尿病并發(fā)癥的方法中，本發(fā)明著重于給予病人P′1類似物，如GLP-1類似物。本發(fā)明進一步考慮在某些情況下，可能優(yōu)選地給予病人一個以上的P′1類似物。如治療方法可含有給予兩個或兩個以上的P′1類似物。這些類似物可以是同一多肽類似物(如GLP-1的兩個不同類似物)，或不同多肽的類似物。進一步，本發(fā)明認為可將一個或多個P′1類似物用作一個復雜治療方案的一部分。在治療糖尿病和糖尿病并發(fā)癥時，示例性的治療方案可以包括給予一個或多個P′1類似物、給予胰島素并調(diào)節(jié)飲食和鍛煉。
在進一步的多方面治療方案中，本發(fā)明著重于給予一個或多個P′1類似物和一個或多個抑制內(nèi)源性切割天然蛋白的特殊酶活性的抑制劑。在GLP-1的例子中，示例性的方法將含給予一個或多個肽類似物及一個或多個DPP IV抑制劑。一種特定酶的抑制劑可以是特異性的(如只調(diào)節(jié)DPP IV活性的抑制劑)或非特異性的(如調(diào)節(jié)多種絲氨酸蛋白酶的抑制劑)。另外，本發(fā)明還著重于給予一個或多個肽類似物及一個或多個降解內(nèi)源性切割天然蛋白的特定酶的酶。在使用GLP-1的例子中，示例性的方法將含給予一個或多個肽類似物及一個或多個降解DPP IV的酶。這樣的酶可以是特異性的(如一種只降解DPP IV的酶)或該酶可以降解多種其它蛋白(如可以降解多種絲氨酸蛋白的酶)。
(f)商業(yè)方法本發(fā)明的其它方面提供了某種進行商業(yè)運作的方法。特別是實踐本發(fā)明的方法可鑒別某些肽酶抗性的P′1類似物，如肽類激素類似物。該技術(shù)步驟與其他步驟之一的結(jié)合，提供了進行制藥、農(nóng)用化學品、生物技術(shù)、或優(yōu)選生命科學商業(yè)活動的新方法。例如本發(fā)明中的P′1類似物可在多種疾病模型中測試其作為藥物的有效性，在所得制劑配制、包裝并隨后上市用于疾病治療之前，需對潛在的治療組合物進行毒性和其他安全性方面的試驗。換言之，這種制劑的開發(fā)和上市權(quán)或這些步驟的實施權(quán)可以授權(quán)給第三方考慮。在本發(fā)明的某些其他方面，這樣鑒別的P′1類似物可用于提供給第三方考慮的信息中，以使其獲得對該P′1類似物在生物或治療方面的功效和負作用的更好了解。
在某些實施方案中，初步鑒別的P′1類似物可用于進一步優(yōu)化，如進一步改良前導類似物的結(jié)構(gòu)。這種優(yōu)化可引致發(fā)展出具有最大蛋白水解抗性，并結(jié)合有藥學上的其他如溶解、滲透、生物利用、毒性、致突變和藥代方面所需的特性的類似物。
對前導類似物的結(jié)構(gòu)修飾主要針對以上列舉的參數(shù)進行。然而這種修飾必須考慮到對類似物的效能和活性的可能影響。例如當一個前導類似物在動物實驗中顯示毒性較大，可在保留所需的抗蛋白酶特性的前提下對該類似物進行降低毒性的修飾。
候選類似物(無論是否進行了修飾以改良體內(nèi)性狀的類似物)或類似物的聯(lián)合必須進行藥效和毒性試驗。這樣的治療概況研究在制藥領(lǐng)域被廣泛應用。在進行人體試驗之前，大量深入的治療概況研究(臨床前研究)需要完成，以確立初步的安全和效果參數(shù)。臨床前研究建立該藥物的作用機理，通過體外(如試管、燒杯、培養(yǎng)皿等)和動物試驗研究其生物利用度、吸收、分布、代謝和消除。動物試驗用于測試該藥物能否提供所需的結(jié)果。使用不同劑量的藥物來檢測其效果、確認其可能發(fā)生的有害負作用并評估毒性。
簡短地說，本領(lǐng)域技術(shù)人員應該知道，候選蛋白酶抗性類似物的鑒別是研發(fā)一個用于治療的藥物制劑的第一步。一定量的含有已知P′1類似物的藥物制劑用于某種狀況和疾病的治療必須既安全又有效。常規(guī)用于本領(lǐng)域的早期藥物試驗，幫助回答潛在藥物的安全和有效性方面的問題。在P′1類似物特別案例中，其藥物制劑的有效性可很容易地在細胞培養(yǎng)物中進行初步評價，然后在小鼠和大鼠模型中進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地選擇出P′1類似物將要針對的特殊疾病的合適細胞和動物模型。簡短地說，不同劑量的所述藥物制劑可以以不同的時間表給予小鼠或大鼠。給藥途徑應該根據(jù)類似物的特殊性質(zhì)和P′1類似物將要導入的細胞類型來進行選擇。對照小鼠可給予安慰劑(如載體或賦形劑)。
在一個實施方案中，治療概況研究包括類似物在細胞和動物體的毒性試驗；對候選類似物進行藥代動力學和代謝分析；在動物疾病模型中確定其有效性。在某些例子中，方法包括分析結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系，根據(jù)有效性、安全性和藥代動力學優(yōu)化前導類似物。這些步驟的目標是選出一個候選類似物進行臨床前研究，進而在人體試驗前向FDA提出新藥研究申請(“IND”)。
對前導類似物進行優(yōu)化和進行治療概況研究，一個目的就是要開發(fā)對某種蛋白酶有抗性且用藥后負作用最小的P′1類似物。類似物在體外使用時，示例性類似物不應該對細胞培養(yǎng)物有額外毒性、不應該致細胞培養(yǎng)物突變、不應該對細胞培養(yǎng)物有致突變作用。在體內(nèi)使用時，示例性類似物不應該有額外毒性(當用于人體是應該只有能夠耐受的毒性)、不應該有致突變作用及不應該有致癌性。
毒性研究指對有效治療劑量的藥物制劑用于機體后可能發(fā)生的有害負作用進行評估。負作用可能有害也可能無害，一個與藥物制劑有關(guān)的負作用可否接受由食品和藥物監(jiān)督管理局在正常審批過程中決定。該決定不是一成不變的(hard and fast)，被認為可接受的負作用因影響因素而變化，這些因素包括(a)被治療的病情的嚴重程度，(b)其他可用的治療和與這些治療有關(guān)的負作用。例如，術(shù)語癌癥包含一組復雜的涉及到異常調(diào)節(jié)的細胞生長、增殖和分化的疾病狀態(tài)。作用仍被認為是可以接受的。在本發(fā)明中，一個負作用的嚴重與否取決于被治療的狀況和其他可用的治療該狀況的方法。
毒性試驗可與有效性試驗串連進行，給予有效治療劑量的小鼠同時可用來監(jiān)測制劑的負作用。
一個或多個在動物體內(nèi)證明安全和有效的蛋白酶抗性P′1類似物能被制成藥物制劑，然后這樣的制劑可上市、流通和銷售。示例性的P′1類似物和這些類似物的藥物制劑可以單獨銷售，或制成藥包/或藥盒銷售。進一步，在上述提到的任一方面，對一個或多個P′1類似物設計的商業(yè)運作方法可任選地包括編制病人和/或病人的醫(yī)療保險公司帳單的體系，和從病人和/或病人的保險公司收取適當?shù)膬敻扼w系。
實施例以下實施例用于說明而非限制。
實施例1蛋白酶抗性GLP-1類似物給予GLP-1治療是糖尿病的候選治療方法。然而，阻礙給予GLP-1治療的一個障礙是GLP-1在體內(nèi)被DPP IV迅速降解。DPP IV的切割位點在GLP-1N端的丙氨酸和谷氨酸之間，先前的研究表明這種切割給予外源性GLP-1后極短的時間內(nèi)就可發(fā)生(圖1)。
為得到抵抗蛋白水解作用的肽類似物，我們構(gòu)建了一個在GLP-1的P′1位點含四取代的類似物。在以下實施例中用到GLP1(7-37)。簡短地講，我們在GLP-1的P′1位的谷氨酸上進行了取代。兩種所做和所試驗過的取代是3-二甲基-天冬氨酸和3-丁基-甲基-甘氨酸。所得的類似物被命名為GLP-1(3DMA)(其中P′1位取代是3-二甲基-天冬氨酸)和GLP-1(BM)(其中P′1位取代是3-丁基-甲基-甘氨酸)。
圖2是證實GLP-1(3DMA)和GLP-1(BM)與天然GLP-1相比具有抗DPP IV切割抗性的實驗的概括。然而，最希望得到的肽類似物不僅要抗蛋白水解，而且還保留了天然肽的所有或大部分生物學活性。于是，我們進行了一系列實驗來確定這些具有很強抗DPP IV降解能力的GLP-1類似物是否也保留了天然GLP-1的生物學活性。
實施例2蛋白酶抗性GLP-1類似物保留了天然GLP-1的功能活性。
我們進行了一系列實驗來測試GLP-1(3DMA)和GLP-1(BM)與天然GLP-1比較的功能活性。圖3-4概括了這些實驗的結(jié)果。簡短地講，我們檢測了GLP-1的兩個功能性質(zhì)GLP-1與其受體的結(jié)合和通過cAMP的產(chǎn)生來測定的信號傳導。圖3概括了測試GLP-1(3DMA)活性的試驗。左邊的圖比較了受體結(jié)合動力學。我們注意到，GLP-1(3DMA)保留了與GLP-1受體結(jié)合的能力。另外我們注意到，與天然多肽相比，雖然結(jié)合力不完全相同，但相似。
右邊的圖是進一步的分析，它概括了確定GLP-1(3DMA)是否能夠激起與天然GLP-1相似的信號的實驗。用編碼人GLP-1受體的cDNA瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞(接近106/10cm板)，轉(zhuǎn)染后一天，用胰酶將細胞消化，接種24孔板(密度接近105/孔)。轉(zhuǎn)染后兩天，分別用天然GLP-1(0.3μM)和GLP-1(3DMA)(10μM)與細胞在室溫下孵育1小時，并設無二者的對照孔。用閃爍放射免疫親近法檢測細胞裂解物中與受體介導的信號相關(guān)的cAMP含量。如圖3所示，GLP-1(3DMA)通過GLP-1受體使信號增強到與天然GLP-1無差別的程度。圖4概括了對GLP-1(BM)活性進行檢測的類似實驗。簡短地講，用編碼人GLP-1受體的cDNA瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞(接近106/10cm板)，轉(zhuǎn)染后一天，用胰酶將細胞消化，接種24孔板(密度接近105/孔)。轉(zhuǎn)染后兩天，分別用天然GLP-1(0.3μM)和GLP-1(BM)(10μM)與細胞在室溫下孵育1小時，并設無二者的對照孔。用閃爍放射免疫親近法檢測細胞裂解物中與受體介導的信號有相關(guān)關(guān)系的cAMP含量。如圖4所示，GLP-1(BM)通過GLP-1受體使信號增強到與天然GLP-1無差別的程度實施例3叔-亮氨酸取代的GLP-1類似物抵抗DPP IV的降解作用實驗1和實驗2提供的數(shù)據(jù)證明在GLP-1的P′1位點上的兩種不同取代生成了蛋白酶抗性肽類似物。我們還另外證明P′1位點上的第三種取代也能產(chǎn)生蛋白酶抗性肽類似物。簡短地講，用叔-亮氨酸取代(TLE)了GLP-1(7-37)的P′1位上的谷氨酸，并對DPP IV切割這種肽類似物的能力進行了測試。
圖5顯示了用DPP IV處理GLP-1(7-37)兩小時(下色譜圖)后與未用蛋白酶處理的GLP-1(7-37)(上色譜圖)的HPLC/MS分析結(jié)果。正如所預期的那樣，DPP IV處理導致GLP-1出現(xiàn)時間依賴性降解。
圖6顯示的是TLE修飾的GLP-1(7-37)類似物的HPLC/MS分析。用人DPP IV處理TLE修飾的GLP-1類似物兩小時，對比該類似物與未用DPP IV處理的類似物在時間過程中的降解。層析結(jié)果的比較(注上圖為未被處理的肽類似物，下圖為被處理的類似物)證明TLE修飾的GLP-1類似物可抵抗DPP IV的降解。
實施例4P′1位上的各種取代可產(chǎn)生對其它蛋白酶的抗性上述實施例提供了大量證據(jù)證明P′1位上的各種取代可產(chǎn)生對絲氨酸蛋白酶DPP IV的抗性。但是，這種P′1位的四取代方法產(chǎn)生的蛋白酶抗性不是DPP IV底物特異的。我們也已證明在模型底物的P′1位進行四取代獲得了對凝血酶切割的抗性。雖然凝血酶同為絲氨酸蛋白酶，但其識別的切點與DPP IV不同，此處概括的結(jié)果提示，本發(fā)明中構(gòu)建P′1類似物以獲得抗任何各種蛋白酶的降解的方法有著廣泛的應用范圍。
圖7概括了在凝血酶的模型底物的P′1位進行叔-亮氨酸取代從而獲得抗蛋白水解抗性的證明實驗。簡短地講，WALAPRSFA肽是凝血酶的模型底物。凝血酶的切點在精氨酸殘基后。因此，該模型肽的絲氨酸殘基是P′1位的。
WALAPR↓SFA上述示例中，P′1位的絲氨酸用黑體字標明，箭頭代表凝血酶在精氨酸后的切割位點。
為測試P′1位四取代引起抗凝血酶水解的能力，我們制備了在P′1位含叔-亮氨酸(TLE)的模型肽。該模型肽類似物序列如下，其中X代表TLE取代。
WALAPRXFA為對比模型肽類似物與天然模型肽被凝血酶消化的情況，這些肽被10nM凝血酶在0.1M HEPES pH 8，0.14M NaCl，5mM CaCl2，0.5％PEG6000中消化4小時，消化完畢，比較消化和未消化的肽的C18反相HPLC結(jié)果，各個層析主峰的質(zhì)譜結(jié)果見圖7。如圖7所示，未經(jīng)修飾的肽被凝血酶有效切割，生成切割產(chǎn)物WALAPR。相反，TLE取代的肽類似物在此種條件下不能被凝血酶切割。
實施例5穩(wěn)定二甲基天冬氨酸GLP-1類似物的體內(nèi)結(jié)果圖8顯示使用三個不同劑量(40μg，4μg，0.4μg)的毒蜥外泌肽-4的糖尿病小鼠與生理鹽水對照溶液的糖尿病小鼠相比體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖9顯示使用40μg劑量的GLP-1(TPA1B4)類似物的糖尿病小鼠與生理鹽水對照或GLP-1對照的糖尿病小鼠相比體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖10顯示使用三個不同劑量(800μg，80μg，8μg)的GLP-1(TPA1B4)的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠相比體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
GLP-1(TPA1B4)類似物是帶有C末端酰胺和第9位β-二甲基天冬氨酸殘基的GLP-1殘基7-36片段類似物，TPA1B4的序列是HAXGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2體內(nèi)實驗用雌性5-7周齡的BKS.Cg-m+/-LePr(db)/J鼠進行，實驗開始前用兩周時間將小鼠調(diào)節(jié)到自然生長(vivarium)狀態(tài)，小鼠在加壓、單獨通氣的籠子中飼養(yǎng)，用標準的嚙齒類動物食物喂養(yǎng)，隨意進食和飲水。血糖用ThereaSense Freestyle監(jiān)測儀測定。每次測定時用針將小鼠尾靜脈劃破，采血一小滴(約10μL)。各指示劑量的GLP-1類似物(TPA1B)和毒蜥外泌肽-4用0.2ml磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解后腹腔內(nèi)注射。本實驗的鹽水對照組注射0.2mlPBS。血糖濃度分別在t＝0、30分、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時(和6小時)。圖8和圖9的為5只小鼠的平均值。
圖11顯示使用20mg/kg劑量的GLP-1類似物(TPA1B4)的糖尿病小鼠與生理鹽水對照或GLP-1對照的糖尿病小鼠相比體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖12顯示使用20mg/kg劑量的GLP-1類似物(TPA1B4)的糖尿病小鼠與生理鹽水對照或GLP-1對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖水平的比較。
雌性5-7周齡的BKS.Cg-m+_LePr(db)/J鼠進行，實驗開始前用兩周時間將小鼠調(diào)節(jié)到自然生長(vivarium)狀態(tài)，小鼠在加壓、單獨通氣的籠子中飼養(yǎng)，用標準的嚙齒類動物食物喂養(yǎng)，隨意進食和飲水。血糖用ThereaSense Freestyle監(jiān)測儀測定。每次測定時用針將小鼠尾靜脈劃破，采血一小滴(約10μL)。小鼠從給藥前兩小時開始禁食直至實驗結(jié)束。GLP-1類似物(TPA1B)和GLP-1用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解后，腹腔內(nèi)注射0.4ml指示劑量給藥。本實驗的鹽水對照組注射0.4ml PBS。血糖濃度分別在t＝0、30分、1小時、4小時測定。給出的值為10只小鼠的平均值。
圖13顯示使用三個不同劑量(8μg，0.8μg，0.08μg)的毒蜥外泌肽-4的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖14顯示使用800μg劑量的GLP-1的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
圖15顯示使用8μg和0.8μg兩個劑量的GLP-1類似物(P1732)的糖尿病小鼠與生理鹽水對照的糖尿病小鼠體內(nèi)不同時間血糖變化的百分比。
GLP-1類似物P1732是GLP-1殘基7-36的類似物，該類似物結(jié)合了尾部帶有C末端酰胺的毒蜥外泌肽-4的一部分、且第9位上有一個β-二甲基天冬氨酸殘基。P1732序列如下HAXGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS-NH2體內(nèi)實驗用雌性5-7周齡的BKS.Cg-m+/_LePr(db)/J鼠進行，實驗開始前用兩周時間將小鼠調(diào)節(jié)到自然生長狀態(tài)，小鼠在加壓、單獨通氣的籠子中飼養(yǎng)，用標準的嚙齒類動物食物喂養(yǎng)，隨意進食和飲水。血糖用ThereaSense Freestyle監(jiān)測儀測定。每次測定時用針將小鼠尾靜脈劃破，采血一小滴(約10μL)。小鼠從給藥前兩小時開始禁食直至實驗結(jié)束。GLP-1類似物(P1732)用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解后，腹腔內(nèi)注射0.4ml指示劑量給藥，本實驗的鹽水對照組注射0.4ml PBS。分別在用藥前和用藥后的30、60和240分鐘測定血糖。給出的P1732數(shù)據(jù)為5只小鼠的平均值、鹽水對照為10只小鼠平均值。
圖16顯示的是式(II)的示例性實施方案，其中天然存在的氨基酸在β位(3-位)被R1和R2修飾，這里R1和R2為獨立的低級烷基或鹵素。在優(yōu)選實施方案中，R1和R2二者皆為低級烷基。在更優(yōu)選的實施方案中，R1和R2獨立為甲基、乙基或丙基。在最優(yōu)選的實施方案中，R1和R2二者都是甲基。
所有出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^整體引用結(jié)合到本文中，其程度與每個出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^整體引用具體而單獨指明地結(jié)合到本文中相同。
等價物或等同方法本領(lǐng)域技術(shù)人員用常規(guī)的實驗就能識別或確定無數(shù)的這里描述的化合物的等價物及其使用方法的方法。這樣的等價物或等同方法被認為在本發(fā)明的范圍內(nèi)并被下述權(quán)利要求所保護。
序列表<110>塔夫茨大學信托人(Trustees of Tufts College)W.W.巴喬夫欽(Bachovchin，William W.)H.-S.賴(Lai，Hung-sen)D.G.桑福德<120>肽和多肽藥物的穩(wěn)定類似物<130>TUU-PWO-011<140>PCT/US04/15488<141>2004-05-17<150>US 60/471,411<151>2003-05-15<160>36<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>30<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>2<211>30<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>2His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>3<211>33<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>3His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn1 5 10 15Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30Asp
<210>4<211>42<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>4Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys1 5 10 15Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys20 25 30Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln35 40<210>5<211>36<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>5Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp1 5 10 15Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr20 25 30Arg Gln Arg Tyr35<210>6<211>27<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>6Ala Pro Leu Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln1 5 10 15MetAla Gln Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr20 25<210>7<211>36<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>7Tyr Pro Ile Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu1 5 10 15Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr20 25 30Arg Gln Arg Tyr35<210>8<211>39<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>8His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Glu Met Glu Glu1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>9<211>39<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>9His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>10<211>31<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>10His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>11<211>30<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>11His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>12<211>33<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3
<223>Xaa＝任何氨基酸<400>12His Ala Xaa Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn1 5 10 15Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr20 25 30Asp<210>13<211>42<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>13Tyr Ala Xaa Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys1 5 10 15Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys20 25 30Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln35 40<210>14<211>36<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>14Tyr Pro Xaa Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp1 5 10 15Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr20 25 30Arg Gln Arg Tyr35<210>15<211>27<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>15Ala Pro Xaa Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln1 5 10 15
Met Ala Gln Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr20 25<210>16<211>36<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>16Tyr Pro Xaa Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu1 5 10 15Leu Asn Arg Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr20 25 30Arg Gln Arg Tyr35<210>17<211>39<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>17His Gly Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Glu Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>18<211>39<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>18His Ser Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser35<210>19
<211>27<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>19Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala1 5 10 15Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25<210>20<211>36<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>20Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala1 5 10 15Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser Ser Gly Ala20 25 30Pro Pro Pro Ser35<210>21<211>27<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>21Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala1 5 10 15Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25<210>22<211>30<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>22Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Ala1 5 10 15Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr Asp20 25 30<210>23<211>39<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>23Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys Ile His Gln1 5 10 15Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys Lys Asn Asp20 25 30Trp Lys His Asn Ile Thr Gln35
<210>24<211>33<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>24Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg1 5 10 15Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg20 25 30Tyr<210>25<211>24<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>25Glu Pro Val Tyr Pro Gly Asp Asn Ala Thr Pro Glu Gln Met Ala Gln1 5 10 15Tyr Ala Ala Asp Leu Arg Arg Tyr20<210>26<211>33<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>26Lys Pro Glu Ala Pro Gly Glu Asp Ala Ser Pro Glu Glu Leu Asn Arg1 5 10 15Tyr Tyr Ala Ser Leu Arg His Tyr Leu Asn Leu Val Thr Arg Gln Arg20 25 30Tyr<210>27<211>44<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>27Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln1 5 10 15Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly20 25 30Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu35 40<210>28<211>41<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>28Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln Leu Ser Ala1 5 10 15
Arg LysLeu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly Glu Ser Asn20 25 30Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu35 40<210>29<211>31<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>29His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210>30<211>30<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>30His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>31<211>28<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>31His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys20 25<210>32<211>27<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>32His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val20 25<210>33<211>9<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<400>33Trp Ala Leu Ala Pro Arg Ser Phe Ala1 5
<210>34<211>9<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>7<223>Xaa＝任何氨基酸<400>34Trp Ala Leu Ala Pro Arg Xaa Phe Ala1 5<210>35<211>30<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>35His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210>36<211>39<212>PRT<213>人(Homo Sapiens)<220>
<221>ACT_SITE<222>3<223>Xaa＝任何氨基酸<400>36His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser20 25 30Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser3權(quán)利要求
1.一種生物活性肽或多肽因子的蛋白酶抗性類似物，該肽或多肽因子的氨基酸序列包括在生理條件下被靶蛋白酶切割的蛋白酶底物序列，其中所述類似物的氨基酸序列與所述肽或多肽因子相對應，但所述蛋白酶底物序列的P′1殘基被具有四取代的Cβ碳的氨基酸類似物所替代，相對所述肽或多肽因子來說，該P′1殘基替代降低了該類似物對所述靶蛋白酶切割的敏感性。
2.權(quán)利要求1的蛋白酶抗性類似物，其中所述氨基酸類似物為式II所代表的類似物 其中R1和R2獨立選自低級烷基或鹵素；R3選自低級烷基、芳基、羥基、-(CH2)mCOOH、-(CH2)mNH2、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2、-SH或-(CH2)m-S-CH3；且m為0、1或2。
3.權(quán)利要求2的蛋白酶抗性類似物，其中R1和R2獨立選自甲基、乙基或丙基。
4.權(quán)利要求2的蛋白酶抗性類似物，其中R1和R2均為甲基。
5.權(quán)利要求2的蛋白酶抗性類似物，其中R3選自低級烷基、苯基、羥苯基、吲哚、咪唑、羥基、-COOH、-CH2COOH、-CH2CH2-NC(＝NH)NH2、-CH2C(＝O)NH2、-CH2CH2C(＝O)NH2、-SH或-CH2SCH3。
6.權(quán)利要求2的蛋白酶抗性類似物，所述蛋白酶抗性類似物保留了至少50％的所述活性肽或多肽因子的生物學活性。
7.權(quán)利要求2的蛋白酶抗性類似物，其中靶蛋白酶為絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶。
8.權(quán)利要求2的蛋白酶抗性類似物，其中所述生物學活性多肽因子選自GLP-1、GLP-2、GIP、NPY、PP和PYY。
9.權(quán)利要求2的蛋白酶抗性類似物，其中所述生物學活性多肽因子選自腦啡肽、Leu-腦啡肽、Met-腦啡肽、血管緊張素I、血管緊張素II、血管加壓素、內(nèi)皮素、血管活性腸肽、神經(jīng)降壓素、內(nèi)啡肽、胰島素、grarnicidin、paracelsin、δ-睡眠誘導肽、促性腺激素釋放激素、人甲狀旁腺激素(1-34)、Wrighton等描述的截斷的紅細胞生成素類似物(Wrighton等，1996，Science 273458-463)、特殊的EMP-1、心鈉肽(ANP、ANF)、人腦鈉肽(hBNP)、抗菌肽、運動升壓素、neurophysins、彈力素、guamerin、心房肽I、心房肽II、心房肽III、δ啡肽I、δ啡肽II、血管升壓素、緩激肽、強啡肽、強啡肽A、強啡肽B、生長激素釋放因子、生長激素、生長激素釋放肽、縮宮素、降鈣素、降鈣素基因相關(guān)肽、降鈣素基因相關(guān)肽II、生長激素釋放肽、速激肽、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、腦鈉多肽、膽囊收縮素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、diazeparn結(jié)合抑制劑片段、FMRF-酰胺、甘丙肽、胃腸釋放多肽、胃腸抑制多肽、胃泌素、胃泌素釋放肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽-1、胰高血糖素樣肽-2、LHRH、黑色素聚集激素、促黑素(MSH)、α-MSH、嗎啡調(diào)節(jié)肽、促胃動素、神經(jīng)激肽-A、神經(jīng)激肽-B、神經(jīng)介素13、神經(jīng)介素C、神經(jīng)介素K、神經(jīng)介素N、神經(jīng)介素U、神經(jīng)肽K、神經(jīng)肽Y、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(PACAP)、胰多肽、肽YY、肽組氨酸-甲硫氨酸酰胺(PHM)、腸泌素、生長抑素、底物K、促甲狀腺激素釋放激素(TRH)、京都啡肽、促黑素抑制素(MIF-1)、血小板生成素類似物、特別是AF 12505、胰島素樣生長因子I(57-70)、胰島素樣生長因子I(30-41)、胰島素樣生長因子I(24-41)、胰島素樣生長因子II(33-40)、胰島素樣生長因子II(33-40)、胰島素樣生長因子II(69-84)、生長激素(GH)-釋放肽-6(GHRP-6)、β-白介素1(163-171)、β-白介素II(44-56)、白介素II(60-70)、表皮生長因子、雙價水蛭素(水蛭肽)、水蛭肽-I、C-型利尿鈉肽、鳥氨酸加壓素(也稱8-鳥氨酸-加壓素)、奧曲肽、eptifibatide、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、內(nèi)嗎啡肽-1；內(nèi)嗎啡肽-2、傷害感受肽、血管緊張素原、腎上腺髓質(zhì)素、抗心律失常肽(AA-P)、拮抗劑G、indolicidin、骨鈣蛋白、cortistatin 29、cortistatin 14、PD-145065、PD-142893、纖維蛋白原結(jié)合抑制肽、瘦體素、GR 83074、副甲狀腺激素相關(guān)多肽、血管緊張素原、亮抑酶肽，及其任何修飾的或截斷的類似物。
10.一種生物活性肽或多肽因子的蛋白酶抗性類似物，該肽或多肽因子的氨基酸序列包括在生理條件下被靶脯氨酸后切割蛋白酶切割的蛋白酶底物序列，其中所述類似物的氨基酸序列與所述肽或多肽因子序列相對應，但所述蛋白酶底物序列的P′1殘基被式I的氨基酸類似物替代 其中，R1和R2獨立選自低級烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、烷氧基、羧基、氨基甲?；?、羰基、鹵素、羥基、胺或氰基，或R1和R2一起形成4-7個原子的環(huán)；R3選自低級烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基、雜芳基、氨基、烷氧基、鹵素、羧基、氨基甲?；?、羰基、氰基、硫代烷基、酰基氨基、酰氨基、氰基、硝基、疊氮基、硫酸酯基、磺酸酯基、亞磺酰氨基、-(CH2)mR4、-(CH2)mOH、-(CH2)mCOOH、-(CH2)mO-低級烷基、-(CH2)mO-低級烯基、-(CH2)nO(CH2)mR4、-(CH2)mSH、-(CH2)mS-低級烷基、-(CH2)mS-低級烯基、-(CH2)nS(CH2)m-R4、(CH2)mNH2、(CH2)mN-C(＝NH)NH2、-(CH2)mC(＝O)NH2或-(CH2)mNH2；R4每次出現(xiàn)獨立代表芳基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或雜環(huán)；m為0、1或2；且n為0、1或2。
11.一種藥物制劑，所述藥物制劑包含權(quán)利要求1-10中任一項的蛋白酶抗性類似物。
12.一種封裝的藥物制劑，所述藥物制劑包含權(quán)利要求1-10中任一項的蛋白酶抗性類似物與藥學上可接受的賦形劑、標簽和/或病人用藥說明書。
13.一種封裝的獸用藥物制劑，所述獸用藥物制劑包含權(quán)利要求1-10中任一項的蛋白酶抗性類似物與可接受的賦形劑、標簽和/或動物用藥說明書。
14.一種治療或預防給予蛋白酶抗性類似物將會有益的疾病的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求1-10中任一項的生物活性肽或多肽因子。
15.權(quán)利要求14的方法，其中蛋白酶抗性類似物為GLP-1、GIP或PYY類似物，所述疾病選自一種或多種胰島素抗性、葡萄糖不耐受、心臟相關(guān)疾病、高血糖癥、高胰島素血癥、肥胖、高脂血癥、高脂蛋白血癥、消化道粘膜異常、進食紊亂和胃腸道紊亂。
16.權(quán)利要求14的方法，其中蛋白酶抗性類似物為GLP-2類似物，所述疾病選自一種或多種節(jié)段性回腸炎和炎癥性腸道疾病。
17.權(quán)利要求1-10中任一項的蛋白酶抗性類似物，進一步含有毒蜥外泌肽-4的C末端氨基酸序列。
18.權(quán)利要求17的蛋白酶抗性類似物，其中毒蜥外泌肽-4的C末端氨基酸序列為PSSGAPPPS。
19.一種生物活性肽或多肽因子的蛋白酶抗性類似物，所述肽或多肽因子有以下氨基酸序列HAXGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS-NH2其中X為式II的氨基酸類似物 其中R1和R2獨立選自低級烷基或鹵素；R3選自低級烷基、芳基、羥基基團、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-NH2、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2、-SH或-(CH2)m-S-CH3；且m為0、1或2。
20.一種給予蛋白酶抗性類似物將會有益的治療或預防疾病或病癥的方法，所述方法包括給予生物活性肽或多肽因子的蛋白酶抗性類似物，所述肽或多肽因子有以下氨基酸序列HAXGTFTSDVSSYLEGQAAKWFIAWLVKGRPSSGAPPPS-NH2其中X為式II的氨基酸類似物 其中R1和R2獨立選自低級烷基或鹵素；R3選自低級烷基、芳基、羥基基團、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-NH2、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2、-SH或-(CH2)m-S-CH3；且m為0、1或2。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病或病癥選自心臟相關(guān)疾病、高血糖癥、肥胖、高脂血癥、糖尿病并發(fā)癥、肥胖相關(guān)高血壓、骨質(zhì)疏松、抑郁、情感性分裂癥、睡眠窒息癥、伴有精力不集中的注意力缺陷綜合征、記憶力喪失、健忘、發(fā)作性睡病和胃腸道疾病。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病或病癥為選自心肌梗塞、缺血再灌注損傷、充血性心衰和心臟停博的心臟相關(guān)疾病。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病或病癥選自抑郁情感性分裂癥、睡眠窒息癥、注意力缺陷綜合征、記憶力喪失、健忘和發(fā)作性睡病。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述疾病或病癥為選自局限性腸炎(節(jié)段性回腸炎)和炎性腸道疾病的胃腸疾病。
25.一種調(diào)節(jié)血糖代謝的方法，所述方法包括給予生物活性肽或多肽因子的蛋白酶抗性類似物，所述肽或多肽因子有以下氨基酸序列HAXGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS-NH2其中X為式II的氨基酸類似物 其中R1和R2獨立選自低級烷基或鹵素；R3選自低級烷基、芳基、羥基基團、-(CH2)m-COOH、-(CH2)m-NH2、-(CH2)m-N-C(＝NH)NH2、-(CH2)m-C(＝O)NH2、-SH或-(CH2)m-S-CH3；m為0、1或2。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗蛋白酶水解的肽和多肽類似物的組合物、其藥學用途及其制備方法。
文檔編號C07K14/60GK1822851SQ200480019850
公開日2006年8月23日 申請日期2004年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者W·W·巴喬夫欽, H·-S·賴, D·G·桑福德 申請人:塔夫茨大學信托人