專利名稱：穩(wěn)定化的固態(tài)多肽微粒的制作方法
背景發(fā)明領域本發(fā)明涉及固態(tài)多肽制劑，其中該多肽是穩(wěn)定化的，能抗升高溫度降解較長的時間。更具體地，本發(fā)明提供了制備固態(tài)多肽微粒的制劑和方法，其中該多肽通過一種或多種穩(wěn)定條件穩(wěn)定化。
技術現(xiàn)狀本領域已知能持續(xù)較長時間地輸送理想劑量的活性劑例如多肽的可植入的裝置。例如，美國專利5,728,396，5,985,305，6,113,938，6,156,331，6,375,978，和6,395,292教導了可植入的滲透裝置，其能輸送穩(wěn)定的活性劑制劑，例如溶液或懸浮液，且以理想的速度持續(xù)較長的時間(即從約2周至幾個月或更長的時間段)。可植入的藥物輸送系統(tǒng)還包括貯庫型(depot-type)材料，例如在美國專利6,468,961，6,331,311和6,130,200中所述的那些。貯庫材料典型地將活性劑隔絕在可生物降解的或可生物侵蝕的貯庫材料中，這樣活性劑能從植入的貯庫材料輸送出，基于活性劑的擴散或貯庫材料的降解或侵蝕。示例性的貯庫材料包括基于PLGA的系統(tǒng)，其典型地能在約2周至6個月的時間內(nèi)輸送活性劑。因為它們可以被設計用于以治療水平持續(xù)較長時間地輸送理想的活性劑，所以可植入的輸送系統(tǒng)能有利地長期治療性地施用理想的活性劑，無需經(jīng)常到醫(yī)療機構就診或重復自己給藥。但是，使用可植入的藥物輸送系統(tǒng)持續(xù)較長時間地輸送治療性多肽面臨許多技術挑戰(zhàn)。
更具體地，一個經(jīng)證實的挑戰(zhàn)是，將裝載在用于輸送多肽的可植入的輸送系統(tǒng)中的治療性多肽的穩(wěn)定性維持數(shù)周或數(shù)月。為了使持續(xù)較長時間地輸送治療劑量的多肽的可植入系統(tǒng)具有合適的大小，通常必需給該系統(tǒng)裝載含有高濃度的要輸送的多肽的溶液或懸浮液。但是，如果這樣的溶液或懸浮液被持續(xù)較長時間地暴露于接近或超過生理條件的溫度(例如，接近或超過37℃的溫度)，包含在該溶液或懸浮液中的多肽將會降解，如果該多肽不經(jīng)穩(wěn)定的話。暴露于接近或超過生理條件的溫度的多肽的降解可以通過多種途徑進行，并且可以改變、降低或破壞多肽的生物學活性。因此，為了使可植入的輸送系統(tǒng)能成功地持續(xù)較長時間地輸送治療性多肽，裝載于其中的多肽必須是對降解穩(wěn)定的，這樣該系統(tǒng)才能在可植入系統(tǒng)的功能期限內(nèi)輸送治療劑量的生物活性多肽。
糖類已經(jīng)用于多肽制劑中，以穩(wěn)定包含于其中的多肽，防止隨時間的降解。更具體地，糖類已經(jīng)用作凍干保護劑，用于通過減少凍干過程中的分子解折疊來抑制多肽的聚集。在凍干過程中和之后糖類還通過限制分子流動性和通過使分子相互作用最小化來提供長期穩(wěn)定性。但是，當使用糖來穩(wěn)定多肽時，通常必須使用大量的糖才能達到理想的穩(wěn)定程度。如Andya等的美國專利6,267,958所教導的，為了達到可接受的穩(wěn)定效果，可能需要多達100～510摩爾比的穩(wěn)定糖，并且包含如此大量的穩(wěn)定糖的多肽制劑不適用于裝載到可植入的藥物輸送系統(tǒng)中。
當需要高濃度的穩(wěn)定糖來實現(xiàn)輸送系統(tǒng)中理想的多肽穩(wěn)定程度時，包含在該系統(tǒng)中的多肽制劑的總體體積會增加，同時可以裝載到系統(tǒng)中的多肽的最大濃度會降低。隨著裝載到可植入系統(tǒng)中的制劑中的多肽濃度的降低，實現(xiàn)理想的給藥方案所需的多肽制劑的量和植入系統(tǒng)的最小尺寸會增加。因此，如果能提供穩(wěn)定治療性多肽的制劑和方法，且其可以減少或完全消除對穩(wěn)定糖的需要，這將是本領域的一項改進。如果該制劑和方法能將多肽穩(wěn)定到一定的程度，使多肽可以高濃度地裝載到可植入的輸送系統(tǒng)中，且在持續(xù)較長時間地暴露于高達或超過生理條件的溫度后仍能表現(xiàn)出可接受的穩(wěn)定性和治療活性，這又將是本領域的一項改進。
發(fā)明概述本發(fā)明包括固態(tài)多肽微粒，其中包含在微粒中的多肽是經(jīng)穩(wěn)定的，能抗在高達或超過生理條件的溫度的降解。如在本文中所使用的，術語“生理條件”是指具有約37℃的溫度的環(huán)境，術語“多肽”包括寡肽和蛋白，且包括任何天然的或合成的含有2個或多個氨基酸的化合物，其中一個氨基酸的羧基連接到另一個的氨基。在每個實施方案中，本發(fā)明的多肽微粒含有多肽物質(zhì)，其通過一種或多種穩(wěn)定條件穩(wěn)定以對抗降解。更具體地，本發(fā)明的多肽微粒被配制為通過控制一種或多種下面的微粒條件而穩(wěn)定包含于其中的多肽pH、糖含量、表面活性劑含量、緩沖劑含量和金屬離子濃度。因為本發(fā)明的多肽微?？膳渲茷榻Y(jié)合兩種或多種穩(wěn)定條件的相加效應，當本發(fā)明的多肽微粒包含穩(wěn)定糖時，達到可接受的多肽穩(wěn)定性所需的穩(wěn)定糖的量顯著減少。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多肽微粒制劑無需使用穩(wěn)定糖即可穩(wěn)定包含于其中的多肽。
本發(fā)明還包括水性穩(wěn)定溶液。為了制備本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒，可以制備含有要穩(wěn)定的多肽的本發(fā)明的水性穩(wěn)定溶液，并進行合適的微粒形成過程，例如凍干或噴霧干燥過程。因此，本發(fā)明的水性穩(wěn)定溶液的配制使得當對水性穩(wěn)定溶液進行微粒形成過程后，該水性穩(wěn)定溶液生成固態(tài)多肽微粒，其含有通過一種或多種穩(wěn)定條件穩(wěn)定的多肽物質(zhì)。通過控制本發(fā)明的水性穩(wěn)定溶液的pH、糖含量、表面活性劑含量、緩沖劑含量、金屬離子濃度或多肽濃度，可以生產(chǎn)出具有較寬范圍的理想的穩(wěn)定特征的固態(tài)多肽微粒。
本發(fā)明還包括生產(chǎn)穩(wěn)定化的固態(tài)多肽微粒的方法。本發(fā)明的方法包括將要穩(wěn)定的多肽溶解到本發(fā)明的水性穩(wěn)定溶液，并將多肽重構到固態(tài)多肽微粒中。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的固態(tài)肽微粒的配制取決于使用的水性穩(wěn)定溶液。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括將要穩(wěn)定的多肽溶解到酸性穩(wěn)定溶液中。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在有穩(wěn)定糖、金屬離子、或穩(wěn)定糖和金屬離子二者存在的情況下，將要穩(wěn)定的多肽溶解到酸性穩(wěn)定溶液中。在另一個實施方案中，本發(fā)明的方法包括在有表面活性劑、穩(wěn)定糖、金屬離子、或穩(wěn)定糖和金屬離子二者存在的情況下，將要穩(wěn)定的多肽溶解到緩沖的、接近中性的穩(wěn)定溶液中。在本發(fā)明的方法的每個實施方案中，可以通過對水性穩(wěn)定溶液進行合適的微粒形成過程，例如凍干或噴霧干燥過程，進行固態(tài)肽微粒的重構步驟。雖然本發(fā)明的方法可以進行變化，以得到具有多種制劑中的任一種的微粒，本發(fā)明的方法在每種情況下都適于提供固態(tài)多肽微粒，其中該多肽是通過一種或多種穩(wěn)定條件穩(wěn)定的。
本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒提供了優(yōu)越的多肽穩(wěn)定作用，在60℃儲存2個月后仍能回收高達96％的穩(wěn)定肽。而且，本發(fā)明的固態(tài)多肽微?？梢砸韵鄬^高的濃度(即25％多肽微?；蚋?裝載到懸浮制劑中，這可易化配制具有相對更高濃度的穩(wěn)定多肽的懸浮劑。因此，本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒有利于用足夠高濃度的穩(wěn)定化的治療性多肽裝載可接受尺寸的植入輸送系統(tǒng)，所述的濃度能持續(xù)較長時間地輸送治療劑量的穩(wěn)定化的治療性多肽。
附圖簡要說明

圖1的圖解釋了凍干的PACAP(醋酸銨，約pH6.4)在40℃儲存3個月后的總降解(RP-HPLC)和聚集(SEC)。
圖2的圖解釋了凍干的PACAP在4℃、40℃和60℃儲存3個月后的穩(wěn)定性。
圖3的圖解釋了當使用不同的賦形劑配制PACAP固態(tài)微粒時對在40℃形成PACAP聚集體的抑制。
圖4的圖解釋了當使用不同的賦形劑配制PACAP固態(tài)微粒時對在60℃形成PACAP聚集體的抑制。
圖5的圖解釋了組氨酸、琥珀酸鹽和蔗糖對在40℃總PACAP降解的穩(wěn)定化作用。
圖6的圖解釋了蔗糖抑制在40℃ BA/PVP懸浮液中PACAP聚集體形成的穩(wěn)定化作用。
圖7的圖解釋了蔗糖抑制在40℃ LL/GML/PVP懸浮液中PACAP聚集體形成的穩(wěn)定化作用。
圖8的圖解釋了不同懸浮介質(zhì)中的PACAP在40℃儲存3個月后的總降解。
圖9說明了在表觀pH2、表觀pH4和表觀pH6凍干的微粒中所含的PACAP在60℃儲存2個月后通過RP HPLC測得的總降解和通過SEC測得的聚集。
表1說明了評價分散在不同懸浮介質(zhì)中的PACAP的穩(wěn)定性的研究結(jié)果，所述的PACAP懸浮液在65℃溫育4小時。
表2說明了評價在37℃溫育了17天后的PACAP的穩(wěn)定性的研究結(jié)果，其中評價的PACAP是單獨的凍干的PACAP或分散在3種不同懸浮介質(zhì)之一中的PACAP。
表3說明了評價在60℃溫育了17天后的PACAP的穩(wěn)定性的研究結(jié)果，其中評價的PACAP是單獨的凍干的PACAP或分散在3種不同懸浮介質(zhì)之一中的PACAP。
表4提供了估計的PACAP的降解和聚集速度，其中PACAP包含在含有各種不同賦形劑的固態(tài)微粒中，且該微粒在40℃和60℃溫育。
表5提供了估計的PACAP的降解和聚集速度，該PACAP包含在固態(tài)微粒中，該固態(tài)微粒由在pH6的NH4OAc緩沖液中制備的3種不同溶液形成，3種溶液中的每一種含有不同量的蔗糖。
表6說明了評價PACAP的穩(wěn)定作用的研究結(jié)果，所述穩(wěn)定作用是通過在不同的pH、用3種不同的糖中的一種配制固態(tài)PACAP微粒來實現(xiàn)的。
表7說明了評價PACAP的相加穩(wěn)定作用的研究結(jié)果，通過在不同的pH、用一種或多種不同賦形劑配制固態(tài)PACAP微粒來實現(xiàn)。
表8說明了評價PACAP的穩(wěn)定性的研究結(jié)果，通過在不同的pH、用CaCl2、組氨酸、以及CaCl2和組氨酸二者配制固態(tài)PACAP微粒來實現(xiàn)。
發(fā)明詳述在第一個實施方案中，本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒包含在酸性pH下穩(wěn)定的多肽，且配制成表現(xiàn)出酸性重構pH。在微粒形成之前水性穩(wěn)定溶液的pH(“表觀”pH)控制著隨后形成的微粒表現(xiàn)出的pH(“重構”pH)，并限定了固態(tài)多肽微粒內(nèi)的多肽的質(zhì)子化狀態(tài)。為了本發(fā)明的目的，表現(xiàn)出酸性重構pH的微粒包括表現(xiàn)出低于約pH5的重構pH的多肽微粒，表現(xiàn)出低于pH4的重構pH的微粒是優(yōu)選的，表現(xiàn)出約pH2～約pH4的重構pH的微粒是特別優(yōu)選的。通過控制本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒表現(xiàn)出的pH，可以控制固態(tài)微粒包含的多肽的質(zhì)子化狀態(tài)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在酸性pH配制本發(fā)明的固態(tài)多肽微?？梢再x予實質(zhì)上的穩(wěn)定化作用。據(jù)信，在酸性pH配制本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒會穩(wěn)定多肽，因為酸性環(huán)境有利于多肽中包含的氨基的質(zhì)子化。多肽中的氨基經(jīng)常參與反應性中間體的形成，所述的中間體易于發(fā)生分子間的或分子內(nèi)的反應，這會改變肽的化學性質(zhì)，并且是多肽降解的重要途徑。我們認為，通過將多肽維持在有利于多肽中的氨基質(zhì)子化的環(huán)境中，根據(jù)第一個實施方案的多肽微粒會限制氨基參與反應性中間體的形成，從而限制分子間的或分子內(nèi)的反應造成的多肽降解。
向根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)微粒加入金屬離子會提供附加的多肽穩(wěn)定作用。當配制的根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)微粒包含金屬離子時，該金屬離子優(yōu)選地由二價金屬鹽提供，例如CaCl2、MgCl2或ZnCl2。包含在根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒中的金屬離子的精確量取決于要穩(wěn)定的特定肽、微粒的pH和有無穩(wěn)定糖。但是，當根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)肽微粒包含金屬離子時，該微粒通常配制成金屬離子與穩(wěn)定化的多肽的摩爾比為約1/1至10/1，約2/1～約6/1的摩爾比范圍是優(yōu)選的，約4/1的摩爾比是特別優(yōu)選的。向本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒加入金屬離子會減少隨時間發(fā)生的多肽二聚作用的量，并由此進一步穩(wěn)定多肽。據(jù)信，金屬離子通過與多肽分子形成離子鍵或鹽橋來減少多肽二聚作用，其中離子鍵或鹽橋會限制多肽分子之間相互作用的機會。
向根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)肽微粒加入穩(wěn)定糖也提供附加的多肽穩(wěn)定作用。通過限制多肽分子的流動性和減少多肽分子之間的分子間相互作用，加入的穩(wěn)定糖能進一步穩(wěn)定多肽。但是，因為本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒可以配制成通過2種或多種相加的穩(wěn)定條件來穩(wěn)定多肽，當配制的根據(jù)本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒包含穩(wěn)定糖時，達到可接受水平的穩(wěn)定性所需的糖量會顯著減少。更具體地，當配制的根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒包含穩(wěn)定糖時，包含的糖的量的范圍通常是相對于穩(wěn)定化的多肽約0.1/1重量/重量～約1/1重量/重量。在優(yōu)選的實施方案中，包含穩(wěn)定糖的本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒包含的穩(wěn)定糖的量的范圍是相對于穩(wěn)定化的多肽約0.1/1重量/重量～約0.5/1重量/重量或約0.1/1重量/重量～約0.25/1重量/重量。當配制的根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒包含穩(wěn)定糖和金屬離子兩者時，達到理想的多肽穩(wěn)定化程度所需的糖和金屬離子的量可以相對于只含有穩(wěn)定糖而無金屬離子、或只含有金屬離子而無穩(wěn)定糖的制劑有所減小。這樣的潛在優(yōu)點可以通過糖、金屬離子和酸性環(huán)境pH的相加穩(wěn)定效應來實現(xiàn)。
盡管非還原糖通常可用作根據(jù)本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒中的穩(wěn)定糖，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并非所有的糖都適用于穩(wěn)定根據(jù)第一個實施方案的肽微粒。更具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)蔗糖(經(jīng)常用于穩(wěn)定多肽的糖)不適于在酸性條件下使用。實際上，當蔗糖用在這種條件下時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)會產(chǎn)生去穩(wěn)定效應。我們認為，這樣的去穩(wěn)定效應的產(chǎn)生是因為蔗糖本身在酸性環(huán)境中不是化學穩(wěn)定的。更具體地，蔗糖在酸性pH會水解成葡萄糖和果糖。盡管海藻糖象蔗糖一樣是二糖，但是海藻糖在酸性條件和升高溫度下是化學穩(wěn)定的。單糖甲基-甘露吡喃糖苷(″甲基-MP″)在酸性環(huán)境下也是化學穩(wěn)定的。而且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當包含在配制成表現(xiàn)出酸性pH的固態(tài)多肽微粒中時，海藻糖和甲基-MP都能顯著地進一步穩(wěn)定多肽。因此，當配制的根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒包含穩(wěn)定糖時，包含在制劑中的糖必須在酸性條件下是穩(wěn)定的，優(yōu)選在處于高達和超過生理條件的溫度時在酸性條件下是穩(wěn)定的。
可以從水性穩(wěn)定溶液制備根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒。為了制備適用于制備根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液，將要穩(wěn)定的多肽溶解到酸性溶液中。通過加入合適的酸(例如HCl)，其量能生成具有理想pH的溶液，可以得到酸性的水性穩(wěn)定溶液。本發(fā)明的水性穩(wěn)定溶液的pH在穩(wěn)定使用水性穩(wěn)定溶液生產(chǎn)的固態(tài)多肽微粒中所含的多肽方面起關鍵作用。為了得到根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒(即具有酸性重構pH)，可能必需在顯著低于目標重構pH的表觀pH下制備水性穩(wěn)定溶液。適用于制備根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液還可以包含溶解于其中的金屬鹽或穩(wěn)定糖。溶解在適用于生產(chǎn)根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液中的金屬鹽或穩(wěn)定糖的量可以變化。但是，當水性穩(wěn)定溶液是要用于制備包含穩(wěn)定糖的固態(tài)多肽微粒時，優(yōu)選地水性穩(wěn)定溶液包含的理想穩(wěn)定糖的量為相對于要穩(wěn)定的多肽約0.1/1重量/重量～約1/1重量/重量。而且，當水性穩(wěn)定溶液是要用于制備包含金屬離子的固態(tài)多肽微粒時，制備的水性穩(wěn)定溶液優(yōu)選地包含理想的金屬離子，且該金屬離子與多肽的摩爾比范圍是約1/1～約10/1。
為了從酸性的水性穩(wěn)定溶液制備根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)多肽微粒，對該穩(wěn)定溶液進行已知的微粒形成過程。例如，可以使用凍干或噴霧干燥過程加工本發(fā)明的水性穩(wěn)定溶液，得到固態(tài)肽微粒。在一個具體實施方案中，通過凍干循環(huán)從本發(fā)明的水性穩(wěn)定溶液制備了根據(jù)本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒，該凍干循環(huán)包括將穩(wěn)定溶液在4℃冷凍30分鐘，并在-50℃冷凍3小時(冷卻速度為2.5℃/分鐘)。如所述冷凍水性穩(wěn)定溶液后，進行的初級干燥循環(huán)是在50mT的腔壓下，在-30℃進行10分鐘，然后在0℃進行10小時。初級干燥循環(huán)后的次級干燥循環(huán)是在200mT的腔壓下，在0℃進行3小時，然后在20℃進行12小時，在30℃進行6小時，所有溫度水平的升高是0.5℃/分鐘。但是，本發(fā)明不限于通過這里所述的精確凍干過程生產(chǎn)的固態(tài)多肽微粒。在蛋白微粒形成領域已知若干合適的凍干和噴霧干燥過程，可以用于制備根據(jù)本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒。
在第二個實施方案中，配制的本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒表現(xiàn)出接近中性的重構pH。如本文所使用的，術語“接近中性的”是指pH5～約pH8的pH范圍。優(yōu)選地，配制的根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒表現(xiàn)出約pH5～pH7的重構pH。根據(jù)本發(fā)明的第二個實施方案的多肽微粒包含緩沖劑，還包含表面活性劑、穩(wěn)定糖、金屬離子、或穩(wěn)定糖和金屬離子二者。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使配制的固態(tài)多肽微粒表現(xiàn)出接近中性的重構pH且包含緩沖賦形劑，可以顯著地穩(wěn)定包含在固態(tài)微粒中的多肽物質(zhì)。我們認為，在接近中性的pH，緩沖劑可以通過抗衡離子作用穩(wěn)定固態(tài)微粒中所含的多肽。更具體地，我們認為緩沖物質(zhì)可以與容易發(fā)生分子間的或分子內(nèi)的反應的包含在多肽中的一個或多個位點相互作用或與之結(jié)合，由此這些位點不能再發(fā)生反應。
適用于配制根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的緩沖劑是能在接近中性的pH進行緩沖的那些。可以用于根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的緩沖劑的具體實例包括氨基酸或肽緩沖劑，例如組氨酸緩沖劑(His-6)或組氨酸-谷氨酸(His-Glu)緩沖劑，和無機緩沖劑，例如琥珀酸鹽和檸檬酸鹽緩沖劑。根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒通常配制有至多約20％重量的緩沖劑，包含至多約15％重量的緩沖劑的多肽微粒是優(yōu)選的。但是，包含在根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒中的緩沖劑的精確量可以根據(jù)包含在微粒中的多肽的量和類型而變。而且，用于配制根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的緩沖劑的量和類型還可以調(diào)節(jié)以獲得表現(xiàn)出理想的重構pH的固態(tài)多肽微粒。
通過使配制的根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)微粒包含穩(wěn)定糖、金屬離子、或穩(wěn)定糖和金屬離子二者，包含在微粒中的多肽的穩(wěn)定化會提高到超過通過簡單地在有緩沖劑存在下、在接近中性的環(huán)境中配制多肽所得到的穩(wěn)定作用。當根據(jù)第二個實施方案配制固態(tài)多肽微粒且其包含穩(wěn)定糖、金屬離子、或穩(wěn)定糖和金屬離子二者時，包含在微粒中的糖和金屬離子的量優(yōu)選地在關于第一個實施方案的固態(tài)肽微粒所詳述的范圍內(nèi)。更具體地，如果配制的根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒包含穩(wěn)定糖，包含在微粒中的穩(wěn)定糖的量優(yōu)選地為相對于要穩(wěn)定的多肽約0.1/1重量/重量～約1/1重量/重量。同樣，非還原糖通?？捎米鞲鶕?jù)本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒中的穩(wěn)定糖，但是因為它們是在接近中性的pH配制的，根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微?？梢园谒嵝原h(huán)境中是不穩(wěn)定的穩(wěn)定糖，例如蔗糖。而且，如果配制的根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒包含金屬離子，配制的微粒優(yōu)選地包含理想的金屬離子，且金屬離子與多肽的摩爾比范圍是約1/1～約10/1。當配制的根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒包含穩(wěn)定糖和金屬離子二者時，達到理想的多肽穩(wěn)定化程度所需的糖和金屬離子的量可以相對于只含有穩(wěn)定糖而無金屬離子、或只含有金屬離子而無穩(wěn)定糖的制劑有所減小。這樣的潛在優(yōu)點可以通過糖、金屬離子和在接近中性的pH的緩沖條件的相加穩(wěn)定作用來實現(xiàn)。
當配制的根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)肽微粒包含表面活性劑時，使用的表面活性劑優(yōu)選地為陰離子表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉(SDS)。包含在根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒中的表面活性劑的量可以根據(jù)要穩(wěn)定的多肽的量和類型以及包含在微粒中的其它賦形劑的性質(zhì)和量而變化。然而，當從水性穩(wěn)定溶液配制根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒時，其包含的理想的表面活性劑的量為約0.02重量％～約0.2重量％。
可以從水性穩(wěn)定溶液制備根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒。為了制備適用于制備根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液，將要穩(wěn)定的多肽溶解到表現(xiàn)出接近中性的表觀pH的溶液中，且該溶液根據(jù)需要包含表面活性劑、金屬鹽、穩(wěn)定糖或金屬鹽和穩(wěn)定糖二者。接近中性的穩(wěn)定溶液可以通過加入合適的緩沖劑來制備，例如已經(jīng)討論的那些緩沖劑，其量能產(chǎn)生具有理想表觀pH的溶液。正如用于制備根據(jù)第一個實施方案的固態(tài)微粒的水性穩(wěn)定溶液，用于制備根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液的表觀pH控制著使用該水性穩(wěn)定溶液生產(chǎn)的固態(tài)多肽微粒的重構pH。因此，為了得到理想的表觀pH和理想的重構pH，在用于生產(chǎn)根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液中使用的緩沖劑的量和類型可以變化。而且，為了得到特征在于其緩沖劑含量在本文所述的范圍內(nèi)的固態(tài)多肽微粒，包含在水性穩(wěn)定溶液中的緩沖劑的量可以根據(jù)使用的緩沖劑的類型、在固態(tài)微粒中理想的緩沖劑的精確量和要包含在固態(tài)微粒中的多肽和其它賦形劑的性質(zhì)和量等因素而變化。例如，下面詳述的實施例中，特征在于10mM濃度的組氨酸緩沖劑的穩(wěn)定溶液提供了含有14重量％緩沖物質(zhì)的固態(tài)多肽微粒。
溶解在適用于制備根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液中的金屬鹽或穩(wěn)定糖的量也可以根據(jù)要穩(wěn)定的多肽的量和性質(zhì)以及金屬鹽或穩(wěn)定糖的性質(zhì)而變化。但是，當用于制備根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液包含穩(wěn)定糖時，該水性穩(wěn)定溶液優(yōu)選地包含理想的穩(wěn)定糖，其量在已經(jīng)描述的范圍內(nèi)(即相對于要穩(wěn)定的多肽約0.1/1重量/重量～約1/1重量/重量，其中約0.1/1重量/重量～約0.5/1重量/重量和約0.1/1重量/重量～0.25/1重量/重量的范圍是優(yōu)選的)。而且，當用于制備根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒的水性穩(wěn)定溶液包含金屬離子時，制備的水性穩(wěn)定溶液優(yōu)選地包含理想的金屬離子，金屬離子與多肽的摩爾比在已經(jīng)描述的范圍內(nèi)(即金屬離子與多肽的摩爾比范圍為約1/1～約10/1，其中約2/1～約6/1的摩爾比范圍是優(yōu)選的，約4/1的摩爾比是特別優(yōu)選的)。
為了從接近中性的水性穩(wěn)定溶液制備出根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒，需要對接近中性的穩(wěn)定溶液進行已知的微粒形成過程。如關于制備根據(jù)第一個實施方案的微粒所描述的，可以使用凍干或噴霧干燥過程從適當?shù)嘏渲频乃苑€(wěn)定溶液制備出根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)微粒。例如，本文所述的凍干過程適用于從水性穩(wěn)定溶液制備根據(jù)第二個實施方案的固態(tài)多肽微粒。但是同樣，本發(fā)明不限于使用這里詳述的具體凍干過程。通過凍干和噴霧干燥過程形成微粒是本領域熟知的，任何合適的凍干或噴霧干燥過程都可以應用到本發(fā)明的水性穩(wěn)定溶液，以提供根據(jù)本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒。
本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒、水性穩(wěn)定溶液和方法特別適用于穩(wěn)定屬于包括以下成員的肽超家族的肽垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽(″PACAP″)和胰高血糖素。在人類中，PACAP/胰高血糖素肽超家族包括至少9種不同類型的生物活性肽PACAP-27；PACAP-38；胰高血糖素；胰高血糖素樣肽，例如GLP-1和GLP-2；生長激素釋放因子(″GRF″)；血管活性腸多肽(″VIP″)；肽組氨酸甲硫氨酸(″PHM″)；腸促胰液素；和糖依賴性胰島素釋放多肽(″GIP″)。在腦中發(fā)現(xiàn)了這9種不同類型的生物活性肽中的8種，并將它們分類為神經(jīng)肽。另外，PACAP/胰高血糖素超家族的許多成員存在于胃腸、胰腺和生殖腺器官中(見，The originand function of the pituitary adenylate cyclase-activatingpolypeptide(PACAP)/glucagon superfamily，Endocrine Reviews，21(6)619-670)。包含在PACAP/胰高血糖素超家族中的肽通過它們的N末端氨基酸在結(jié)構上相關，在細胞生產(chǎn)各種不同的包含在PACAP/胰高血糖素超家族中的肽時使用的基因和前體分子在結(jié)構上相似。
特別令人感興趣的是Bayer Corporation(″Bayer″)生產(chǎn)的合成的PACAP-R3激動劑類似物(″PACAP類似物″)。該合成肽通過下面的31個氨基酸序列定義HSDAVFTDNY TRLRKQVAAK KYLQS IKNKR Y。Bayer改造了PACAP類似物的效力和對胰腺中的R 3受體的選擇性。為了提高PACAP類似物的穩(wěn)定性，將位點17上的原始甲硫氨酸替換為纈氨酸，將原始位于位點24上的天冬酰胺替換為谷氨酰胺。該PACAP類似物可以用于治療I I型糖尿病，理想的是從能輸送PACAP類似物的可植入藥物輸送系統(tǒng)給對象(人)輸送治療劑量的PACAP類似物至少3個月，優(yōu)選至少6個月。但是，無論是維持在固態(tài)還是溶解在水性的或有機溶劑溶液中，未保護的PACAP類似物在接近或超過生理條件的溫度下是不穩(wěn)定的。因此，為了將PACAP類似物裝載在適用于從可植入的長期釋放輸送系統(tǒng)輸送的懸浮液中，必須穩(wěn)定固態(tài)PACAP類似物微粒以防止否則會因長期暴露于接近或超過生理條件的溫度而造成的降解。
隨著固態(tài)PACAP類似物暴露于接近或超過生理條件的溫度，已經(jīng)確定最重要的降解源是聚集體形成。更具體地，使用凍干的PACAP類似物，經(jīng)測定，未保護的凍干的PACAP類似物的主要降解產(chǎn)物是共價二聚體、二聚體-OAc和PACAP-OAc加合物。目前認為，PACAP類似物降解為這樣的聚集體產(chǎn)物是如下進行的形成反應性分子內(nèi)環(huán)狀酰亞胺，隨后由醋酸鹽離子、另一個PACAP類似物分子或二者進行親核攻擊。這些提出的降解途徑的可能的修飾位點是在PACAP類似物分子的Asp3Ala4和Gln24Ser25氨基酸處。已經(jīng)進一步確認，還發(fā)生N末端肽鍵的切割來降解固態(tài)的未保護的PACAP類似物。發(fā)現(xiàn)該蛋白水解主要在pH4，推測是通過輔助的Asp3羧基側(cè)鏈的分子內(nèi)環(huán)封閉而發(fā)生。但是，如在下面的實施例中所詳述的，本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒的各種實施方案在穩(wěn)定PACAP類似物防止降解方面是有效的，甚至當該微粒維持在40℃和60℃的溫度數(shù)月時亦如此。
盡管本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒方法的幾種不同實施方案能有效地穩(wěn)定PACAP類似物，3個實施方案提供了優(yōu)越的穩(wěn)定作用。在一個實施方案中，固態(tài)PACAP類似物微粒是從表現(xiàn)出表觀pH 2的穩(wěn)定溶液凍干的。用稀HCl將H2O的pH調(diào)至理想值，制備出用于穩(wěn)定溶液的溶劑。在60℃儲存2個月后，根據(jù)該實施方案的固態(tài)PACAP類似物微粒能回收92％的原始PACAP類似物，且僅形成1.1％的二聚體。圖9顯示了2個月穩(wěn)定性的結(jié)果，證實了從具有表觀pH2的穩(wěn)定溶液制備出的固態(tài)PACAP微粒的顯著提高的穩(wěn)定性。
在第二個實施方案中，在酸性pH配制固態(tài)多肽微粒，且包含0.55/1重量/重量比(海藻糖/PACAP類似物)的海藻糖和PACAP類似物。這些微粒能回收96％的原始PACAP類似物，且僅形成0.7％的二聚體，甚至在60℃儲存2個月后。為了配制特征在于酸性pH且包含0.55/1重量/重量比的海藻糖和PACAP類似物的固態(tài)PACAP類似物微粒，可以使用酸性的水性穩(wěn)定溶液?？梢允褂煤线m的酸(例如稀HCl)制備這樣的穩(wěn)定溶液。該溶液的pH(表觀pH)優(yōu)選地調(diào)節(jié)至約pH2，且將海藻糖和PACAP類似物以理想的0.55/1重量/重量比溶解到該溶液中。然后可以對制備的溶液進行凍干或噴霧干燥過程，以生產(chǎn)理想的固態(tài)PACAP類似物微粒。
在第三個實施方案中，還是在酸性pH配制固態(tài)多肽微粒，且其包含4/1摩爾比(Ca2+/PACAP類似物)的PACAP類似物和Ca2+離子。在60℃儲存2個月后，根據(jù)該制劑制備的微粒能回收95％的原始PACAP類似物，且僅形成0.8％的二聚體。為了配制特征在于酸性pH且包含4/1摩爾比的Ca2+和PACAP類似物的固態(tài)PACAP類似物微粒，可以制備酸性的水性穩(wěn)定溶液。同樣地，可以使用合適的酸(例如稀HCl)制備這樣的溶液，且該溶液的pH優(yōu)選地調(diào)節(jié)至約pH2。將CaCl2和PACAP溶解，其量能生成Ca2+和PACAP類似物的摩爾比為4/1的溶液，可以在溶液中提供合適量的Ca2+離子和PACAP類似物。然后可以對制備的穩(wěn)定溶液進行凍干或噴霧干燥過程，以生產(chǎn)理想的固態(tài)PACAP類似物微粒。
盡管已經(jīng)在最高60℃的溫度、最長2個月的時間評價了包含在本文所述的微粒中的PACAP類似物的穩(wěn)定性，該評價和在40℃的降解動力學的對比提供的發(fā)現(xiàn)表明，本發(fā)明的方法適用于提供穩(wěn)定化的固態(tài)PACAP類似物微粒，其能在接近生理溫度的溫度(即40℃)抗降解遠遠超過2個月。更具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含在微粒中的PACAP類似物在60℃的總降解速度比在40℃高約5倍。而且，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的固態(tài)PACAP微粒中的聚集或二聚作用在60℃的速度比在40℃高10倍。因此，當將根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的固態(tài)PACAP類似物微粒維持在約37℃時，預期包含在微粒中的PACAP類似物將會表現(xiàn)出可接受的穩(wěn)定性長達6個月和可能更久。
盡管下面的實施例指向PACAP類似物的穩(wěn)定化，但是本發(fā)明不限于此。例如，本發(fā)明的方法可以用于提供PACAP/胰高血糖素超家族的其它成員的穩(wěn)定化的固態(tài)微粒，特別是具有實質(zhì)上同源的氨基酸序列的那些家族成員，例如人VIP和人生長激素釋放因子。但是，本發(fā)明的方法也不限于穩(wěn)定化PACAP/胰高血糖素超家族的成員。本發(fā)明的固態(tài)多肽微粒、水性穩(wěn)定溶液和方法可以用于穩(wěn)定表現(xiàn)出因蛋白水解或聚集體形成造成的降解或具有傾向于降解途徑(例如對PACAP觀察的那些)的一級結(jié)構的任何多肽。
實施例1鑒于在可植入的藥物輸送系統(tǒng)中使用的懸浮介質(zhì)的性質(zhì)，經(jīng)常在升高溫度下混合懸浮制劑材料并隨后將懸浮制劑裝載到可植入系統(tǒng)中。為了評價在升高溫度下懸浮在各種懸浮介質(zhì)中的PACAP類似物(或簡稱″PACAP″)的穩(wěn)定性，將未保護的凍干PACAP懸浮在4種不同的懸浮介質(zhì)(LL/GML/PVP，BA/PVP，EHL/PVP，和PEG/PVP)中。為了將PACAP懸浮在懸浮介質(zhì)中，手工地將3.3mg醋酸PACAP混合到每種不同的懸浮液中，使PACAP含量為約3％。在65℃溫育4小時后，評價PACAP懸浮制劑的穩(wěn)定性。通過RP-HPLC和SEC評價了制備的PACAP懸浮液的穩(wěn)定性，如從表1中所見，結(jié)果表明PACAP在整個4小時溫育期間都是穩(wěn)定的，因此應該能夠經(jīng)受與懸浮制劑生產(chǎn)過程典型相關聯(lián)的溫度條件。
然后進一步在37℃和65℃溫育PACAP懸浮液另外的17天。另外的17天溫育階段結(jié)束后，在37℃溫育的懸浮液中觀察到微小的穩(wěn)定性喪失(表2)，而在65℃溫育的懸浮液中觀察到相對更強的降解(表3)。該結(jié)果表明，共價連接的聚集是評價的PACAP懸浮液中的主要降解途徑。在有和沒有介質(zhì)存在的情況下均發(fā)生聚集這一事實表明，懸浮介質(zhì)不是造成自聯(lián)結(jié)的原因。另外，其它的化學降解也促成凍干的PACAP的喪失。
實施例2從加工研究得到的基本發(fā)現(xiàn)導致對于糖(蔗糖)和非離子表面活性劑(吐溫80)對PACAP凍干物和懸浮液的穩(wěn)定化作用的評價。為了進行評價，以3個水平的吐溫80(0，0.05，0.2重量％)和蔗糖(0，0.5/1，1/1，重量/重量)在10mM NH4OAc(pH6.4)中用PACAP制備了樣品。還制備了在10mM組氨酸(pH 6.4)和琥珀酸鈉(pH 5.6)中的PACAP溶液。凍干每種PACAP溶液，得到重構的固態(tài)PACAP微粒，向每個小瓶中裝入3.3mg從每種溶液重構的物質(zhì)樣品，其中的樣品含有(1)無添加劑，(2)0.2重量％的吐溫80，(3)0.2％重量的吐溫80+0.5∶1重量/重量的蔗糖，和(4)1∶1重量/重量的蔗糖。手工地將各種3.3mg樣品與LL/GML/PVP和BA/PVP混合，得到具有約3％PACAP含量的懸浮制劑，在65℃溫育懸浮制劑4小時。初始溫育階段后，如下所述儲存各種懸浮制劑，并通過RP-HPLC和SEC評價。
圖1表明，蔗糖抑制了PACAP聚集，而吐溫80的存在沒有附加作用。通過剩余PACAP的百分比評估的總體穩(wěn)定性也相應增加。PACAP聚集的程度表現(xiàn)為受儲存溫度影響(圖2)。不含有穩(wěn)定劑的凍干的PACAP在4℃保持穩(wěn)定至少3個月，且與40℃相比，在60℃實質(zhì)上更迅速地聚集。該研究表明，蔗糖在生理溫度(40℃)和升高溫度(60℃)下均能穩(wěn)定凍干的PACAP。
圖3和4分別顯示了用各種不同賦形劑制備的凍干制劑在40和60℃儲存3個月PACAP聚集體形成的線性增加。證實了組氨酸和琥珀酸鈉是比醋酸銨更好的穩(wěn)定劑。除了含有1∶1重量/重量的蔗糖的樣品以外，在60℃的聚集速度約比在40℃觀察到的快10倍，在60℃的總降解速度約比在40℃觀察到的快5倍(表4)。這些結(jié)果表明，高蔗糖含量能通過降低總體的分子流動性和蛋白-蛋白相互作用來提高熱穩(wěn)定性。
另一方面，總降解在3個月的時間段內(nèi)表現(xiàn)出線性較低的關系(圖5)。該實驗表明，含有等量蔗糖(重量/重量)的凍干PACAP(在醋酸銨中在表觀pH6.4制備的)能產(chǎn)生最佳的(但不是可接受的)穩(wěn)定性，估計在40℃在6個月中的總降解為8.4％。
另外，該實驗表明蔗糖對在BA/PVP和LL/GML/PVP中的PACAP懸浮液的聚集體形成的抑制(圖6和7)類似于單獨的凍干的PACAP制劑。就聚集體形成而言蔗糖的穩(wěn)定化作用似乎在BA/PVP懸浮液中有所減小。在BA/PVP中PACAP的類似的長期穩(wěn)定性需要更多量的蔗糖(圖8)。
為了表征降解產(chǎn)物并闡明降解途徑，通過電霧化飛行時間質(zhì)譜分析了重構的穩(wěn)定性樣品(在60℃儲存了24天的凍干PACAP)，并使用RP-HPLC方法鑒別了降解產(chǎn)物。
完整PACAP的分子量(MW)為3743原子質(zhì)量單位?；赗P-HPLC分析，鑒別出主要的降解產(chǎn)物是共價二聚體和二聚體-OAc加合物。值得注意的是，在主峰之后但是在洗脫二聚體峰之前洗脫的一群峰都具有與PACAP-OAC加合物(即3785原子質(zhì)量單位)相同的質(zhì)量。從RP-HPLC和電霧化飛行時間質(zhì)譜分析得到的組合結(jié)果表明，兩種降解通過相同的反應中間體進行?；谠摲治?，可假設潛在的降解機制如下方案1假設的機制 可以假設降解通過2步機制進行，經(jīng)由限速的環(huán)狀酰亞胺中間體形成和隨后的醋酸鹽離子、另一個PACAP分子或二者的親核加成。由于所有樣品的水含量都較低(＜1％)，作為水親核加成結(jié)果的脫酰胺作用不是主要的。
實施例3使用在pH6的NH4OAc緩沖液中制備的3種不同的多肽溶液，通過凍干方法(FTS Duro stop)制備了固態(tài)PACAP微粒。3種不同溶液中的每一種含有不同量的蔗糖，第一種無蔗糖，第二種含有的蔗糖與PACAP的重量比為0.5/1，第三種含有的蔗糖與PACAP的重量比為1/1。將從3種溶液中的每一種制備的固態(tài)PACAP微粒儲存在2℃～8℃的對照溫度、接近生理溫度的溫度(40℃)和超過生理溫度的溫度(60℃)。在24天和3個月，評估包含在每組固態(tài)PACAP微粒中的PACAP的穩(wěn)定性。為了評估每組微粒中的PACAP穩(wěn)定性，將微粒重構到水中，通過反相RP-HPLC(乙腈梯度洗脫，流動相含有0.1％三氟醋酸，在214nm紫外檢測)和尺寸排阻HPLC(SEC，恒溶劑洗脫，30％乙腈與含有0.1％三氟醋酸和200mM氯化鈉的70％水溶液混合，在220nm紫外檢測)分析。
對于測試的所有制劑，在60℃的聚集速度(通過SEC評估)都比在40℃高10倍(表5)。除了以PACAP與蔗糖重量比為1/1制備的固態(tài)PACAP微粒外，在60℃在各種固態(tài)PACAP微粒中觀察到的總降解速度(通過RP HPLC評估)都比在40℃快約5倍。
實施例4評價了pH對PACAP分子隨時間的穩(wěn)定性的影響。為了進行這樣的評價，首先將PACAP原料溶解到3種不同溶液的水中，第一種溶液的pH為2，第二種溶液的pH為4，第三種溶液的pH為6。使用稀HCl將每種溶液的pH調(diào)至理想值。3種溶液中的每一種都裝在凍干瓶中，通過本文已經(jīng)描述的凍干過程，從每種溶液生產(chǎn)出固態(tài)PACAP微粒。然后將來自每種溶液的微粒在60℃儲存2個月，然后使用RP-HPLC和SEC評價了包含在固態(tài)微粒中的PACAP的穩(wěn)定性。圖9顯示了2個月穩(wěn)定性的結(jié)果，證實了在酸性pH制備的固態(tài)PACAP微粒的顯著提高的穩(wěn)定性。
實施例5評價了在不同pH、用一定量的潛在穩(wěn)定糖制備的固態(tài)PACAP微粒中含有的PACAP的穩(wěn)定性。在每種情況下，固態(tài)PACAP微粒含有7.3摩爾當量的3種不同糖中的一種蔗糖；海藻糖；和甲基甘露吡喃糖苷(均來自Sigma)。從8種不同水性溶液制備了評價的固態(tài)PACAP微粒。通過將PACAP溶解到pH調(diào)至2的第一種溶液和pH調(diào)至6的第二種溶液(如前，使用稀HCl調(diào)整本實施例所述的各種溶液的pH)中，制備了前兩種水性溶液。通過將PACAP和甲基-MP溶解到pH調(diào)至2的溶液和pH調(diào)至6的溶液中，制備了第三種和第四種水性溶液。通過將PACAP和海藻糖溶解到pH調(diào)至2的溶液和pH調(diào)至6的溶液中，制備了第五種和第六種水性溶液。通過將PACAP和蔗糖溶解到pH調(diào)至2的溶液和pH調(diào)至6的溶液中，制備了第七種和第八種水性溶液。
如已經(jīng)描述的，通過凍干從8種溶液中的每一種制備了固態(tài)PACAP微粒，然后將從8種溶液中的每一種制備的固態(tài)PACAP微粒在60℃儲存2個月。將各種固態(tài)PACAP微粒暴露于60℃2個月后，使用RP HPLC和SEC方法評價了包含在各種微粒中的PACAP的穩(wěn)定性。
HPLC分析表明，當包含在于pH6制備的PACAP微粒中時，研究的所有3種糖都表現(xiàn)出提高的穩(wěn)定性。更具體地，在pH6，蔗糖在防止聚集體形成方面提供約6倍的改善，海藻糖在相同的測量中提供約4倍的改善。而且，與在pH2制備的沒有添加穩(wěn)定糖的PACAP微粒相比，海藻糖和甲基MP均對在pH2制備的微粒中包含的PACAP提供附加的穩(wěn)定性(表6)。但是，當包含在于pH2制備的PACAP微粒中時，蔗糖表現(xiàn)出顯著的去穩(wěn)定效應。我們認為，蔗糖對在pH2制備的PACAP的去穩(wěn)定效應是從酸性pH的溶液生產(chǎn)PACAP微粒的過程中蔗糖分解的結(jié)果。
實施例6制備了含有組氨酸緩沖劑(Sigma)的PACAP微粒和含有組氨酸緩沖劑與氯化鈣(CACl2，JT Baker)、蔗糖和十二烷基硫酸鈉(SDS，Pierce)組合的PACAP微粒，評價了這些微粒提供的PACAP穩(wěn)定作用。為了制備評價的PACAP微粒，制備了6種不同的水性溶液。每種溶液包含理想量的溶于其中的PACAP，通過加入稀HCl將制備的6種溶液中的每一種的pH調(diào)至6。制備的第一種水性溶液沒有添加劑(組氨酸緩沖劑、CaCl2、蔗糖或SDS)。用10mM濃度的組氨酸緩沖劑制備了第二種水性溶液。用10mM濃度的組氨酸緩沖劑和10mM濃度的CaCl2配制了第三種水性溶液。用10mM濃度的組氨酸緩沖劑配制了第四種水性溶液，且含有相對于PACAP的重量比為0.5/1(蔗糖/PACAP)的蔗糖。用10mM濃度的組氨酸緩沖劑、10mM濃度的CaCl2和能提供相對于PACAP為0.5/1重量比(蔗糖/PACAP)的蔗糖量，制備了第五種水性溶液。用10mM濃度的組氨酸緩沖劑和0.02重量％的SDS制備了第六種水性溶液。然后使用本文已經(jīng)描述的凍干過程，從6種水性溶液中每一種制備了固態(tài)PACAP微粒。然后將從每種溶液制備的PACAP微粒在60℃儲存2個月，儲存后，使用RP-HPLC和SEC方法評價了包含在各種不同微粒中的PACAP的穩(wěn)定性。如表7所示，組氨酸緩沖劑的存在大大抑制了PACAP聚集體的形成(聚集體的形成大約降低了6倍)。另外，蔗糖、CaCl2和SDS能進一步穩(wěn)定肽，將聚集體的形成降低約14～20倍。
實施例7為了評價CaCl2對在酸性和接近中性的pH制備的PACAP微粒的穩(wěn)定作用，配制了4種不同類型的微粒，在60℃儲存了2個月，然后分析了PACAP降解。從4種不同的水性溶液制備了4種不同的微粒制劑。4種溶液中的每一種都包含理想量的溶于其中的PACAP，并使用稀HCl將每種溶液的pH調(diào)至理想水平。配制的第一種水性溶液不含有添加劑(組氨酸或CaCl2)，且第一種溶液的pH調(diào)至2。配制的第二種水性溶液含有10mM濃度的CaCl2，且第二種溶液的pH調(diào)至2。配制的第三種水性溶液含有10mM濃度的組氨酸緩沖劑，配制的第四種水性溶液含有10mM濃度的組氨酸緩沖劑和10mM濃度的CaCl2。使用本文已經(jīng)描述的凍干過程，從4種水性溶液中每一種制備了固態(tài)PACAP微粒(每種不同微粒的組成見表8)，將從4種中每種溶液制備的PACAP微粒在60℃儲存2個月。將微粒在60℃儲存2個月后，使用RP-HPLC和SEC方法評價了包含在微粒中的PACAP的穩(wěn)定性。如表8所示，該評價的結(jié)果證實，在pH2和6，CaCl2均進一步提高PACAP微粒的穩(wěn)定性(表8)。
權利要求
1.穩(wěn)定化的多肽微粒，其包含多肽和選自金屬離子和糖類的穩(wěn)定劑，所述糖在高達或超過生理條件的溫度在酸性條件下是穩(wěn)定的，該多肽微粒配制成表現(xiàn)出酸性重構pH。
2.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的多肽微粒含有多肽、金屬離子和糖，所述糖在高達和超過生理條件的溫度在酸性pH下是穩(wěn)定的。
3.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑選自二糖和單糖，所述糖在高達和超過生理條件的溫度在酸性條件下是穩(wěn)定的。
4.根據(jù)權利要求3的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑選自海藻糖和甲基-甘露吡喃糖苷。
5.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑包含選自二糖和單糖的穩(wěn)定劑，所述糖在高達和超過生理條件的溫度在酸性條件下是穩(wěn)定的，且該穩(wěn)定劑以穩(wěn)定劑與多肽的重量/重量比為約0.1/1～約1/1包含在多肽微粒中。
6.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑包含選自二糖和單糖的穩(wěn)定劑，所述糖在高達和超過生理條件的溫度在酸性條件下是穩(wěn)定的，且該穩(wěn)定劑以穩(wěn)定劑與多肽的重量/重量比為約0.1/1～約0.5/1包含在多肽微粒中。
7.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑包含選自二糖和單糖的穩(wěn)定劑，所述糖在高達和超過生理條件的溫度在酸性條件下是穩(wěn)定的，且該穩(wěn)定劑以穩(wěn)定劑與多肽的重量/重量比為約0.1/1～約0.25/1包含在多肽微粒中。
8.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑包含源自二價金屬離子鹽的金屬離子。
9.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑包含源自選自CaCl2，MgCl2和ZnCl2的二價金屬離子鹽的金屬離子。
10.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑包含金屬離子，且包含在多肽微粒中的穩(wěn)定劑與多肽的摩爾比范圍為約1/1～約10/1。
11.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑包含金屬離子，且包含在多肽微粒中的穩(wěn)定劑與多肽的摩爾比范圍為約2/1～約6/1。
12.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定劑包含金屬離子，且包含在多肽微粒中的穩(wěn)定劑與多肽的摩爾比為約4/1。
13.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的多肽選自垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽/胰高血糖素超家族。
14.根據(jù)權利要求1的多肽微粒，其中所述的多肽選自垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、生長激素釋放因子、血管活性腸多肽、肽組氨酸甲硫氨酸、腸促胰液素和糖依賴性胰島素釋放多肽。
15.穩(wěn)定化的多肽微粒，其包含垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽和選自海藻糖和甲基-甘露吡喃糖苷的穩(wěn)定糖，其中包含在多肽微粒中的穩(wěn)定糖與垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽的重量/重量比是約0.55/1，且該多肽微粒配制成表現(xiàn)出酸性重構pH。
16.穩(wěn)定化的多肽微粒，其包含垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽和選自Ca2+、Mg2+和Zn2+的穩(wěn)定金屬離子，其中包含在多肽微粒中的金屬離子與垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽的摩爾比是約4/1，且該多肽微粒配制成表現(xiàn)出酸性重構pH。
17.多肽微粒，其包含多肽和2種或多種選自金屬離子、表面活性劑、緩沖劑和糖類的穩(wěn)定劑，所述糖類在高達和超過生理條件的溫度下在接近中性的pH環(huán)境中是穩(wěn)定的，該多肽微粒配制成表現(xiàn)出接近中性的重構pH。
18.根據(jù)權利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽選自垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽/胰高血糖素超家族。
19.根據(jù)權利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽選自垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、生長激素釋放因子、血管活性腸多肽、肽組氨酸甲硫氨酸、腸促胰液素和糖依賴性胰島素釋放多肽。
20.根據(jù)權利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽微粒含有穩(wěn)定糖和選自氨基酸緩沖劑、肽緩沖劑和無機緩沖劑的緩沖劑。
21.根據(jù)權利要求21的多肽微粒，其中穩(wěn)定糖與多肽的重量/重量比范圍為約0.25/1～約1/1。
22.根據(jù)權利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽微粒含有選自氨基酸緩沖劑和肽緩沖劑的緩沖劑和穩(wěn)定金屬離子。
23.根據(jù)權利要求23的多肽微粒，其中金屬離子與多肽的摩爾比范圍為約2/1～約10/1。
24.根據(jù)權利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽微粒包含選自氨基酸緩沖劑和肽緩沖劑的緩沖劑和表面活性劑。
25.根據(jù)權利要求25的多肽微粒，其中所述的表面活性劑占多肽微粒的約0.02重量％至約0.2重量％。
26.根據(jù)權利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽微粒含有選自氨基酸緩沖劑和肽緩沖劑的緩沖劑、表面活性劑、金屬離子和穩(wěn)定糖。
27.根據(jù)權利要求18的多肽微粒，其中所述的表面活性劑包含十二烷基硫酸鈉。
28.根據(jù)權利要求25的多肽微粒，其中所述的表面活性劑包含十二烷基硫酸鈉，且占多肽微粒的約0.02重量％至約0.2重量％。
29.根據(jù)權利要求18的多肽微粒，其中所述的多肽是垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽，且該多肽微粒包含選自氨基酸緩沖劑和肽緩沖劑的緩沖劑和一種或多種另外的穩(wěn)定劑，所述另外的穩(wěn)定劑選自穩(wěn)定糖，包含的穩(wěn)定糖與多肽的重量/重量比范圍為約0.25/1～約1/1；金屬離子，包含的金屬離子與多肽的摩爾比范圍為約2/1～約10/1；和表面活性劑，其占多肽微粒的約0.02重量％至約0.2重量％。
30.穩(wěn)定化的多肽微粒，其包含在酸性條件下是穩(wěn)定的多肽，其中該多肽微粒配制成表現(xiàn)出酸性重構pH。
31.根據(jù)權利要求30的穩(wěn)定化的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定化的多肽微粒配制成表現(xiàn)出低于pH 5的重構pH。
32.根據(jù)權利要求30的穩(wěn)定化的多肽微粒，其中所述的穩(wěn)定化的多肽微粒配制成表現(xiàn)出約pH 2至pH 4的重構pH。
33.根據(jù)權利要求30的穩(wěn)定化的多肽微粒，其中所述的多肽包含選自垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、生長激素釋放因子、血管活性腸多肽、肽組氨酸甲硫氨酸、腸促胰液素和糖依賴性胰島素釋放多肽的多肽，且該微粒配制成表現(xiàn)出低于pH 5的重構pH。
34.根據(jù)權利要求30的穩(wěn)定化的多肽微粒，其中所述的多肽包含選自垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽、胰高血糖素、胰高血糖素樣肽、生長激素釋放因子、血管活性腸多肽、肽組氨酸甲硫氨酸、腸促胰液素和糖依賴性胰島素釋放多肽的多肽，且該微粒配制成表現(xiàn)出約pH 2至pH 4的重構pH。
35.根據(jù)權利要求30的穩(wěn)定化的多肽微粒，其中所述的多肽包含垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽類似物，在60℃儲存2個月后，配制的微粒能回收大于90％的初始垂體腺苷酸環(huán)化酶多肽類似物，且形成低于2％的二聚體。
全文摘要
本發(fā)明包括含有多肽物質(zhì)的固態(tài)多肽微粒，所述多肽物質(zhì)經(jīng)穩(wěn)定能在接近或超過生理條件的溫度抗降解。在每個實施方案中，本發(fā)明的多肽微粒都含有多肽物質(zhì)，其由一種或多種穩(wěn)定條件穩(wěn)定化以抗降解。因為本發(fā)明的多肽微?？梢耘渲瞥山Y(jié)合兩種或多種穩(wěn)定條件的相加作用，當本發(fā)明的多肽微粒包含穩(wěn)定糖時，達到可接受的多肽穩(wěn)定性所需的穩(wěn)定糖的量顯著降低。
文檔編號A61K9/00GK1708314SQ200380102384
公開日2005年12月14日 申請日期2003年10月28日 優(yōu)先權日2002年10月29日
發(fā)明者J·本茨, 康玲玲 申請人:阿爾薩公司