細(xì)胞活性在線檢測和藥物篩選方法及裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及檢測細(xì)胞活性的在線監(jiān)測、抗癌藥物篩選領(lǐng)域。特別是涉及一種基于力學(xué)效應(yīng)的納米微懸臂梁及其在檢測細(xì)胞活性和對抗癌藥物進(jìn)行快速篩選中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]化療目前還是腫瘤的一項(xiàng)有效的治療措施。但用于臨床的抗腫瘤藥物普遍存在選擇性差、毒副作用大、易產(chǎn)生耐藥性等問題，因此繼續(xù)尋找選擇性高、毒副作用小的抗癌藥是抗腫瘤新藥研宄的重點(diǎn)。每年都有大量的植物提取物以及化合物出現(xiàn)，如何進(jìn)行藥物初篩仍是工作的一個重要環(huán)節(jié)。
[0003]細(xì)胞活性是判斷體外培養(yǎng)細(xì)胞在某些條件下是否能正常生長的重要指標(biāo)，如藥物處理、放射性或紫外線照射、培養(yǎng)條件變化等。它是從事相關(guān)方面的科學(xué)研宄的常用手段，更是體外篩選抗腫瘤藥物和臨床腫瘤藥敏試驗(yàn)的重要方法之一。目前常用的方法有很多，如流式細(xì)胞儀、直接染色法、克隆形成試驗(yàn)、比色法等。然而這些傳統(tǒng)方法都比較貴或無法量化細(xì)胞的活性而只能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。另外，這些方法當(dāng)中有些需要熒光或放射性物質(zhì)標(biāo)記。而標(biāo)記過程本身就很繁瑣，標(biāo)記往往會對細(xì)胞生理功能造成破壞從而影響對細(xì)胞重要的生物學(xué)信息的檢測。因此，發(fā)展非標(biāo)記、非侵入、經(jīng)濟(jì)、高效的方法來定量檢測細(xì)胞的活性及其在藥物作用下的變化情況對藥物篩選尤其是對殺滅癌細(xì)胞的抗癌藥物的篩選有著重要的意義。
[0004]本世紀(jì)初，在原子力顯微鏡(AFM)和微機(jī)電系統(tǒng)(MEMS)基礎(chǔ)上發(fā)展起來一種基于力學(xué)效應(yīng)的高靈敏度微懸臂梁生化傳感技術(shù)，當(dāng)其表面發(fā)生生物或化學(xué)反應(yīng)時表面應(yīng)力會發(fā)生改變，當(dāng)這種反應(yīng)控制在微懸臂梁的單側(cè)表面時，其上下表面會產(chǎn)生一個應(yīng)力差從而導(dǎo)致微梁的彎曲變形。通過預(yù)先在微梁的單側(cè)表面上修飾一層探針分子就可以實(shí)現(xiàn)對能與探針分子發(fā)生生物或化學(xué)反應(yīng)的分子進(jìn)行檢測(圖1)。這項(xiàng)技術(shù)無需使用任何熒光物質(zhì)、放射性和酶作為反應(yīng)示蹤劑，消除了標(biāo)記過程的影響，可以實(shí)時原位再現(xiàn)生化反應(yīng)和生物活性變化的反應(yīng)過程。利用光杠桿原理可以高靈敏度檢測出微梁的這種彎曲變形，獲得實(shí)時原位的探針分子與靶標(biāo)分子反應(yīng)過程信息。也可以用微梁共振的動態(tài)模式測量靶標(biāo)分子與探針分子結(jié)合后微梁的質(zhì)量增量引起的共振頻率的漂移。傳統(tǒng)的微梁傳感方法都是利用以上應(yīng)力模式或者共振模式來實(shí)現(xiàn)傳感的。
[0005]作為一項(xiàng)高靈敏的傳感技術(shù)，微梁傳感雖然在分子檢測方面有了很多的研宄，但在細(xì)胞尺度的研宄報道卻幾乎沒有，而細(xì)胞對周圍基質(zhì)的作用(力)情況往往能反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)在的一些信息。我們在本發(fā)明中提出將這項(xiàng)技術(shù)用于細(xì)胞的研宄。我們在將此方法用于檢測細(xì)胞是否存在時，發(fā)現(xiàn)微梁表面吸附細(xì)胞后，除了如預(yù)測的會產(chǎn)生應(yīng)力所引起的靜態(tài)彎曲和質(zhì)量增加導(dǎo)致共振頻率變化外，還發(fā)現(xiàn)了新的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，即微梁的隨機(jī)漲落會明顯增強(qiáng)，而沒有吸附細(xì)胞的裸梁基本沒有什么漲落。因此本發(fā)明提出利用微懸臂梁漲落的結(jié)果來反應(yīng)其表面細(xì)胞的活性情況。當(dāng)具有活性的細(xì)胞在微梁表面時，其新陳代謝過程釋放的能量會引起微懸臂梁的漲落，微梁漲落的幅度反應(yīng)了細(xì)胞的新陳代謝的強(qiáng)弱，而新陳代謝的強(qiáng)弱反應(yīng)了細(xì)胞的活性情況。從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞活性的實(shí)時在線監(jiān)測。漲落的幅度反應(yīng)了細(xì)胞活性的大小，通過計算這種漲落的方差或振幅從而可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞活性的定量檢測。利用這一特性我們就能監(jiān)測細(xì)胞在藥物作用下的實(shí)時活性變化情況。當(dāng)在同一個陣列上的不同梁上吸附上不同細(xì)胞時，在加入同一種藥物時，還可以監(jiān)測同一種藥物對不同細(xì)胞活性的影響，從而可以實(shí)現(xiàn)高通量的藥物篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是:提供一種微納米微懸臂梁，其可用于檢測細(xì)胞的活性并能模擬人體內(nèi)部環(huán)境實(shí)現(xiàn)對能殺滅癌細(xì)胞的抗癌藥物進(jìn)行篩選，構(gòu)建對細(xì)胞活性進(jìn)行實(shí)時在線定量監(jiān)測和對抗癌藥物進(jìn)行高效篩選的傳感系統(tǒng)，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、快速便捷、成本低。
[0007]當(dāng)具有活性的細(xì)胞在微梁表面時，由于其新陳代謝過程釋放的能量會引起微梁的漲落(圖2a)。我們發(fā)現(xiàn)，通過檢測這種漲落的幅度可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞活性的實(shí)時檢測。我們在利用單梁系統(tǒng)對乳腺癌細(xì)胞MCF7的研宄中發(fā)現(xiàn):沒有細(xì)胞的裸梁引起的漲落很小(圖2b)，而吸附有活細(xì)胞的微梁所產(chǎn)生的漲落明顯較大(圖2a，圖4a)，當(dāng)細(xì)胞由于長時間缺乏營養(yǎng)物質(zhì)而死亡時，其漲落又明顯降低(圖4b)。而當(dāng)細(xì)胞由于短時間缺乏營養(yǎng)物質(zhì)活性有所損失但未死亡時，其引起的漲落比活細(xì)胞有所減小，但大于死亡細(xì)胞所引起的(圖4c)。為了進(jìn)一步量化細(xì)胞活性，我們對漲落曲線的方差進(jìn)行了分析(圖3)?；罴?xì)胞引起的微梁漲落曲線的方差遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于沒有細(xì)胞的裸梁和死亡細(xì)胞所引起的，活性有所降低的細(xì)胞引起的微梁漲落曲線的方差正好介于活細(xì)胞和死亡的細(xì)胞之間。利用這一特性可以對細(xì)胞的活性進(jìn)行實(shí)時檢測，并且可以實(shí)現(xiàn)對殺滅癌細(xì)胞的藥物進(jìn)行篩選。利用具有多根梁的陣列可以實(shí)現(xiàn)對多種細(xì)胞活性的檢測以及檢測不同的細(xì)胞在同種藥物作用下的情況，從而實(shí)現(xiàn)對殺滅癌細(xì)胞藥物的高通量篩選。
[0008]要實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞活性的實(shí)時檢測和抗癌藥物的篩選，本發(fā)明的主要技術(shù)方案為:
[0009]I)細(xì)胞在微梁表面的吸附及貼壁
[0010]首先對微梁進(jìn)行預(yù)處理，利用APTES或膠原蛋白等增強(qiáng)細(xì)胞吸附和貼壁的試劑對微梁進(jìn)行包被。然后將處理過的微梁浸泡在要檢測的細(xì)胞懸浮液中，待細(xì)胞在重力作用下落在微梁上后再將微梁放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至細(xì)胞在微梁表面貼壁(如圖2a中所示)O
[0011]2)細(xì)胞活性的實(shí)時監(jiān)測
[0012]微梁表面的細(xì)胞貼壁后，將微梁固定在微梁傳感裝置的池子里。加入緩沖液，排除池子里的氣泡使其里面充滿液體。通過檢測微梁尖端反射的激光在光電位置敏感器(PSD)靶面上的位移實(shí)現(xiàn)對微梁的漲落進(jìn)行實(shí)時檢測(圖2c)，從而反應(yīng)出其上面的細(xì)胞活性的變化情況。
[0013]3)藥物的篩選
[0014]加入不同的藥物，監(jiān)測在不同的藥物作用下微懸臂梁漲落的變化情況，實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞在不同藥物作用下的活性變化情況的檢測，從而實(shí)現(xiàn)對殺滅癌細(xì)胞藥物的篩選。檢測癌變細(xì)胞和正常細(xì)胞(如乳腺癌細(xì)胞MFC7和正常的乳腺細(xì)胞)在同一種藥物作用下的活性變化情況，篩選出能殺滅癌細(xì)胞而對正常細(xì)胞殺傷力小的藥物。
[0015]本發(fā)明基于表面應(yīng)力效應(yīng)的微懸臂梁傳感技術(shù)，通過檢測細(xì)胞引起的微梁漲落大小來實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞活性的檢測，其優(yōu)點(diǎn)有:(1)通過計算細(xì)胞引起的漲落曲線的方差可以對細(xì)胞的活性進(jìn)行定量檢測；(2)細(xì)胞在梁上貼壁后就可以對細(xì)胞的活性進(jìn)行檢測，一步完成，操作簡單；(3)基于微梁漲落模式檢測細(xì)胞的活性是基于活細(xì)胞對微梁的作用力來實(shí)現(xiàn)的，不需要對細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行顏色標(biāo)記；(4)微梁的漲落被PSD實(shí)時記錄下來，從而對細(xì)胞活性的檢測也是實(shí)時的；(5)通過化學(xué)物理方法可以除去微梁表面的細(xì)胞從而微梁可以恢復(fù)到開始使用前的狀態(tài)，這樣微梁可以重復(fù)使用，檢測的成本和藥物篩選的成本低。
[0016]更具體地，本發(fā)明提供以下各項(xiàng):
[0017]1.微懸臂梁用于制備用于通過以下方法檢測細(xì)胞活性的系統(tǒng)的用途:
[0018]使所述細(xì)胞與微懸臂梁結(jié)合；和
[0019]測量并計算結(jié)合有所述細(xì)胞的微懸臂梁的漲落曲線的方差或振幅，從而確定所述細(xì)胞的相對活性。
[0020]2.根據(jù)I所述的方法，其中所述細(xì)胞通過以下方式與微懸臂梁結(jié)合:用增強(qiáng)細(xì)胞吸附和貼壁的試劑包被所述微懸臂梁；將所述包被的微懸臂梁浸泡在所述細(xì)胞的懸浮液中；待所述細(xì)胞在重力作用下落在所述包被的微懸臂梁上后，再將落有所述細(xì)胞的所述微懸臂梁放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至所述細(xì)胞在所述微懸臂梁表面貼壁。
[0021]3.根據(jù)I所述的方法，其中通過以下方式測量結(jié)合有所述細(xì)胞的微懸臂梁的漲落:將結(jié)合有所述細(xì)胞的微懸臂梁置于包括激光器和光電位置敏感器的微懸臂梁傳感系統(tǒng)中；以及，測量所述微懸臂梁的尖端反射的由所述激光器發(fā)出的激光在所述光電位置敏感器靶面上的位移。
[0022]4.根據(jù)I所述的用途，其中所述增強(qiáng)細(xì)胞吸附和貼壁的試劑是3-氨丙基三乙氧基硅烷或膠原蛋白，所述微懸臂梁優(yōu)選是單側(cè)鍍金的氮化硅微懸臂梁。
[0023]5.利用微懸臂梁篩選能夠減弱癌細(xì)胞活性的藥物的方法，所述方法包括:
[0024]使所述癌細(xì)胞與微懸臂梁結(jié)合；
[0025]用待檢測的藥物處理結(jié)合有所述癌細(xì)胞的微懸臂梁；和
[0026]測量并計算用所述藥物處理的和未用所述藥物處理的結(jié)合有所述癌細(xì)胞的微懸臂梁的漲落曲線的方差或振幅，
[0027]其中，與未用所述藥物處理的結(jié)合有所述