一種蚯蚓多肽、其編碼序列及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蚯蚓多肽、其編碼序列及其應(yīng)用。揭示了一種來源于蚯蚓的新的多肽，編碼該多肽的多核苷酸，該多肽具有抗腫瘤的功能。
【專利說明】
一種蚯蚓多肽、其編碼序列及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：更具體地，本發(fā)明涉及分離自蚯蚓的一種具有 抗腫瘤功能的多肽，編碼該多肽的多核苷酸，以及該多肽的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蚯蚓俗稱曲蟮，中藥稱地龍，地龍性寒味咸，具有清熱、平肝、止喘、降壓、抑菌及活 血化瘀等功效，已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)中藥中治療多種疾病，如高熱狂燥，驚風(fēng)抽搐，風(fēng)熱頭痛， 目赤、半身不遂等。到了上世紀(jì)80年代，又陸續(xù)報道蚯蚓抽提物對多種癌細(xì)胞具有抑制作 用，并在初步臨床應(yīng)用中取得了一定的抑癌效果（第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1986,7(2) :85;中國 腫瘤臨床，1991,18(2) :131 ;生物化學(xué)與生物物理學(xué)報，2002,34(5) :576;腫瘤醫(yī)學(xué)雜志， 2007,12(1) :16;江蘇醫(yī)藥，2008,34(4) :383)。
[0003] 在中國專利ZL200510112490. 5中，揭示了一種分離自威廉腔環(huán)蚓廣譜抑制癌細(xì) 胞生長的蚯蚓蛋白，命名為"EFE6蛋白"。
[0004] 但是，蚯蚓中是否還有對于抑癌有效的成份及其作用機(jī)理目前仍然知之甚少，本 領(lǐng)域有必要進(jìn)行進(jìn)一步的研究探索，找到其它有效成分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種蚯蚓多肽、其編碼序列及其應(yīng)用。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多肽，該多肽選自下組：
[0007] (a)具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽；或
[0008] (b)將SEQ ID N0:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個（如1-30個，更佳地1-20個，更 佳地1-10個，更佳地1-5個或1-3個）氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗 腫瘤功能的由（a)衍生的多肽；
[0009] (c)與SEQ ID N0:2氨基酸序列具有80 %以上（較佳地90 %以上；更佳地95 %以 上；更佳地98%以上或99%以上）的序列相同性的，且具有抗腫瘤功能的多肽；
[0010] (d)SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽的片段，其具有抗腫瘤功能；或
[0011] (e)在（a)多肽的N或C末端添加標(biāo)簽序列，或在其N末端添加信號肽序列構(gòu)成的 多肽。
[0012] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸編碼所述的多肽。
[0013] 在一個優(yōu)選例中，該多核苷酸具有SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體。
[0016] 在一個優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞不是可繁殖為動植物的細(xì)胞。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備所述多肽的方法，該方法包含：
[0018] (1)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；
[0019] ⑵從培養(yǎng)物中分離出所述的多肽。
[0020] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多肽的用途，所述的多肽用于制備抑制腫瘤的 藥物。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備抑制腫瘤的藥物組合物，它含有所述的 多肽（較佳地，該多肽在藥物組合物中為安全有效量的）以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備抑制腫瘤的藥盒，所述藥盒中包含所述 的藥物組合物。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種能與所述的多肽特異性結(jié)合的抗體。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種抑制腫瘤的方法，所述方法包括：給予腫瘤患者有 效量的所述的多肽，或給予腫瘤患者所述的藥物組合物。
[0025] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0026] 圖1、蚯蚓抑癌蛋白質(zhì)在HPLC中的層析圖譜。其中，星號所示的峰為感興趣的抗腫 瘤多肽組分的峰。
[0027] 圖2、從蚯蚓中分離的抑制腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜。其中，泳道1為標(biāo) 準(zhǔn)分子量蛋白Marker，泳道2、3為上樣量不同的抗腫瘤多肽。
[0028] 圖3、蚯蚓抗腫瘤多肽的質(zhì)譜鑒定結(jié)果。
[0029] 圖4、蚯蝴抗腫瘤多肽的N-端測序結(jié)果。
[0030] 圖5、蚯蚓抗腫瘤多肽PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶。其中，泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)，泳道 2、3為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
[0031] 圖6、蚯蚓抗腫瘤多肽的基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列。
[0032] 圖7、蚯蝴抗腫瘤多肽對多種癌細(xì)胞生長的抑制作用。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明人致力于抗腫瘤功能性多肽的研究，經(jīng)過廣泛而深入的研究，揭示了一種 來源于蚯蚓的新的多肽，該多肽具有抗腫瘤的功能以及水解纖維蛋白的功能。
[0034] 本發(fā)明人首先從赤子愛勝蝴（Eisenia foetida)抽提物中分離到一種分子量為 24663. 0道爾頓的抑制腫瘤細(xì)胞生長的多肽，測定了該多肽N端的一端氨基酸序列為見12-V-I-G-G-T-D-A-A-P-G-E-F-P-W-Q-L-(SEQ ID N0 :3)，并以此為依據(jù)合成了相應(yīng)的簡并引 物。然后，利用新鮮的活體赤子愛勝蚓分離抽提總RNA，以此RNA為模板經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA， 用PCR法擴(kuò)增和克隆了蚯蚓抗腫瘤多肽的基因，然后將蚯蚓抗腫瘤多肽的編碼序列插入到 T載體并轉(zhuǎn)入到合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而測定了該多肽的基因的全序列，翻譯得到 該抗腫瘤多肽完整的氨基酸序列。
[0035] 如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從原始環(huán)境中分離出來（如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其它物質(zhì)分開，則為分離純化的。
[0036] 如本文所用，"分離的多肽（或蛋白）"是指所述多肽基本上不含天然與其相關(guān)的 其它蛋白質(zhì)、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化該 蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。多肽的純度能用于 氨基酸序列分析。
[0037] 如本文所用，所述的"抗腫瘤多肽"與"抑癌多肽"可互換使用；所述的"抗腫瘤功 能"與"抑癌功能"可互換使用。
[0038] 本發(fā)明還包括所述的抗腫瘤多肽的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"片 段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的來源于蚯蚓的天然抗腫瘤多肽相同的 生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個或多個 保守或非保守行氨基酸殘基（優(yōu)先保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨 基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有 取代基團(tuán)的多肽，或（iii)成熟多肽與另一個化合物（比如延長多肽半衰期的化合物，如聚 乙二醇）融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽 (如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白質(zhì)原序列）。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這 些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0039] 在本發(fā)明中，術(shù)語"抗腫瘤多肽"指具有抑癌活性的SEQ ID N0:2序列的多肽。該 術(shù)語還包括具有與所述的抗腫瘤多肽相同功能的、SEQ ID N0:2序列的變異形式。這些變 異形式包括（但并不限于）：一個或多個（通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個， 最佳地1-10個）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失 一個或數(shù)個（通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi)）氨基酸。例如， 在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變多肽的功能。又比如， 在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù) 語還包括了所述的抗腫瘤多肽的活性片段和/或活性衍生物。
[0040] 該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo) 突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與所述抗腫瘤多肽的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)、 以及利用抗所述抗腫瘤多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0041] 發(fā)明還提供了所述的抗腫瘤多肽的類似物。這些類似物與分離自蚯蚓的天然抗腫 瘤多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或 者兼而有之。這些多肽包括天然的遺傳變異體。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸 的殘基（如D-氨基酸）的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ -氨 基酸）的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性多肽。
[0042] 修飾（通常不改變一級結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 ?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工過程中或進(jìn)一步加工步驟 中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶（如哺 乳動物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷 酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸）的序列，還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能 或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
[0043] 在本發(fā)明中，"抗腫瘤多肽的保守性變異多肽"是指與SEQ ID Ν0:2的氨基酸序列 相比,有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似 或相近的氨基酸所替換而形成的多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換 而產(chǎn)生。
[0044] 表 1
[0045]
[0046]
[0047] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。其中DNA形式包括cDNA、基因組 DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的，可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成 熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO: 1所示的編碼區(qū)序列相同或是簡并的變異體。如 本文所用，"兼并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)，但是與SEQ ID NO: 1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
[0048] 編碼SEQ ID N0:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成 熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附加編碼序列） 以及非編碼序列。
[0049] 術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括 附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0050] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非 天然發(fā)生的變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一 個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
[0051] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多 核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指：（1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度 下雜交和洗脫，如〇. 2XSSC，0. 1%SDS，60°C;或（2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v)甲酰 胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或（3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90% 以上，更好使95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID N0:2 所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
[0052] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的長度至 少含15個核苷酸，較好的至少30個核苷酸，更好的至少50個核苷酸，最好是至少100個核 苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)（PCR)以確定和/或分離編碼所述的抗腫瘤多 肽的多聚核苷酸。
[0053] 本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
[0054] 本發(fā)明的多核苷酸的全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合 成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放讀 碼框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的 cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò) 增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0055] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0056] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化 學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明的多肽（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可將該DNA 序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載體）和細(xì)胞中。此外，還可通過化 學(xué)合成將突變引入本發(fā)明的多肽序列中。
[0057] 應(yīng)用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增 DNA/RNA 的方法（Saiki 等，Science 1985 ;230 :1350-1354)被 優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優(yōu)選使用RACE 法（RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法），用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息 適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/ RNA片段。
[0058] 利用本發(fā)明的抗腫瘤多肽，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與所述的抗腫瘤多 肽發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
[0059] 本發(fā)明的抗腫瘤多肽及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn) 行施用（給藥）時，可提供不同的效果。尤其是，本發(fā)明的抗腫瘤多肽可用于抑制腫瘤或腫 瘤細(xì)胞（體內(nèi)或體外）的生長。
[0060] 所述的腫瘤可以為各種良性或惡性腫瘤，如黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺 癌、肺癌、腦腫瘤、卵巢癌、骨腫瘤、結(jié)腸、甲狀腺腫瘤、縱隔腫瘤、小腸腫瘤、腎腫瘤、腎上腺 腫瘤、膀胱腫瘤、睪丸腫瘤、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等。例如，腫瘤例子包 括但并不限于：各種實體腫瘤，如肺癌、肝癌、胃癌、腸癌。
[0061] 通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其 中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括（但并不限 于）：肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
[0062] 本發(fā)明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于抗腫瘤治療。在使用本發(fā)明所述的 抗腫瘤多肽時，還可同時使用其他治療劑，如紫杉醇等。
[0063] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明的多肽以及藥學(xué)上 可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙 醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式， 例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠 囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜 在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約 5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
[0064] 使用藥物組合物時，是將安全有效量的所述的抗腫瘤多肽施用于哺乳動物，其中 該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/20千 克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還 應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0065] 所述的抗腫瘤多肽的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。多種表達(dá)載體，也包括 來源于病毒的表達(dá)載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺病毒相關(guān)病毒、單純皰疹病毒、細(xì)小病毒 等，可用于將編碼本發(fā)明的抗腫瘤多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。構(gòu)建攜帶該多核苷酸的 重組病毒載體的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0066] 能與所述的抗腫瘤多肽結(jié)合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié) 合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫而獲得。篩選時，必須對所述的抗腫瘤多肽分子進(jìn)行標(biāo)記。 [0067] 本發(fā)明的多肽可為治療癌癥相關(guān)疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應(yīng)用前 旦 -5^0
[0068] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0069] 從繁雜的蚯蚓抽提物中純化到單一純度的抗腫瘤多肽，此抗腫瘤多肽對培養(yǎng)的正 常細(xì)胞是無毒或低毒的。本發(fā)明不僅為開發(fā)研究蚯蚓抗腫瘤多肽的基因工程產(chǎn)品創(chuàng)造了良 好的條件，也為開發(fā)蚯蚓抗腫瘤多肽針劑應(yīng)用于臨床治療腫瘤疾病提供了必要的化學(xué)結(jié)構(gòu) 資料，因而具有巨大的應(yīng)用前景。
[0070] 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0071] 實施例1、從蚯蚓中分離純化天然的抑癌蛋白質(zhì)
[0072] 本發(fā)明人主要采用了赤子愛勝蚓進(jìn)行抽提并分離純化，以獲得具有抑癌活性的組 份。
[0073] 首先制備粗的蚯蚓粉，取鮮活蚯蚓若干，洗凈后經(jīng)機(jī)械搗碎，加入冰冷的丙酮（或 乙醇）脫水，所得沉淀晾干，即為粗蚯蚓粉，儲藏_20°C冰箱中備用。
[0074] 取粗蚯蚓粉若干，加兩倍體積的水浸泡過夜，次日以5000rmp冷凍離心，收集上清 液并裝入透析袋對水透析24小時，再以5000rmp冷凍離心，上清液經(jīng)冷凍干燥成凍干粉，純 化時取凍干粉少許以緩沖液溶解，然后經(jīng)離子交換和凝膠過濾層析分離，得到了一組抑癌 蛋白質(zhì)組份。
[0075] 本發(fā)明人對獲得的抑癌蛋白質(zhì)組分進(jìn)行了 HPLC分析，得到單一的抗腫瘤多肽組 分見圖1。具體地，依據(jù)下列兩種鑒定方法確定為單一組份。
[0076] 本發(fā)明人對獲得的抗腫瘤多肽組分進(jìn)行了 SDS-PAGE分析為單一條帶，見圖2。
[0077] 本發(fā)明人對獲得的抗腫瘤多肽組分進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示該樣品為24663. 0 道爾頓的單一組分，見圖3。
[0078] 實施例2、蚯蚓抗腫瘤多肽N-端20個氨基酸序列測定
[0079] 純化的蚯蚓抗腫瘤多肽樣品在PE491蛋白質(zhì)測序儀上經(jīng)過20個循環(huán)，測得的 N-端氨基酸序列為VIGGTDAAPGEFPWQL_T_(SEQIDN0:3)，見圖4。
[0080] 實施例3、引物的設(shè)計和合成
[0081] 根據(jù)實施例2測得的蚯蚓抗腫瘤多肽的N-端序列，設(shè)計兩條上游寡核苷酸兼并引 物為：
[0082] 5 ' -GT (T/C/A/G) AT (T/C/A) GG (T/C/A/G) GG (T/C/A/G) AC (T/C/A/G) GA (T/C) GC-3'（SEQ ID N0:4)和 5'-CC(T/C/A/G)GG(T/C/A/G)GA(A/G)TT(T/C/)CC(T/C/A/G) TGGCA(A/G)-3'（SEQ ID N0:5)(括號內(nèi)為兼并核苷酸），由于缺乏蚯蚓抗腫瘤多肽的C-端 氨基酸序列信息，下游引物選用TaKaRa3' -RACE試劑盒里的通用引物，引物合成委托上海 鉬尚生物技術(shù)有限公司完成。
[0083] 實施例4、總RNA的提取
[0084] 取新鮮的活體蚯蚓1-2條，在液氮中研磨成粉，加 2ml Trizol試劑，將研磨成粉 狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。 將勻漿轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，室溫靜置5分鐘，12000g 4°C離心5分鐘，上清液吸入新的離心管 (切勿吸取沉淀）。向上清液中加入〇. 2ml氯仿，充分振蕩至乳化溶液呈乳白狀后，再室溫 靜置5分鐘，然后12000g 4°C離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，向其中加入 等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫下靜置10分鐘，12000g 4°C離心10 分鐘，小心棄去上清，收集沉淀。緩慢沿離心管壁加入lml 75%乙醇，輕輕上下顛倒洗滌離 心管管壁，12000g 4°C離心5分鐘后小心棄去乙醇，敞口于空氣中干燥5-10分鐘，使乙醇充 分揮發(fā)，加入50 μ 1 DEPC水溶解，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。
[0085] 實施例5、巢式PCR擴(kuò)增蚯蝴抗腫瘤多肽基因
[0086] 以實施例4中制得的蚯蚓總RNA為模板，利用TaKaRa公司的3'_RACE試劑盒進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄，按試劑盒中的操作說明書進(jìn)行。
[0087] 使用實施例3中的合成引物，以上述所得cDNA為模板，進(jìn)行外圍PCR擴(kuò)增，總反應(yīng) 體系 20μ 1，其中模板 1μ 1，上游引物（SEQ ID N0 :4)1μ 1(10μΜ/μ l)，TaKaRa3'-RACE 試 劑盒提供的下游引物（1〇μΜ/μ 1)1μ 1，高保真酶 0. 25μ 1(5ιι/μ 1)，dNTP(2. 5ιηΜ)1μ 1，反 應(yīng)條件是先94°C變性3分鐘，然后進(jìn)入循環(huán)，94°C 30秒，56°C退火30秒，72°C延伸1分鐘， 進(jìn)行25個循環(huán)，最后72°C保溫lOmin，得到的PCR產(chǎn)物作為下輪PCR的模板。
[0088] 取外圍PCR產(chǎn)物1μ 1作為模板進(jìn)行內(nèi)圍PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系5〇μ 1，上游引 物（SEQ ID NO :5) 2 μ 1 (10 μ Μ/ μ 1)，TaKaRa3' -RACE 試劑盒提供的下游引物（10 μ Μ/ μ 1) 2 μ 1，高保真酶0. 5 μ 1 (5u/ μ 1)，dNTP (2. 5mM) 2 μ 1，反應(yīng)條件與前者完全相同，取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢查，擴(kuò)增出一條約l〇〇〇bp的DNA片段，見圖5。
[0089] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后用天根公司膠回收試劑盒回收，溶于50μ 1的滅菌水 中，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0090] 實施例6、蚯蝴抗腫瘤多肽的基因克隆
[0091] 取PCR產(chǎn)物電泳條帶的回收產(chǎn)物3μ 1與T-載體1 μ 1連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)藍(lán)白斑篩選， 酶切和PCR鑒定，獲得陽性克隆。
[0092] 實施例7、蚯蝴抗腫瘤多肽的基因的鑒定
[0093] 實施例6中獲得的陽性克隆上海鉬尚生物技術(shù)有限公司測定，基因全序列和編碼 的蛋白質(zhì)序列見SEQ ID NO: 1和SEQ ID Ν0:2,或見圖6。該成熟蛋白的cDNA具有714個 核苷酸（SEQ ID NO: 1中第1-714位（不含起始密碼子和終止密碼子）），即238個氨基酸。 經(jīng)電腦軟件分析該蛋白質(zhì)的分子量為24663道爾頓，等電點為4. 19。
[0094] 實施例8、蚯蝴抗腫瘤多肽對多種培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的抑制作用
[0095] 在本實施例中，分別選用了下列幾種常規(guī)的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行抑制試驗：95_D (人肺 癌細(xì)胞），PLC/PRF/5 (人肝癌細(xì)胞），HCT-8 (人腸癌細(xì)胞），N-87 (人胃癌細(xì)胞）。上述腫瘤 細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。
[0096] 各種細(xì)胞分為對照組和測試組，測試組中給予上述蚯蚓抗腫瘤多肽（SEQ ID N0:2)處理，終濃度為50μ g/ml。給藥24小時，48小時和72小時后，與對照組細(xì)胞相比。
[0097] 結(jié)果如圖7,發(fā)現(xiàn)加入蚯蚓抗腫瘤多肽的測試組中腫瘤細(xì)胞生長均發(fā)生明顯抑制， 可見蚯蚓抗腫瘤多肽有明顯的抗腫瘤效果。
[0098] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種分離的多肽，其特征在于，該多肽選自下組： (a) 具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或 (b) 將SEQ ID N0:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成 的，且具有抗腫瘤功能的由（a)衍生的多肽； (c) 與SEQ ID N0:2氨基酸序列具有80%以上的序列相同性的，且具有抗腫瘤功能的 多肽； (d) SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽的片段，其具有抗腫瘤功能；或 (e) 在（a)多肽的N或C末端添加標(biāo)簽序列，或在其N末端添加信號肽序列構(gòu)成的多 肽。2. -種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述多肽。3. 如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸具有SEQ ID NO: 1所示的核 苷酸序列。4. 一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。5. -種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的載體。6. -種制備權(quán)利要求1所述多肽的方法，其特征在于，該方法包含： (1) 培養(yǎng)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞； (2) 從培養(yǎng)物中分離出權(quán)利要求1所述的多肽。7. 權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，所述的多肽用于制備抑制腫瘤的藥物。8. 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤包括：肺癌，肝癌，腸癌，胃癌。9. 一種用于制備抑制腫瘤的藥物組合物，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的多肽 以及藥學(xué)上可接受的載體。10. -種用于制備抑制腫瘤的藥盒，其特征在于，所述藥盒中包含權(quán)利要求8所述的藥 物組合物。
【文檔編號】C07K14/435GK105884876SQ201510039295
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年1月26日
【發(fā)明人】季軍捷, 徐少瓊, 李振, 朱洪, 張勇, 鄭翠玲, 單輝, 劉小龍, 周海洋, 周元聰, 戚正武
【申請人】中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 濟(jì)寧華能制藥廠有限公司