專利名稱：對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)異常的測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于對(duì)組織，細(xì)胞或體液樣品中細(xì)胞的檢查，目的在于發(fā)覺細(xì)胞生長(zhǎng)的異常性，特別是發(fā)覺潛在的(或真實(shí)的)癌細(xì)胞。本發(fā)明特別可用于篩選來自婦女的樣品如子宮頸涂片，以便發(fā)現(xiàn)這些婦女子宮頸細(xì)胞的異常。本發(fā)明還可用于檢查其它組織樣品中的細(xì)胞，包括乳腺，如在此通過實(shí)驗(yàn)所證明的。對(duì)于發(fā)現(xiàn)是異常的樣品可作更詳細(xì)的檢驗(yàn)，并且可對(duì)組織中細(xì)胞的狀態(tài)作進(jìn)一步的檢查。發(fā)現(xiàn)惡性的或惡性前狀態(tài)之后，可隨之通過適當(dāng)?shù)奶幚恚M(jìn)行更深入的診斷程序。
本發(fā)明是基于如下驚人的發(fā)現(xiàn)可將一種特異性結(jié)合分子用于檢測(cè)異常的細(xì)胞，這種特異性結(jié)合分子針對(duì)DNA復(fù)制起始前復(fù)合物的特殊蛋白質(zhì)。針對(duì)Cdc6的結(jié)合分子對(duì)本發(fā)明特別有用。針對(duì)MCM蛋白，特別是MCM5的結(jié)合分子也特別有用。在此列舉的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，針對(duì)Cdc6的特異性結(jié)合分子，以及還有那些針對(duì)MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6或MCM7的特異性結(jié)合分子，與抗PCNA和Ki67的抗體相比較，對(duì)于指示組織樣品中細(xì)胞生長(zhǎng)的異常性要有效得多。以前的研究者本應(yīng)預(yù)料到，Cdc6和MCM′s將得到與Ki67和PCNA類似的結(jié)果，因?yàn)樗械倪@些蛋白質(zhì)都可被認(rèn)為是“增殖標(biāo)志”。對(duì)于經(jīng)受抗原提取處理(加壓蒸煮或高壓滅菌處理)的子宮頸樣品，下面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)際上對(duì)于所有的這些樣品，得到的結(jié)果是相似的，但是，對(duì)于子宮頸涂片和冷凍樣品，存在明顯的差異。主要以篩選為目的的這樣一些樣品，都不是穩(wěn)定到足以經(jīng)受加壓蒸煮。從篩選的角度特別重要的是，使用抗-Cdc6或抗MCM結(jié)合分子檢查子宮頸樣品得到了非常有力和明確的結(jié)果，顯示出對(duì)異常細(xì)胞的高水平染色，以及對(duì)LSIL樣品充分濃密的染色。這表明，對(duì)于檢查取自子宮頸上皮表面的涂片樣品是有效的，確實(shí)，在此已實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這點(diǎn)。對(duì)于HSIL樣品也觀察到充分濃密的染色。
通過實(shí)驗(yàn)檢查乳腺組織，尿液，血液和血清中的異常性，證實(shí)本發(fā)明具有通用性。借助于可自動(dòng)化操作的生物化學(xué)方法，通過將相同的抗體用于檢測(cè)體液中是否存在發(fā)育異常的或贅生性細(xì)胞，提供了進(jìn)一步的證據(jù)。在此已證明的實(shí)例包括，通過分析尿液檢查膀胱癌，以及通過分析血液檢查白血病和淋巴瘤。用于這種分析的適合方法是解離增強(qiáng)鑭熒光免疫測(cè)定(Dissociation Enhanced LanthanideFluorescence Immunoassay)“DELFIA”。證據(jù)還包括，借助于DELFIA對(duì)血液的分析檢測(cè)肉瘤和癌癥病例。
子宮頸上皮基本上由二種不同類型的細(xì)胞組成扁平上皮細(xì)胞和柱狀上皮細(xì)胞，每種細(xì)胞位于組織中不同的解剖區(qū)域。扁平上皮位于子宮頸開口(OS)的外表面(外子宮頸)，而柱狀上皮延伸進(jìn)入子宮頸內(nèi)的導(dǎo)管(內(nèi)子宮頸)。這二種不同類型的上皮細(xì)胞在子宮頸開口附近相互接觸，形成扁平-柱狀結(jié)合。扁平-柱狀結(jié)合是臨床上重要的部位，因?yàn)榇蠖鄶?shù)惡性腫瘤正是發(fā)生在此區(qū)域。為了能有效地診斷，子宮頸涂片樣品應(yīng)該包括來自此區(qū)域的細(xì)胞。為了確保能達(dá)到此目的，涂片應(yīng)該包含柱狀上皮細(xì)胞和扁平上皮細(xì)胞。
絕大多數(shù)在扁平-柱狀結(jié)合發(fā)生的子宮頸瘤來自扁平上皮，此扁平上皮是一個(gè)處于不斷更新狀態(tài)的，動(dòng)態(tài)的多層干細(xì)胞系統(tǒng)。干細(xì)胞區(qū)本身位于鄰近基質(zhì)膜的基底細(xì)胞層中。干細(xì)胞分裂產(chǎn)生副基底細(xì)胞，中間型細(xì)胞和表面細(xì)胞三種衍生成分。這通常是根據(jù)它們的特征形態(tài)和在扁平上皮中的位置來確定。從位于扁平上皮最深層的基底細(xì)胞轉(zhuǎn)變成位于其表面的表層細(xì)胞，涉及到逐步分化和喪失增殖能力的過程，直至最后分化成位于子宮頸表面的表面扁平上皮細(xì)胞。
在異常發(fā)育狀態(tài)下，當(dāng)細(xì)胞發(fā)展通過扁平上皮時(shí)，出現(xiàn)細(xì)胞增殖增加，伴隨著細(xì)胞分化減少。通常，首先為方便起見，對(duì)子宮頸的篩選檢查包括檢查取自其上皮表面的涂片，細(xì)胞病理學(xué)家尋找代表由于異常發(fā)育而降低分化的表面異常性。
在胎兒后期階段，青春期以及妊娠過程中，在結(jié)合處的柱狀上皮通過組織轉(zhuǎn)化過程由扁平上皮取代了。取代柱狀細(xì)胞的組織轉(zhuǎn)化性扁平細(xì)胞，特別易受致癌因子的攻擊。不應(yīng)該將正常的組織轉(zhuǎn)化與扁平上皮內(nèi)不正常的異常發(fā)育相混淆，從篩選的角度，能夠區(qū)分組織轉(zhuǎn)化細(xì)胞和異常發(fā)育細(xì)胞，是重要的。
盡管有充分的和昂貴的國(guó)家篩選檢查計(jì)劃，子宮頸癌仍然是英國(guó)婦女第八位最常見的惡性腫瘤，并且是35歲以下婦女中最常見的惡性腫瘤(癌癥研究戰(zhàn)役，子宮頸癌，1994，CRC倫敦)。在發(fā)展中國(guó)家，子宮頸癌是35-45歲的婦女中最常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致死亡的主要原因，估計(jì)每年有437，000新增病例(癌癥研究戰(zhàn)役，癌癥-世界透視，1995，CRC倫敦)。
大多數(shù)病例表現(xiàn)為扁平細(xì)胞癌(SCC)，并且與“高危險(xiǎn)”型人乳頭狀病毒如16，18和31的感染密切相關(guān)(Park等，癌，1995，76(增刊10)p.1902-13)。子宮頸癌適合于通過人群篩選檢查來預(yù)防，因?yàn)樗陌l(fā)展要通過明確認(rèn)識(shí)的非侵害性“上皮內(nèi)”階段(Wright等，子宮頸的癌前損傷，見Blaustein女性生殖道病理學(xué)，R.J.Kurman編著，1994，Springer-Verlag紐約，p.229-78)?？蓱?yīng)用3層(CIN)或2層(Bethesda)系統(tǒng)對(duì)扁平上皮內(nèi)的異常性進(jìn)行分類。不同的組織學(xué)異常一般與感染的HPV類型相關(guān)連，并且與DNA倍數(shù)性，純系性和自然損傷史有關(guān)。當(dāng)以Bethesda系統(tǒng)分類時(shí)，相應(yīng)于CIN1和子宮頸HPV感染(HPVI)的低程度扁平上皮內(nèi)損傷(LSIL)，一般代表有效的HPV感染，具有比較低的發(fā)展成侵入性疾病的危險(xiǎn)性(Wright and Kurman.有關(guān)子宮頸入侵前損傷形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)的主要述評(píng)轉(zhuǎn)換此范例的科學(xué)基礎(chǔ)，見乳頭狀瘤病毒評(píng)述有關(guān)乳頭狀瘤病毒的研究現(xiàn)狀，C.Lacey編著，1996，Leeds大學(xué)出版Leeds)。與CIN1(LSIL)相比較，相應(yīng)于CIN2和CIN3的高程度扁平上皮內(nèi)損傷(HSIL)顯示出較高的發(fā)展危險(xiǎn)性，雖然認(rèn)為這二者都代表惡性腫瘤的潛在性預(yù)兆。盡管有可能對(duì)每種上皮內(nèi)損傷評(píng)估其惡性腫瘤的大致危險(xiǎn)性，但是，目前還不可能對(duì)單個(gè)病例確定其發(fā)展的大致可能性。
1943年P(guān)apanicolau和Trout引入了Pap涂片試驗(yàn)，以便發(fā)現(xiàn)婦女的先兆性子宮頸癌。這是一種細(xì)胞學(xué)篩選檢查試驗(yàn)，已證明很可能是為預(yù)防癌癥而引入的最成功的公眾健康措施。在大規(guī)模篩選檢查方案中，對(duì)婦女每3-5年至少作一次子宮頸涂片檢查，已證明在某些國(guó)家這種大規(guī)模篩選檢查措施，對(duì)降低子宮頸癌的死亡率和發(fā)病率非常有效。例如在英國(guó)的Columbia和Finland，有組織地篩選檢查使子宮頸癌的死亡率降低了70％。如果早發(fā)現(xiàn)，子宮頸癌是容易治療的。
盡管取得了這些成績(jī)，但是，全世界的現(xiàn)實(shí)情況令人沮喪。在每年幾十萬發(fā)生子宮頸癌的婦女中，50％以上將死于這種疾病。所有這些婦女的75％是在發(fā)展中國(guó)家，在這些國(guó)家由于財(cái)政限制，應(yīng)用現(xiàn)有的方法作大規(guī)模篩選檢查的計(jì)劃是不可行的。即使在許多發(fā)達(dá)國(guó)家，在過去的十年中這種疾病的下降也不顯著，而細(xì)胞學(xué)篩選檢查的效果與所期望的相隔甚遠(yuǎn)。此外，專家觀察到，在定期作篩選檢查的病人，特別是年輕婦女中，有一個(gè)侵害性子宮頸癌病例的基本比例。
為什么細(xì)胞學(xué)篩選檢查有時(shí)不能發(fā)現(xiàn)子宮頸癌的主要原因是，二次檢查之間的間隔時(shí)間太長(zhǎng)，以及假陰性結(jié)果的數(shù)量太多(10-30％)(Pap細(xì)胞學(xué)篩選檢查獲得了最大的好處嗎？WHO and EUROGIN公報(bào)，關(guān)于子宮頸癌控制的報(bào)告，新聞公報(bào)WHO/25，1997年3月)。
大量的假陰性結(jié)果反映了如下事實(shí)分析Pap涂片是一種最困難的形態(tài)學(xué)實(shí)踐。與細(xì)針吸取法，體液細(xì)胞學(xué)檢查或活組織檢查相比較，Pap涂片的結(jié)果更難分析，因?yàn)橹糜谕科系幕旌霞?xì)胞群具有復(fù)雜性和易變性，并且在宮頸內(nèi)膜存在廣泛發(fā)生的炎癥和恢復(fù)過程。還存在細(xì)胞群的周期性改變，妊娠引起的改變，以及發(fā)生在絕經(jīng)后期的改變。因?yàn)閶D科細(xì)胞學(xué)是如此困難，使對(duì)細(xì)胞技師的訓(xùn)練期很長(zhǎng)，他們要求是受過教育的學(xué)生，要求有高等級(jí)的訓(xùn)練和圖形識(shí)別技能。即使在完成了足夠的培訓(xùn)計(jì)劃之后，細(xì)胞技師還需要有幾年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，然后他們才能對(duì)Pap涂片結(jié)果是否正常或不正常，始終如一地作出精確的判斷。類似的情況是，雖然可以訓(xùn)練病理學(xué)家分析組織學(xué)切片，但是，為了具有足夠的組織和管理細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室的技能，并能對(duì)異常的涂片作出適當(dāng)?shù)脑\斷，他們還需要有細(xì)胞學(xué)的特殊補(bǔ)充訓(xùn)練。
關(guān)于Pap篩選檢查方案的二個(gè)主要問題是，顯然不可避免的假陰性率(10-30％)和比較高的檢查費(fèi)用。因此，現(xiàn)在正在考慮用另外的方法進(jìn)行子宮頸篩選檢查。二種最常討論的建議是，應(yīng)用HPV DNA測(cè)定和分型作為主要的篩選檢查方式或作為對(duì)Pap涂片檢查的補(bǔ)充，以及使用可對(duì)常規(guī)獲得的Pap涂片進(jìn)行自動(dòng)化篩選檢查的儀器，這樣可減少對(duì)比較高工資細(xì)胞技師和細(xì)胞病理學(xué)家的需要(Richart，癌癥增刊，1995，76(10)1919-1927；Birdsong，人類病理學(xué)，1996，27(5)468-481)。
前一種方法仍然有問題。問題是對(duì)HPV應(yīng)用原位法的靈敏度和陽性預(yù)報(bào)值。將PCR用于HPV DNA檢測(cè)在一般人群中得出了如此高比率的HPV感染，以致使人認(rèn)為將HPV DNA測(cè)定用于臨床篩選檢查是不可靠的。
第二種方法涉及自動(dòng)化技術(shù)。目前許多公司正在開發(fā)和銷售自動(dòng)化篩選檢查儀。一般來說，這種儀器是應(yīng)用一個(gè)高分辨率視頻掃描器來捕捉圖象，然后將它數(shù)字化，并以一系列阿拉伯?dāng)?shù)字進(jìn)行分析，隨后使數(shù)據(jù)通過一個(gè)干涉網(wǎng)絡(luò)，借此可訓(xùn)練此機(jī)器區(qū)別正常的和異常的細(xì)胞成分。希望隨著軟件和硬件的進(jìn)一步發(fā)展，可考慮使自動(dòng)化篩選檢查用于主要的篩選檢查過程，雖然目前美國(guó)FDA還沒有批準(zhǔn)任何儀器用于對(duì)Pap涂片進(jìn)行預(yù)篩選或者用于單獨(dú)篩選。對(duì)于試圖克服常規(guī)Pap涂片檢查中問題的這樣一個(gè)昂貴和復(fù)雜的途徑，那些公司準(zhǔn)備投資是如此巨大，這說明問題的嚴(yán)重性和確實(shí)需要一個(gè)解決辦法。
以前沒有提出過以檢測(cè)細(xì)胞增殖標(biāo)志作為這種解決辦法，本領(lǐng)域的專家懷疑這種增殖標(biāo)志能提供有用的臨床信息(Hall和Coates，組織病理學(xué)，1995，26105-112)。據(jù)信測(cè)定細(xì)胞增殖參數(shù)將提供關(guān)于腫瘤的客觀信息，但是盡管進(jìn)行了許多研究，卻很少有直接證據(jù)表明應(yīng)用細(xì)胞增殖標(biāo)志如PCNA，Ki67等，對(duì)最恰當(dāng)?shù)夭捎玫膫鹘y(tǒng)組織學(xué)檢測(cè)確實(shí)是一個(gè)改進(jìn)。甚至很少有研究選擇這樣一個(gè)關(guān)鍵性問題，將增殖標(biāo)志的相對(duì)數(shù)值同標(biāo)準(zhǔn)的組織病理學(xué)分級(jí)和構(gòu)架進(jìn)行比較。
將免疫細(xì)胞化學(xué)或免疫熒光染色與自動(dòng)化子宮頸篩選檢查共同使用的企圖，受到正常細(xì)胞的非特異染色所限制。例如，已經(jīng)顯示上皮細(xì)胞膜抗原(EMA)可染色來自帶有CIN子宮頸的贅生性細(xì)胞，但是有報(bào)告表明它也可染色來自正常子宮頸的某些組織轉(zhuǎn)化細(xì)胞。因此，雖然目前已可獲得用于檢測(cè)免疫組織學(xué)染色的技術(shù)，但是市場(chǎng)上還沒有這種自動(dòng)化篩選檢查儀器，或者也沒更進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)。
最廣泛研究的增殖標(biāo)志有Ki67和PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)，Ki67是一種未知功能的蛋白質(zhì)(Yu和Filipe，組織化學(xué)雜志，1993，25843-853)。PCNA參與DNA復(fù)制延伸，也參與DNA的修復(fù)機(jī)制中。因此，它出現(xiàn)在DNA復(fù)制或修復(fù)的實(shí)際合成過程中。
發(fā)明人已研究了參與DNA復(fù)制的較早起始階段中的一些蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)是Cdc6和MCM2-7蛋白家族(MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6和MCM7)。Williams等(1997)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94142-147)曾報(bào)導(dǎo)，培養(yǎng)中的人HeLa細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞增殖周期中都表達(dá)Cdc6，但是，當(dāng)通過血清饑餓使之靜止時(shí)，WI38人二倍體成纖維細(xì)胞停止表達(dá)Cdc6。在此發(fā)現(xiàn)，這些觀察可擴(kuò)展至其它細(xì)胞系和其它動(dòng)物種。MCMs存在于G1期細(xì)胞核中(DNA合成之前)，并且在DNA合成的過程中，從染色質(zhì)逐漸位移進(jìn)入可溶性的核質(zhì)中。在此發(fā)現(xiàn)，在靜止期它們也不存在于染色質(zhì)。在此還證明，MCM5不存在于子宮頸和乳腺的分化細(xì)胞中。
根據(jù)這些背景事實(shí)，可預(yù)期MCMs或Cdc6抗血清類似于PCNA或Ki67的分布。對(duì)于這種預(yù)測(cè)的進(jìn)一步證據(jù)來自于Hiraiwa等的報(bào)告(國(guó)際癌癥雜志，1997，74180-184)，他們?cè)趲追N人組織和三種類型的人腫瘤中發(fā)現(xiàn)了對(duì)PCNA和MCM7(hCDC47)的類似免疫染色圖形。
但是出乎預(yù)料的是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與PCNA和Ki67相比較，MCMs和Cdc6的潛在性診斷價(jià)值顯著的不同。
發(fā)明人已試驗(yàn)將針對(duì)人MCM蛋白和人Cdc6產(chǎn)生的抗血清用于子宮頸細(xì)胞學(xué)。他們研究了正常人和患病人子宮頸的切片以及子宮頸涂片。他們將這些結(jié)果同用PCNA和Ki67獲得的結(jié)果相比較。用Cdc6抗體或MCM(例如MCMs)抗體檢測(cè)LSIL(HPVI/CIN1)損傷比用抗PCNA或抗Ki67抗體更有效。而且，基本上所有的LSIL(HPVI/CIN1)或HSIL(CIN2/3)損傷細(xì)胞都被染色。這與通過其它的增殖標(biāo)志如PCNA染色的情況大不相同。它表明，針對(duì)DNA復(fù)制起始前復(fù)合物蛋白質(zhì)的，特別是針對(duì)Cdc6或MCM蛋白質(zhì)(例如MCM5，但是在此也作為MCM2，MCM3，MCM4，MCM6和MCM7的例證)的特異性結(jié)合分子，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)非典型的或贅生性細(xì)胞有特殊的診斷價(jià)值。對(duì)于可經(jīng)受抗原提取處理(加熱蒸煮或高壓滅菌處理)的子宮頸樣品，對(duì)該樣品用甲醛固定，石蠟包埋，抗-Cdc6和抗-MCM抗體給出了同用PCNA得到的結(jié)果相類似的染色圖形，但是涂片的結(jié)果最佳，新鮮和冷凍樣品都很清晰。
因此，概括地說，本發(fā)明從不同角度涉及到幾種方法和途徑，用于檢測(cè)通常是取自人體內(nèi)樣品的組織，體液或細(xì)胞中的一種特殊靶標(biāo)多肽，或編碼一種靶標(biāo)多肽的mRNA。
根據(jù)它包含在DNA復(fù)制的起始前復(fù)合物中，可將本發(fā)明的靶標(biāo)多肽例如Cdc6蛋白和MCM蛋白如MCM5，區(qū)別于對(duì)本發(fā)明無用的其它細(xì)胞增殖標(biāo)志。根據(jù)在靜止期間和分化過程中是否從染色質(zhì)轉(zhuǎn)移也可將它們區(qū)分。例如，根據(jù)它在靜止細(xì)胞中仍然結(jié)合于染色質(zhì)，可將不能用于本發(fā)明靶標(biāo)的ORC2(Gavin等，1995，科學(xué)270，1667-1671)，與蛋白質(zhì)如Cdc6和MCM5區(qū)分開。在靜止細(xì)胞中Orc2不被下調(diào)，雖然ORC復(fù)合物的其它成分如Orc1可能有不同的行為表現(xiàn)。在靜止期和分化過程中，Cdc6被迅速下調(diào)。停止在G0期僅僅48小時(shí)的培養(yǎng)細(xì)胞不會(huì)有任何可測(cè)出的Cdc6蛋白。在體外較長(zhǎng)時(shí)間停滯的細(xì)胞中，或者在體外的分化細(xì)胞中，都不能測(cè)出Cdc6。在體外通過血清饑餓或接觸抑制劑停滯的細(xì)胞，將喪失染色質(zhì)結(jié)合的MCMs(在幾天之后)，雖然至少在14天內(nèi)這些細(xì)胞中的總MCMs水平?jīng)]有明顯地降低。在體外經(jīng)受分化的細(xì)胞(例如用DMSO或TPA誘導(dǎo)分化的HL-60細(xì)胞)下調(diào)了MCM3，但是Orc2不下調(diào)(Musahl，關(guān)于DNA復(fù)制的Aussois討論會(huì)，法國(guó)Aussois，1997年6月)。來自組織的分化細(xì)胞在體外不表達(dá)MCM蛋白如MCM2和MCM5。六個(gè)MCM蛋白，MCM2-MCM7，形成一個(gè)多蛋白復(fù)合體，它斷開成為二個(gè)亞復(fù)合體即MCM3和MCM5二聚體，MCM2-4-6-7四聚體。在S期間MCM3和MCM5可能比MCM2-4-6-7更緩慢地從染色質(zhì)移出(Kubota等，1997，EMBO雜志，16，3320-3331)。在G1期MCMs處于染色質(zhì)-結(jié)合狀態(tài)，在S期和核中位移，但在G2期不與染色質(zhì)結(jié)合。在酵母菌中Cdc6有類似的行為表現(xiàn)，雖然除了從染色質(zhì)被移出之外還被降解，在G1/S轉(zhuǎn)變時(shí)蛋白質(zhì)水平顯著地下降。還可能包括本發(fā)明的另一些DNA復(fù)制起始前復(fù)合體成分。例子包括酵母菌的人相似物成分，例如Cdc7蛋白激酶(Chapman和Johnston，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究，1989，180，419-428(酵母菌)，Sao等，1997，EMBO雜志，16，4340-4351(人-在靜止時(shí)下調(diào)的))，Cdc7蛋白激酶的調(diào)節(jié)亞單位Dbf4(Jackson等，1993，分子細(xì)胞生物學(xué)，13，2899-2908(酵母菌)，Masai等，關(guān)于真核生物DNA復(fù)制的冷泉港討論會(huì)，1997年9月3-7日(人))，Cdc14蛋白磷酸酶(Hogan和Koshland PNAS USA，1992，89，3098-3102(酵母菌))，與MCMs相關(guān)，并且具有與它相似表型的Cdc45(Zou等，分子細(xì)胞生物學(xué)，1997，17，553-563(酵母菌)，Takisawa等，關(guān)于真核生物DNA復(fù)制的冷泉港討論會(huì)，1997年9月3-7日(非洲爪蟾))，與MCMs相關(guān)，并且具有與它相似表型的MCM10(Merchant等，1997，分子細(xì)胞生物學(xué)，17，3261-3271)?？梢哉f本發(fā)明的靶標(biāo)多肽是多種多樣的，包括任何一種DNA復(fù)制前復(fù)合物成分，參與限制每個(gè)細(xì)胞周期中DNA復(fù)制一次的復(fù)制感受態(tài)染色質(zhì)成分，參與允許染色質(zhì)單環(huán)DNA復(fù)制并在開始DNA復(fù)制之前在復(fù)制起點(diǎn)裝配的復(fù)制許可成分。
人Cdc6的氨基酸序列被公開于Williams等，1997，PNAS USA94142-147，GenBank檢索號(hào)U77949。
人MCM2的序列被公開于Todorov等，1994，細(xì)胞科學(xué)雜志，107，253-265，GenBank檢索號(hào)X67334。
人MCM3的序列被公開于Thommes等，1992，核酸研究，20，1069-1074，GenBank檢索號(hào)P25205。
人MCM4的序列被公開于Ishimi等，1996，生物化學(xué)雜志，271，24115-24122，GenBank檢索號(hào)X74794。
人MCM5的序列被公開于Hu等，1993，核酸研究，21，5289-5293，GenBank檢索號(hào)X74795。
人MCM6的序列被公開于Hoithoff等，1996，基因組學(xué)，37，131-134，GenBank檢索號(hào)X67334。
人MCM7的序列被公開于Hu等，1993，核酸研究，21，5289-5293。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種檢測(cè)來自個(gè)體的樣品中是否存在異常增殖細(xì)胞或細(xì)胞生長(zhǎng)異常性的方法，此方法包括使樣品與所述的針對(duì)靶標(biāo)多肽的特異性結(jié)合成分相接觸，并測(cè)定此特異性結(jié)合成分對(duì)樣品的結(jié)合。
本發(fā)明的另一方面提供了一種將組織分為如下二類的方法(ⅰ)正?；?ⅱ)潛在性或確實(shí)的癌變前狀態(tài)，或者癌變狀，發(fā)育異?；蛸樕誀顟B(tài)，此方法包括測(cè)定所述的針對(duì)靶標(biāo)多肽的特異性結(jié)合成分對(duì)組織樣品的結(jié)合?？梢詫⑦@種結(jié)合的圖形或程度同已知正常的樣品和/或已知異常的樣品相比較。
發(fā)明人已單獨(dú)地克隆了人Cdc6，如在此所述，但是，首先發(fā)表其克隆過程的是Williams等人，他們的論文(PNAS USA 94142-147，1997)提供了其完整的氨基酸序列。如在此實(shí)驗(yàn)所證明的，抗-Cdc6結(jié)合分子對(duì)于標(biāo)記多種組織中的異常性非常有效，特別是子宮頸樣品，優(yōu)選地是涂片。這與對(duì)正常的子宮頸組織涂片樣品沒有結(jié)合形成對(duì)照。
人MCM5的氨基酸序列被公開于Hu等，1993，核酸研究，21，5289-5293，GenBank檢索號(hào)X74795。在此包括的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，針對(duì)它的結(jié)合分子同針對(duì)Cdc6的結(jié)合分子一樣，對(duì)于標(biāo)記多種組織中的異常性非常有效，特別是子宮頸樣品，優(yōu)選地是涂片。同對(duì)Cdc6相比較，獲得高親和性抗-MCM5抗體似乎更容易些，這可能表明MCM5具有較高的抗原性。
在此包括的另一方面的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，針對(duì)MCM2，MCM3，MCM4，MCM6或MCM7的結(jié)合分子，對(duì)于標(biāo)記組織樣品如子宮頸涂片中的異常性也有效。已發(fā)現(xiàn)同抗-MCM2和抗-MCM7抗體相比較，抗-MCM5抗體給出較強(qiáng)的染色圖形，整體染色較強(qiáng)，染色的細(xì)胞數(shù)目也較多。還發(fā)現(xiàn)抗-Cdc6抗體給出類似于抗-MCM5的染色圖形。
這樣，(例如)抗-Cdc6或抗MCM特異性結(jié)合成分對(duì)樣品的結(jié)合，可提供對(duì)組織的檢測(cè)區(qū)分，從中得出樣品異常，潛在性或確實(shí)的癌變前狀態(tài)，或者癌變狀態(tài)，發(fā)育異?；蛸樕誀顟B(tài)的檢測(cè)。根據(jù)當(dāng)前的慣例，當(dāng)應(yīng)用Pap試驗(yàn)得到陽性結(jié)果時(shí)，可對(duì)試驗(yàn)陽性的個(gè)體作進(jìn)一步檢查，例如通過該組織檢查試驗(yàn)和/或重復(fù)的篩選檢查。為了使?jié)撛诘陌┳兦盃顟B(tài)不致變成真正的癌變狀態(tài)，這是非常通行的作法。一般采取每月一次的六次篩選檢查，以便監(jiān)測(cè)異常生長(zhǎng)的發(fā)展或消退，如果需要可即時(shí)采取適當(dāng)?shù)闹委煷胧?br> 如果基于本發(fā)明對(duì)組織樣品的檢測(cè)異常性，組織被檢測(cè)分類為潛在性或確實(shí)的癌變前狀態(tài)或癌變狀態(tài)，則需要作適當(dāng)?shù)倪M(jìn)一步診斷和/或臨床跟蹤。
值得注意的是，本發(fā)明并不局限于檢測(cè)必然成為癌變前狀態(tài)或癌變狀態(tài)的細(xì)胞生長(zhǎng)異常性。還可以檢測(cè)其它一些細(xì)胞增殖性疾病，如后面的實(shí)驗(yàn)例證證明了這點(diǎn)，包括對(duì)牛皮癬(見后面實(shí)施例24)以及炎癥性腸道疾病如潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn′氏病(實(shí)施例33和34)的檢測(cè)。炎癥性腸道疾病除了其本身有理由是細(xì)胞增殖性疾病外，還可能是癌癥狀態(tài)的前兆，雖然不是對(duì)于全部病人，這樣，借助于本發(fā)明對(duì)它們的檢測(cè)，可用于為密切跟蹤提供有價(jià)值的結(jié)果。對(duì)于炎癥性腸道疾病，由于存在結(jié)腸和腸道的脫落細(xì)胞，有可能對(duì)糞便樣品和由此樣品制備的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)分析。后面實(shí)施例32描述了對(duì)糞便涂片的染色，是通過從糞便回收的細(xì)胞制備的涂片。
本發(fā)明可被用于預(yù)篩選樣品，然后作進(jìn)一步分析檢查。還可將本發(fā)明用于篩選或分析已用現(xiàn)有的技術(shù)如Pap涂片檢查法或ThinPrep2000檢查法檢測(cè)過的樣品。后面的實(shí)驗(yàn)還表明，應(yīng)用適當(dāng)?shù)目贵w，Pap染色分析和本發(fā)明的檢測(cè)分析可在相同的樣品制備上進(jìn)行。因此，例如子宮頸涂片既可用常規(guī)的Pap涂片試驗(yàn)檢查，又可用本發(fā)明的試驗(yàn)檢查。
本發(fā)明的另一方面提供一種標(biāo)記組織樣品內(nèi)異常細(xì)胞的方法。此方法包括使樣品與針對(duì)靶標(biāo)多肽如所述Cdc6，MCM5或其它MCM的特異性結(jié)合成分相接觸，在此條件下，其中的特異性結(jié)合成分與異常增殖的細(xì)胞相結(jié)合，而不結(jié)合于正常細(xì)胞。為了確定樣品內(nèi)是否存在異常增殖的細(xì)胞，可檢測(cè)特異性結(jié)合成分是否與樣品結(jié)合。
在另一方面，本發(fā)明提供了針對(duì)所述靶標(biāo)多肽的特異性結(jié)合成分確定，檢查或診斷在組織或其樣品中是否存在異常的細(xì)胞增殖，細(xì)胞生長(zhǎng)異常性，發(fā)育異常，瘤形成或者是否處于潛在性或真實(shí)的癌變前狀態(tài)或癌變狀態(tài)的應(yīng)用。
可以以試劑盒的形式提供特異性結(jié)合分子，試劑盒內(nèi)還可以包括根據(jù)本發(fā)明的使用說明書。作為本發(fā)明的另一方面是提供這樣一種試劑盒。其中還可以包括一種或幾種其它試劑如標(biāo)記分子等(見后面)。試劑可包裝在容器如密封的小藥瓶?jī)?nèi)，防止暴露于外環(huán)境。取決于所需要的組織，試劑盒內(nèi)還可能包括一種或幾種用于采集試驗(yàn)樣品本身的工具，例如，用于從口腔獲取細(xì)胞的棉拭子，用于采血的注射器，用于制備子宮頸涂片的刮片，以及活組織檢查槍等(這些物品通常都要消毒滅菌)。試劑盒內(nèi)還包括如下成分中的任何一種，其任何組合形式，或者其全部成分為了減少非特異性染色的封閉劑，用于貯存中保存結(jié)合分子活性的貯存緩沖液，用于抗體染色過程中的染色緩沖液和/或漂洗緩沖液，以及陽性對(duì)照和陰性對(duì)照等。陽性和陰性對(duì)照可被用于確認(rèn)試劑盒中根據(jù)本發(fā)明所采用的試劑的活性和正確使用。對(duì)照可以是已知對(duì)靶標(biāo)如Cdc6或MCM5的存在顯示陽性或陰性的樣品，例如組織切片和固定在蓋玻片上的細(xì)胞等。對(duì)照的設(shè)計(jì)和使用是標(biāo)準(zhǔn)的，是本領(lǐng)域正常能力的普通技術(shù)人員熟知的。
可使用任何簡(jiǎn)便的方法和技術(shù)從體內(nèi)采集樣品。對(duì)于子宮頸篩選檢查，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的涂片樣品。另一方面，還可使用ThinPrep 2000技術(shù)(Cytec Corp，Boxborough，Mass，USA)。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)此項(xiàng)技術(shù)可作為常規(guī)的Pap涂片制備法的替代技術(shù)。將樣品采集至液體培養(yǎng)基內(nèi)，而不是在載玻片上作細(xì)胞涂片。然后借助于自動(dòng)化處理器(ThinPrep 2000儀)從液體中收集細(xì)胞，并將它們?cè)谳d玻片上沉積形成一個(gè)薄層，用于分析。可使用刮片或棉拭子，例如從子宮頸或口腔采集內(nèi)皮細(xì)胞。血液和其它液體樣品可用注射器或針頭采集。其它的組織樣品可通過活組織檢查或組織切片采集。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品不經(jīng)抗原提取處理或加壓蒸煮/高壓滅菌處理?？乖崛√幚碓诒绢I(lǐng)域長(zhǎng)時(shí)間以來已標(biāo)準(zhǔn)化了，是普通的技術(shù)人員所熟知的。Hiraiwa等參考Shin等(1991)，Lab.Invest.64，693-702，提出了一種示范性方法。樣品可以是新鮮的或冷凍的，但通常不用甲醛固定或石蠟包埋。如上所述，特別優(yōu)選的實(shí)施方案中樣品是子宮頸涂片。子宮頸涂片不足以經(jīng)受加壓蒸煮。而且，抗原提取處理對(duì)于篩選檢查一般不是很有利，在此高篩選量是所希望的。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)性例證方面證明對(duì)如下檢查的適用性包括檢查涂片的子宮頸檢查，乳腺，尿道惡性腫瘤(通過對(duì)活組織樣品和對(duì)尿中細(xì)胞涂片的檢查)，結(jié)腸，肺，膀胱，皮膚，喉，食道，支氣管，淋巴結(jié)，以及血液癌檢查，還包括檢查血液和血清，用于證明肉瘤和癌癥的轉(zhuǎn)移。本發(fā)明另外還可用于檢查子宮頸腺上皮細(xì)胞惡性變前的異常性(腺上皮內(nèi)瘤形成，GIN)，或者其它組織內(nèi)惡性變前的異常性。特別適合用于對(duì)其它一些臨床標(biāo)本的細(xì)胞學(xué)或生物化學(xué)檢查中，這種檢查要檢測(cè)出贅生性細(xì)胞，或者將它們與顯示出活性改變的細(xì)胞區(qū)分開可能是非常困難的。這些標(biāo)本包括痰，細(xì)支氣管-肺泡洗出液標(biāo)本，尿液，以及來自消化道(包括食道，胃和胰腺，膽管和胰管)的沖刷物標(biāo)本。本發(fā)明還可用于對(duì)組織的組織學(xué)或生物學(xué)檢查中，在此對(duì)增殖的檢查使之能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)臨床結(jié)果，和/或更合理地選擇治療方法。這些標(biāo)本可能包括腺細(xì)胞(例如肺，乳腺，結(jié)腸，前列腺，胃)，扁平細(xì)胞(例如肺，皮膚，食道)或其它類型上皮細(xì)胞(例如，膀胱，輸尿管，腎臟，卵巢)的惡性腫瘤。
在下述對(duì)一系列乳腺癌檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)中觀測(cè)到，使用抗-Cdc6抗體，以及包括抗-MCM2，抗-MCM3，抗-MCM4，抗-MCM5，抗-MCM6和抗-MCM7在內(nèi)的多種抗-MCM抗體，為診斷乳腺癌的免疫細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)方法提供了高程度的特異性。這種方法可用于乳腺活組織檢查標(biāo)本或細(xì)針吸取法(FNA)標(biāo)本，或者取自乳腺導(dǎo)管的液體標(biāo)本，隨后用于篩選檢查程序。
可應(yīng)用任何一種現(xiàn)有技術(shù)制備將經(jīng)受與本發(fā)明各種結(jié)合成分接觸的檢測(cè)樣品，使特異性結(jié)合分子能夠結(jié)合于靶標(biāo)多肽如所述的Cdc6，MCM5或其它MCM，并能根據(jù)本發(fā)明不同實(shí)施方案測(cè)定核酸水平和酶活性等。在本領(lǐng)域多種技術(shù)都是規(guī)范的，例如(對(duì)于結(jié)合靶標(biāo)多肽的抗體分子)Pap試驗(yàn)中用于固定細(xì)胞的技術(shù)。
可借助于任何適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)定結(jié)合成分如抗體對(duì)正常和待測(cè)樣品的反應(yīng)性。一種可能性是以獨(dú)特的指示分子進(jìn)行標(biāo)記。指示分子可直接或間接地產(chǎn)生可察覺的，而優(yōu)選地是可測(cè)定的信號(hào)。指示分子的連接可能是直接或間接地連接，例如通過肽鍵的共價(jià)結(jié)合，或者非共價(jià)結(jié)合。經(jīng)由肽鍵的連接可能是由于編碼結(jié)合分子(例如抗體)和指示分子的融合基因重組表達(dá)的結(jié)果。
一種優(yōu)選的方式是，借助于各種結(jié)合成分與具有單獨(dú)的特異性吸收或發(fā)散特征的熒光染料，磷或激光染料的共價(jià)結(jié)合。適合的熒光染料包括熒光素，若丹明，藻紅素和德克薩斯紅。適合的生色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。
其它一些指示標(biāo)記包括，可變色的大分子膠體顆?；蝾w粒材料如膠乳小珠，可直接或間接引起可察覺信號(hào)的磁性或順磁性的，以及生物學(xué)或化學(xué)的活性劑，可肉眼觀察，電子檢測(cè)或記錄這些信號(hào)。這種分子也可以是催化某些反應(yīng)的酶，例如，生成或改變顏色，或者引起電子特性改變的反應(yīng)。它們可能是分子激發(fā)性反應(yīng)，以致能級(jí)間的電子躍遷將引起特征性的吸收光譜或發(fā)散光譜。它們還可能包括用于與生物傳感器連接的化學(xué)物質(zhì)。生物素/親合素或生物素/鏈親合素，以及堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)都可以利用。另一些例子是辣根過氧化物酶和化學(xué)發(fā)光。
檢測(cè)結(jié)合的方式不是本發(fā)明的特征，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)它們的喜好和常識(shí)能夠選擇一種適當(dāng)?shù)姆绞健?br> 在下述的一些實(shí)驗(yàn)中使用了辣根過氧化物酶。另一些實(shí)驗(yàn)是用堿性磷酸酶進(jìn)行的，獲得了相似的結(jié)果(例如對(duì)于子宮頸涂片)。與辣根過氧化物酶相比，堿性磷酸酶可能是較靈敏的檢測(cè)系統(tǒng)，但是，所形成的顏色與Pap染色不太適合。
下面是本發(fā)明實(shí)施方案中已采用的，用于子宮頸涂片抗體染色的一種方案。
1.在50∶50的丙酮∶甲醇中固定新鮮的涂片5分鐘(注意，當(dāng)涂片已用“Cytofix”預(yù)固定時(shí)的另一種起始步驟是，在甲基化酒精中浸泡10分鐘以便除去Cytofix，Cytofix預(yù)固定是一種在英國(guó)規(guī)范地用于處理涂片樣品的醇和石蠟處理法，使攜帶樣品時(shí)能安全地運(yùn)送到篩選中心。還應(yīng)該用任何其它的防護(hù)層蓋住涂片，為了使樣品暴露于抗體染色，可采用任何適當(dāng)?shù)奶幚矸?。
2.在Tris緩沖鹽水(TBS)中浸洗5分鐘。
3.為了滲透，在以TBS配制的4 mM脫氧膽酸鈉中浸洗15分鐘。
4.在TBS加0.3％Triton X100的溶液中浸洗5分鐘。
5.重復(fù)步驟4。
6.在TBS加0.025％Triton X100的溶液中浸洗5分鐘。
7.瀝去過多的液體，而不使組織干脫。
8.將涂片轉(zhuǎn)移至濕盒內(nèi)，對(duì)每張涂片加上以TBS配制的10％羊血清試劑200μl，作用至少2小時(shí)(或過夜)。
9.瀝去過多的液體而不使組織干脫。
10.在每張涂片上加上以含有0.1％Triton和1％BSA的TBS稀釋的第一抗體200μl，在有軌搖床上4℃振搖過夜。
11.將涂片轉(zhuǎn)移至框架中，在TBS加0.3％Triton X100的溶液中浸洗5分鐘。
12.在TBS加0.025％Triton X100的溶液中浸洗5分鐘。
13.重復(fù)步驟12。
14.瀝去過多的液體而不使組織干脫。
15.將涂片轉(zhuǎn)移至濕盒內(nèi)，對(duì)每張涂片加上以含有1％BSA的TBS1∶500稀釋的生物素化羊抗-兔第二抗體(Dako)200μl，作用1小時(shí)。
16.在涂片與第二抗體作用時(shí)，配制SABC溶液。
17.將涂片轉(zhuǎn)移至框架內(nèi)，在TBS中浸洗5分鐘。
18.將涂片置于含有0.6％過氧化氫的內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑中作用10分鐘。
19.在TBS中浸洗5分鐘。
20.重復(fù)步驟19二次。
21.將涂片轉(zhuǎn)移至濕盒內(nèi)，對(duì)每張涂片加上SABC溶液200μl，作用30分鐘。
22.將涂片轉(zhuǎn)移至框架內(nèi)，在TBS中浸洗5分鐘。
23.重復(fù)步驟22。
24.在DAB溶液中顯色10分鐘。
25.在流動(dòng)的自來水中浸洗5分鐘。
26.將涂片置于Harris′蘇木精溶液中染色6秒鐘。
27.在流動(dòng)的自來水中浸洗1分鐘。
28.在0.5％鹽酸中分化1-2秒鐘。
29.在流動(dòng)的自來水中浸洗5分鐘。
30.在50％甲醇中漂洗2分鐘。
31.在70％甲醇中漂洗2分鐘。
32.在90％甲醇中漂洗2分鐘。
33.在100％甲醇中漂洗2分鐘。
34.置于橙黃G工作液中作用2分鐘。
35.在100％甲醇中漂洗7秒鐘，并緩慢攪動(dòng)。
36.重復(fù)步驟35。
37.置于EA50液中作用2分鐘。
38.在100％甲醇中漂洗7秒鐘，并緩慢攪動(dòng)。
39.重復(fù)步驟38。
40.將涂片置于二甲苯中使透明5分鐘。
41.重復(fù)步驟40二次。
42.用DEPEX封固劑對(duì)涂片加蓋玻片。
可按類似的方式制備用于免疫熒光檢測(cè)的涂片(已制備)。在加入第二抗體之后，將它們置于鏈親合素FITC-結(jié)合標(biāo)記的抗體中溫育1小時(shí)，并且用碘化丙錠/RNA酶A(均購(gòu)自Sigma，以50ng/ml的濃度)對(duì)DNA作負(fù)染，然后漂洗并在甘油／PBS/苯二胺中封固。
用于本發(fā)明的優(yōu)選的結(jié)合分子包括抗體，該靶標(biāo)的天然配體，對(duì)準(zhǔn)該標(biāo)本上一個(gè)或幾個(gè)抗原表位的小分子，以及T-細(xì)胞受體結(jié)合功能區(qū)。
應(yīng)用本領(lǐng)域規(guī)范性技術(shù)，可獲得對(duì)所需靶標(biāo)如Cdc6，MCM5或其它的MCM特異性的抗體。產(chǎn)生抗體的方法包括用此蛋白質(zhì)或其片段，或者用表達(dá)此蛋白質(zhì)或片段的細(xì)胞或病毒免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠，大鼠，兔，馬，山羊，綿羊，猴)或鳥類如雞。用編碼該靶標(biāo)多肽的DNA進(jìn)行免疫也是可能的?？蓱?yīng)用本領(lǐng)域熟知的多種技術(shù)中的任何一種從免疫動(dòng)物獲得抗體，并進(jìn)行篩選，優(yōu)選地是通過抗體對(duì)所需抗原的結(jié)合。例如可應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)或免疫沉淀技術(shù)(Armitage等，1992，自然35780-82)。
產(chǎn)生單克隆抗體的方法也是本領(lǐng)域完善確立的方法?？梢允箚慰寺】贵w經(jīng)受重組DNA技術(shù)處理，以便產(chǎn)生保持其原有抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術(shù)包括將一個(gè)抗體的編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA，或互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)導(dǎo)入一個(gè)不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)，或恒定區(qū)加框架區(qū)內(nèi)。參見例如，EP 184187A，GB 2188638A或EP-A-0239400。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤可能經(jīng)受基因突變或其它改變，這可能改變或不改變所產(chǎn)生抗體的結(jié)合特異性。
作為用肽免疫動(dòng)物的另一種方式或補(bǔ)充，還可以從重組產(chǎn)生的表達(dá)免疫球蛋白可變區(qū)的文庫(kù)，獲得對(duì)靶標(biāo)特異性的抗體，例如應(yīng)用在其表面能展現(xiàn)功能性免疫球蛋白結(jié)合功能區(qū)的λ噬菌體或絲狀噬菌體，參見例如WO 92/01047。此文庫(kù)可能是天然的，是由從未用靶標(biāo)免疫過的細(xì)菌獲得的序列構(gòu)建的，或者可能是一種用從已暴露于所需抗原(或其片段)的細(xì)菌獲得的序列構(gòu)建的文庫(kù)。
可用許多方式對(duì)抗體進(jìn)行修飾。當(dāng)然，除非文中另有說明，術(shù)語“抗體”應(yīng)該被認(rèn)為是包括任何一種具有抗體抗原結(jié)合功能區(qū)的特異性結(jié)合物質(zhì)。因此，它包括抗體片段，衍生物和功能等價(jià)物，包括含有免疫球蛋白結(jié)合功能區(qū)的任何一種多肽，不論是天然的或者是合成的。因此還包括與另一多肽融合的，含有免疫球蛋白結(jié)合功能區(qū)的嵌合分子或等價(jià)物。在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述了關(guān)于嵌合抗體的克隆和表達(dá)。
已經(jīng)證明，結(jié)合抗原的功能可以借助于整個(gè)抗體的某些片段來實(shí)現(xiàn)。結(jié)合片段的實(shí)例包括(ⅰ)由VL，VH，CL和CH1功能區(qū)組成的Fab片段；(ⅱ)由VH和CH1功能區(qū)組成的Fd片段；(ⅲ)由單一抗體的VL和VH功能區(qū)組成的Fv片段；(ⅳ)由VH功能區(qū)組成的dAb片段(Ward，E.S等，自然341，544-546，(1989))；(ⅴ)分離出的CDR區(qū)；(ⅵ)F(ab′)2片段，含有二個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段；(ⅶ)單鏈的Fv分子(scFv)，其中的VH功能區(qū)和VL功能區(qū)由肽鍵連接，使此二個(gè)功能區(qū)能相連形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird等，科學(xué)，242，423-426，1988；Huston等，PNAS USA，85，5879-5883，1988)；(ⅷ)雙特異性的單鏈Fv二聚體(PCT/US 92/09965)；以及(ⅸ)“雙體”，通過基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(WO 94/13804；P.Hollige等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，90，6444-6448，1993)。
多肽，包括抗體和抗體片段的重組表達(dá)是本領(lǐng)域熟知的。
已熟知在多種不同宿主細(xì)胞中用于多肽的克隆和表達(dá)的系統(tǒng)。適合的宿主細(xì)胞包括細(xì)菌，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母和桿狀病毒系統(tǒng)。本領(lǐng)域可用來表達(dá)異源性多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系包括中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，Hela細(xì)胞，幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞和其它許多細(xì)胞。常用的優(yōu)選細(xì)菌宿主是大腸桿菌(E.coli)。用于桿狀病毒表達(dá)的優(yōu)選宿主是昆蟲細(xì)胞如SF9細(xì)胞系。
可以選擇或構(gòu)建含有適當(dāng)調(diào)節(jié)序列的適合載體，這些調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列，終止子片段，聚腺苷酸化序列，增強(qiáng)子序列，標(biāo)記基因，以及適當(dāng)?shù)匕ㄆ渌恍┬蛄?。進(jìn)一步的詳細(xì)內(nèi)容參見例如，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版，Sambrook等，1989，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版。轉(zhuǎn)化程序取決于所采用的宿主，但也是熟知的。
通過從編碼核酸表達(dá)產(chǎn)生針對(duì)本發(fā)明中有用的靶標(biāo)如Cdc6的抗體或其它特異性結(jié)合分子之后，可將它們回收，并可能將它們分離出，如果必要，還可結(jié)合于適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物或指示劑，然后根據(jù)本發(fā)明公開的方法提供來用于檢測(cè)組織樣品如子宮頸涂片中是否存在細(xì)胞生長(zhǎng)異常性。
與正常組織相比較，腫瘤中Cdc6和MCM的表達(dá)水平要高得多，并且這些抗原可釋放進(jìn)入血液(例如由于腫瘤細(xì)胞壞死)或其它體液，如尿或糞便中。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任何一種技術(shù)如DELFIA，ELISA，RIA，蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)，可將特異性結(jié)合分子用于檢測(cè)體液如血清中的這種靶標(biāo)。可能監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展和衰退，例如對(duì)治療的反應(yīng)或復(fù)發(fā)。因此，可根據(jù)本發(fā)明檢查血液和其它體液樣品，例如尿，前列腺液，乳頭液，漿液和腹水滲出液，腦脊液，還有糞便。例如，應(yīng)用如Williams等在臨床化學(xué)學(xué)報(bào)，1986，155，329-344中所描述的DELFIA，ELISA，RIA，可檢查血液樣品中是否存在靶標(biāo)多肽如MCM5和Cdc6。
檢查體內(nèi)對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合可用于確定體內(nèi)異常細(xì)胞的定位?？梢詫⑨槍?duì)本發(fā)明靶標(biāo)的標(biāo)記的結(jié)合分子對(duì)病人給藥，并測(cè)定在體內(nèi)的結(jié)合。
當(dāng)將放射性核苷酸如碘-125，銦-111，鉈-201，或锝-99m附著于抗體時(shí)，如果此抗體優(yōu)先定位于腫瘤而不是正常組織，則可借助于γ照相機(jī)或閃爍法檢測(cè)和定量測(cè)定腫瘤組織中存在的放射標(biāo)記。所獲得腫瘤圖象的質(zhì)量與信號(hào)干擾比直接相關(guān)。在Pck等(1992)，核醫(yī)學(xué)生物學(xué)，19，699-677中描述了應(yīng)用锝-99m的放射性標(biāo)記法。Goldenberg D.M，國(guó)際生物學(xué)標(biāo)記雜志，1992，7，183-188提供了關(guān)于用抗-CEA抗體進(jìn)行瘤成像的述評(píng)。任何對(duì)人或動(dòng)物體內(nèi)實(shí)施的方法，都應(yīng)該是一種確實(shí)診斷疾病的方法，當(dāng)然，為應(yīng)用這樣的任何一種方法，本發(fā)明將它擴(kuò)展到所公開的針對(duì)靶標(biāo)多肽的特異性結(jié)合成分。
已報(bào)導(dǎo)Cdc6蛋白和MCM蛋白具有ATP酶活性(Zwerschke等，1994，生物化學(xué)雜志，269，23351-23356；Ishimi等，關(guān)于真核生物DNA復(fù)制的冷泉港研討會(huì)，1997年9月3-7日)。這些蛋白質(zhì)還可能具有其它的酶活性，例如，Ishimi等(同上)報(bào)導(dǎo)的蝸牛酶活性。通過測(cè)定樣品中的酶活性，可以檢測(cè)本發(fā)明靶標(biāo)蛋白質(zhì)的水平。例如，對(duì)于酶活性已發(fā)展了特異性生色底物，如辣根過氧化物酶(二氨基聯(lián)苯胺)，和β-半乳糖苷酶(X-GAL)。
可以在核酸水平檢測(cè)Cdc6，MCM5或其它靶標(biāo)蛋白的表達(dá)，例如通過測(cè)定mRNA的水平。Williams等(關(guān)于真核生物DNA復(fù)制的冷泉港研討會(huì)，1997年，9月3-7日)已報(bào)導(dǎo)了在小鼠消化道腸隱窩基底Cdc6 mRNA的表達(dá)。檢測(cè)RNA的方法對(duì)本領(lǐng)域是熟知的，包括RNA印跡試驗(yàn)，斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)，原位雜交法，定量RT-PCR法?？稍谟糜谶x擇性雜交和/或經(jīng)受特異性核酸擴(kuò)增反應(yīng)如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的條件下，探測(cè)從一種或幾種細(xì)胞分離和/或純化的核酸，或者是從細(xì)胞分離和/或純化的核酸得到的核酸文庫(kù)(例如，從細(xì)胞分離出的mRNA得到的cDNA文庫(kù))。應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員可自由選擇的多種技術(shù)中的任何一種，可測(cè)定探針與靶標(biāo)核酸的結(jié)合。例如，探針可能是放射性，熒光或酶標(biāo)記的。其它不采用探針標(biāo)記的方法包括，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性測(cè)定，應(yīng)用PCR的擴(kuò)增，RNA酶切割，以及等位基因特異性寡核苷酸探測(cè)。
為了實(shí)用，或者至少為商業(yè)的目的考慮到費(fèi)用和時(shí)間，在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)靶標(biāo)蛋白的表達(dá)，通常比在核酸水平上檢測(cè)更為優(yōu)選。
下面將參照實(shí)驗(yàn)例證對(duì)本發(fā)明的各方面進(jìn)行說明。本發(fā)明的另一些方面和實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見的。實(shí)施例1-抗體的制備應(yīng)用如下方案制備了針對(duì)Cdc6的抗體。
基于它們與人Orcl和酵母Cdc6/Cdc18的微弱的序列同源性，鑒定了編碼人Cdc6-樣蛋白質(zhì)片段(GenBank檢索號(hào)T 90351，H59204，N 69246，AA 045217，AA 099980)的表達(dá)序列標(biāo)志物。從IMAGE協(xié)作組織(美國(guó)研究基因公司)獲得了相應(yīng)的文庫(kù)克隆，并用ABI PRISM 377測(cè)序儀(Applied Biosystems)對(duì)雙鏈測(cè)序。所有5個(gè)克隆的共有序列都含有一個(gè)536個(gè)氨基酸的開放讀框。在同隨后公布的人Cdc6序列對(duì)比時(shí)，揭示了在蛋白質(zhì)水平具有99.7％的同源性。將二個(gè)單獨(dú)的相應(yīng)于氨基酸145-360和364-547的人Cdc6片段，作為Xbal-BamHI片段克隆進(jìn)入了pET 23a表達(dá)載體(Novagen)，并在E.coli CL41株中表達(dá)。借助于Ni+2瓊脂糖親和層析(Qiagen)純化重組蛋白質(zhì)片段，并用于免疫動(dòng)物。按以前所述的方法產(chǎn)生抗體并進(jìn)行親和性純化(Romanowski等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，9310189-10194)。三個(gè)抗體都能識(shí)別整個(gè)HeLa細(xì)胞提取物和核提取物中的62kD優(yōu)勢(shì)帶。
按如下制備了針對(duì)MCM5的抗體根據(jù)已公布的人MCM5序列(Hu等，1993，核酸研究，21，5289-5293)設(shè)計(jì)了PCR引物。從反轉(zhuǎn)錄的HeLa cDNA擴(kuò)增了相當(dāng)于氨基酸367-582的MCM5編碼序列的一個(gè)片段，并作為SphI-BglII片段被克隆進(jìn)入pQE70表達(dá)載體(Qiagen)。在BL21E.coli細(xì)胞中表達(dá)此蛋白質(zhì)，并應(yīng)用Ni2+瓊脂糖親和層析(Qiagen)純化。如Romanowski等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，9310189-10194中所述產(chǎn)生了抗體。實(shí)施例2-Cdc6和MCM5與細(xì)胞增殖的關(guān)系借助于蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)以前就發(fā)現(xiàn)，永生化人HeLa細(xì)胞系在其整個(gè)細(xì)胞周期中都表達(dá)Cdc6和MCM5(Williams等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，94142-147；Schulte等，歐洲生物化學(xué)雜志，1996，235，144-151)。最近Williams報(bào)導(dǎo)了在靜止的Wi38人成纖維細(xì)胞中對(duì)Cdc6的下調(diào)。
發(fā)明人還借助于蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)顯示，當(dāng)通過接觸抑制使小鼠3T3成纖維細(xì)胞靜止時(shí)，對(duì)Cdc6的表達(dá)將被下調(diào)(

圖1A)。
通過生長(zhǎng)至匯合使NIH3T3細(xì)胞系停滯。使培養(yǎng)物保持靜止?fàn)顟B(tài)7天。通過用胰蛋白酶分散細(xì)胞并重新接種，使細(xì)胞脫離G0停滯狀態(tài)。每隔3小時(shí)制備一次可溶性(上清液)提取物和核蛋白(沉淀)提取物，并用抗-人MCM5，Orc2和Cdc6的抗體對(duì)二種提取物作免疫印跡試驗(yàn)。
在靜止細(xì)胞(G0)中Orc2(見Gavin等，克隆-科學(xué)(1995)270，1667-1671)仍然結(jié)合于染色質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期后并沒有明顯地增加?？墒?，在靜止細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)合組分(沉淀)中不能檢測(cè)出MCM5，雖然在可溶性組分中含有顯著含量的MCM5。與MCM5不同，靜止細(xì)胞中完全不存在Cdc6，但是當(dāng)細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期時(shí)，對(duì)此蛋白質(zhì)的表達(dá)被迅速地誘發(fā)。用人EJ13細(xì)胞(來自膀胱癌的細(xì)胞)也得到了類似的結(jié)果。
這些結(jié)果表明，在靜止細(xì)胞中不存在Cdc6是普遍現(xiàn)象。
借助于免疫熒光法并應(yīng)用抗-Cdc6和抗-MCM5抗體，將這些研究擴(kuò)展到完整的細(xì)胞。
當(dāng)通過接觸抑制使新生的人成纖維細(xì)胞(NHF)靜止時(shí)，也發(fā)現(xiàn)對(duì)Cdc6和MCM5的表達(dá)被下調(diào)了。使NHF生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)，保持靜止3天。通過用胰蛋白酶分散細(xì)胞并重新接種，使細(xì)胞脫離G0停滯狀態(tài)。然后在脫離G0后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收獲完整的細(xì)胞，直至進(jìn)入S-期。以碘化丙錠染色，用于顯示DNA，并將此結(jié)果同用抗Cdc6和抗MCM5抗體對(duì)樣品的染色結(jié)果相比較。
靜止(G0)細(xì)胞顯示沒有Cdc6免疫反應(yīng)性，而用抗-MCM5抗體時(shí)有非常微弱的信號(hào)。但是，在進(jìn)入細(xì)胞周期和S-期的期間，觀測(cè)到對(duì)Cdc6和MCM5的強(qiáng)核酸免疫反應(yīng)性。
這些研究可能表明，類似于PCNA或Ki67，抗-Cdc6抗體可能對(duì)增殖中的細(xì)胞提供一種標(biāo)志。但已證明PCNA或Ki67都不能對(duì)子宮頸細(xì)胞提供滿意的標(biāo)志。實(shí)施例3-用抗-Cdc6和抗-MCM5結(jié)合分子檢測(cè)異常的(例如腫瘤)細(xì)胞比用PCNA或Ki67抗體有效得多實(shí)施例2中所述的結(jié)果表明，Cdc6的表達(dá)可能類似于PCNA或Ki67的表達(dá)，但后二者都不適合于子宮頸細(xì)胞學(xué)檢查。發(fā)明人在正常的或患病的子宮頸切片上，將針對(duì)這些蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行了比較。
對(duì)于常規(guī)的增殖標(biāo)志PCNA和Ki67，子宮頸SILs的免疫染色，當(dāng)與對(duì)于Cdc6或MCM5的染色相比較時(shí)，顯示出不同式樣的免疫反應(yīng)性。對(duì)于正常子宮頸，針對(duì)所有四個(gè)抗原的抗體顯示出局限于基底層和副基底層的上皮細(xì)胞陽性免疫染色。沒有觀察到對(duì)組織轉(zhuǎn)化細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞或炎癥細(xì)胞的免疫染色。對(duì)于低級(jí)和高級(jí)SILs(LSIL和HSIL)，抗-Cdc6抗體和抗-MCM5抗體都顯示出有大部分(＞95％)異常細(xì)胞的陽性免疫染色?？墒?，對(duì)于PCNA和Ki67的免疫染色，在二個(gè)等級(jí)的SIL中都只有少量(＜30％)的異常細(xì)胞群。作為L(zhǎng)SIL特征性的，并反映HPV細(xì)胞病變效應(yīng)的Koilocytes，對(duì)于Cdc6和MCM5都顯示出陽性免疫染色，然而，對(duì)于PCNA或Ki67只有少量(20％)細(xì)胞顯示出陽性染色。
在子宮頸篩選檢查中，其中的組織樣品通過從上皮細(xì)胞表面涂片的方式最容易獲得，抗-Cdc6或抗-MCM5結(jié)合分子比抗-Cdc6和抗-Ki67分子對(duì)異常細(xì)胞高得多的染色水平提供了明顯的優(yōu)勢(shì)。
切出5μm厚的切片置于載玻片上，并在二甲苯中脫蠟。通過在以100％甲醇配制的0.6％過氧化氫中室溫下溫育3-5分鐘，淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。在磷酸緩沖鹽水中漂洗切片2次，每次5分鐘，然后對(duì)每個(gè)切片用在磷酸緩沖鹽水(PBS)中配制的10％胎牛血清(FCS)大約100μl封閉。將玻片瀝干，擦去多余的血清。將第一抗體在含有25％FCS的PBS中按1∶20稀釋，取25-50μl加到每個(gè)切片上。在濕盒內(nèi)室溫溫育45分鐘。然后在PBS內(nèi)漂洗玻片3次，每次5分鐘，隨后用PBS配制的20％抗-Ki67或抗-PCNA兔血清封閉15分，用PBS配制的20％抗-Cdc6或抗-MCM5驢血清封閉15分鐘。瀝去封閉抗體并擦干玻片之后，加入在含有10％正常人血清的PBS中1∶200稀釋的生物素化兔抗-小鼠第二抗體(對(duì)于抗-Ki67或抗-PCNA)，或者生物素化的驢抗-兔第二抗體(對(duì)于抗-Cdc6或抗-MCM5)，室溫下作用30分鐘。在PBS中漂洗3次，每次5分鐘，然后加入在PBS中1∶500稀釋的鏈親合素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，在室溫下作用30分鐘。在PBS中漂洗3次，每次5分鐘，然后加入以含有0.005％過氧化氫的100mM Tris.Cl(pH7.6)配制的1％二氨基聯(lián)苯胺底物，室溫下溫育5分鐘。通過在自來水中漂洗使反應(yīng)停止，用Gill蘇木精對(duì)切片輕微染色，用梯度濃度乙醇脫水，并在二甲苯中浸洗2次，每次6分鐘。用DPX封固基質(zhì)對(duì)切片加蓋玻片。
將正常子宮頸的一系列切片，用各自的抗體對(duì)PCNA，Ki67，MCM5和Cdc6染色。所有的這些抗體顯示出類似的免疫反應(yīng)圖形，陽性細(xì)胞僅局限于基底層和副基底層。
將低級(jí)SIL(CINI)子宮頸的一系列切片，分別用抗體對(duì)PCNA，Ki67，MCM5和Cdc6染色。在扁平上皮的較底部的第三層有顯著的發(fā)育異常，是與HPV有關(guān)的病毒性改變(Koilocytosis)，這種改變正向表面擴(kuò)展。PCNA和Ki67顯示出局限于上皮較底層1/3的散亂病灶的免疫反應(yīng)性，其中只有少部分異常細(xì)胞被陽性染色。相比之下，Cdc6和MCM5顯示出全厚度的免疫反應(yīng)性，包括在上皮較淺表層的Koilocytes在內(nèi)的所有異常細(xì)胞都被陽性染色。
分別用PCNA，Ki67，MCM5和Cdc6抗體對(duì)高級(jí)SIL的一系列切片染色。發(fā)育異常存在于整個(gè)上皮層。PCNA和Ki67顯示出類似的免疫反應(yīng)性圖形，具有充分的染色厚度，但其中只有少部分異常細(xì)胞是陽性染色(達(dá)到大約30％)。Cdc6和MCM5也顯示出全厚度的上皮染色。但是，與PCNA和Ki67明顯不同的是，Cdc6和MCM5顯示出對(duì)所有異常細(xì)胞的陽性染色。
這些結(jié)果表明，應(yīng)用抗Cdc6或抗-MCM5特異性結(jié)合分子，通過測(cè)定其與涂片樣品的結(jié)合，對(duì)于檢查子宮頸的狀態(tài)特別有用。涂片只是從子宮頸的上表層細(xì)胞取樣，因此具有高水平的染色是重要的。用抗-Cdc6和抗-MCM5獲得的這樣高水平的染色，對(duì)于早期異常性(低級(jí)的SIL，CINI)非常有意義，用抗-PCNA或抗-Ki67都不能顯示這種早期異常。而且，用抗-Cdc6和抗-MCM5抗體對(duì)LSIL樣品獲得的全厚度染色，用抗-PCNA或抗-Ki67抗體都不能獲得，使前者對(duì)于檢查早期潛在性惡性變前狀態(tài)涂片樣品的特殊用途更令人注目。實(shí)施例4-Cdc6和MCM5抗體可檢測(cè)子宮頸涂片中的異常細(xì)胞實(shí)施例3證明抗-Cdc6和抗-MCM5結(jié)合分子對(duì)檢測(cè)子宮頸切片中潛在性惡變前損傷具有價(jià)值。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它們對(duì)于檢測(cè)子宮頸涂片樣品制備中的異常細(xì)胞也同樣有效。
在4％甲醛中(從在磷酸緩沖鹽水中的多聚甲醛新鮮配制)固定子宮頸涂片10分鐘。然后用抗-Cdc6抗體(1∶200)或抗-MCM5抗體(1∶200)對(duì)已固定的材料染色，隨之用異硫氰酸熒光素(Amersham，1∶100)結(jié)合標(biāo)記的驢抗-兔多克隆抗體染色。用碘化丙錠標(biāo)記總DNA。應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡(Bio-Rad MRC 1024)觀察圖像。在這些圖像中，總DNA顯紅色，Cdc6或MCM5的免疫染色是綠色，而免疫反應(yīng)性核顯出黃色。
正常子宮頸涂片的例子顯示出特征性平行排列的宮頸內(nèi)膜細(xì)胞帶，以及淺表的和組織轉(zhuǎn)化的扁平細(xì)胞的混合細(xì)胞群。沒有證據(jù)表明存在與任何所試驗(yàn)抗體的特異性抗-Cdc6或抗-MCM5的免疫反應(yīng)性。
包含異常核質(zhì)細(xì)胞(異常扁平細(xì)胞)的不正常涂片，與三種不同的抗-Cdc6抗體和抗-MCM5抗體顯示出陽性染色。Koilocytes也與抗-Cdc6和抗-MCM5抗體顯示出強(qiáng)免疫反應(yīng)性。鄰近的正常淺表扁平細(xì)胞/組織轉(zhuǎn)化細(xì)胞未顯示出Cdc6或MCM5免疫反應(yīng)性。
用不同的抗-Cdc6抗體都獲得了對(duì)LSIL細(xì)胞，包括Koilocytes細(xì)胞的優(yōu)先染色結(jié)果，對(duì)比之下，對(duì)于正常子宮頸涂片，或者對(duì)于異常子宮頸涂片中的正常細(xì)胞，都只有非常低的背景染色。應(yīng)用抗-MCM5抗體也獲得了這種結(jié)果。
用抗-MCM5抗體觀察到類似的結(jié)果。實(shí)施例5-Cdc6和MCM5抗體優(yōu)先染色乳腺中的癌細(xì)胞用抗-Cdc6和抗-MCM5抗體對(duì)另一部位的常見癌癥，乳腺癌進(jìn)行了試驗(yàn)。對(duì)乳腺組織固定和染色的方法同實(shí)施例3和4中對(duì)子宮頸涂片所述的方法。
用抗-Cdc6和抗MCM5抗體對(duì)一系列乳腺癌進(jìn)行了試驗(yàn)。
用抗-Cdc6和抗-MCMS抗體對(duì)多種組織學(xué)類型的乳腺癌，包括低等級(jí)和高等級(jí)侵害的導(dǎo)管癌，都觀察到強(qiáng)陽性染色反應(yīng)，而正常的乳腺?zèng)]有顯示任何免疫染色反應(yīng)的證據(jù)。對(duì)于低等級(jí)的粘膜癌也觀察到與這二個(gè)抗體的強(qiáng)陽性染色反應(yīng)。重要的是，與癌細(xì)胞靠近的正常基質(zhì)細(xì)胞為陰性。
實(shí)施例6-對(duì)血液樣品的分析試驗(yàn)應(yīng)用在Williams等，臨床化學(xué)學(xué)報(bào)，1986，155，329-344中所述的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，檢測(cè)來自患有散布性組織變形癥病人的保存血樣品，表明存在MCM5和Cdc6。血清中可溶性MCM5和Cdc6的含量與腫瘤的大小有關(guān)。實(shí)施例7-涂片和冷凍切片與經(jīng)受抗原提取處理的石蠟包埋組織切片的比較用抗-Ki67，PCNA，MCM5和Cdc6的抗體，對(duì)甲醛固定，石蠟包埋的如下組織的5μm厚切片進(jìn)行了過氧化物酶免疫染色試驗(yàn)正常子宮頸(7個(gè)樣品)，LSIL(5個(gè)樣品)，HSIL(6個(gè)樣品)，以及扁平細(xì)胞癌(6個(gè)樣品)。
切割5μm厚的切片，置于載玻片上，在二甲基中脫蠟。通過在以100％甲醇配制的0.6％過氧化氫中室溫下溫育30分鐘，淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。在超純水中浸洗玻片2分鐘，然后在檸檬酸鈉緩沖液中加壓蒸煮2分鐘。在Tris緩沖鹽水(TBT)中浸洗2次，每次5分鐘，然后對(duì)每個(gè)切片用以TBS配制的10％羊血清約100μl封閉。將玻片瀝干，擦去多余的血清。在含有1％BSA的TBS中將第一抗體稀釋成1∶200，對(duì)每個(gè)切片加入100μl，在溫盒內(nèi)4℃溫育過夜。然后在TBS中浸洗3次，每次5分鐘，隨后加入在含有1％BSA的TBS中以1∶500稀釋的生物素化羊抗-抗兔第二抗體，室溫下作用30分鐘。在TBS中浸洗3次，每次5分鐘，然后加入在TBS中1∶500稀釋的鏈親合素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，室溫下作用30分鐘。以TBS漂洗3次，每次5分鐘，然后加入在含有0.005％過氧化氫的TBS中配制的1％二氨基聯(lián)苯胺底物，室溫下溫育10分鐘。通過在自來水中漂洗而終止反應(yīng)，然后用蘇木精對(duì)切片輕微染色，通過梯度濃度乙醇脫水，并在二甲苯中透明。用DPX封固基質(zhì)對(duì)切片加蓋玻片。
用抗-PCNA，Ki67，MCM5和Cdc6抗體對(duì)如下組織的冷凍組織切片進(jìn)行過氧化物酶免疫染色試驗(yàn)正常子宮頸(8個(gè)樣品)，HSIL(9個(gè)樣品)，以及LSIL(8個(gè)樣品)。
將冷凍切片在丙酮中固定10分鐘。通過在以100％甲醇配制的0.6％過氧化氫中溫育30分鐘，淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后在TBS中洗切片，用以TBS配制的10％羊血清封閉過夜。加入在含有1％BSA的TBS中1∶200稀釋的第一抗體，4℃溫育過夜。然后同上面用于固定組織切片的程序，引入第二抗體。
在用于冷凍切片時(shí)，用抗-MCM5和抗-Cdc6抗體染色的靈敏度，比用抗-PCNA和抗-Ki67抗體高很多。
對(duì)于甲醛固定，石蠟包埋和加壓蒸煮的正常組織，LSIL和扁平細(xì)胞瘤組織，抗-PCNA，抗-MCM7，抗-MCM5和抗-Cdc6給出了相似的染色圖形。相比之下Ki67的靈敏度非常弱，對(duì)LSIL和扁平細(xì)胞癌只有灶性微弱染色。實(shí)施例8-用抗MCM7抗體對(duì)冷凍切片和對(duì)經(jīng)受抗原提取處理的組織染色用抗-MCM7抗體對(duì)分類為HSIL的子宮頸4塊冷凍切片進(jìn)行了染色試驗(yàn)。
觀察到與用抗-Cdc6和抗-MCM5抗體染色相同的染色圖形。
此結(jié)果不同于Hiraiva等(國(guó)際癌癥雜志，74∶180-184)的結(jié)果，他發(fā)現(xiàn)在已經(jīng)受抗原提取處理方案的幾種人組織和三種類型的人腫瘤，對(duì)PCNA和MCM7(hCDC47)有相似的免疫染色圖形。
但是，發(fā)現(xiàn)用抗-MCM7抗體對(duì)正常子宮頸，LSIL和扁平細(xì)胞瘤的，經(jīng)受了抗原提取處理的石蠟包埋組織切片得到的與Hiraiwa等一致的染色圖形，類似于用抗-PCNA抗體得到的染色圖形。如在實(shí)施例7中所指出的，抗-MCM5和抗-Cdc6抗體對(duì)如此制備的這些切片的染色圖形，也類似于抗-PCNA抗體的染色圖形。實(shí)施例9-用抗MCM2抗體染色用兔抗-人MCM2多克隆抗體對(duì)二個(gè)正常子宮頸的冷凍切片和4個(gè)HSIL的冷凍切片(其中每個(gè)都包含正常的子宮頸上皮)染色。
正常的外子宮頸僅在基底層顯示出細(xì)胞核染色，染色不表現(xiàn)在淺表的分化細(xì)胞內(nèi)。相比之下，對(duì)于異常的上皮，整個(gè)厚度都有HSIL細(xì)胞的核染色。內(nèi)子宮頸細(xì)胞為陰性。實(shí)施例10-用抗-MCM3抗體染色將兔抗-人MCM3多克隆抗體用于對(duì)一個(gè)正常子宮頸的冷凍切片和2個(gè)HSIL的冷凍切片(其中每個(gè)都包含正常的子宮頸上皮)染色。
正常的外子宮頸僅在基底層顯示出明顯顆粒狀的核染色，淺表的分化細(xì)胞內(nèi)不表現(xiàn)出核染色?？梢妼?duì)角質(zhì)細(xì)胞質(zhì)的某些背景染色。對(duì)比之下，對(duì)于異常上皮，整個(gè)厚度都有HSIL細(xì)胞的核染色。對(duì)宮頸內(nèi)膜粘液有某些染色，雖然宮頸內(nèi)膜細(xì)胞核為陰性。
還將抗-人MCM3多克隆抗體用于對(duì)四個(gè)HSIL涂片和2個(gè)LSIL涂片(其中每個(gè)都包含有正常的子宮頸細(xì)胞)染色。在每種情況下都有對(duì)SIL細(xì)胞核的染色。此外，在使用第一抗體的稀釋液時(shí)，對(duì)角質(zhì)細(xì)胞有背景細(xì)胞質(zhì)染色，對(duì)宮頸內(nèi)膜細(xì)胞核有某些染色。
將抗-非洲爪蟾MCM3多克隆抗體用于染色HSIL的冷凍切片。通過蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)和組織切片定位，證明抗-非洲爪蟾MCM3抗體與人MCM3有交叉反應(yīng)性。對(duì)于異常上皮，整個(gè)厚度都有HSIL細(xì)胞的核染色。實(shí)施例11-用抗-MCM4抗體的染色將兔抗-人MCM4多克隆抗體用于對(duì)一個(gè)正常子宮頸冷凍切片和二個(gè)HSIL冷凍切片(其中每個(gè)都包含正常的子宮頸上皮)染色。
正常的子宮頸僅在基底層顯示出明顯顆粒狀的核染色，在淺表層分化細(xì)胞內(nèi)未表現(xiàn)出核染色?？梢妼?duì)角質(zhì)細(xì)胞質(zhì)的某些背景染色。相比之下，對(duì)于異常的上皮，整個(gè)厚度都有HSIL細(xì)胞的核染色，表面的細(xì)胞核為強(qiáng)染色。在使用第一抗體的稀釋液時(shí)，對(duì)宮頸內(nèi)膜細(xì)胞核有微弱的染色。
還將抗-人MCM4多克隆抗體用于對(duì)二個(gè)HSIL涂片染色(其中每個(gè)涂片都包含正常的子宮頸細(xì)胞)。在每次情況下對(duì)HSIL細(xì)胞都有核染色。此外，在使用第一抗體的稀釋液時(shí)，對(duì)角質(zhì)細(xì)胞有細(xì)胞質(zhì)背景染色，對(duì)宮頸內(nèi)膜細(xì)胞核有某些染色。實(shí)施例12-用抗MCM6抗體染色將兔抗-人MCM6多克隆抗體用于對(duì)一個(gè)正常子宮頸冷凍切片和二個(gè)HSIL冷凍切片(其中每個(gè)都包含正常的子宮頸上皮)染色。
正常的外子宮頸僅在基底層顯示出細(xì)胞核強(qiáng)染色，在淺表層分化細(xì)胞中未表現(xiàn)出有核染色。相比之下，對(duì)于異常上皮，整個(gè)厚度都有HSIL細(xì)胞核的強(qiáng)染色。對(duì)宮頸內(nèi)膜粘液也有某些染色，但對(duì)宮頸內(nèi)膜細(xì)胞核只有微弱的染色。
還將抗-人MCM6多克隆抗體用于對(duì)4個(gè)HSIL涂片和4個(gè)LSIL涂片染色(其中每個(gè)都包含正常子宮頸細(xì)胞)。在每種情況都有對(duì)SIL細(xì)胞的核染色。此外，在使用第一抗體的稀釋液時(shí)，對(duì)角質(zhì)細(xì)胞有細(xì)胞質(zhì)背景染色，對(duì)宮頸內(nèi)膜細(xì)胞核有某些染色。實(shí)施例13-用抗-MCM7抗體的進(jìn)一步染色實(shí)驗(yàn)將兔抗-人MCM7多克隆抗體用于對(duì)3個(gè)正常子宮頸冷凍切片，6個(gè)HSIL冷凍切片和一個(gè)子宮頸SCC冷凍切片(其中每個(gè)切片都包含正常的子宮頸上皮)染色。
正常的外子宮頸僅在基底層顯示出核染色，在淺表層分化細(xì)胞中未表現(xiàn)出核染色?？梢妼?duì)角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞外質(zhì)有某些背景染色。相比之下，對(duì)于異常的上皮，在整個(gè)厚度的大多數(shù)HSIL細(xì)胞都有細(xì)胞核強(qiáng)染色。在使用第一抗體的稀釋液時(shí)，對(duì)宮頸內(nèi)膜粘液有某些染色，對(duì)宮頸內(nèi)膜細(xì)胞核有弱染色。
還將抗-人MCM7多克隆抗體用于對(duì)二個(gè)HSIL涂片和二個(gè)LSIL涂片染色(其中每個(gè)都包含正常子宮頸細(xì)胞)。在每次情況下，都有對(duì)SIL細(xì)胞的核染色。此外，在使用第一抗體的稀釋液時(shí)，對(duì)角質(zhì)細(xì)胞有細(xì)胞質(zhì)背景染色，對(duì)宮頸內(nèi)膜細(xì)胞核有某些染色。
將抗-非洲爪蟾MCM7多克隆抗體(通過蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)和對(duì)組織切片的定位證明與人MCM7有交叉反應(yīng))用于對(duì)HSIL的冷凍切片染色。對(duì)于異常的上皮，整個(gè)厚度都有HSIL細(xì)胞的核染色。方法子宮頸涂片的制備固定新鮮的涂片(在50∶50的丙酮∶甲醇中固定5分鐘)，淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性(如上面所述)之后，對(duì)細(xì)胞作滲透(4mM脫氧膽酸鈉，10分鐘)，漂洗(在含有0.25％Triton X-100的TBS中)處理，并用TBS配制的10％羊血清封閉過夜。加入在含有1％BSA的TBS中1∶200稀釋的第一抗體在4℃溫育過夜，然后在TBS中浸洗玻片3次，每次5分鐘，隨后加入在含有1％BSA的TBS中以1∶500稀釋的生物素化兔第二抗體(Dako)，室溫下作用30分鐘。TBS中漂洗3次，每次5分鐘，然后加入在TBS中以1∶500稀釋的鏈親合素辣根過氧化物酶復(fù)合物(Dako)，室溫下作用30分鐘。TBS中洗3次，每次5分鐘之后，加入以含有0.005％過氧化氫的TBS配制的1％二氨基聯(lián)苯胺底物，室溫下溫育10分鐘。通過在自來水中漂洗使反應(yīng)停止，用蘇木精對(duì)玻片稍作負(fù)染，通過梯度乙醇脫水，并在二甲苯中透明。以DPX封固基質(zhì)施加蓋玻片。免疫熒光將新鮮收集的子宮頸涂片材料懸浮于0.5 ml PBS中，并加入0.5ml8％甲醛使之固定，然后使之沉淀在聚賴氨酸蓋玻片上。如在Romanowski等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)，1996，9310189-10194中所述的方法對(duì)蓋玻片進(jìn)行了處理。在5％BSA/PBS／Triton X-100和SDS中封閉之后，將它們與第一抗體共同溫育，漂洗，與第二抗體(FITC結(jié)合標(biāo)記的抗-兔抗體，Amersham 1∶100)，然后用碘化丙錠/RNA酶A(二者均為Sigma產(chǎn)品，以50ng/ml的濃度)對(duì)DNA負(fù)染，漂洗，并封固在甘油/PBS/苯二胺中。
在BioRad MRC 1024激光共焦掃描顯微鏡上用雙通道(FITC&Texas Red)法收集熒光圖像。對(duì)于某些圖像，收集了1-2μl間距的共焦序列，然后投射為單幀圖像(圖4a和c)。從乳房切除標(biāo)本收集新鮮的正常乳腺組織和腫瘤乳腺組織。將其薄切片(＜1mm)在4％多聚甲醛中固定30分鐘，然后同上述處理，但是允許較長(zhǎng)時(shí)間地與二種抗體溫育和漂洗。實(shí)施例14-本發(fā)明的實(shí)施方案與標(biāo)準(zhǔn)Pap染色法的盲法比較對(duì)從同時(shí)在地方醫(yī)院門診病人診斷作陰道鏡檢的婦女獲得的涂片，進(jìn)行盲法試驗(yàn)，以便將用抗-MCM5抗體的檢測(cè)效果同標(biāo)準(zhǔn)的Pap染色法進(jìn)行比較。
表1顯示，對(duì)于通過常規(guī)Pap染色法檢查為陽性的26例，通過本發(fā)明的抗體試驗(yàn)，全部26也被記錄為陽性。在被常規(guī)Pap染色法記錄為陰性的16例中，13例也被抗體試驗(yàn)記錄為陰性。
余下的三例中，一例含有被染色的未成熟組織轉(zhuǎn)化扁平上皮細(xì)胞，顯示出炎癥性背景反應(yīng)改變。其余2例經(jīng)Pap染色法再次檢查證實(shí)含有異常的(LSIL)細(xì)胞，也就是說，本發(fā)明可用于排除這種Pap染色法的假陰性結(jié)果。
這些結(jié)果證明，應(yīng)用本發(fā)明的抗體試驗(yàn)，沒有丟失來自Pap染色的任何信息，反而增加了信息。這允許用常規(guī)的Pap染色對(duì)抗體試驗(yàn)可能的失敗提供保險(xiǎn)。實(shí)施例15-對(duì)患有尿道惡性腫瘤病人尿樣品的檢查建立了離解增強(qiáng)鑭熒光免疫測(cè)定法(“DELFIA”)，以便應(yīng)用二種不同的兔抗-hMCM5多克隆抗血清檢測(cè)人MCM5。
基于夾心檢測(cè)法，將過量的特異性抗體固相化在一種表面上(在此是聚苯乙烯微量滴定板的孔表面)-即為“捕捉抗體”。在與第一抗體結(jié)合反應(yīng)之后，過量加入具有不同抗原表位特異性的標(biāo)記的(在此用銪標(biāo)記)第二抗體。免疫反應(yīng)完成之后，洗去多余的材料，并加入了增強(qiáng)液(Wallac Oy)，然后用時(shí)間分辨熒光計(jì)測(cè)定時(shí)間分辨性熒光。信號(hào)強(qiáng)度與分析物的濃度成正比。
應(yīng)用了如下的檢測(cè)步驟1.用兔抗-MCM5多克隆抗體包被過夜(4℃，每孔1600ng)；2.用DELFIA漂洗緩沖液(Wallac Oy)洗3次；3.在5％BSA/PBS中封閉1小時(shí)；4.用DELFIA漂洗緩沖液(Wallac Oy)洗3次；5.第一抗體-結(jié)合反應(yīng)(在含有0.02％TWEEN的Wallac multi緩沖液中1∶3稀釋分析物)過夜(4℃)；6.用DELFIA漂洗緩沖液(Wallac Oy)洗4次；7.以銪標(biāo)記的兔抗-MCM5多克隆抗體(420Eu／TgG)進(jìn)行第二抗體結(jié)合反應(yīng)，3小時(shí)；8.用DELFIA漂洗緩沖液(Wallac Oy)洗6次；9.加入增強(qiáng)液，振搖溫育10分鐘。用時(shí)間分辨熒光計(jì)(Wallac Oy)測(cè)定時(shí)間分辨熒光。
用來自二只不同兔的兔抗-MCM5多克隆抗血清和以5％BSA/PBS配制的重組人MCM5作分析物，制作了13pM-41250pM范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過將樣品DELFIA測(cè)定數(shù)與由重組hMCM5 5％BSA/PBS制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較，可確定樣品中hMCM5的濃度。預(yù)計(jì)使用單克隆抗體時(shí)會(huì)有更好的靈敏度。
以3000rpm轉(zhuǎn)速將取自英國(guó)劍橋Addenbrookes醫(yī)院尿道惡性腫瘤病人的尿樣品離心(50-150ml，SIGMA 4K10，7分鐘，4℃)，并通過對(duì)DNA-結(jié)合蛋白進(jìn)行低滲膨脹，douncing和鹽提取處理，得到了來自細(xì)胞沉淀的可溶性組分。應(yīng)用MCM5 DELFIA測(cè)定此可溶性組分，將其生物化學(xué)數(shù)據(jù)同醫(yī)院泌尿科病理室的診斷報(bào)導(dǎo)相比較。
5份臨床確定為惡性腫瘤陽性的標(biāo)本中，應(yīng)用本發(fā)明的DELFIA測(cè)定4份記分為陽性(80％)，顯示有可測(cè)定量MCM5(29-58pM)。6份臨床確定為惡性腫瘤陰性的樣品中，全部給出類似于DELFIA零標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)。實(shí)施例16-對(duì)患有急性和慢性白血病/淋巴瘤病人血樣品的分析將實(shí)施例15中所述的DELFIA試驗(yàn)用于檢測(cè)從劍橋Addenbrookes醫(yī)院急性和慢性白血病/淋巴病病人得到的血液樣品。以3000rpm轉(zhuǎn)速將血液樣品離心(SIGMA 4K10，7分鐘，4℃)，并通過對(duì)DNA-結(jié)合蛋白進(jìn)行低滲膨脹，douncing和鹽提取處理，得到了來自細(xì)胞沉淀的可溶性組份。隨后應(yīng)用DELFIA檢測(cè)此可溶性組份。
6個(gè)惡性腫瘤病例中，5例用本發(fā)明的DELFIA測(cè)定為陽性(83％)，顯示有可測(cè)定量的MCM5(24-1945pM)。6例對(duì)照樣品(來自門診糖尿病患者的血液)全部給出類似于“0”標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)。實(shí)施例17-對(duì)轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的血清學(xué)檢測(cè)應(yīng)用實(shí)施例15中所述的DELFIA試驗(yàn)，對(duì)來自英國(guó)劍橋Addenbrookes醫(yī)院惡性乳腺癌和卵巢癌病人的血清進(jìn)行了檢測(cè)。
2例肉瘤和3例癌癥(乳腺和卵巢腺癌)都顯示出了可測(cè)定量的MCM5。實(shí)施例18-制備用于本發(fā)明的全-MCM-多克隆抗體按如下方法獲得了能夠結(jié)合MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6和MCM7的多克隆抗體制備物。
應(yīng)用t-BOC化學(xué)過程合成了肽片段VVCIDEFDKMSDMRTAC，此片段相當(dāng)于MCM蛋白質(zhì)家族共同的共有序列。使此肽結(jié)合于PPD(純化的蛋白質(zhì)衍生物-結(jié)核菌素)。
每隔21天對(duì)兔免疫注射一次。第三次免疫后的第10天采集血清，用于以后的實(shí)驗(yàn)(在下面的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中被稱為全-MCM)。實(shí)施例19-用抗Cdc6，抗-MCM2，抗-MCM5，抗-MCM7和全-MCM抗體對(duì)正常乳腺組織和乳腺癌組織的染色用抗Cdc6，MCM2，MCM5和MCM7的抗體，以及全-MCM抗體，對(duì)正常乳腺(乳房復(fù)位手術(shù)接受者的)和組織活檢證明為導(dǎo)管和小葉癌的乳腺組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行染色?？?MCM2抗體是BM28小鼠單克隆抗體，可從Transduction實(shí)驗(yàn)室購(gòu)得(見他們的1998抗體產(chǎn)品目錄)。如上所述，對(duì)每個(gè)抗體單獨(dú)進(jìn)行染色。
對(duì)經(jīng)受了加壓蒸煮的甲醛固定，石蠟包埋的樣品和冷凍樣品進(jìn)行了測(cè)定。
根據(jù)醫(yī)院贊同的倫理道德準(zhǔn)則，使用了Addenbrooke醫(yī)院為組織活檢診斷或切除術(shù)后得到的甲醛固定，石蠟包埋的人組織。從這些組織切割了5μm厚的切片，置于APES(氨丙基三乙氧基硅烷)涂布的載玻片上，在二甲苯中脫蠟，并經(jīng)過從乙醇直到水的處理。在檸檬酸緩沖液中對(duì)組織切片加壓蒸煮，以便有助于抗原表位的回收，隨后在Tris-緩沖鹽水(TBS)中漂洗。通過在TBS中配制的0.6％過氧化氫中溫育30分鐘淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。
在TBS中洗切片，并用TBS中配制的10％羊血清封閉達(dá)2小時(shí)之久。在含有0.1％Triton和1％牛血清白蛋白(BSA)的TBS中稀釋第一抗體。對(duì)每個(gè)切片加100μl抗體，在溫盒中4℃溫育切片。
然后在含有0.025％Triton的TBS中洗玻片，隨后在含有1％BSA的TBS中以1∶500稀釋的生物素化羊抗-兔第二抗體(DAKO)中室溫下溫育1小時(shí)。在TBS中漂洗之后，將應(yīng)用底物二氨基聯(lián)苯胺的鏈親合素辣根過氧化物酶系統(tǒng)用于染色切片。通過在水中漂洗使反應(yīng)停止，并用Harris蘇木精作輕微負(fù)染，通過梯度乙醇脫水，并在二甲苯中透明。用DEPEX封固基質(zhì)施加蓋玻片。
如上面實(shí)施例7中所述制備冷凍切片，不同的是用10％羊血清封閉30分鐘而不是過夜。
在正常乳腺組織中，只有1-3％的導(dǎo)管細(xì)胞或小葉細(xì)胞為染色陽性。基質(zhì)細(xì)胞為陰性。
在各種乳腺癌中，包括低度和高度損傷的，以及小葉和導(dǎo)管型的，50-80％的異常細(xì)胞顯示出染色陽性，周圍的基質(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞仍然未被染色。
這些結(jié)果是用每個(gè)抗體單獨(dú)獲得的。
與抗-PCNA和抗-ki67抗體進(jìn)行了比較。對(duì)于石蠟切片，抗-PCNA染色得到與抗-MCM5和抗-CDC6類似的結(jié)果，然而抗-Ki67僅顯示出微弱的灶性染色。對(duì)于冷凍切片，用抗-MCM和抗-CDC6抗體染色獲得比抗-PCNA或抗-Ki67抗體好得多的結(jié)果。實(shí)施例20-用抗-MCM5，MCM7和全-MCM抗體對(duì)正常前列腺和前列腺癌的染色如在實(shí)施例19中對(duì)乳腺細(xì)組織所述的方法，制備前列腺正常組織和前列腺癌的石蠟包埋組織學(xué)切片標(biāo)本，以分別的實(shí)驗(yàn)用抗-MCM5，抗-MCM7和全-MCM抗體對(duì)切片染色。
對(duì)每種抗體，正常組織顯示陽性染色的細(xì)胞小于10％，而腺癌組織顯示出30-50％的腫瘤細(xì)胞染色，周圍的基質(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞仍未被染色。實(shí)施例21-用抗-MCM2，MCM5，MCM7，全-MCM和CDC6抗體對(duì)正常結(jié)腸和結(jié)腸癌組織的染色用抗MCM2，MCM5，MCM7，全-MCM和CDC6抗體，分別對(duì)結(jié)腸腺癌和結(jié)腸管絨毛腺癌的組織學(xué)切片標(biāo)本染色。正常標(biāo)本也用這些抗體染色。
在正常組織中，僅在較底層的第三結(jié)腸隱窩看見對(duì)每種抗體的染色，隱窩內(nèi)較淺表層的分化細(xì)胞仍未被染色。
在管絨毛腺癌和腺癌組織中，大于50％的腫瘤細(xì)胞對(duì)每種抗體的染色為陽性，周圍結(jié)締組織成分未被染色。
象實(shí)施例19中對(duì)乳腺組織一樣，檢測(cè)了冷凍樣品和石蠟包埋樣品。一方面抗-MCM和抗-CDC6抗體間的結(jié)果相類似，另一方面抗-PCNA和抗-Ki67抗體間的結(jié)果相類似，也就是說，對(duì)于冷凍樣品，用抗-MCM和抗-CDC6抗體的染色結(jié)果優(yōu)于用抗-PCNA和抗-Ki67抗體獲得的染色結(jié)果。實(shí)施例22-用抗MCM2，MCM5，MCM7和全-MCM抗體對(duì)正常肺組織和肺癌組織的染色分別用抗-MCM2，抗-MCM5，抗-MCM7和全-MCM抗體，對(duì)來自肺扁平細(xì)胞癌或肺腺癌病人的組織活檢或切片的石蠟包埋組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行了染色。如實(shí)施例19中對(duì)乳腺組織所述的方法制備標(biāo)本。用對(duì)正常肺實(shí)質(zhì)組織的染色進(jìn)行比較。
在正常組織中，被染色的增生部分非常少。
在所有的癌組織中，30％以上的腫瘤細(xì)胞為染色陽性，周圍的炎癥細(xì)胞或結(jié)締組織細(xì)胞未被染色。實(shí)施例23-用抗-MCM2，抗-MCM5，抗-MCM7，全-MCM和抗-CDC6抗體對(duì)正常膀胱和膀胱癌組織的染色用抗-MCM2，抗-MCM5，抗-MCM7，全-MCM和抗-CDC6抗體，對(duì)來自膀胱鏡檢時(shí)取樣的移行細(xì)胞癌組織活檢的組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行了染色。
對(duì)于正常膀胱組織，在移行上皮的基底層有強(qiáng)染色，而較淺表的分化細(xì)胞仍未被染色。
在包含腫瘤的原位組織碎片中，全厚度的異常發(fā)育細(xì)胞被陽性染色。
對(duì)于侵入性移行細(xì)胞癌，50-100％的腫瘤細(xì)胞顯示出核染色，伴有染色陰性的基質(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞成分。
用實(shí)施例19中對(duì)乳腺組織的檢測(cè)，測(cè)定了冷凍和石蠟包埋的二種樣品。一方面抗-MCM和抗-CDC6抗體間的結(jié)果相類似，另一方面抗-PCNA和抗-Ki67抗體的結(jié)果相類似，也就是說，對(duì)于冷凍樣品，用抗-MCM和抗-CDC6抗體的染色結(jié)果優(yōu)于應(yīng)用抗-PCNA和抗-Ki67得到的染色結(jié)果。實(shí)施例24-用抗-MCM5抗體對(duì)多種皮膚樣品的染色用抗-MCM5抗體對(duì)如下的皮膚組織學(xué)樣品染色正常皮膚，增生狀態(tài)的皮膚(包括牛皮癬)，陽光性角化癥，Bowen氏病，以及侵害性扁平細(xì)胞癌。
正常皮膚顯示主要對(duì)上皮基底層染色，偶見上皮第三底層中的細(xì)胞也被染色，但是較淺表的分化細(xì)胞仍未被染色。
在牛皮癬的情況下，較顯著的染色存在于表皮最下面的3-4層，反映皮膚的更新率增加了。
對(duì)于陽光性角化癥和Bowen氏病(原位癌)，顯示表皮中所有的異常發(fā)育細(xì)胞都被染色，直達(dá)全厚度。
在侵害性扁平細(xì)胞癌，顯示出70％以上的細(xì)胞被染色，對(duì)于良好分化的腫瘤，顯示出鄰近珠狀角蛋白的分化細(xì)胞陰性染色小病灶。實(shí)施例25-用抗-MCM5抗體對(duì)喉組織的染色如同實(shí)施例19中所述的制備乳腺組織石蠟包埋標(biāo)本的方法，制備正常喉和喉癌組織學(xué)樣品，用抗-MCM5抗體對(duì)其染色。
正常組織顯示僅對(duì)基底增殖的上皮細(xì)胞染色(小于10％)。
癌組織顯示對(duì)50％以上的細(xì)胞具有核染色?；|(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞全都為陰性。實(shí)施例26-用抗MCM5抗體對(duì)食道組織的染色如同實(shí)施例19中所述的制備乳腺組織石蠟包埋標(biāo)本的方法，制備正常食道和食道癌組織學(xué)樣品，用抗-MCM5抗體對(duì)其染色。
正常組織顯示僅對(duì)基底增殖的上皮細(xì)胞染色(小于10％)。
癌組織顯示對(duì)50％以上的細(xì)胞具有核染色?；|(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞全都為陰性。實(shí)施例27-用抗-MCM5抗體對(duì)支氣管組織的染色如同實(shí)施例19中所述的制備乳腺組織石蠟包埋標(biāo)本的方法，制備正常支氣管和支氣管癌組織學(xué)樣品，用抗-MCM5抗體對(duì)其染色。
正常組織顯示僅對(duì)基底增殖的上皮細(xì)胞染色(小于10％)。
癌組織顯示對(duì)50％以上的細(xì)胞具有核染色?；|(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞全都為陰性。實(shí)施例28-用抗-MCM5抗體對(duì)正常淋巴結(jié)和一類淋巴癌組織的染色如在實(shí)施例19中對(duì)乳腺組織所述的方法，制備反應(yīng)性淋巴結(jié)和一類Hodgkin氏和非Hodgkin氏淋巴癌組織的冷凍組織學(xué)樣品和石蠟包埋組織學(xué)樣品。
反應(yīng)性淋巴結(jié)顯示在淋巴樣濾泡的生發(fā)中心內(nèi)的細(xì)胞有強(qiáng)染色，偶見在旁濾泡區(qū)內(nèi)有散布的陽性染色細(xì)胞。
淋巴癌組織顯示對(duì)50％以上的惡性淋巴細(xì)胞有核染色。實(shí)施例29-用抗-MCM5抗體對(duì)尿細(xì)胞涂片的檢查從已知患有移行細(xì)胞癌的病人和從泌尿科診斷正常病人收集尿樣品。將20ml尿以3000g離心10分鐘，取出上清液，沉淀再懸浮于50μl上清液內(nèi)。將此沉淀物在APES載玻片上作涂片，并在乙醇中固定。
在Tris緩沖鹽水(TBS)中洗玻片，然后在4mM脫氧膽酸鈉內(nèi)滲透10分鐘。以加有0.025％Triton的TBS洗玻片，并用TBS配制的10％羊血清封閉2小時(shí)。將預(yù)先吸附的抗-MCM5抗體在含有0.1％Triton和1％BSA的TBS中稀釋，對(duì)每個(gè)玻片加入200μl。置于濕盒內(nèi)在有軌搖床上4℃溫育過夜。
在含有0.025％Triton的TBS中洗此玻片，隨后在含有1％BSA的TBS中1∶500稀釋的生物素化羊抗-兔第二抗體(DAKO)中室溫下溫育1小時(shí)。用TBS配制的0.6％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶10分鐘，隨后在TBS中漂洗。將使用底物二氨基聯(lián)苯胺的鏈親合素辣根過氧化物酶系統(tǒng)用于染色此玻片。通過在水中漂洗使反應(yīng)停止，用Harris蘇木精對(duì)玻片稍加染色，隨之用橙黃G和EA50(PAP染料)染色。
對(duì)于6例按此方法制備尿細(xì)胞涂片，并用抗-MCM5抗體染色的移行細(xì)胞癌樣品，所有的惡性移行細(xì)胞都顯示出強(qiáng)染色，背景中伴有未被染色的炎癥細(xì)胞和扁平細(xì)胞。從泌尿科診斷正常的病人尿液制備的相似涂片，扁平細(xì)胞或正常的移行細(xì)胞都顯示未被染色。實(shí)施例30-對(duì)正常子宮頸樣品和扁平上皮內(nèi)損傷病人的子宮頸樣品的DELFIA檢測(cè)為了如上面實(shí)施例15中所描述的用二個(gè)不同的兔抗-MCM5多克隆抗血清檢測(cè)人MCM5，建立了離解增強(qiáng)鑭熒光免疫測(cè)定法(DELFIA)。
檢查了二個(gè)正常子宮頸樣品和二個(gè)HSIL子宮頸樣品。通過低滲膨脹和douncing處理使組織樣品溶液化，隨后鹽提取DNA結(jié)合顆粒。
二個(gè)正常樣品得到類似于零標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)。
二個(gè)HSIL樣品記分為陽性，表明應(yīng)用免疫檢測(cè)法可以檢測(cè)子宮頸樣品中的異常性。實(shí)施例31-用抗-MCM5抗體對(duì)多種癌組織的染色用抗-MCM5抗體對(duì)多種癌組織和白血病骨髓的組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行了染色，結(jié)果如下
胃癌顯示50％以上的腫瘤細(xì)胞被染色。
腎癌顯示30-50％的腫瘤細(xì)胞被染色。
卵巢癌顯示30-50％的腫瘤細(xì)胞被染色。
睪丸癌顯示30-50％的腫瘤細(xì)胞被染色。
急性白血病骨髓顯示90％以上的腫瘤細(xì)胞被染色。實(shí)施例32-對(duì)結(jié)腸涂片的染色從健康患者收集糞便材料，應(yīng)用WO 97/09600中所述的方法，借助于以上皮-特異性抗體包被的磁珠從糞便樣品中提取出脫落的表面結(jié)腸細(xì)胞，此包被的磁珠由Dynal AS(Oslo，Norway)提供。
在含有0.025％Triton的TBS(Tris-緩沖鹽水)中洗滌提取出的磁珠和上皮細(xì)胞混合物。在緩沖的4％多聚甲醛中固定之后，在TBS中洗此細(xì)胞，并從形成的細(xì)胞沉淀作細(xì)胞涂片。隨后的處理同對(duì)尿樣品涂片的處理。
PAP染色的涂片顯示出磁珠，一些纖維素和細(xì)胞碎片的混合物，存在許多來自結(jié)腸的粒狀上皮細(xì)胞和少量來自肛門溝的扁平細(xì)胞。
用抗-MCM5抗體染色時(shí)，對(duì)于正常細(xì)胞和異常細(xì)胞獲得了類似于對(duì)膀胱或子宮頸的結(jié)果。實(shí)施例33-對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎病人腸切片的染色用抗-MCM5抗體對(duì)來自活動(dòng)的潰瘍性結(jié)腸炎病人的腸石蠟包埋切片染色。
在所有被檢查的切片中，在炎癥區(qū)大約50％的表面上皮細(xì)胞顯示出對(duì)MCM5的核表達(dá)。在活動(dòng)的潰瘍性結(jié)腸炎組織內(nèi)存在大量淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞也常常顯示出對(duì)MCM5的核表達(dá)。
還檢查了靜止的潰瘍性結(jié)腸炎組織(即不存在活動(dòng)性炎癥)。在所有的這些組織內(nèi)，其表面上皮細(xì)胞不顯示對(duì)MCM5的染色.在存在于靜止的潰瘍性結(jié)腸炎組織的少量淋巴細(xì)胞中，只有很少量的細(xì)胞顯示出對(duì)MCM5的核染色。
發(fā)現(xiàn)在石蠟包埋的切片中，對(duì)于MCM5和PCNA的活動(dòng)的和靜止的潰瘍性結(jié)腸炎染色是相似的。實(shí)施例34-對(duì)Crohn氏病患者腸切片的染色對(duì)活動(dòng)性Crohn氏病患者腸石蠟包埋切片的染色，顯示出在鄰接潰瘍和炎癥區(qū)的表面上皮細(xì)胞中有對(duì)MCM5的核表達(dá)。在炎癥組織中的淋巴細(xì)胞也常常顯示出對(duì)MCM5的核表達(dá)。
還檢查了靜止性Crohn氏病患者的腸組織，在表面上皮細(xì)胞和存在的少量淋巴細(xì)胞中對(duì)MCM5的染色都是陰性。
對(duì)于活動(dòng)性和靜止性Crohn氏病的石蠟包埋切片，用抗-MCM5抗體與用抗-PCNA抗體得到了類似的結(jié)果。
用冷凍切片和石蠟包埋切片對(duì)抗-MCM5和抗-PCNA的染色進(jìn)行比較表明，對(duì)于冷凍切片，用抗-MCM5抗體的染色優(yōu)于用抗-PCNA抗體的染色，具有較多的核被染色。實(shí)施例35-用抗-MCM5抗體對(duì)正常和癌變子宮內(nèi)膜的染色用抗-MCM5抗體對(duì)正常和癌變子宮內(nèi)膜的冷凍和石蠟包埋切片進(jìn)行染色。
當(dāng)與正常組織相比較時(shí)，在癌變的子宮內(nèi)膜顯示了較好的染色，并且，與石蠟包埋的切片相比較，冷凍切片較優(yōu)越。實(shí)施例36-對(duì)子宮頸涂片單層細(xì)胞(ThinPrep)的染色在APES玻片上作涂片之后，將用于制作子宮頸涂片的刷子/刮片置于75％甲醇中，通過攪動(dòng)取下剩余的細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液在MSEHarrier離心機(jī)中以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心2分鐘對(duì)20％蔗糖液離心分層，取出并棄去上層液。將剩下的液層以3000rpm轉(zhuǎn)速再離心5分鐘，將此細(xì)胞沉淀再懸浮于200μl水中。取50μl置于每張玻片上，讓細(xì)胞沉淀在玻片上，并除去水分。然后執(zhí)行同實(shí)施例29中(尿細(xì)胞涂片)的步驟，并作PAP染色。
在多次實(shí)驗(yàn)中，用單層涂片得到的結(jié)果與用常規(guī)涂片得到的結(jié)果相同。用單層制備的優(yōu)越性可能在于，可除去粘液和大部分炎癥細(xì)胞。討論在此所述的結(jié)果表明，在體內(nèi)正常分化的組織中Cdc6和MCM5被下調(diào)了，培養(yǎng)中的一系列靜止的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色質(zhì)內(nèi)也不存在Cdc6和MCM5。這提供了某種暗示，表明這些蛋白質(zhì)可能具有作為細(xì)胞增殖標(biāo)本的潛在價(jià)值。HiraiWa等曾證實(shí)，MCM7可被免疫定位于多種類型的腫瘤內(nèi)，例如起始的皮膚腫瘤，以及胃，胰腺和結(jié)腸的惡性腫瘤，PCNA也有類似的分布。他們得出結(jié)論可能將MCM7的免疫定位用作組織切片中細(xì)胞增殖的指針。但是，如上面已注意到的，病理學(xué)領(lǐng)域的專家懷疑，借助于標(biāo)志物如PCNA和Ki67對(duì)腫瘤內(nèi)細(xì)胞增殖速度的檢測(cè)是否具有臨床用途，因?yàn)閹缀鯖]有直接的證據(jù)表明，這些標(biāo)志物對(duì)最佳應(yīng)用的傳統(tǒng)組織學(xué)檢測(cè)法如分級(jí)和分步檢測(cè)能提供真正的改進(jìn)。
在此報(bào)導(dǎo)的觀察結(jié)果顯示，針對(duì)Cdc6，MCM5和MCM7的特異性結(jié)合分子，與傳統(tǒng)的增殖標(biāo)志物如PCNA和Ki67相比較，在新鮮和冷凍的子宮頸SILs樣品中表現(xiàn)出對(duì)潛在的惡變前細(xì)胞具有高得多的特異性?？?Cdc6和抗-MCM5能夠明確地區(qū)分LSIL和HSIL中的異常細(xì)胞和鄰近的正常細(xì)胞，包括宮頸內(nèi)膜細(xì)胞，子宮頸外細(xì)胞，組織轉(zhuǎn)化細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。鑒于這種情況，已將所述的抗-Cdc6和抗-MCM抗體應(yīng)用于取自SILs病人和無此病患者的子宮頸涂片。對(duì)這些蛋白質(zhì)觀測(cè)到的驚人程度的特異性和靈敏度結(jié)果是令人震驚的。在贅生性細(xì)胞和HPV-感染的Koilocyte細(xì)胞都觀測(cè)到很強(qiáng)的核染色和細(xì)胞質(zhì)染色。在顯示出不明確異常性的組織轉(zhuǎn)化扁平細(xì)胞(未確定功能意義的非典型扁平細(xì)胞)中也發(fā)現(xiàn)有陽性免疫染色。但是，涂片中其余的混合正常細(xì)胞群，包括子宮頸外細(xì)胞，宮頸內(nèi)膜細(xì)胞，組織轉(zhuǎn)化扁平細(xì)胞和炎癥細(xì)胞(包括淋巴細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞)，對(duì)Cdc6和MCM的免疫染色都是陰性。
當(dāng)用于子宮頸涂片和冷凍切片時(shí)，抗-MCM5，抗-Cdc6和抗-MCM7的靈敏度比抗-PCNA高得多，但是用于甲醛固定，石蠟包埋和暴露于通過加壓蒸煮作抗原提取處理的組織時(shí)，這些抗體得出了相似的染色圖形。子宮頸涂片和其它的細(xì)胞樣品，以及冷凍切片，都不如甲醛固定，石蠟包埋的組織切片堅(jiān)實(shí)，因此不能經(jīng)受加壓蒸煮處理。
Cdc6和MCM抗體用于子宮頸涂片時(shí)的驚人特異性和靈敏度，為將生物化學(xué)/免疫細(xì)胞學(xué)技術(shù)引入子宮頸大規(guī)模自動(dòng)化篩選檢查提供了條件。而且，這些抗體還可能有助于改進(jìn)對(duì)LSILs的發(fā)現(xiàn)和分級(jí)，對(duì)于LSILs的分級(jí)，目前在同一觀察者和不同的觀察者之間都存在明顯的差異，即使對(duì)于子宮頸細(xì)胞學(xué)的專家也是如此。應(yīng)用這些抗體還將有助于以較高的準(zhǔn)確性和客觀性鑒別HSIL，因此有助于減少高數(shù)量的假陰性結(jié)果，這是關(guān)系到目前全球子宮頸篩選檢查計(jì)劃的一個(gè)主要問題。
如已注意到，對(duì)下列樣品檢測(cè)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)例證表明，本發(fā)明具有不限于子宮頸篩選檢查的通用性乳腺組織，胃，腎，卵巢，睪丸和結(jié)腸，尿樣品和血樣品(白血病/淋巴瘤病人的血樣品，以及轉(zhuǎn)移性肉瘤和癌病人的血樣品)，還有炎癥性腸道病的組織，包括潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn氏病的腸組織，以及糞便涂片，雖然在多種實(shí)施方案中優(yōu)選地是檢查子宮頸樣品，特別是子宮頸涂片。除細(xì)胞學(xué)技術(shù)外，還證明可應(yīng)用生物化學(xué)技術(shù)。
在上面實(shí)施例14中所述的，用盲法試驗(yàn)將本發(fā)明的實(shí)施方案與應(yīng)用規(guī)范的PAP涂片法的子宮頸涂片檢查相比較，結(jié)果證實(shí)了本發(fā)明具有令人振奮的實(shí)用性。
所有在此被提到的文獻(xiàn)均被引入作為參考。表1用盲法試驗(yàn)對(duì)被召回作陰道鏡檢門診的病人，抗-MCM5抗體檢測(cè)法與常規(guī)Pap檢測(cè)法的比較
a)見正文
權(quán)利要求
1．一種檢測(cè)人體樣品中是否存在異常增殖細(xì)胞或細(xì)胞生長(zhǎng)異常性的方法，此方法包括檢測(cè)樣品中的一種靶標(biāo)多肽，其中該靶標(biāo)多肽是DNA復(fù)制起始前復(fù)合物的一種成分；先決條件是，在此靶標(biāo)多肽是MCM7時(shí)，樣品不經(jīng)受抗原提取處理或加壓蒸煮/高壓滅菌處理。
2．權(quán)利要求1的方法，其中的靶標(biāo)多肽是選自如下種類CDC6，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6，MCM7，Cdc7蛋白激酶，Dbf4，Cdc14蛋白磷酸酶，Cdc45和MCM10。
3．權(quán)利要求2的方法，其中的靶標(biāo)多肽是選自CDC6，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6和MCM7。
4．權(quán)利要求3的方法，其中的靶標(biāo)多肽是CDC6。
5．權(quán)利要求3的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM2。
6．權(quán)利要求3的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM3。
7．權(quán)利要求3的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM4。
8．權(quán)利要求3的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM5。
9．權(quán)利要求3的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM6。
10．權(quán)利要求3的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM7。
11．權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的方法，其中該方法包括，使樣品與針對(duì)靶標(biāo)多肽的一種或幾種特異性結(jié)合成分接觸，以及測(cè)定該特異性結(jié)合成分與樣品的結(jié)合。
12．權(quán)利要求11的方法，其中所述的一種或幾種特異性結(jié)合成分是針對(duì)所述靶標(biāo)多肽的。
13．權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)的是組織樣品。
14．權(quán)利要求13的方法，其中的組織樣品是新鮮的或冷凍的。
15．權(quán)利要求13的方法，其中的組織樣品不經(jīng)甲醛固定或石蠟包埋。
16．權(quán)利要求13的方法，其中的組織樣品不經(jīng)受抗原提取處理或加壓蒸煮/高壓滅菌處理。
17．權(quán)利要求13-16任一項(xiàng)的方法，其中的組織是選自肺，乳腺，結(jié)腸，前列腺，胃，皮膚，食道和膀胱。
18．權(quán)利要求17的方法，其中的組織是乳腺組織。
19．權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中待測(cè)的是細(xì)胞樣品。
20．權(quán)利要求1-12任一項(xiàng)的方法，其中的樣品是取自人體的體液。
21．權(quán)利要求20的方法，其中的細(xì)胞樣品是由所述的體液提供。
22．權(quán)利要求20或21的方法，其中的體液是血液。
23．權(quán)利要求20或21的方法，其中的體液是尿液。
24．權(quán)利要求1-23任一項(xiàng)的方法，其中被篩選檢查的是一個(gè)人群。
25．權(quán)利要求24的方法，其中的個(gè)體可被分類為(ⅰ)具有正常的組織或(ⅱ)具有包含潛在性或確實(shí)的癌變前細(xì)胞或癌細(xì)胞，異常發(fā)育細(xì)胞或贅生性細(xì)胞的異常組織。
26．權(quán)利要求25的方法，其中被分類為具有異常組織的個(gè)體的組織或細(xì)胞將經(jīng)受進(jìn)一步檢查或分析。
27．一種檢測(cè)人體子宮頸樣品中是否存在異常增殖細(xì)胞或細(xì)胞生長(zhǎng)異常性的方法，此方法包括，使樣品與針對(duì)靶標(biāo)多肽的一種或幾種特異性結(jié)合成分接觸，以及測(cè)定該特異性結(jié)合成分與樣品的結(jié)合，其中的靶標(biāo)多肽是一種DNA復(fù)制起始前復(fù)合物成分。
28．權(quán)利要求27的方法，其中的樣品是子宮頸涂片。
29．權(quán)利要求27或28的方法，其中的靶標(biāo)多肽是選自如下種類CDC6，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6，MCM7，Cdc7蛋白激酶，Dbf4，Cdc14蛋白磷酸酶，Cdc45和MCM10。
30．權(quán)利要求29的方法，其中的靶標(biāo)多肽是選自CDC6，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6和MCM7。
31．權(quán)利要求30的方法，其中的靶標(biāo)多肽是Cdc6。
32．權(quán)利要求30的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM2。
33．權(quán)利要求30的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM3。
34．權(quán)利要求30的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM4。
35．權(quán)利要求30的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM5。
36．權(quán)利要求30的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM6。
37．權(quán)利要求30的方法，其中的靶標(biāo)多肽是MCM7。
38．權(quán)利要求27-37任一項(xiàng)的方法，其中所述的一種或幾種特異性結(jié)合成分是針對(duì)所述多種靶標(biāo)多肽的。
39．權(quán)利要求27-38任一項(xiàng)的方法，其中被篩選檢查的是一個(gè)人群。
40．權(quán)利要求39的方法，其中的個(gè)體可被分類為(ⅰ)具有正常的組織或(ⅱ)具有包含潛在性或確實(shí)的癌變前細(xì)胞或癌細(xì)胞，異常發(fā)育細(xì)胞或贅生性細(xì)胞的異常組織。
41．權(quán)利要求40的方法，其中被分類為具有異常組織的個(gè)體的組織或細(xì)胞將經(jīng)受進(jìn)一步檢查或分析。
42．一種檢測(cè)人體內(nèi)是否存在異常增殖細(xì)胞或細(xì)胞生長(zhǎng)異常性的方法，此方法包括檢測(cè)人體組織，體液或細(xì)胞中的靶標(biāo)多肽，或者編碼靶標(biāo)多肽的mRNA，其中的靶標(biāo)多肽是DNA復(fù)制起始前復(fù)合物的一種成分；先決條件是，在對(duì)取自人體的樣品實(shí)行此方法，并且其靶標(biāo)多肽是MCM7時(shí)，該樣品不經(jīng)受抗原提取處理或加壓蒸煮/高壓滅菌處理。
43．權(quán)利要求42的方法，其中所述的組織，體液或細(xì)胞是在取自人體的樣品中。
44．權(quán)利要求43的方法，其中所述的樣品是組織樣品。
45．權(quán)利要求44的方法，其中的樣品是新鮮的或冷凍的。
46．權(quán)利要求44的方法，其中的樣品不經(jīng)甲醛固定或石蠟包埋。
47．權(quán)利要求44的方法，其中的組織樣品不經(jīng)受抗原提取處理或加壓蒸煮/高壓滅菌處理。
48．權(quán)利要求42-47任一項(xiàng)的方法，其中被篩選檢查的是一個(gè)人群。
49．權(quán)利要求48的方法，其中的個(gè)體可被分類為(ⅰ)具有正常的組織或(ⅱ)具有包含潛在性或確實(shí)的癌變前細(xì)胞或癌細(xì)胞，異常發(fā)育細(xì)胞或贅生性細(xì)胞的異常組織。
50．權(quán)利要求49的方法，其中被分類為具有異常組織的個(gè)體的組織或細(xì)胞將經(jīng)受進(jìn)一步檢查或分析。
51．一種試劑盒，它包含針對(duì)一種或幾種靶標(biāo)多肽的一種或幾種特異性結(jié)合成分，其中的靶標(biāo)多肽是DNA復(fù)制起始前復(fù)合物的一種成分，此試劑盒還包含按照權(quán)利要求11-48任一項(xiàng)的方法使用此特異性結(jié)合成分的說明書。
52．權(quán)利要求51的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是選自如下種類CDC6，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6，MCM7，Cdc7蛋白激酶，Dbf4，Cdc14蛋白磷酸酶，Cdc45，和MCM10。
53．權(quán)利要求52的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是選自CDC6，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6和MCM7。
54．權(quán)利要求53的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是CDC6。
55．權(quán)利要求53的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是MCM2。
56．權(quán)利要求53的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是MCM3。
57．權(quán)利要求53的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是MCM4。
58．權(quán)利要求53的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是MCM5。
59．權(quán)利要求53的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是MCM6。
60．權(quán)利要求53的試劑盒，其中的靶標(biāo)多肽是MCM7。
61．權(quán)利要求51-60任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述的一種或幾種特異性結(jié)合成分是針對(duì)多種所述靶標(biāo)多肽的。
全文摘要
通過檢測(cè)靶標(biāo)多肽或其編碼mRNA測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的異常性,特別是癌變異常性,在此該靶標(biāo)多肽是組織,細(xì)胞或體液中的DNA復(fù)制起始前復(fù)合物的成分。靶標(biāo)多肽包括CDC6,MCM2,MCM3,MCM4,MCM5,MCM6和MCM7。在測(cè)定癌變和癌變前細(xì)胞生長(zhǎng)異常性時(shí)的檢測(cè)樣品包括,子宮頸組織(組織活檢樣品和涂片樣品),乳腺,結(jié)腸,肺,膀胱,皮膚,喉,食道,支氣管,淋巴結(jié)和泌尿道(組織活檢樣品和細(xì)胞涂片樣品)組織,在測(cè)定血液癌和證明肉瘤的癌轉(zhuǎn)移時(shí),檢測(cè)樣品包括從尿液、血液和血清中離心獲得的細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12PGK1282422SQ98812478
公開日2001年1月31日 申請(qǐng)日期1998年10月21日 優(yōu)先權(quán)日1997年10月21日
發(fā)明者R·A·拉斯基, G·H·威廉斯, N·科萊曼 申請(qǐng)人:癌癥研究行動(dòng)技術(shù)有限公司