專利名稱：治療細(xì)胞增生異常的組合物及改變細(xì)胞生長狀態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種治療細(xì)胞增生異常的組合物及改變細(xì)胞生長狀態(tài)的方法。
背景技術(shù)：
癌癥是美國第二大死因，僅次于心臟疾病，在醫(yī)藥領(lǐng)域亟需一種用以治 療如癌癥等細(xì)胞增生異常的藥劑及方法。雖然近年來在癌癥診斷及治療等領(lǐng) 域有許多進(jìn)展與突破，但外科手術(shù)及放射線治療多半僅能治愈早期發(fā)現(xiàn)的癌 癥病患。除此之外，治療的選擇非常有限。舉例而言，臨床上，通常在末期
才能診斷出肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC，以下簡稱肝癌)，此 時肝功能早已受損。雖然目前認(rèn)為外科切除手術(shù)是唯一的可行醫(yī)療手段，但 僅有非常少數(shù)的患者適合進(jìn)行手術(shù)。絕大多數(shù)無法進(jìn)行手術(shù)的患者，會接受 局部區(qū)域治療，例如經(jīng)皮下酒精注射及經(jīng)導(dǎo)管動脈化學(xué)栓塞治療。然而，肝 硬化或反復(fù)的抗腫瘤治療會造成肝功能儲備能力下降，因而限制了這些肝癌 療法的運用。由于傳統(tǒng)化學(xué)治療或放射線治療無法有效治療肝癌，對于發(fā)生 多處腫瘤、遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移或治療后癌癥復(fù)發(fā)等癥狀的患者而言，沒有較佳的治療 方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，藉由多種細(xì)胞因子的組合，能夠加乘地減低肝癌腫瘤大小。 相對應(yīng)地，本發(fā)明的一方面提出一種用以治療一受試者體內(nèi)細(xì)胞增生異 常的組合物。本發(fā)明的另一方面提出一種改變細(xì)胞生長狀態(tài)的方法。上述方 法包括對于有治療需求的受試者投予有效劑量的第一多肽或可編碼該第一多肽的第一核酸，以及有效劑量的第二多肽(即，與第一多肽不同的一多肽) 或可編碼該第二多肽的第二核酸。
上述第一多肽及第二多肽可以是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, 或稱白血球生 長因子)、白介素-12 (IL-12, interleukin-12)、內(nèi)皮抑制因子(ED ， endostatin， 或稱內(nèi)皮抑素)或色素上皮衍生因子(PEDF, pigment epithelium-derived factor)。在一實施例中，第一及第二多肽為GM-CSF以及IL-12。在較佳的 情形中，上述第一核酸及第二核酸為表達(dá)載體(expressionvector)，如，腺 病毒(adenovirus, Ad)載體，其能夠在一宿主細(xì)胞中表現(xiàn)第一及第二多肽。 上述細(xì)胞增生異?？梢允欠前┌Y的異常，或癌癥，如肝癌?？舍槍哂邪┘?xì) 胞的組織或器官，例如肝，投予上述多肽或核酸的每一種。在一具體實施例 中，上述方法還包括對受試者投予第三多肽，例如ED或可編碼該第三多肽 的第三核酸。在另一具體實施例中，上述方法還包括對受試者投予第四多肽， PEDF，或可編碼該第四多肽的第四核酸。
本發(fā)明的另一方面提出一藥學(xué)組合物，包括上述多肽的至少二種以及一 藥學(xué)上可接受的載體。上述多肽可以是GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF。此 外，本發(fā)明的范圍亦涵蓋一藥學(xué)組合物，包括上述核酸的至少二種以及一藥 學(xué)上可接受的載體。在較佳的情形中，上述核酸為腺病毒載體。


為讓本發(fā)明的上述及其它目的、特征、優(yōu)點與實施例能更明顯易懂，所 附附圖的詳細(xì)說明如下
圖1A 圖1C以長條圖闡明結(jié)合IL-12及GM-CSF基因治療所誘發(fā)的加 乘抗腫瘤效果。如下文"材料及方法"所述，制造移植性或多灶性的原位肝 腫瘤，并以腺病毒進(jìn)行治療。圖1A闡明在腫瘤移植后第7日此負(fù)載有腫瘤 的BALB/c小鼠的治療結(jié)果。圖1B闡明在腫瘤移植后第14日，此負(fù)載有腫 瘤的BALB/c小鼠的治療結(jié)果。在第28日利用卡尺測量肝腫瘤大小。每一試
驗組包含5只小鼠。圖lC闡明以DEN喂食Wistar鼠(Wistarrats) IO周以 誘發(fā)多灶性肝腫瘤，之后以腺病毒治療的結(jié)果。以修正腫瘤負(fù)荷指數(shù) (modified tumor burden index, MTBI)來表示腫瘤負(fù)荷，以表示負(fù)載有腫瘤 的小鼠及正常健康小鼠之間的肝重/體重比值例的差異。每一試驗組包含10 只小鼠。在長條圖中每一長條下方，顯示每一種療法與Ad/GFP療法相較之 下，小鼠腫瘤體積或腫瘤負(fù)荷縮小的倍數(shù)。利用單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析， 統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異設(shè)定為一代表pO.05;"代表pO.005^"代表pO.001。
圖2以折線圖闡明腺病毒注射后，小鼠的血清IFN-y量。如"材料及方 法"所述，以腺病毒治療帶有7日大腫瘤的BALB/c小鼠。當(dāng)注射腺病毒或 PBS之后，以ELISA測定法于指定的時間測量血清IFNi量。每一試驗組包 含3只小鼠。在第6日，Ad/組合組中的IFNi量明顯高于Ad/IL-12組(p = 0.00105,單向ANOVA分析)。
圖3A 圖3C以長條圖闡明在IL-12-或組合療法所導(dǎo)致的抗腫瘤效果中， CD4+、 CD8+、 NKT、以及NK細(xì)胞次群所扮演的角色。圖3A闡明細(xì)胞次 群耗盡，根據(jù)下述流程將anti-CD4、 anti-CD8、或anti-asialoGMl抗體以腹膜 內(nèi)注射至帶有7日大腫瘤的BALB/c小鼠體內(nèi)。在腫瘤移植后第20日，亦即 最后一次抗體注射后次日，隔離出脾細(xì)胞，并利用流動式細(xì)胞測量術(shù)決定每 一細(xì)胞次群的耗盡效率。每一試驗組包含3只小鼠。在圖3B以及圖3C中， 分別利用如圖1所示的Ad/IL-12療法以及Ad/組合療法再次檢驗特定細(xì)胞次 群被耗盡的腫瘤生長。在腫瘤移植后第28日測量腫瘤大小。"PBS"代表并 未以腺病毒治療腫瘤，"無"代表以腺病毒治療腫瘤但并無耗盡細(xì)胞次群， 其它長條分別代表以Ad/IL-12或Ad/組合療法治療、以及己耗盡CD4、 CD8 T細(xì)胞、或NK細(xì)胞的動物的腫瘤大小。IgG2a為一老鼠mAb對照組，且兔 子血清是正常兔子血清對照組。每一試驗組包含5只小鼠。以星號(*)表示 相較于IgG2a或正常兔子血清對照組，發(fā)生顯著腫瘤再生的實驗組，其中* 代表p〈0.05;"代表pO.005; ***代表pO.OOl。
圖4A 圖4D以長條圖闡明Ad/IL-12或Ad/組合療法誘發(fā)的多變效應(yīng)。
闡明進(jìn)行腺病毒療法或PBS處理的結(jié)果，在注射腺病毒后第4日由受試動物 的腫瘤中分離出單核白血球。圖4A闡明分泌IFN-y的效應(yīng)細(xì)胞，分別利用 抗CD4、抗CD8、或抗NK細(xì)胞的抗體或者利用a-GalCer-loaded CDld DimerX I將細(xì)胞染色，之后迸行細(xì)胞內(nèi)IFN-y染色。圖4B闡明表現(xiàn)CDld的DC， 以anti-CDld及anti-CDl lc抗體將細(xì)胞雙重染色。圖4C闡明腫瘤專一性CD8+ T細(xì)胞，利用經(jīng)照射處理的BNL細(xì)胞(黑色長條，BNL+)或不以BNL細(xì)胞 (白色長條，BNL-)，于體外剌激分離的TIL，進(jìn)行24小時，其后進(jìn)行細(xì) 胞內(nèi)IFN-y染色，利用流動式細(xì)胞測量術(shù)來計算IFN-y+細(xì)胞。圖4D闡明NK 細(xì)胞毒性能力，在以腺病毒治療或PBS處理的受試動物注射腺病毒后第4曰， 分離出受試動物的脾細(xì)胞，并以YAC-1細(xì)胞進(jìn)行測定，以LDH測定法在不 同效應(yīng)/標(biāo)的比例下一式三份地決定細(xì)胞分解情形。長條代表雙重陽性細(xì)胞 中，每毫克腫瘤組織所含的平均細(xì)胞數(shù)目士顯著差異(SD)細(xì)胞。每一試驗 組包含5只小鼠。圖中顯示兩組獨立試驗中的代表性數(shù)據(jù)。各項數(shù)據(jù)以 Ad/GFP為比較基準(zhǔn)進(jìn)行單向ANOVA統(tǒng)計分析，*代表p<0.05; **代表 p〈0.005; ***代表？<0.001。
圖5A及圖5B闡明腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中的NKT細(xì)胞。圖5A闡明TIL 中大部分的CD4+細(xì)胞為不變NKT細(xì)胞，利用anti-IFN個anti-CD4、以及 a-GalCer-loaded CDld DimerX I將TIL進(jìn)行三重染色，篩選出CD4+IFN-y+ 細(xì)胞，接著利用CDldDimerXI染色進(jìn)一步分析其NKTT細(xì)胞受體表現(xiàn)。圖 5B闡明利用Ad/組合療法顯著活化CD4/CD8雙陰性NKT細(xì)胞，利用如圖 5A所示的方法染色TIL，篩選出NKT+IFN-，細(xì)胞，接著利用anti-CD4染色 進(jìn)一步分析其CD4表現(xiàn)，在流動式細(xì)胞測量術(shù)分析中，利用同型對照抗體作 為陰性控制，根據(jù)控制抗體提供的基線信號設(shè)定四個象限。
圖6A及圖6B分別以照片和長條圖闡明以腺病毒療法或PBS處理的受 試動物中，其腫瘤部位的巨噬細(xì)胞及iNOS表現(xiàn)。圖6A闡明腺病毒治療后， 腫瘤區(qū)域中的巨噬細(xì)胞浸潤。在腺病毒療法或PBS處理后第4日，將小鼠殺 死并將其腫瘤部位切片，接著分別利用anti-Mac-3以及anti-iNOS染色其巨
噬細(xì)胞以及iNOS。圖6B闡明缺乏IFN-Y的小鼠中，腫瘤浸潤性巨噬細(xì)胞減 少的情形，在進(jìn)行Ad/組合療法注射之前、同時、以及之后，以anti-IFN-Y 或?qū)φ战MIgG2a對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射(參見"材料及方法")。在第4日， 分離腫瘤浸潤性細(xì)胞并進(jìn)行分析，首先利用anti-CDl lb抗體進(jìn)行表面染色， 接著利用anti-iNOS抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色。長條表示在雙重陽性細(xì)胞中，每 毫克腫瘤組織的平均細(xì)胞數(shù)目士SD。每一試驗組包含4只小鼠，以ANOVA 統(tǒng)計法，分析anti-IFNi相對于耗盡IgG2a對照組的數(shù)據(jù)，***代表p<0.001 。 圖7A及圖7B闡明ED及PEDF組合基因療法所誘導(dǎo)的加乘性抗腫瘤功 效。如"材料及方法"所述，產(chǎn)生具有移植性或多灶性原位肝腫瘤的動物模 型，并進(jìn)行腺病毒治療。圖7A闡明于腫瘤移植后第7天進(jìn)行治療的荷瘤 BALB/c小鼠。在第28日利用卡尺測量肝腫瘤大小。每一試驗組包含5只小 鼠。圖7B闡明利用腺病毒治療帶有多灶性肝腫瘤的大白鼠。于腺病毒治療 后兩周測量腫瘤大小。插圖中顯示腫瘤負(fù)荷尺度的倍數(shù)。每一試驗組包含5 只動物。在長條圖中每一長條下方，顯示每一種療法與Ad/GFP療法相比較 之下，小鼠腫瘤體積或腫瘤負(fù)荷縮小的倍數(shù)。利用Wilcoxon測驗進(jìn)行統(tǒng)計分 析，統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異設(shè)定為M戈表pO.05; **代表？<0.005; ***代表 p〈0扁。
圖8A及圖8B闡明四合一療法所誘導(dǎo)的加乘性抗腫瘤功效。圖8A闡明 于腫瘤移植后第14天進(jìn)行治療的荷瘤BALB/c小鼠，其具有較大的肝腫瘤。 在第28日利用卡尺測量肝腫瘤大小。每一試驗組包含5只小鼠。圖8B利用 多灶性腫瘤模型進(jìn)一步闡明四合一療法的加乘性抗腫瘤功效。在腺病毒治療 后兩周測量腫瘤體積。插圖中顯示腫瘤負(fù)荷尺度的倍數(shù)。每一試驗組包含5 只動物。在長條圖中每一長條下方，顯示每一種療法與Ad/GFP療法相比較 之下，小鼠腫瘤體積或腫瘤負(fù)荷縮小的倍數(shù)。利用Wilcoxon測驗進(jìn)行統(tǒng)計分
析，統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異設(shè)定為M戈表p〈0.05; **代表？<0.005; ***代表 pO.OOl。
圖9A至圖9D闡明腫瘤區(qū)域的免疫組織化學(xué)法染色。圖9A闡明四合一
療法可降低腫瘤區(qū)域的微血管密度。微血管密度是藉由計算10個隨機區(qū)塊中 微血管數(shù)目來定量。圖9B闡明四合一療法可于腫瘤區(qū)域中誘導(dǎo)大量細(xì)胞凋 亡。計算腫瘤區(qū)域中IO個隨機區(qū)塊內(nèi)，原位末端標(biāo)記陽性(TUNEL-positive) 標(biāo)的數(shù)目，以決定細(xì)胞凋亡指數(shù)。圖9C以及圖9D分別闡明四合一療法亦可 在腫瘤區(qū)域中誘導(dǎo)顯著較多的腫瘤浸潤CD4+ 丁細(xì)胞以及008+ T細(xì)胞。各 項數(shù)據(jù)以Ad/GFP為比較基準(zhǔn)進(jìn)行單向ANOVA統(tǒng)計分析，*代表p<0.05; 一代表p〈0.005;"承代表p0.001。
具體實施例方式
下文將參照附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明的多種具體實施例。可由本發(fā)明的實 施方式以及申請專利范圍了解本發(fā)明的其它優(yōu)點、特征以及目的。
下文描述根據(jù)本發(fā)明實施例，用以在細(xì)胞增生異常(例如癌癥)受試者 體內(nèi)改變細(xì)胞生長狀態(tài)的方法。上述方法利用GM-CSF、IL-12、ED以及PEDF 其中至少二種。
GM-CSF是一種細(xì)胞激素，可作為白血球細(xì)胞生長因子。其可刺激干細(xì) 胞產(chǎn)生顆粒性白血球(嗜中性白血球、嗜酸性白血球、以及嗜堿性白血球) 及單核白血球。IL-12是一種白介素、或免疫系統(tǒng)的荷爾蒙，其主要可用于 動物體內(nèi)對于微生物感染的自然反應(yīng)以及辨別異己。ED是一種天然XVIII 型膠原的C端片段衍生物，其大小約20-kDa;已知其可作為一抗血管生成劑， 其功效類似血管靜止蛋白(angiostatin)及凝血酶調(diào)節(jié)素(thrombospondin)。 ED是一種大范圍的抗血管生成抑制劑，且可干擾某些生長因子的促進(jìn)血管 新生作用，例如堿性纖維母細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF/FGF-2)以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 。 PEDF (色素上皮衍生因子)是一種抗血管生成的有效抑制劑。其 可藉由數(shù)種破壞性路徑來標(biāo)定治療腫瘤，包括抗增生(anti-proliferation)、 抗血管生成(anti-angiogenesis)以及前分化(pro-differentiation)。
雖然本發(fā)明實施例可利用多種方式制備而得的GM-CSF、 IL-12、 ED或 PEDF,在較佳的情形中，可使用高度純化的GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF。 這些多肽的實例包含哺乳動物多肽(如，人類)或具有和哺乳動物的GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF大致上相同生物活性的多肽。上述多肽包含所有自然產(chǎn) 生、經(jīng)遺傳工程、及化學(xué)合成的GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF。利用重組 DNA技術(shù)所得多肽的氨基酸序列可能和自然產(chǎn)生的GM-CSF、 IL-12、 ED或 PEDF或其功能等價物的氨基酸序列相同。在本說明書中，"GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF"等詞匯亦涵蓋經(jīng)化學(xué)修飾的GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF。 上述經(jīng)化學(xué)修飾的GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF，包含經(jīng)構(gòu)型改變、添加 或刪除一糖鏈者，以及將其和如聚乙二醇的化合物結(jié)合。利用標(biāo)準(zhǔn)方法或下 文實施例所述的方法純化并檢驗上述GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF之后，
即可將其運用于根據(jù)本發(fā)明實施例的組合物中。
此處所述的GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF多肽的氨基酸組合物可在不 影響該多肽功能的情形下而加以改變。舉例而言，其可含有一或更多種保留 性氨基酸取代。"保留性氨基酸取代"是指以具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取 代其中原有的氨基酸殘基。所屬領(lǐng)域中已定義出具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基 家族，上述各種家族及其包括的氨基酸如下堿性側(cè)鏈(如，賴氨酸(Lysine, 或稱離氨酸)、精氨酸、組氨酸)；酸性側(cè)鏈(如，天冬氨酸、谷氨酸(glutamate， 或稱麩氨酸))；不帶電極性側(cè)鏈(如，甘氨酸、天門冬酰氨酸、谷酰氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、胱氨酸)；非極性側(cè)鏈(如，丙氨酸、纈氨酸、 亮氨酸(Leucine,或稱白氨酸)、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、 色氨酸)；卩分支側(cè)鏈(如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)；以及芳香基側(cè) 鏈(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，在較佳的情形中， 可利用來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基，來取代GM-CSF、 IL-12、 ED 或PEDF序列中一些可預(yù)測的非必須氨基酸殘基。或者是，可在其序列的全 部或部分造成某些突變，例如藉由飽和突變(saturationmutagenesis)，且可 藉由測定GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF的活性來篩選所產(chǎn)生的突變型。上 述檢測活性的方法為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
可利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的合成方法或重組技術(shù)來合成或產(chǎn)生上述多肽。 舉例而言，可在一表現(xiàn)載體中選殖可編碼上述多肽的核酸，在該表現(xiàn)載體中， 核酸可操作上連接至一調(diào)控序列，該調(diào)控序列適用于在一宿主細(xì)胞中表達(dá)該 多肽，然后將載體送入一適當(dāng)宿主細(xì)胞以表達(dá)該多肽。之后，利用習(xí)知方法， 由宿主細(xì)胞純化該重組多肽，例如利用硫酸銨沉淀及分餾管柱層析法?？筛?據(jù)下文實施例所述方法，測定利用上述方法制備的多肽的活性。
根據(jù)本發(fā)明另一方面，提出用以在一細(xì)胞增生異常(如，癌癥)受試者 體內(nèi)改變細(xì)胞生長狀態(tài)的方法。 一細(xì)胞增生異常是指不受控制的自發(fā)性細(xì)胞 生長的異常現(xiàn)象，包括惡性及非惡性的生長。此類異常的實施例包括肝癌(如，
HCC)、結(jié)腸癌、乳癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、黑色素瘤、肺癌、神經(jīng)膠母 細(xì)胞瘤、腦瘤、血癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、腎細(xì)胞癌、頭頸癌、子宮頸癌、胰 臟癌、食道癌及舌鱗狀細(xì)胞癌。
受試者是指人類及非人類動物。非人類動物的實施例包括所有脊椎動物， 如，哺乳類動物，例如非人類靈長類(尤其是高等靈長類)、狗、嚙齒動物 (如，小鼠或大白鼠)、天竺鼠、貓，及非哺乳類動物，例如鳥類、兩棲類、 爬蟲類等等。在一較佳具體實施例中，受試者為人類。在另一具體實施例中，
受試者為實驗動物或適合作為疾病模式研究的動物。
利用一種用以診斷異常的標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)，來識別用以接受細(xì)胞增生異常 治療的受試者的結(jié)果。"治療"是指基于治愈、減輕、緩和、治療、預(yù)防、 或改善異常、異常癥狀或異常素因的目的，對于具有一細(xì)胞增生異常(如， 癌癥)的一受試者投予一化合物或組合物。"有效劑量"是指化合物的量對 于受治療的受試者足以產(chǎn)生例如上文所述的醫(yī)學(xué)上理想結(jié)果。本發(fā)明的治療 方法可在活體內(nèi)或體外進(jìn)行，且可單獨進(jìn)行或結(jié)合其它藥物或療法。
在活體內(nèi)治療時，可將一化合物或組合物投予一受試者。 一般而言，將 化合物懸浮于一藥學(xué)上可接受的載體(如，生理食鹽水)中，并以口服或靜 脈輸液的方式、或經(jīng)由皮下、肌肉內(nèi)、腦脊髓膜內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道 內(nèi)、鼻內(nèi)、胃內(nèi)、氣管內(nèi)、或肺內(nèi)注射或植入等方式進(jìn)行投藥。
所需的劑量會隨著許多因素而異，上述因素包括但不限于所選投藥途徑、 配方本質(zhì)、患者疾病特性、受試者的體重、表面積、年齡及性別、使用中的
其它藥物、以及主治醫(yī)生的判斷。適當(dāng)?shù)膭┝糠秶s為0.01 100mg/kg。隨著 可用化合物組合不同以及各種投藥途徑的效率不同，所需劑量也會不同。舉 例而言，口服投藥所需的劑量應(yīng)高于靜脈注射投藥的劑量。可利用所屬領(lǐng)域 中熟知的一般經(jīng)驗法則，調(diào)整上述劑量濃度的變異，以達(dá)最佳效果。將化合 物封裝于適當(dāng)運送傳輸載具(如，聚合物微粒子或植入式載具)中可能會增 加藥物傳輸效率，尤其是口服傳輸?shù)男省?br> 上述核酸或多核苷酸可利用所屬領(lǐng)域已知的聚合物、生物可分解微粒子、 或微膠囊傳輸載具，以進(jìn)行傳輸。另一種可用以達(dá)成核酸攝入的方法為利用 標(biāo)準(zhǔn)方法制備的微脂體。上述傳輸載具中可僅將含有多核苷酸，或還含有組 織專一性抗體。或者是，可制備一分子結(jié)合物(molecularconjugate)，該分 子結(jié)合物是由藉由靜電力或共價力連接至聚L-賴氨酸的一質(zhì)體或其它載體 所構(gòu)成。聚L-賴氨酸可結(jié)合至一配位子，上述配位子可結(jié)合至標(biāo)的細(xì)胞上的 一受體(參見，Cristiano，"a/" 1995， J.Mol.Med. 73:479)。或者是，可利用 所屬領(lǐng)域已知的組織專一性轉(zhuǎn)錄調(diào)控組件，以達(dá)成組織專一性標(biāo)定。將"裸 露DNA"(即，缺乏傳輸載具的DNA)傳輸至肌肉內(nèi)、皮膚內(nèi)、或皮下部 位，是另一種進(jìn)行活體內(nèi)表現(xiàn)的手段。
在上述多核苷酸如表達(dá)載體中，可編碼GM-CSF、 IL-12、 ED或PEDF 的核酸序列可操作上連接至一 啟動子(promoter)或強化子-啟動子
(enhancer-promoter)組合。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體包括質(zhì)體及病毒載體，病毒載 體例如皰疹病毒(herpes viruses)、反轉(zhuǎn)錄病毒(retroviruses)、牛痘病毒
(vaccinia viruses)、減毒牛痘病毒(attenuated vaccinia viruses)、金絲雀痘 病毒(canary pox viruses)、腺病毒及腺病毒相關(guān)病毒(adeno-associated viruses)。
雖然患者所需劑量會隨著上述多種因素而不同，進(jìn)而投與的劑量可能有 所不同，但投予多核苷酸的較佳劑量為約106~1012個多核苷酸分子復(fù)本。此
一藥劑可依需要重復(fù)投予，而投藥路徑可為上述路徑的任一種。
本發(fā)明的范圍包含一組合物，其含有一適當(dāng)載體及一種或更多種上述化 合物。組合物可以是藥學(xué)組合物其含有藥學(xué)上可接受的載體，或者也可以是 化妝品組合物其含有化妝品可接受的載體。
本發(fā)明的組合物可包含一載體。隨著組合物類型的不同，載體可以是一 種藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體的實施例包括但不限于，生物 兼容性載具、佐劑、添加劑、及稀釋劑，以形成可以用劑量形式投予的組合 物。藥學(xué)上可接受的載體，在投予受試者時或之后，不會引起不良的生理效 果。此外，藥學(xué)組合物中的載體必須和活性成分兼容，且在較佳的情形中還 能夠安定該活性成分，才能被視為可接受的載體?？衫靡环N或更多種助溶 劑作為藥學(xué)載體，以傳輸活性化合物。以任何上述形式存在的上述組合物可 用以治療細(xì)胞增生異常。
"有效劑量"是指可在受治療的受試者身上產(chǎn)生治療效果所需的活性化 合物的量。如同所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所知，有效劑量會隨著欲治療及定種類、 投藥路徑、以及和其它療法共同運用的可能性等因素而有所不同。
投予本發(fā)明的藥學(xué)組合物時，可利用非口服、口服、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸、局 部涂抹、或經(jīng)頰等方式投藥。在此處"非口服" 一詞是指利用皮下、皮內(nèi)、 靜脈、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、關(guān)節(jié)滑膜腔內(nèi)、胸骨內(nèi)、脊髓腔內(nèi)、病灶 內(nèi)、或顱內(nèi)注射，以及任何適當(dāng)輸入液體的技術(shù)。
滅菌的可注射組合物可以是利用不具毒性且非口服投藥途徑可接受的稀 釋劑或溶劑所形成的溶液或懸浮液。在可接受的載具以及溶劑中，適用的有甘
露糖醇、水、林格氏液(Ringer's solution)、以及等滲透壓氯化鈉溶液。此外， 傳統(tǒng)上可利用不揮發(fā)油作為溶劑或懸浮基(如，合成的單酸或雙酸甘油脂)。 脂肪酸，例如油酸及其甘油脂衍生物非常適用于制備注射劑，其它天然的藥 學(xué)上可接受的油脂類亦然，例如橄欖油或蓖麻油，特別是聚氧乙基化的油脂 類。這些油溶液或懸浮液也可含有一長鏈醇類稀釋劑或分散劑，如羧甲基纖 維素，或類似的分散劑。亦可利用其它常用的表面活性劑，例如吐溫系列
(Tweens)或司盤系列(Spans)、或其它類似乳化劑，或者制備藥學(xué)上可接 受的固體、液體、或其它劑型時常用的生體可用率增進(jìn)劑，以進(jìn)行制備。
用于口服投藥的組合物可以是任何可口服劑型，包括膠囊、錠劑、乳劑、 及水懸液、分散液、及水溶液。在錠劑的情形中，常用的載體包括乳糖以及 玉米淀粉。通常亦會加入潤滑劑，例如硬脂酸鎂。欲以膠囊劑型用于口服投 藥時，常用的稀釋劑包括乳糖以及千燥玉米淀粉。當(dāng)利用水懸液或乳劑進(jìn)行 口服投藥時,可將活性成分懸浮或溶解于和乳化或懸浮劑結(jié)合的油相成分中。 若有需要，可加入某些甜味劑、調(diào)味劑、或著色劑。
可利用制藥領(lǐng)域習(xí)知的技術(shù)，制備鼻用噴霧劑或吸入劑組合物。舉例而 言，可將此組合物制備成溶于生理食鹽水的水溶液，可利用苯甲醇或其它適 當(dāng)防腐劑、吸收促進(jìn)劑(用以增進(jìn)生體可用率)、氟碳化合物、和/或其它習(xí) 知領(lǐng)域己知的助溶或分散劑。
具有活性化合物的組合物也可經(jīng)由塞藥的形式以進(jìn)行直腸投藥。
局部涂抹組合物含有的皮膚學(xué)上可接受載體必須是安全的且具有有效劑 量，其適合施用于皮膚。 一般而言，局部涂抹組合物可以是固態(tài)、半固態(tài)、 乳霜狀、或液態(tài)。其可以是一種化妝品或皮膚產(chǎn)品，形式為軟膏、乳液、泡 沫、乳霜、凝膠、或溶液。下文詳述皮膚學(xué)上可接受載體的相關(guān)細(xì)節(jié)。
可單獨使用本發(fā)明實施例的組合物,或連同其它生物活性成分一起使用。 不論是單獨或是連同其它活性成分一起使用，都能夠以單劑或在一定時期內(nèi) 以多劑的形式，將其施予一受試者。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易想見各種投藥 形式。投予組合物的劑量范圍必須足以產(chǎn)生預(yù)期的效果。然而，上述劑量也 不應(yīng)過大，以免導(dǎo)致任何副作用，例如不必要的交叉反應(yīng)及與其相似者。一 般而言，劑量會隨著受試者的年齡、體重、性別、病癥、以及病癥嚴(yán)重程度 還有欲達(dá)到的效果而有所不同。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可在不需過份實驗的情 形下，決定適當(dāng)?shù)膭┝俊．?dāng)出現(xiàn)任何相反病征(counter indications)、耐藥 性、或類似狀況時，可調(diào)整劑量。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易評估上述因素， 并以該信息為基礎(chǔ)，以決定基于一預(yù)期目的欲使用本發(fā)明實施例的組合物時
所需的有效濃度。
另一方面，本發(fā)明還提供了所述的組合物在制備治療受試者體內(nèi)細(xì)胞增 生異常的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了所述的組合物在制備用以在細(xì)胞增 生異常受試者體內(nèi)改變細(xì)胞生長狀態(tài)的藥物中的用途。
下文特定具體實施例僅具說明性質(zhì)，且不應(yīng)視為對本發(fā)明的任何限制。 發(fā)明人相信，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說明書的公開，不需進(jìn)一步探究，即 可完全運用本發(fā)明。此處提及的所有發(fā)表文獻(xiàn)，均為本說明書的參考文獻(xiàn)。
目前醫(yī)界認(rèn)為免疫療法在治療癌癥特別是多灶性腫瘤結(jié)節(jié)或腫瘤轉(zhuǎn)移等
方面，具有非常優(yōu)異的效果。有效的免疫監(jiān)視(immunosurveillance)使得免 疫療法成為有系統(tǒng)地根除腫瘤的理想工具。此外，以與腫瘤相關(guān)的抗原或腫 瘤細(xì)胞疫苗進(jìn)行活性疫苗接種后產(chǎn)生的免疫記憶(immunological memory) 通常會誘發(fā)持久性腫瘤專一性T-細(xì)胞，而提供一種長期防止癌癥復(fù)發(fā)的系 統(tǒng)。免疫療法中，常會使用細(xì)胞激素以增強抗腫瘤免疫性。在各種細(xì)胞激素 中，GM-CSF是癌癥治療中最有效的細(xì)胞激素之一 (參見，Dranoff G et al.， 1993; Hsieh CL et al., 1997)。GM-CSF作用的基本機制主要涉及增強GM-CSF 誘發(fā)的樹狀細(xì)胞中抗原表現(xiàn)的能力，GM-CSF亦可活化腫瘤專一性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)并導(dǎo)致腫瘤消退。(參見，Tazi A et al. J Clin Invest 1993;91:566-576) 。 IL-12是另一種有效的抗腫瘤細(xì)胞激 素，其能夠增強CTL、自然殺手(natural killer, NK)細(xì)胞、或自然殺手T(natural killer T， NKT)細(xì)胞對于非常多種標(biāo)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性，并誘發(fā)上述CTL、 NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞分泌干擾素(interferon, IFN)-Y(參見，BrundaMJ., 1994; Nastala CL et al.， 1994)。
利用抗血管生成的機制來治療癌癥能夠藉由抑制與腫瘤相關(guān)的血管生成 而有效地抑制腫瘤生長，且因而能夠使得腫瘤無法得到必須的養(yǎng)分及氧氣， 如此一來，腫瘤會進(jìn)入"休眠"狀態(tài)，而暫停細(xì)胞增生與轉(zhuǎn)移等活動。與傳 統(tǒng)癌癥療法相比較，抗血管生成療法有兩大主要優(yōu)點。其一，抗血管生成療 法主要可抑制新微細(xì)血管的生長。此一特點比起傳統(tǒng)化學(xué)療法溫和許多，這
是因為抗血管生成療法對于內(nèi)皮細(xì)胞具專一性，且不會危害正常細(xì)胞。其二， 目前癌癥治療面臨的最大障礙是抗藥性的問題，這是因為癌癥細(xì)胞的遺傳特 性不穩(wěn)定，且因而其基因組變異的可塑性非常大。但抗血管生成機制是標(biāo)定 正常且穩(wěn)定的內(nèi)皮細(xì)胞，此類內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)生突變及抗藥性的可能性非常低。
發(fā)明人先前曾發(fā)表過利用一重組腺病毒攜帶GM-CSF及ED基因，以治 療早期大白鼠肝癌模型；然而，此種療法對于治療大型腫瘤的效果不彰(參 見，TaiKFeta1.，2003)。相似地，利用IL-12基因療法治療肝癌的療效雖然 很顯著，但也僅限于小型腫瘤負(fù)荷，且在許多案例中，僅限于皮下腫瘤模型。 為了增強免疫療法對于大型腫瘤負(fù)荷特別是對于原位肝腫瘤的抗腫瘤效果， 本發(fā)明利用以腺病毒為媒介，將IL-12及GM-CSF，或ED及PEDF，或IL-12、 GM-CSF、 ED及PEDF基因(即，四合一基因)同時轉(zhuǎn)移至帶有大型肝腫瘤 的動物體內(nèi)或具有化學(xué)誘發(fā)的多重肝癌結(jié)節(jié)的動物中。本發(fā)明實施例顯示， 與單一細(xì)胞激素基因治療相比較，原位腫瘤療法并配合同時投予 Ad/GM-CSF及Ad/IL-12，或Ad/ED及Ad/PEDF，或Ad/IL腳12、 Ad/GM-CSF、 Ad/ED及Ad/PEDF (即，帶有四合一基因的腺病毒)，均可加乘地減低腫瘤 體積，并且，本發(fā)明實施例發(fā)現(xiàn)，在IL-12媒介的基因治療中，NK細(xì)胞為造 成腫瘤退化的主要效應(yīng)細(xì)胞；而在(IL-12 + GM-CSF)組合療法中，CD8+T 細(xì)胞、NKT細(xì)胞、以及可能包含巨噬細(xì)胞為主要的效應(yīng)細(xì)胞。
實施例
材料及方法
潘應(yīng)樣力動欽
由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC (Rockville，MD))購得小鼠肝癌細(xì)胞株BNL以及人類胚胎腎細(xì)胞株293。 利用含10°/。胎牛血清(購自Biological Industries, Israel)的DMEM培養(yǎng)基 (Dulbecco，s modified Eagle's medium,購自Seromed， Berlin, Germany)，來
維持上述二細(xì)胞株。實驗中采用7~8周大的雄性BALB/c小鼠以及6~7周大 的雄性Wistar大白鼠。所有動物實驗皆符合中國臺灣國立臺灣大學(xué)醫(yī)學(xué)院動 物福利委員會的指導(dǎo)方針。
腺病毒載體的構(gòu)筑
利用AdEasy系統(tǒng)腺病毒載體(參見，He TC et al.， 1998)，腺病毒載體 帶有一老鼠GM-CSF cDNA (Ad/GM-CSF)或一 GFP基因(Ad/GFP)，上 述二種核酸皆受到一CMV立即早期基因啟動子的調(diào)控(參見，TaiKFetal.， 2003) 。 Ad/IL-12是由中國臺灣國立臺灣大學(xué)醫(yī)學(xué)院江伯倫教授提供， Ad/IL-12是一種腺病毒載體，其含有鼠科單鏈IL-12基因，上述IL-12基因 可編碼兩種IL-12次單元(p35及p40)并由一多肽連接子(linker)將上述 兩種次單元相連接(參見，LeeYLetal., 2001)。也可利用類似的方法， 構(gòu)筑帶有老鼠ED基因(Ad/ED)或PRDF基因(Ad/PEDF)的腺病毒載體。
實施例1
原位肝腫瘤的產(chǎn)生以及活體內(nèi)基因治療
對于單一肝癌結(jié)節(jié)模型，在第O日將3 x 10S個BNL細(xì)胞注射到小鼠左
肝葉中。在移除針頭后，立刻以電凝劑(購自Aaron, Petersburg, Florida, USA) 密封針孔，以防止注入物質(zhì)滲漏。接著縫合切口。在腫瘤移植后第7日或第 14日，于腫瘤內(nèi)進(jìn)行一次注射(single injection)，各組分別注射30 pl的腺 病毒、2xl0 9個Ad/GFP、 lxl()9個Ad/GM-CSF、 1*109個Ad/IL-12、或lxl0 9 個Ad/GM-CSF + lxl()9個Ad/IL-12 (即，Ad/組.合療法)或30 的PBS (每 一試驗組n-5)。由不知道治療組別的研究人員在第28日利用卡尺測量腫 瘤大小。利用下列公式計算腫瘤體積體積-寬度2x長度x0.52。
對于原發(fā)性多灶性肝癌模型，Wistar大白鼠接受0.02 ml/kg/天的二乙亞 硝胺(DEN， diethylnitrosamine)(購自Sigma， St Louis, MO， USA)，為期 10周。每周給予的DEN劑量的容積約占大白鼠7日所需飲用水量的 100ppm。每周計算大白鼠的體重，并配制新鮮的DEN水溶液。10周后，藉
助手術(shù)顯微鏡(x20放大倍數(shù))將PE10硅膠管插入受試動物的胃指腸動脈中。 進(jìn)行100pl的腺病毒(劑量同上述)或100nl的PBS (每一試驗組n-10) 的一次注射，經(jīng)由硅膠管將其由肝動脈灌入肝中，之后扎起胃指腸動脈。治 療后第14日，殺死大白鼠取出肝臟后稱重。在同一時間，將另外10只同齡 但并未接受DEN喂食的Wistar大白鼠殺死，以作為健康對照組。根據(jù)修正 腫瘤負(fù)荷指數(shù)來決定臨床療效，修正腫瘤負(fù)荷指數(shù)的定義為接受治療實驗組 的肝重/體重比值和健康對照組的肝重/體重比值的差異。
貧沐餅游c脅r省應(yīng)、c脅r-潘應(yīng)、服一智應(yīng)、或唇-y纖盡
在第0日將BNL細(xì)胞(3xl05)注射到BALB/c小鼠的肝中。在腫瘤移 植后第7日，將腺病毒注射至腫瘤內(nèi)。耗盡004+ T-細(xì)胞、CD8+ T-細(xì)胞或 IFN-7的方式如下在腫瘤移植后第5日(即，注射腺病毒前2日)藉由腹 膜內(nèi)(i.p.)注射分別注入0.5 mg的anti-CD4單株抗體(mAb) (GK1.5)、 anti-CD8mAb (53-6,72)、或anti-IFN-y mAb (R4-6A2);之后在腫瘤移植 后第8、 10、 12、及19日注射0.25mg的相同mAb。耗盡NK細(xì)胞的方式如 下在上述日程，藉由腹膜內(nèi)注射注入20 ^的兔子anti-asialoGMl抗血清(取 得自Wako， Osaka, Japan)。以相同劑量及相同日程對小鼠進(jìn)行正常大白鼠IgG 或正常兔子血清的腹膜內(nèi)注射，以作為對照組。利用流動式細(xì)胞測量術(shù)以確 認(rèn)耗盡CD4+、 CD8+、或NK細(xì)胞的程度。在腫瘤移植后第28日，觀察每
一試驗組的腫瘤生長。
辦浸裙絲紀(jì)潘應(yīng)艦動(欲應(yīng)纖藩
在如前述進(jìn)行腺病毒注射后第4日，制備來自腫瘤組織的腫瘤浸潤性淋 巴細(xì)胞(tumor-infiltrating Lymphocytes ， TIL )(參見，Chang CJ et al.， 2004 )。 簡言之，利用剃刀片將切除的肝腫瘤切成小片。將組織片段于HBSS水溶液 (lg/10ml)以及中脫氧核糖核酸酶I (DNasel) (0.01 mg/ml;購自Roche Applied Science)，在37'C下保溫培養(yǎng)15分鐘。上述HBSS水溶液含有膠 原酶I型(0.05 mg/ml)、膠原酶iV型(0.05 mg/ml)、hyauronidase(0.025mg/ml)
以及大豆胰蛋白酶抑制劑(1 mg/ml)(皆購自Sigma-AIdrich)。藉由離心 收集細(xì)胞，并將之重新懸浮于一新鮮的可分量的HBSS消解溶液(digestion solution)中，置于37'C下15分鐘。利用具有40 pm篩目的篩子，移除未消 解材料，并收集通過篩目的細(xì)胞且以RPMI 1640培養(yǎng)液清洗。進(jìn)一步利用 Ficoll-Paque梯度來分離該清洗后的細(xì)胞，以移除死細(xì)胞。利用所得到的細(xì)胞 進(jìn)行細(xì)胞測量分析。以直接共軛抗體將上述細(xì)胞的表面標(biāo)記染色，上述直接 共軛抗體為異硫氰酸鹽(FITC)共軛anti-CD4 mAb (GK1.5) 、 anti-CD8 mAb (53-6.72)、或藻紅素(phycoerythrin， PE)共軛anti-CD3 mAb (145-2C11) (皆購自BD Biosciences Pharmingen)。禾!j用a-GalCer-loaded DimerX I (CDld:Ig融合蛋白)(購自BD Biosciences Pharmingen)來偵測NKT細(xì)胞， 上述a-GalCer-loaded DimerX I是以PE共軛A85-l mAb (抗老鼠IgG)進(jìn)行 探測。在表面染色之后，根據(jù)供貨商(BD Biosciences Pharmingen)的操作手 冊將細(xì)胞固定并可滲透化(permeabilized)，且接著以AlexaFluor647共軛的 anti-IFN-Y mAb (XMG1.2)或同型對照的對照組Ab進(jìn)行染色。利用FACScan (購自Becton Dickinson, Mountain View， CA)分析染色的細(xì)胞，且利用 CELLQest軟件(購自BD Biosciences Pharmingen)分析取得的數(shù)據(jù)。
#艨專一絲0)5+ r潘應(yīng)游話沐^話眾
為了決定BNL專一性CD8+T細(xì)胞，必須先活化lxl()S個TIL，在37°C 下將之和以lxl()S個經(jīng)照射處理的BNL并加入20 ng/ml的IL-12、 1 pg/ml 的anti-CD28、以及2 joM的孟寧素(monensin)保溫培養(yǎng)24小時。經(jīng)過隔 夜活化作用后，如上所述利用anti-CD8抗體染色細(xì)胞，接著進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)IFN-Y 染色。
iVK薪絲漱定
以乳酸去氫酶(LDH)測定法(購自Promega, Madison, WI)決定NK 細(xì)胞毒性活性，利用YAC細(xì)胞作為標(biāo)的細(xì)胞并設(shè)定為依供貨商指示的E/T 比。利用下列公式計算特定細(xì)胞溶解的百分比-
細(xì)胞毒性W-[(試驗中LDH釋放量-效應(yīng)細(xì)胞及標(biāo)的細(xì)胞自發(fā)釋放的LDH 量)/ (最大LDH釋放量-自發(fā)釋放的LDH量)]x 100 可將標(biāo)的細(xì)胞單獨置于培養(yǎng)液中進(jìn)行保溫培養(yǎng)，以欲決定標(biāo)的細(xì)胞的自發(fā) LDH釋放量；或是將標(biāo)的細(xì)胞置于含有2%的Triton X-100的混合物中進(jìn)行 保溫培養(yǎng)，以決定最大LDH釋放。所有測定分析均重復(fù)進(jìn)行三次。
所有統(tǒng)計分析結(jié)果均以平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(standard error, SE)來表示。利用 單向ANOVA統(tǒng)計分析法己評估不同試驗組間腫瘤體積的差異的顯著程度。
結(jié)果
腺病毒遞送GM-CSF及IL-12可加乘地小腿原位肝腫瘤
為了在臨床相關(guān)條件下測試免疫療法，本發(fā)明運用可代表中型或大型腫 瘤負(fù)荷的原位肝腫瘤模型。將BNL細(xì)胞(3xl05)注入至BALB/c小鼠的左 肝葉。通常，在腫瘤移植后第7天以及第14天后，通?？捎^察到的腫瘤結(jié)節(jié) 大小分別約為10 20mm3以及60~100 mm3， 二者分別可代表中型腫瘤負(fù)荷及 大型腫瘤負(fù)荷。對于7日大以及14日大的腫瘤，分別以腺病毒(Ad/GFP、 Ad/GM-CSF、 Ad/IL-12、或Ad/GM-CSF + Ad/IL-12)進(jìn)行腫瘤內(nèi)地一次注射。 在第28天利用卡尺測量肝腫瘤大小。如圖1A 圖1C所示，以Ad/GM-CSF 治療的動物僅出現(xiàn)邊際效果；然而，以Ad/IL-12治療的動物，在7日大腫瘤 模型(圖1A， pO.OOl)或14日大腫瘤模型(圖1B， p<0.05)中，相對于 對照組以PBS或以Ad/GFP治療組，皆造成顯著的腫瘤減小。非常值得注意 的是，利用Ad/GM-CSF + Ad/IL-12 (即，Ad/組合療法)治療，幾乎可完全 消退7日大腫瘤模型(p<0.001)中的腫瘤，且相對于上述任一種單一療法， 可加乘地減小14日大腫瘤模型(p<0.001)中的腫瘤體積。
GM-CSF及IL-12可組合療法可顯著消退大白鼠中DEN誘發(fā)地多灶性肝瘤 本發(fā)明進(jìn)一步探究細(xì)胞激素免疫療法對于多灶性肝腫瘤模型的抗腫瘤效
果。利用前述方法，以DEN誘發(fā)Wistar大白鼠的原發(fā)性肝腫瘤(參見，Barajas Metal.Hepatology 2001;33:52-61)。 一般而言，可在6 8周的期間內(nèi)產(chǎn)生多 灶性腫瘤?？山?jīng)由肝動脈注入腺病毒或PBS。治療后兩周，測量大白鼠的肝 重及體重。以修改腫瘤負(fù)荷指數(shù)(MTBI)來表示腫瘤負(fù)荷，其可指出荷瘤大 白鼠及正常健康大白鼠之間肝重/體重比值的差異。通常而言，正常健康動物 的肝重/體重比值是固定的；而帶有肝腫瘤的動物比起正常動物有較大的肝重 /體重比值。在本發(fā)明所用的模型中，健康大白鼠的肝重/體重比值平均為約 0.0405 ±0.004 (n=10)，而以PBS治療的荷瘤動物的肝重/體重比值平均為 約0.0697 ±0.01 (n = 9)。因此，PBS對照組的MTBI為0.0292 ± 0.0123 (圖 1C)。相反地，以Ad/組合療法治療的動物的MTBI非常接近健康動物，且 相較于Ad/GM-CSF療法(縮小26%)或Ad/IL-12療法(縮小55°/。)等單一 療法，Ad/組合療法中出現(xiàn)了加乘的縮小結(jié)果(縮小92%)(圖1C)。由上 述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，利用GM-CSF及IL-12組合療法對于多灶性肝癌模型亦有 良好的效果。
GM-GS^ J!/丄-"資會if法誘發(fā)努屋夢犬著游/FA^
IFN-y是由IL-12誘導(dǎo)的一種主要細(xì)胞激素，且在以細(xì)胞為媒介的免疫反 應(yīng)的發(fā)展過程中，扮演了非常關(guān)鍵的角色。有鑒于此，本發(fā)明分析了以腺病 毒治療的動物體內(nèi)的IFN-Y產(chǎn)量。如圖2所示，在Ad/IL-12治療的BLAB/c 小鼠中，IFN-Y之血清含量較高(約為1,000 pg/ml)，且這樣的高含量可持 續(xù)約12至約20天。應(yīng)注意，在Ad/組合療法治療的動物中，IFN-y的血清含 量約4,000 pg/ml，這樣的含量大約是以Ad/IL-12治療的動物的4倍。因此， 根據(jù)上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，投予Ad/GM-CSF及Ad/IL-12組合療法可大幅增進(jìn) IFN-y的產(chǎn)量。
a^/l-"及爿^邀會#*法^^不^效應(yīng)潘應(yīng)潘應(yīng)秉遂療^瘦潛遊
為了進(jìn)一步確定涉及IL-12媒介的或組合療法媒介的抗腫瘤免疫性的效 應(yīng)細(xì)胞，分別利用anti-CD4 mAb或anti-CD8 mAb或anti-asialoGMl抗血清
以耗盡BALB/c小鼠的CD4+T-細(xì)胞、CD8+T-細(xì)胞、或NK細(xì)胞。將不相關(guān) 的大白鼠單株IgG2a或正常兔子血清以相同劑量及相同日程來治療小鼠，以 作為對照組。圖3A闡明關(guān)于個別抗體的每一細(xì)胞次群的耗盡效率，圖中分 別顯示CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞及NK細(xì)胞的耗盡率約為97.9%、 96.2%、 及93.1%;另一方面，IFN-Y耗盡是利用ELISA法進(jìn)行測定，耗盡率近乎99%。 在以Ad/IL-12治療NK細(xì)胞耗盡的情形中，Ad/IL-12的抗腫瘤效果明顯減弱 (圖3B， p<0.005) 。 CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞被耗盡也會對抗腫瘤活性 的效果造成某些較輕微的影響(p<0.05)。另一方面，在以Ad/組合療法治 療NK細(xì)胞耗盡的小鼠時，對于抗腫瘤活性完全沒有影響(圖3C)，而在 CD4+T-細(xì)胞耗盡的小鼠中明顯恢復(fù)腫瘤生長(p<0.001)，且在CD8+T-細(xì) 胞耗盡的小鼠中部分恢復(fù)腫瘤生長(p<0.05)。在兩種療法中，中和IFN-y 會大幅減弱抗腫瘤效果(圖3B及圖3C)，因而可推得，IFN-y在Ad/IL-12 及Ad/組合療法中對于抗腫瘤效果扮演關(guān)鍵的角色。
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有鑒Ad/IL-12及Ad/組合療法間對于不同耗盡子集產(chǎn)生的結(jié)果明顯不
同，本發(fā)明實施例進(jìn)一步比較這兩種療法誘發(fā)的效應(yīng)細(xì)胞的習(xí)性。在腺病毒 注射后第4日隔離腫瘤浸潤性細(xì)胞，并以流動式細(xì)胞測量術(shù)進(jìn)行分析。如圖 4A所示，在以Ad/組合療法治療的動物的腫瘤區(qū)域中，相較于以Ad/IL-12 療法治療的，前者可偵測到明顯較大量的CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、及 NKT細(xì)胞等分泌IFN-y之細(xì)胞。相反地，Ad/IL-12療法相較于Ad/組合療法， 前者可誘發(fā)較高程度的NK浸潤。關(guān)于Ad/GM-CSF治療，其與Ad/GFP療法 相較之下或PBS對照組僅誘發(fā)稍微大量一些的CD4+ T細(xì)胞及CD8+ T細(xì)胞。 NKT細(xì)胞的活化需要在帶有抗原的細(xì)胞，如樹狀細(xì)胞(DC)，的表面 上表現(xiàn)CDld分子。因此，本發(fā)明一實施例測量了腫瘤浸潤性細(xì)胞中CDld+ DC的量。圖4B所示的數(shù)據(jù)顯示，Ad/組合療法相較于其它療法可誘發(fā)明顯 較大量的CDld+CDllc+DC。本實施例中，利用活性測定進(jìn)一步確認(rèn)Ad/組
合療法相較于Ad/IL-12療法可誘發(fā)較大量的腫瘤專一性CTL (圖4C);然 而Ad/IL-12療法相較于Ad/組合療法可誘發(fā)較高的NK細(xì)胞毒性能力(圖 4D)。這些實驗結(jié)果皆符合圖4A中的觀察結(jié)果。
本發(fā)明一實施例進(jìn)一步確認(rèn)腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞中CD4+的群體，本實 施例是利用anti-IFN個anti-CD4、以及用以染色NKT細(xì)胞的載有a-半乳糖 神經(jīng)酰胺(o-galactosylceramide, a-GalCer)- CDld:Ig DimerX I進(jìn)行三重染色。 結(jié)果顯示，以Ad/IL-12療法治療的小鼠中，CD4+ IFN-y+細(xì)胞中有59.6%是 NKT細(xì)胞；而在Ad/組合療法中，其CD4+ IFN-Y+細(xì)胞中的NKT族群更高 達(dá)65.2% (圖5A)。更有甚者，本實施例也發(fā)現(xiàn)，在Ad/組合療法中，在活 化的NKT細(xì)胞中，CD4-族群(可能代表CD4/CD8雙陰性的NKT細(xì)胞)約 為30.3%;另一方面，在Ad/IL-12療法中，在活化的NKT細(xì)胞中，CD4-族 群約為13.6%,亦即Ad/組合療法中，活化的NKT細(xì)胞中的CD4-族群明顯 較大(圖5B)。新近的研究顯示，CD4/CD8雙陰性NKT子集可能會產(chǎn)生比 CD4+NKT子集更高的抗腫瘤活性(參見，Crowe NYetal., 2005)。
總而言之，上述數(shù)據(jù)顯示，GM-CSF及IL-12組合療法相較于IL-12單 一療法，前者似乎能夠誘發(fā)更大量的所有效應(yīng)細(xì)胞，除了NK細(xì)胞之外。這 正好能夠解釋為什么組合療法比起IL-12單一療法有更加的抗腫瘤效果。
邀合;^法在#蘑^凝^誘發(fā)#紫犬蘆游話眾游巨麼潘應(yīng)
已知IFN-y尚可活化巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞藉由iNOS表現(xiàn)而產(chǎn)生一 氧化氮(NO)，藉此發(fā)揮其腫瘤毒殺活性(參見，Adams DO and Hamilton TA.， 1984)。因而，本發(fā)明的一實施例利用anti-Mac-3抗體或anti-iNOS抗體進(jìn) 行免疫組織化學(xué)法染色，以偵測以腺病毒治療的動物的腫瘤組織內(nèi)是否有任 何活化的巨噬細(xì)胞。在以Ad/組合療法治療的動物的腫瘤床中觀察到非常大 量的活化的巨噬細(xì)胞的浸潤現(xiàn)象，但在其它療法中，則明顯較少(圖6A)。 浸潤現(xiàn)象是響應(yīng)IFN-y分泌而導(dǎo)致，因為當(dāng)利用IFN-y已耗盡的動物進(jìn)行Ad/ 組合療法時，巨噬細(xì)胞浸潤現(xiàn)象會大幅減少。(圖6B)。因此，可藉由區(qū)域 中的大量IFN-y招來并活化具有腫瘤毒殺活性的巨噬細(xì)胞。
實施例2
務(wù)^^d/5Z) ;5^"法、爿d/尸edf;Sf"法或v4a/ed、 ^W^:z)f、 j^7乙-"j ^^c m-cs1
邀合#法f^合一;S^法)使/亭嚴(yán)位^#,遊眾
根據(jù)上述方法，在雄性BALB/c小鼠以及Wistar大白鼠體內(nèi)誘發(fā)原位肝 腫瘤。之后，依照下列程序，對該小鼠或大白鼠進(jìn)行單一的腺病毒注射(2xl09 Ad/GFP、 2xl()9的Ad/ED、 2乂109的Ad/PEDF、 1乂109的Ad/ED + lxl()9的 Ad/PEDF;或0.5x109的Ad/GM-CSF、 Ad/IL-12、 Ad/ED及Ad/PEDF)或30jxl 的PBS注射。
在小鼠模型中，對于帶有7日大肝腫瘤的動物，相較于對照組的動物， 僅僅以2xl09的Ad/ED或2xl09的Ad/PEDF治療，即可分別使腫瘤大小退化 約64°/。及約66%;另一方面，以lxl()9的Ad/ED以及l(fā)x109的Ad/PEDF治 療能夠加乘地使腫瘤大小退化約79% (參見圖7A)。在大白鼠模型中，僅 僅以Ad/ED或Ad/PEDF治療，或利用Ad/ED以及Ad/PEDF組合療法，可 分別使腫瘤大小退化約99.9%、約95.4%及約99.9% (參見圖7B)。
對于帶有14日大腫瘤的小鼠，以任一下述方法進(jìn)行治療Ad/ED及 Ad/PEDF組合療法、Ad/IL-12及Ad/GM-CSF組合療法或Ad/ED、 Ad/PEDF、 Ad/IL-12及Ad/GM-CSF組合療法(即四合一療法)，上述療法可分別使得 腫瘤大小退化約65.1%、 73.4%及卯％ (參見圖8A)。因此，在相同病毒劑 量下，包含抗血管生成療法以及免疫療法的組合療法與單獨的抗血管生成療 法或單獨的免疫療法相較之下，組合療法展現(xiàn)了加乘的治療效果。本發(fā)明也 針對有多灶性肝腫瘤的大白鼠進(jìn)行了與上述相同的療法，試驗結(jié)果顯示，上 述三種組合療法可分別使腫瘤大小退化約99.9%、約99.9%及約99.9% (參見 圖8B)。
Ad/GM-CSF及Ad/IL-12組合療法經(jīng)證實可誘發(fā)高濃度的IFN-y,雖然其 效果低于Ad/ED及Ad/PEDF組合療法，但已足以降低微血管密度 (microvessel density, MVD);另一方面，四合一療法與Ad/ED及Ad/PEDF 組合療法相較之下，四合一療法可進(jìn)一步降低腫瘤血管形成的程度(參見圖 9A)，可知，四合一療法能夠加乘地降低微血管密度。利用Ad/GM-CSF及 Ad/IL-12組合療法不會顯著提髙腫瘤區(qū)域中的細(xì)胞凋亡數(shù)目，然而Ad/ED及 Ad/PEDF組合療法以及四合一療法能夠顯著提高腫瘤區(qū)域中的細(xì)胞凋亡數(shù) 目(參見圖9B)。由于在四合一療法中，Ad/ED以及Ad/PEDF的劑量僅為 Ad/ED及Ad/PEDF組合療法中的二分之一，而兩種療法具有相近的細(xì)胞凋 亡數(shù)目，此一現(xiàn)象意味著免疫療法能夠促進(jìn)抗血管療法中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果顯示，與對照組相較之下，Ad/GM-CSF及 Ad/IL-12組合療法可導(dǎo)致腫瘤區(qū)域中出現(xiàn)顯著較高的CD4+(圖9C)及CD8+T 細(xì)胞(圖9D)浸潤，然而Ad/ED及Ad/PEDF組合療法則不能。更重要的一 點在于，相較于Ad/GM-CSF + Ad/IL-12組合療法，四合一療法可誘導(dǎo)非常 高量的腫瘤浸潤004+ (圖9C)及CD8+T細(xì)胞(圖9D)。因此，上述試驗 結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明實施例的四種生長因子能夠?qū)е聫娏业拿庖叻磻?yīng)，而 可將較多量的效應(yīng)子(effector)召集至腫瘤區(qū)域，而有助于加乘地減小腫瘤 大小。
總結(jié)而論，根據(jù)本發(fā)明各實施例顯示，利用IL-12及GM-CSF或ED及 PEDF或四合一基因的組合療法，是一種理想的原位肝腫瘤治療手段。值得 注意的是，根據(jù)發(fā)明人的初步研究結(jié)果顯示，此一手段在具有慢性肝炎而自 發(fā)地發(fā)展成多灶性肝癌的土撥鼠模型中，也具有顯著的抗腫瘤效果。因此， 可考慮利用此種組合模式作為治療大面積肝腫瘤的一種可能的臨床選擇。
縱4沐實雄
本說明書公開的所有特征可任意組合。可利用其它具有相同、等價、或 類似目的的替代性特征來取代說明書中公開的每一特征。因此，除非另為不 同的表示，所公開的每一特征僅為一系列等價或類似特征的上位概念的例示。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，然其并非用以限定本發(fā)明，任何 熟悉該技術(shù)的人員在不脫離本發(fā)明的精神及范圍內(nèi)當(dāng)可作各種更動與潤飾。
權(quán)利要求
1、一種用以在細(xì)胞增生異常受試者體內(nèi)改變細(xì)胞生長狀態(tài)的方法，該方法至少包含對該受試者投予有效劑量的第一多肽或可編碼該第一多肽的第一核酸，及有效劑量的第二多肽或可編碼該第二多肽的第二核酸，其中所述第一多肽及第二多肽選自由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素-12、內(nèi)皮抑制因子、及色素上皮衍生因子組成的物質(zhì)群組。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一多肽及第二多肽為粒細(xì)胞 -巨噬細(xì)胞集落剌激因子及白介素-12,該方法還包含對所述受試者投予第三 多肽或可編碼該第三多肽的第三核酸以及第四多肽或可編碼該第四多欣的 第四核酸二者中的至少一種，其中所述第三多肽為內(nèi)皮抑制因子，所述第 四多肽為色素上皮衍生因子。
3、 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述第一核酸、第二核酸、第 三核酸及第四核酸為腺病毒載體。
4、 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中每一所述多肽或核酸是投予至 具有所述細(xì)胞增生異常的組織或器官。
5、 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述細(xì)胞增生異常為肝癌。
6、 一種用以治療受試者體內(nèi)細(xì)胞增生異常的藥學(xué)組合物，該藥學(xué)組合 物至少包含第一多肽、第二多肽以及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述第一 多肽及第二多肽是選自由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素-12、內(nèi)皮 抑制因子、及色素上皮衍生因子所組成的群組。
7、 如權(quán)利要求6所述的藥學(xué)組合物，其中所述第一及第二多肽為粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子及白介素-12，該藥學(xué)組合物還包含第三多肽以及 第四多肽的至少一種，其中所述第三多肽為內(nèi)皮抑制因子，第四多肽為色 素上皮衍生因子。
8、 如權(quán)利要求6或7所述的藥學(xué)組合物，其中所述細(xì)胞增生異常為肝癌。
9、 一種用以治療受試者體內(nèi)細(xì)胞增生異常的藥學(xué)組合物，該藥學(xué)組合 物至少包含可編碼第一多肽的第一核酸、可編碼第二多肽的第二核酸、以 及藥學(xué)上可接受的載體，其中所述第一多肽及第二多肽是選自由粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、白介素-12、內(nèi)皮抑制因子、及色素上皮衍生因子組 成的群組。
10、 如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述第一核酸所編碼的第一多 肽為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子以及第二核酸所編碼的第二多肽為白介 素-12，該組合物還包含可編碼第三多肽的第三核酸以及可編碼第四多肽的 第四核酸二者中的至少一種，其中所述第三多肽為內(nèi)皮抑制因子，第四多 肽為色素上皮衍生因子。
11、 如權(quán)利要求9或10所述的組合物，其中所述第一核酸、第二核酸、 第三核酸及第四核酸為腺病毒載體。
12、 如權(quán)利要求9或10所述的組合物，其中所述細(xì)胞增生異常為肝癌。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于用以治療細(xì)胞增生異常的組合物及改變細(xì)胞生長狀態(tài)的方法。本發(fā)明提供一種用以在細(xì)胞增生異常受試者體內(nèi)改變細(xì)胞生長狀態(tài)的方法，該方法包含對受試者投予有效劑量的第一多肽或可編碼該第一多肽的第一核酸，以及有效劑量的第二多肽或可編碼該第二多肽的第二核酸。本發(fā)明還提供一種藥學(xué)組合物，該藥學(xué)組合物包含上述多肽的至少二種以及一藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明還提供一種藥學(xué)組合物，該藥學(xué)組合物包含上述核酸的至少二種以及一藥學(xué)上可接受的載體。
文檔編號A61K38/20GK101385850SQ200810212618
公開日2009年3月18日 申請日期2008年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日
發(fā)明者黃麗華, 黃凱文 申請人:黃麗華;黃凱文