專利名稱：治療血液惡性腫瘤和自身免疫疾病的hvem配體的制作方法
血系統(tǒng)的細(xì)胞和組織，包括血液、骨髓和淋巴結(jié)。血液惡性腫瘤包括白血病和淋巴瘤兩者。術(shù)語白血病通常用于限定以白細(xì)胞異常增殖為特征的血液或骨髓的血液惡性腫 瘤。白血病的主要亞型根據(jù)涉及淋巴樣(例如T或B淋巴細(xì)胞譜系)或骨髓樣(例如粒細(xì) 胞、紅細(xì)胞或巨核細(xì)胞譜系)細(xì)胞的惡性腫瘤，以及疾病是急性的還是慢性的起始來鑒定 [Freireich, E.J. et al. ,1991]。術(shù)語淋巴瘤包括淋巴組織贅生物的異質(zhì)群。淋巴瘤大致地分類在Hodgkin淋巴 瘤，以及T細(xì)胞(T-NHL)和B細(xì)胞(B-NHL)非Hodgkin淋巴瘤下。世界衛(wèi)生組織(WHO)分 級(jí)最近已經(jīng)問世(在本申請(qǐng)隨后討論)，并且已經(jīng)建立基于該分級(jí)的診斷指導(dǎo)方針[Jaffe， E. S. et al.，2004 (參見下文中的表3和4)]。慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)是以骨髓和血液中淋巴細(xì)胞緩慢但是累進(jìn)的累積 為特征的一種淋巴細(xì)胞性白血病。取決于疾病的時(shí)期，通常發(fā)生淋巴結(jié)和脾增大。盡管CLL 可以是T細(xì)胞或B細(xì)胞來源的，超過85%的情況是B細(xì)胞來源的。當(dāng)前的認(rèn)識(shí)暗示CLL是 起源于在活化和成熟狀態(tài)以及細(xì)胞亞群不同的B淋巴細(xì)胞的異質(zhì)疾病(參見[KupperS，R.， 2005])。該疾病可以產(chǎn)生自白血病的B細(xì)胞凋亡減少和增殖增加兩者。CLL細(xì)胞通常在來 源克隆，并表達(dá)下列細(xì)胞表面標(biāo)記⑶19、⑶20、⑶21和⑶24。此外，它們表達(dá)更通常在T細(xì) 胞上發(fā)現(xiàn)的 CD5(參見[Chiorazzi，N, and al.，2005])。CLL被認(rèn)為是〃非Hodgkin氏淋巴瘤〃(NHL)的亞類并且與主要存在于淋巴結(jié)的 緊密相關(guān)的疾病"小淋巴細(xì)胞淋巴瘤"(SLL) —起，相當(dāng)于所有NHL情況的大約20%。CLL是美國(guó)和大部分西歐成人中最常見的白血病。國(guó)家癌癥學(xué)會(huì)(NCI)估計(jì)在美 國(guó)CLL的發(fā)病率是每年大約10. 000新病例。CLL的臨床表現(xiàn)主要在55歲之后出現(xiàn)。男人 的發(fā)病率比女人更高，男人幾乎兩倍于女人可能得到該疾病。CLL代表未滿足的醫(yī)學(xué)需要因?yàn)閷?duì)于治療只有有限的選擇。對(duì)于NHL最常見的治療是化療，尤其是稱為010 (環(huán)磷酰胺、辦(11~0巧1~111^(^11[阿 霉素]、安可平[長(zhǎng)春新堿]、強(qiáng)的松)的合并用藥法，以及放射治療。有時(shí)，還使用手術(shù)和 骨髓移植。更近一些，生物藥劑學(xué)試劑，特別是例如利妥昔單抗(rituximab)和阿侖單抗 (alemtuzumab)的單克隆抗體的使用已有增加。其它組合方法包括例如rituximab的生物 藥劑與化療一起使用。盡管這些治療已經(jīng)顯著地改進(jìn)了 B淋巴惡性腫瘤的處理，它們的不 足中包括許多病人對(duì)這些服法非應(yīng)答(一些病人變成對(duì)一些或所有這些途徑不應(yīng)的)，以 及由這些治療的使用產(chǎn)生的副作用和并發(fā)癥。其中最常見的化療副作用是惡心和嘔吐(其 通常是使用止吐藥處理)、脫發(fā)(其通常在治療完成之后隨著時(shí)間的過去逆轉(zhuǎn))和白細(xì)胞減 少，特別是中性粒細(xì)胞減少。中性粒細(xì)胞減少通常在第二周顯現(xiàn)。在這期間，許多臨床醫(yī)師 推薦預(yù)防的使用環(huán)丙沙星。如果在中性粒細(xì)胞減少周期中顯現(xiàn)發(fā)燒，需要對(duì)中性粒細(xì)胞減 少膿毒癥的緊急醫(yī)學(xué)鑒定，因?yàn)樵诘椭行粤＜?xì)胞計(jì)數(shù)的病人中感染會(huì)迅速地發(fā)展。對(duì)于利 妥昔單抗，已經(jīng)報(bào)道了首次輸注反應(yīng)、淋巴細(xì)胞減少、傳染性并發(fā)癥例如包括乙型肝炎和進(jìn) 行性多灶性白質(zhì)腦病(PML)的病毒再活化、粘膜與皮膚反應(yīng)和腎并發(fā)癥。對(duì)于阿侖單抗，可 能出現(xiàn)嚴(yán)重的血液毒性，包括各類血細(xì)胞減少、骨髓發(fā)育不全、自身免疫自發(fā)性血小板減少 和自身免疫性溶血性貧血。有時(shí)，這些毒性可能加速病態(tài)和死亡率。自身免疫疾病免疫系統(tǒng)具有防止它攻擊自身組織的控制機(jī)制。當(dāng)這些機(jī)制沒有適當(dāng)?shù)匦惺构δ芑虍?dāng)它們損壞時(shí)，它們可能產(chǎn)生自身免疫或自身免疫疾病的出現(xiàn)。自身免疫代表從器官特 異性到非器官特異性的廣譜疾病。在范圍的一端，Hashimoto氏甲狀腺炎代表高度器官特 異性的疾病，其中破壞性損害僅僅針對(duì)一種器官。在范圍的另一端，全身性紅斑狼瘡(SLE) 代表非器官特異性疾病，其中涉及涉及組織廣泛遍及身體。隨著我們的免疫生物學(xué)認(rèn)識(shí)的 增進(jìn)，以及分子和診斷工具的發(fā)展，大多數(shù)器官或組織系統(tǒng)可能遭受顯示于以下列表的自 身免疫疾病的自動(dòng)破壞潛能逐漸變得明顯。如此其中自身免疫疾病包括艾迪生氏病、強(qiáng) 直性脊柱炎、再生障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫肝炎、腹腔病、克羅恩氏 病、皮肌炎、古德帕斯徹氏綜合征、突眼性甲狀腺腫、Guillain-Barre綜合癥、橋本氏病、自 發(fā)性白細(xì)胞減少、特發(fā)性血小板減少性紫癜、胰島素依賴型糖尿病(1型糖尿病)、男性不育 癥、混合型結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化(MS)、重癥肌無力、類天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、 phacogenic葡萄膜炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性粘液水腫、瑞特氏綜合征、類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎(RA)、硬皮病、Sjogren氏綜合癥、stiff man綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、甲狀腺 毒癥、潰瘍性結(jié)腸炎和韋格納氏肉芽腫病。沒有完全了解自身免疫疾病的病因?qū)W。在有些情況下，已經(jīng)建立了分子模擬機(jī)制， 借此產(chǎn)生性的抗細(xì)菌或抗病毒反應(yīng)可能不注意地導(dǎo)致對(duì)自身組織的免疫反應(yīng)的發(fā)生。此 外，已知繼承或遺傳易感促進(jìn)這些疾病中許多的出現(xiàn)。淋巴和骨髓譜系細(xì)胞兩者都和自身免疫疾病的發(fā)生有牽連。自身反應(yīng)T和B淋巴 細(xì)胞確定每種疾病的主要臨床_病理特征和涉及的組織。T淋巴細(xì)胞可能直接攻擊自身組 織而B細(xì)胞分泌自身反應(yīng)抗體。在SLE中，產(chǎn)生包括對(duì)雙鏈DNA的抗體的大量自身反應(yīng)性 抗體，其被認(rèn)為引起或加重腎損害。是巨噬細(xì)胞骨髓譜系細(xì)胞的有助于通過提供細(xì)胞因子 和趨化因子反應(yīng)(例如TNF-a和IL-8)，以及通過充當(dāng)自動(dòng)破壞過程的效應(yīng)細(xì)胞，維持、擴(kuò) 增和延長(zhǎng)針對(duì)自身組織的免疫攻擊。對(duì)于現(xiàn)在已知適用抗TNF-a治療的RA和克羅恩氏 病，TNF-a的作用已經(jīng)明顯地確定。對(duì)于RA，骨髓譜系細(xì)胞被認(rèn)為分化為破骨細(xì)胞由此引 起骨損害和發(fā)炎的關(guān)節(jié)的滑液襯墊破壞。RA病人還顯示適用直接針對(duì)B細(xì)胞的治療，例如 抗⑶20抗體治療。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及用于治療用途的HVEM配體，其中所述HVEM配體選自LIGHT、作為抗 HVEM抗體的LIGHT片段，其中，所述片段在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，且所 述片段與HVEM結(jié)合。尤其本發(fā)明涉及用于治療血液惡性腫瘤或自身免疫疾病的HVEM配體。本發(fā)明還涉及血液惡性腫瘤或自身免疫疾病的治療方法，其包括給需要的受試者 服用治療有效量的HVEM配體。定義如本文使用的，涉及特異性蛋白質(zhì)(例如抗體或LIGHT)可以包括具有天然氨基酸 序列的多肽，以及變體和修飾形式，不管它們的來源或制備方式。具有天然氨基酸序列的蛋 白質(zhì)是具有與從自然界獲得的(例如天然存在的LIGHT)相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。上 述天然序列蛋白質(zhì)可以從自然界分離或可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組和/或合成方法制備。天然序列 蛋白質(zhì)特別地包括天然存在的截短或可溶形式、天然存在的變體形式(例如選擇性拼接形 式)、天然存在的等位變體和包括翻譯后修飾的形式。天然序列蛋白質(zhì)包括例如糖基化作用、或磷酸化作用、或一些氨基酸殘基的其它修飾的翻譯后修飾之后的蛋白質(zhì)。本文使用的術(shù)語“HVEM”意欲包括所有異名，包括但不限于“皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì) (Herpes Virus Entry Mediator) ”、“HVEA”、“皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì) A”、“TNFRSF14”、“腫瘤壞 死因子超家族成員 14”、“TNR14”、“LIGHTR”、“LIGHT 受體”、“TR2”、“類 TNF 受體”、“ATAR，，、 “另一個(gè) TRAF 相關(guān)受體(Another TRAF-AssociatedRec印tor) ”。TNFRSF14 是 HUGO(人類 基因組組織)基因命名委員會(huì)(HGNC)批準(zhǔn)的代號(hào)。HVEM的UniProtKB/Swiss-Prot"原始 登錄號(hào)(Primary Accession Number)"是 Q92956?！昂罄m(xù)登錄號(hào)(SecondaryAccession Number)“是 Q8WXR1、Q96J31 和 Q9UM65?！芭潴w"表示與受體分子結(jié)合以形成受體_配體復(fù)合物的天然或合成化合物。迄今為止，已經(jīng)鑒定了 4種與HVEM結(jié)合的配體。這些配體中的兩種，LIGHT和 LTa 是 TNF 家族成員分子(Morel，Y. et al.，2000 ；Mauri, D. N. et al.，1998 和 Harrop， J. A. et al.，1998)。在結(jié)構(gòu)上，TNF家族成員通常表達(dá)為單程2型跨膜，同源三聚體或異源 三聚體，糖蛋白。在表達(dá)為跨膜蛋白質(zhì)之后，它們通過蛋白水解作用裂解以產(chǎn)生可溶形式的 配體。HVEM的第三種配體，BTLA，一種1型跨膜糖蛋白，是免疫球蛋白(Ig)超家族成員分子 并與CD28密切相關(guān)(Gonzalez, L. C. et al.，2005)。第四種配體，糖蛋白D (gD)，是單純皰 疹病毒(HSV)包膜的結(jié)構(gòu)部件，并對(duì)HSV進(jìn)入宿主細(xì)胞是必不可少的(Montgomery，! . I.et al. , 1996 ；Hsu,H. et al. , 1997 ；Kwon,B. S. et al. , 1997 ；Tan,K. B. et al. , 1997 ；Marsters, S. A. et al. , 1997 ；ffallach, D. et al. , 1999 ；Collette, Y. et al. ,2003 ；Harrop, J. A. et al. , 1998 ；Gonzalez, L. C. et al. , 2005and ffhitbeck, J. C. et al. , 1997)。結(jié)合研究(Gonzalez,L. C. et al.，2005 和 Sedy, J. R. et al.，2005)表明 BTLA 與 HVEM的大多數(shù)膜遠(yuǎn)端CRD區(qū)域相互作用，這隨后被結(jié)晶學(xué)(Compaan，D. M. et al.，2005)支 持。HVEM的膜遠(yuǎn)端CRD1區(qū)域還和與HSV-gD的相互作用有牽連，具有來自CRD2的另外的貢 獻(xiàn)(Compaan，D.M. et al.，2005 和 Carfi，A. et al. ,2001) 盡管在 BTLA 和 HSV-gD 之間序 列和結(jié)構(gòu)不相似，晶體結(jié)構(gòu)研究還顯示它們?cè)贖VEM上的結(jié)合位點(diǎn)包括基本上重疊的表面 (Compaan, D. M. et al.，2005 禾口 Carfi，A. et al.，2001)。本文使用的術(shù)語“LIGHT”意欲包括所有異名，包括但不限于“T細(xì)胞表達(dá)的，與單 純性皰疹病毒(HSV)糖蛋白D競(jìng)爭(zhēng)HVEM的，可誘導(dǎo)的，淋巴毒素”、“TNFSF14”、“腫瘤壞死因 子配體超家族成員14”、“TNF14_HUMAN”、“HVEM-L”、“HVEML”、“HVEM配體”、“皰疹病毒進(jìn)入 介質(zhì)配體”、“皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)-配體”、“TL4”、“類TNF-4”、“TN14”、“LT Y ”和“CD258”。 TNFSF14是HGNC批準(zhǔn)的代號(hào)。⑶258是HLDA (人類白細(xì)胞分化抗原)Workshop的簇指定分 配。LIGHT 的UniProtKB/Swiss-Prot"原始登錄號(hào)〃是043557?！?后續(xù)登錄號(hào)"是075476、 Q8WVF8 和 Q96LD2。在天然抗體中，兩條重鏈通過二硫鍵彼此連接并且每條重鏈通過二硫鍵與輕鏈連 接。有兩種輕鏈，X和K。有5種主要的重鏈類別(或同種型)IgM、IgD、IgG、IgA*IgE， 其確定抗體分子的功能性活動(dòng)。每條鏈包含獨(dú)特的序列結(jié)構(gòu)域。輕鏈包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，可 變區(qū)(VL)和恒定區(qū)(CL)。重鏈包括四個(gè)結(jié)構(gòu)域，可變區(qū)(VH)和三個(gè)恒定區(qū)(CH1、CH2和 CH3，共同稱為CH)。輕(VL)和重(VH)鏈兩者的可變區(qū)確定對(duì)抗原的結(jié)合識(shí)別和特異性。 輕(CL)和重(CH)鏈的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域賦予重要的生物學(xué)特性，例如抗體鏈締合、分泌、轉(zhuǎn)胎 盤流動(dòng)性、互補(bǔ)結(jié)合和與Fc受體(FcR)結(jié)合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，由一條輕鏈和一條重鏈的可變部分組成?？贵w特異性存在于抗體結(jié)合部位和抗原決定 簇之間的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性?？贵w結(jié)合部位由主要來自高變區(qū)或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的殘基組成。 偶而，來自非高變區(qū)或框架區(qū)(FR)的殘基影響總的區(qū)域結(jié)構(gòu)由此影響結(jié)合部位?；パa(bǔ)決定 區(qū)或CDR指的是共同限定天然免疫球蛋白結(jié)合部位的天然Fv區(qū)的結(jié)合親合性和特異性的 氨基酸序列。免疫球蛋白的輕和重鏈各具有三個(gè)⑶R，分別命名為L(zhǎng)-⑶R1、L-⑶R2、L-⑶R3 和H-⑶R1、H-⑶R2、H-⑶R3。因此抗原結(jié)合部位包括六個(gè)⑶R，包括來自一條重鏈和一條輕 鏈各自V區(qū)的⑶R組。框架區(qū)(FR)指的是在⑶R之間插入的氨基酸序列。術(shù)語"抗體" 進(jìn)一步意欲包括抗體、消化片段、其特定部分和變體，包括模擬抗體或其特定片段或部分結(jié) 構(gòu)和/或功能的抗體模擬物或抗體部分，包括單鏈抗體及其片段。功能性片段包括與哺乳 動(dòng)物HVEM結(jié)合的抗原結(jié)合片段。如本文使用的，術(shù)語"人類抗體"指的是其中抗體分子的重要部分，在氨基酸序 列或結(jié)構(gòu)上類似來源于人類起端抗體的抗體。術(shù)語"人源化抗體"指的是通過基因工程或 其它方式修飾以在結(jié)構(gòu)或氨基酸序列上與天然發(fā)生的人類抗體相似的抗體。在需要減少抗 體的免疫原性的情況下，“人類抗體"或"人源化抗體"可能被認(rèn)為更適合給藥至人類用 于治療、預(yù)防或診斷目的。以其多種名稱的"單克隆抗體"或"mAb"指的是僅僅包含能夠與特定表位免疫 反應(yīng)的一個(gè)物種的抗體結(jié)合部位的抗體分子群。因此單克隆抗體通常顯示對(duì)它與其免疫 反應(yīng)的任何表位的單一結(jié)合親合性。單克隆抗體還可以限定具有復(fù)數(shù)抗體結(jié)合部位，各自 對(duì)不同表位免疫專一的抗體分子。例如，雙特異性抗體可以具有兩個(gè)抗原結(jié)合部位，各自 識(shí)別不同的相互作用分子、或不同的表位。如本文使用的，術(shù)語"抗體片段"、“抗體部 分"、“抗體變體"等包括任何包含包括免疫球蛋白分子至少一部分以致允許在所述分子 和抗原(例如HVEM)之間特異性相互作用的分子的蛋白質(zhì)或多肽。免疫球蛋白分子的部分 可以包括，但不限于重或輕鏈的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分、重鏈或輕 鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架區(qū)、或其任何部分、或能夠并入本發(fā)明的抗體以允許與 抗原(例如HVEM)的相互作用的配體或抗受體(例如LIGHT、BTLA或HSV-gD)的至少一部 分。術(shù)語"雜交瘤"表示通過呈交用抗原免疫非人哺乳動(dòng)物制備的B細(xì)胞與來源于 小鼠等的骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合獲得的細(xì)胞，其產(chǎn)生具有抗原特異性的需要的單克隆抗體。如本文使用的，術(shù)語"受試者"表示哺乳動(dòng)物，例如嚙齒動(dòng)物、貓、犬和靈長(zhǎng)類。優(yōu) 選根據(jù)本發(fā)明的受試者是人。發(fā)明詳述治療方法和應(yīng)用本發(fā)明的第一個(gè)目的涉及用于治療用途的HVEM配體，其中所述HVEM配體選自 LIGHT、作為抗HVEM抗體LIGHT片段，其中，所述片段在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘 導(dǎo)凋亡，且所述片段與HVEM結(jié)合。通常所述HVEM配體可以和放療和激素療法聯(lián)合使用。通常所述HVEM配體還可以和選自抗癌劑、止吐藥、造血集落刺激因子、止痛藥和 抗焦慮藥的一種或多種試劑聯(lián)合使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于治療血液惡性腫瘤或自身免疫疾病的HVEM配體。本發(fā)明還涉及HVEM配體制造治療血液惡性腫瘤或自身免疫疾病的藥劑的用途， 其中所述HVEM配體選自LIGHT、作為抗HVEM抗體的LIGHT片段，其中，所述片段在慢性淋巴 細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，且所述片段與HVEM結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，血液惡性腫瘤包括但不限于例如慢性淋巴細(xì)胞性白血病 (CLL)的淋巴樣細(xì)胞贅生物、非Hodgkin淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)和外套 細(xì)胞淋巴瘤(MCL)。更具體地說，非Hodgkin淋巴瘤(NHL)包括B和T非Hodgkin淋巴瘤。 此外，細(xì)胞淋巴樣贅生物包括B、NK和T細(xì)胞淋巴樣贅生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫疾病包括但不限于艾迪生氏病、強(qiáng)直性脊柱炎、再生 障礙性貧血、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫肝炎、腹腔病、克羅恩氏病、皮肌炎、古德帕 斯徹氏綜合征、突眼性甲狀腺腫、Guillain-Barre綜合癥、橋本氏病、自發(fā)性白細(xì)胞減少、 特發(fā)性血小板減少性紫癜、胰島素依賴型糖尿病(1型糖尿病)、男性不育癥、混合型結(jié)締組 織病、多發(fā)性硬化(MS)、重癥肌無力、類天皰瘡、尋常天皰瘡、惡性貧血、phacogenic葡萄膜 炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)性粘液水腫、瑞特氏綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、硬皮病、 Sj6gren氏綜合癥、stiff man綜合癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、甲狀腺毒癥、潰瘍性結(jié)腸炎 和韋格納氏肉芽腫病。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HVEM配體是LIGHT或其片段，其在慢性淋巴細(xì)胞性白 血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。特別地，所述配體可以由多肽組成，包括與登錄號(hào)Q92956的序列具有至少90%同 一性并在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的序列。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 本發(fā)明的配體是可以以可溶形式使用的LIGHT。本發(fā)明的多肽可以通過本領(lǐng)域本來已知的任何技術(shù)產(chǎn)生，例如，無限制地，任何化 學(xué)的、生物的、遺傳的或酶的技術(shù)，單獨(dú)或組合。已知需要的序列的氨基酸序列，通過生產(chǎn)多肽的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 容易地產(chǎn)生所述多肽。例如，它們能夠使用眾所周知的固相方法合成，優(yōu)選使用市場(chǎng)上可買 到的肽合成裝置(例如AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，California制造的)并且遵循 制造商的指導(dǎo)?？蛇x擇地，本發(fā)明的多肽能夠通過本領(lǐng)域現(xiàn)在眾所周知的重組DNA技術(shù)合成。例 如，這些片段能夠在把編碼需要的(多)肽的DNA序列摻入表達(dá)載體并把上述載體引入可 以表達(dá)需要的多肽的合適的真核或原核宿主之后作為DNA表達(dá)產(chǎn)物獲得，它們隨后能夠使 用眾所周知的技術(shù)從其中分離。本發(fā)明的多肽能夠以分離的(例如純化的)形式或包含在載體，例如膜或脂囊泡 (例如脂質(zhì)體)中使用。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HVEM配體是抗HVEM抗體或其與HVEM結(jié)合的片 段。所述配體可以通過例如凋亡誘導(dǎo)、抗體依賴的細(xì)胞毒性、互補(bǔ)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、或 通過產(chǎn)生細(xì)胞因子或趨化因子的免疫效應(yīng)細(xì)胞補(bǔ)充和/或活化的機(jī)制，誘導(dǎo)表達(dá)HVEM的惡 性淋巴細(xì)胞死亡和/或消除。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述配體在表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞中，尤其是在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞可以從遭受急性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、漿細(xì) 胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤或T細(xì)胞淋巴瘤的病人獲得。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中所述抗HVEM抗體或其所述片段是不抑制BTLA與HVEM 結(jié)合的抗體或其片段。在本發(fā)明的一個(gè)選擇性的實(shí)施方案中所述抗HVEM抗體或其所述片段是抑制BTLA 與HVEM結(jié)合并且不與包括或由人類HVEM序列CPKCSPGYRVKEACGELTGTVCEPC (SEQ ID NO 1)組成的30氨基酸序列結(jié)合的抗體或其片段。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述抗HVEM抗體或所述片段是識(shí)別選自組I、II、III、 IV、V或VI的表位的抗體或其片段。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述抗HVEM抗體或所述 片段是識(shí)別選自組II、IV或V的表位的抗體或其片段。HVEM mAb識(shí)別的表位通過以下特征鑒定i) mAb 抑制 LIGHT、HSV-gD 和 / 或 BTLA 與 HVEM 結(jié)合的能力。ii)誘變實(shí)驗(yàn)借此測(cè)試mAb與HVEM突變體結(jié)合的能力。使用的HVEM突變體包括i)兩種缺失突變體a. CRD1結(jié)構(gòu)域缺失和b. CRD3 結(jié)構(gòu)域中氨基酸 129_133 缺失(dell29_l33)ii) 一種具有殘基131-133取代的丙氨酸取代突變體(mutl31_133)上面一組實(shí)驗(yàn)確定了 6個(gè)不同的mAb組以及由此6個(gè)表位1.組I mAb相應(yīng)于不與CRD1結(jié)合但是受del 129-133缺失突變體的影響并且僅僅 封閉HVEM與LIGHT的結(jié)合的那些。2.組II mAb相應(yīng)于與CRD1缺失結(jié)合但不與dell29-133缺失或mutl31-133突變 體結(jié)合的那些。3.組III mAb相應(yīng)于不與CRD 1缺失突變體結(jié)合且不受del 129-133缺失影響，并 且不抑制三種HVEM配體結(jié)合的那些。4.組IV mAb相應(yīng)于不受CRD1影響但是受del 129-133缺失突變體影響，并且不抑 制三種HVEM配體結(jié)合的那些。5.組V mAb相應(yīng)于與CRD1缺失但不與dell29-133缺失結(jié)合的，不受mutl31-133 突變體影響，并且不能封閉HVEM與三種配體結(jié)合的那些。6.組VI mAb相應(yīng)于與CRD1缺失結(jié)合但受del 129-133缺失或mutl31-133突變體 部分影響，并且能夠封閉HVEM與全部配體結(jié)合的那些。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述抗HVEM抗體是可從根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2007年4 月 26 日在 COLLECTION NATIONALE DECULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM)儲(chǔ)存的選自 CNCMI-3752、CNCM 1-3753和CNCM 1-3754的雜交瘤獲得的單克隆抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及適于獲得抗HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 系，其通過例如凋亡誘導(dǎo)、抗體依賴的細(xì)胞毒性、互補(bǔ)介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、或通過產(chǎn)生細(xì)胞因 子或趨化因子的免疫效應(yīng)細(xì)胞補(bǔ)充和/或活化的機(jī)制，誘導(dǎo)表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞死亡 和/或消除。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及適于獲得抗HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞系，其在表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞中，尤其是在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及適于獲得抗HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì) 胞系，其識(shí)別選自組I、II、III、IV、V或VI的表位。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中所述雜交瘤細(xì)胞系選自CNCM 1-3752、CNCM 1-3753和 CNCM 1-3754。盡管可以使用多克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。能夠與HVEM特異性結(jié)合的抗體可以源自于許多物種包括但不限于嚙齒動(dòng)物(小 鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉(cāng)鼠等)、豬、牛、馬或靈長(zhǎng)類等。來自靈長(zhǎng)類(猴、狒狒、黑猩猩等)起源 的抗體具有與人類序列最高的相似度并因此期待是較少免疫原性的。來源于多種物種的抗 體能夠通過修飾抗體的氨基酸序列"人源化"同時(shí)保持它們與需要的抗原結(jié)合的能力?？?體還可以源自于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，包括小鼠，其已經(jīng)用人免疫球蛋白基因座遺傳修飾以表達(dá)人 類抗體。形成"多克隆抗體"的程序?yàn)楸绢I(lǐng)域所熟知。例如，多克隆抗體能夠從針對(duì)HVEM 免疫的動(dòng)物的血清獲得，所述HVEM可以通過基因工程，例如根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知 的標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生。通常，上述抗體能夠通過皮下給藥HVEM蛋白質(zhì)到已經(jīng)放血以獲得預(yù)免疫 血清的新西蘭白兔(New Zealand white rabbit)形成?？梢砸悦坎课?00 yl總量在6個(gè) 不同的部位注射抗原。每種注射材料可以包含有或者沒有磨成粉的SDS聚丙烯酰胺凝膠電 泳之后包含蛋白質(zhì)或多肽的丙烯酰胺凝膠的佐劑。然后在第一次注射并用相同的抗原以6 星期的間隔周期地加強(qiáng)三次之后2周把兔放血。然后每次加強(qiáng)之后10天收集血清樣品。然 后通過使用捕獲該抗體的相應(yīng)抗原的親和層析法從血清中回收多克隆抗體。形成多克隆抗 體的這個(gè)和其它程序被(Harlow et al. , 1988)公開，其在此并入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。盡管歷史上單克隆抗體通過克隆純免疫球蛋白分泌細(xì)胞系的永生化產(chǎn)生，單克隆 純抗體分子群也可以通過本發(fā)明的方法制備。制備單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)室方法為本領(lǐng)域所熟知(參見，例如Harlow et al., 1988)。單克隆抗體(mAb)可以通過用純化的HVEM蛋白質(zhì)免疫例如小鼠、大鼠、靈長(zhǎng)類等哺 乳動(dòng)物制備。分離來自免疫的哺乳動(dòng)物的抗體生產(chǎn)細(xì)胞并與骨髓瘤或異骨髓瘤細(xì)胞融合以 生產(chǎn)雜交細(xì)胞(雜交瘤)。利用生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞作為需要的單克隆抗體的來 源。該雜交瘤培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)方法在(Kohler and Milstein, 1975)中描述。可選擇地，可以分離 免疫球蛋白基因并用于制備篩選特異反應(yīng)的反應(yīng)性抗體的文庫。包括重組噬菌體和其它表 達(dá)文庫地許多這樣的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。雖然mAb可以通過雜交瘤培養(yǎng)生產(chǎn)本發(fā)明不被這樣限制。還預(yù)期了通過克隆和轉(zhuǎn) 移從本發(fā)明的雜交瘤克隆的核酸生產(chǎn)的mAb的用途。也就是說，表達(dá)本發(fā)明的雜交瘤分泌 的分子的核酸可以被轉(zhuǎn)移進(jìn)另一個(gè)細(xì)胞系以生產(chǎn)轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體基因型上與原始雜交瘤不 同但是也能夠生產(chǎn)本發(fā)明的抗體分子，包括完整抗體分子的免疫活性片段，與雜交瘤分泌 的那些相當(dāng)。參見，例如美國(guó)專利號(hào)4，642，334來讀??；PCT公開號(hào)；Winter等人的歐洲專 利公開號(hào)0239400和Cabilly等人的歐洲專利公開號(hào)0125023。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，識(shí)別HVEM的mAb可以通過用相應(yīng)的重組人類Fc_IgGl融 合蛋白免疫Balb-c小鼠產(chǎn)生。把脾細(xì)胞與X-63骨髓瘤細(xì)胞融合并根據(jù)已經(jīng)描述的程序
11(Olive D，1986)克隆。然后通過轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色篩選雜交瘤上清液，因?yàn)榕c未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 缺乏反應(yīng)性。也預(yù)期了不涉及免疫接種的抗體產(chǎn)生技術(shù)，例如使用噬菌體展示技術(shù)來檢查自然 的文庫(來自未免疫的動(dòng)物)；參見(Barbas et al.，1992，和Waterhouse et al. 1993)。通過常規(guī)的免疫球蛋白純化程序，例如親合性、離子交換和/或分子篩層析等適 當(dāng)?shù)貜呐囵B(yǎng)基分離本發(fā)明的抗體。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以是人類嵌合抗體?？梢酝ㄟ^獲得編碼 VL和VH結(jié)構(gòu)域的核酸序列，通過把它們插入具有編碼人類抗體CH和人類抗體CL的基因 的動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體構(gòu)建人類嵌合抗體表達(dá)載體，以及通過引入動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)該表達(dá)載 體生產(chǎn)本發(fā)明的所述人類嵌合抗體。人類嵌合抗體的CH結(jié)構(gòu)域可以是屬于人免疫球蛋白 的任何區(qū)域，但是IgG類的那些是合適的并且也可以使用屬于IgG類的任何一個(gè)亞類，例如 IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。同時(shí)，人類嵌合抗體的CL可以是屬于Ig的任何區(qū)域，并且能夠 使用k類或\類的那些。生產(chǎn)嵌合抗體的方法涉及為本領(lǐng)域所熟知的常規(guī)重組DNA和基 因轉(zhuǎn)染技術(shù)(參見Morrison SL. et al. (1984)和專利文件US5, 202，238 ；和US5，204，244)。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述抗體可以是人源化抗體?？梢酝ㄟ^獲得編碼⑶R 結(jié)構(gòu)域的核酸序列，通過把它們插入具有編碼與人類抗體一致的重鏈恒定區(qū)；和與人類抗 體一致的輕鏈恒定區(qū)的基因的動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體，以及通過引入動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)該表達(dá)載 體生產(chǎn)所述人源化抗體。人源化抗體表達(dá)載體可以是其中編碼抗體重鏈的基因和編碼抗體輕鏈的基因存 在于分離的載體中的類型或其中兩個(gè)基因存在于同一個(gè)載體中(串聯(lián)式)的類型。在構(gòu) 建人源化抗體表達(dá)載體的容易，引入動(dòng)物細(xì)胞的容易，和在動(dòng)物細(xì)胞中抗體H和L鏈表達(dá) 水平之間的平衡方面，串聯(lián)式人源化抗體表達(dá)載體更優(yōu)越(Shitara K et al. 1994)。串 聯(lián)式人源化抗體表達(dá)載體的實(shí)例包括？以^^乂93(1097/10354)、？￡￡18等?；诔Ｒ?guī)重 組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的生產(chǎn)人源化抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知(參見，例如Riechmarm L. et al. 1988 ；Neuberger MS. et al. 1985)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)，包括例 如 CDR 嫁接(EP 239，400 ；PCT 公開 W091/09967 ；U. S.專利號(hào) 5，225，539 ；5，530，101 和 5，585，089)、鑲蓋(veneering)或表面重建(resurfacing) (EP 592，106 ；EP 519，596 ； Padlan EA(1991) ；StudnickaGM et al. (1994) ；Roguska MA. et al. (1994))和鏈替換(美 國(guó)專利號(hào)5，565，332)。制備上述抗體的通用重組DNA技術(shù)也是已知的(參見歐洲專利申請(qǐng) EP 125023和國(guó)際專利申請(qǐng)W0 96/02576)。本發(fā)明包括，例如，能夠與HVEM或其部分結(jié)合的抗體片段，包括但不限于Fab (例 如通過木瓜蛋白酶消化)、Fab'(例如通過胃蛋白酶消化和部分還原)和F(ab' )2 (例如 通過胃蛋白酶消化)、facb (例如通過纖溶酶消化)、pFc'(例如通過胃蛋白酶或纖溶酶消 化)、Fd (例如通過胃蛋白酶消化，部分還原并重團(tuán)聚)、Fv或scFv (例如通過分子生物學(xué)技 術(shù))片段(參見，例如Colligan，Immunology，上文)。上述片段可以通過酶裂解、合成或重組技術(shù)生產(chǎn)，如本領(lǐng)域已知的和/或在此描 述的。也可以使用其中一個(gè)或多個(gè)終止密碼子引入天然終止位點(diǎn)上游的抗體基因以多種截 短形式生產(chǎn)抗體。多種抗體部分可以通過常規(guī)技術(shù)化學(xué)連接，或者使用基因工程技術(shù)作為 連續(xù)的蛋白質(zhì)制備。
可以通過用一種蛋白酶papaine處理與人類HVEM特異性反應(yīng)的抗體獲得本發(fā)明 的所述Fab片段。同時(shí)，F(xiàn)ab可以通過把編碼抗體Fab的DNA插入用于原核表達(dá)系統(tǒng)或真 核表達(dá)系統(tǒng)的載體，并把該載體引入原核生物或真核生物以表達(dá)Fab來生產(chǎn)?？梢酝ㄟ^用一種蛋白酶p印sin處理與人類HVEM特異性反應(yīng)的抗體獲得本發(fā)明的 所述F(ab' )2。同樣地，可以通過如下所述經(jīng)硫醚鍵或二硫鍵結(jié)合Fab'生產(chǎn)F(ab' )2?？梢酝ㄟ^用一種還原劑二硫蘇糖醇處理與HVEM特異性反應(yīng)的F (ab ‘ ) 2獲得所述 Fab'。同時(shí)，可以通過把編碼抗體Fab'片段的DNA插入用于原核生物的表達(dá)載體或用于 真核生物的表達(dá)載體，并把該載體引入原核生物或真核生物以實(shí)現(xiàn)其表達(dá)來生產(chǎn)Fab'。所述scFv片段可以通過獲得編碼如先前描述的VH和VL結(jié)構(gòu)域的cDNA，構(gòu)建編 碼scFv的DNA，把該DNA插入用于原核生物的表達(dá)載體或用于真核生物的表達(dá)載體，然后把 該表達(dá)載體引入原核生物或真核生物以表達(dá)scFv來生產(chǎn)。為了產(chǎn)生人源化scFv片段，可 以使用稱為CDR嫁接的公知技術(shù)，其涉及從供體scFv片段選擇互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，并且把 它們嫁接到已知三維結(jié)構(gòu)的人類scFv片段骨架上(參見，例如W098/45322 ；W0 87/02671 ； US5, 859，205 ；US5, 585，089 ；US4, 816，567 ；EP0173494)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體是一價(jià)的、二價(jià)的、多價(jià)的、單一特 異性的、雙特異性的或多特異性的。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，HVEM的抗體是結(jié)合片段 或偶聯(lián)物。例如本發(fā)明的抗體可以偶聯(lián)至發(fā)育抑制性試劑、細(xì)胞毒素試劑或前體藥物活化酶。對(duì)于效應(yīng)子作用可能還需要修飾本發(fā)明的抗體，例如以便增強(qiáng)抗體的抗原依賴的 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)和/或補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC)。這可以通過在抗體的 Fc區(qū)域引入一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代實(shí)現(xiàn)?？蛇x擇地或另外，可以把半胱氨酸殘基弓丨入Fc區(qū) 域，從而在該區(qū)域中允許鏈間二硫鍵形成。由此產(chǎn)生的同二聚抗體可能具有改進(jìn)的內(nèi)在化 能力和/或增加的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺死和/或抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC) (Caron PC. et al. 1992 ；和 Shopes B. 1992)本發(fā)明的抗體的另一種氨基酸修飾也許能夠用于改變抗體的原始糖基化模式?！案淖儭敝傅氖莿h除抗體中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)碳水化合物部分，和/或添加抗體中 不存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)?？贵w的糖基化通常是N-連接的?！癗-連接"指的是碳水化物部分連接到天冬酰 胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是除脯氨酸 之外的任何氨基酸，是碳水化物部分酶連接到天冬酰胺側(cè)鏈的識(shí)別序列。因此，在多肽中任 何一個(gè)該三肽序列的存在產(chǎn)生一個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)。通過改變氨基酸序列以致它包含一個(gè) 或多個(gè)上述三肽序列(對(duì)于N-連接糖基化位點(diǎn))方便地完成糖基化位點(diǎn)添加到抗體。另一種共價(jià)修飾涉及化學(xué)或酶偶聯(lián)苷到抗體。在不需要在具有N-或0-連接糖基 化的糖基化能力的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)抗體方面這些程序是有益的。取決于使用的偶聯(lián)方式， 糖可能附于(a)精氨酸和組氨酸，(b)自由羧基，(c)自由巰基例如半胱氨酸的那些，(d)自 由羥基例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的那些，(e)芳香族殘基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色 氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。例如，上述方法描述于W087/05330中。可以化學(xué)或酶完成存在于抗體上的任何碳水化合物部分的除去?；瘜W(xué)去糖基化需 要使抗體接觸化合物三氟甲磺酸，或相當(dāng)?shù)幕衔?。該處理產(chǎn)生除連接的糖(N-乙酰葡萄糖胺或N_乙酰半乳糖胺)之外大多數(shù)或全部糖的裂解，而保留抗體完整?；瘜W(xué)去糖基化 由Sojahr H.等人.(1987)和Edge，AS.等人.(1981)描述。可以通過使用如Thotakura， NR.等人.(1987)描述的多種內(nèi)和外糖苷酶實(shí)現(xiàn)抗體上碳水化合物部分的酶裂解?？贵w的另一種共價(jià)修飾包括以美國(guó)專利號(hào)4，640，835 ；4，496，689 ；4, 301, 144 ； 4，670，417 ；4, 791，192或4，179，337中闡述的方式把抗體連接到多種非蛋白質(zhì)聚合物的一 種，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。本發(fā)明進(jìn)一步的目的涉及治療血液惡性腫瘤和自身免疫疾病的方法，其包括給需 要的受試者服用治療有效量的上面定義的HVEM配體。在本發(fā)明的背景中，本文使用的術(shù)語"治療(treating)“或"治療 (treatment)“表示逆轉(zhuǎn)、減輕、抑制發(fā)展、或防止上述術(shù)語應(yīng)用的病癥或狀況、或上述病癥 或狀況的一種或多種癥狀。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"患者"或"需要其的患者"意指受或可能受血液惡性腫瘤或 自身免疫性疾病影響的人或非人哺乳動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的"治療有效量"的HVEM配體表示以適用于任何治療的合理效益/ 風(fēng)險(xiǎn)比治療所述血液惡性腫瘤或自身免疫性疾病的足夠量的HVEM配體。然而，可以了解本 發(fā)明的HVEM配體和組合物的每日使用總量由主治醫(yī)師在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)決定。對(duì) 于任何特定患者特定的治療有效劑量水平可能依賴多種因素，包括治療的病癥和該病癥的 嚴(yán)重度、使用的特定HVEM配體的活性；使用的特定組合物、年齡、體重、總體健康狀態(tài)、性別 和患者的日常飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、和使用的特異性抗體的排泄速率、治療的持續(xù)時(shí) 間；與使用的特定多肽聯(lián)合或同時(shí)使用的藥物、和在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域公知的類似因素。例如，在本 領(lǐng)域技術(shù)人員中公知以低于要求達(dá)到需要的治療效果的化合物劑量開始并逐漸增加劑量 直到達(dá)到預(yù)期效果。根據(jù)本發(fā)明的HVEM配體可以與治療上述病癥或狀況的任何其它治療策略(例如 外部放療、化療或細(xì)胞因子治療)聯(lián)合使用。藥物組合物本發(fā)明進(jìn)一步的目的涉及包括有效劑量HVEM配體的藥物組合物。本發(fā)明的上述任何治療劑可以與藥學(xué)上可接受的輔料，和任選持續(xù)釋放基質(zhì)(例 如可生物降解的聚合物)結(jié)合以形成治療組合物。‘‘藥物上〃或〃藥學(xué)上可接受的〃指的是當(dāng)給藥至哺乳動(dòng)物，視情況而定特別是 人時(shí)不產(chǎn)生不利的、過敏的或其它不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。藥學(xué)上可接受的載體或 輔料指的是無毒的固體、半固體或液體填料、稀釋劑、包封材料或任何類型的輔助性成分。藥物組合物的形式、給藥途徑、劑量和服法天然依賴患者要治療的狀況、疾病的嚴(yán) 重度、年齡、體重和性別等。本發(fā)明的藥物組合物可以配制為局部、口服、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下給藥寸。優(yōu)選地，藥物組合物包含藥學(xué)上適用于能夠注射的劑型的運(yùn)載工具。這些尤其可 以是等滲的、無菌的鹽溶液(磷酸一鈉或二鈉，氯化鈉、鉀、鈣或鎂等或上述鹽的混合物)， 或干燥的，特別是凍結(jié)干燥的組合物，取決于情況，當(dāng)其添加無菌水或生理鹽水時(shí)，允許可 注射的溶液的組成。
可以使用于給藥的劑量適應(yīng)作為多種參數(shù)的函數(shù)，尤其是作為使用的給藥方式、 有關(guān)的病狀、或者治療需要的持續(xù)時(shí)間的函數(shù)。為了制備藥物組合物，可以在藥學(xué)上可接受的載體或水介質(zhì)中溶解或分散有效量 的HVEM配體。適于可注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散體；包括芝麻油、花生油或水 性丙二醇的劑型；和用于臨時(shí)制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉劑。在任何場(chǎng)合，形式 必須是無菌的并且在易于可注射性存在的程度上必須是液體。在制造和存儲(chǔ)條件下它必須 是穩(wěn)定的并且必須保存以防微生物，例如細(xì)菌和真菌的污染作用。可以在水中與表面活性劑，例如羥丙纖維素適當(dāng)?shù)鼗旌现苽浠钚晕镔|(zhì)作為游離堿 或藥理學(xué)可接受的鹽的溶液。也可以在甘油、液體聚乙二醇，其混合物中和在油類中制備分 散體。根據(jù)普通的儲(chǔ)存和使用條件，這些制劑包括防腐劑以防止微生物的生長(zhǎng)。本發(fā)明的HVEM配體可以以中性或鹽形式配制為組合物。藥學(xué)上可接受的鹽包括 酸加成鹽(由蛋白質(zhì)的自由氨基形成的)和由無機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或由有機(jī)酸(諸 如醋酸、草酸、酒石酸、mandelic等)形成的鹽。由自由羧基形成的鹽也可以源自于無機(jī)堿 (例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機(jī)堿(諸如異丙胺、三甲 胺、組氨酸、普魯卡因等)。載體也可以是溶劑或分散介質(zhì)，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和 液體聚乙二醇等)、其合適的混合物、和蔬菜油類?？梢跃S持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，例如通過涂層 (例如卵磷脂)的使用，對(duì)于分散體通過需要的顆粒大小的維持和通過表面活性劑的使用。 微生物作用的預(yù)防可以通過多種抗細(xì)菌和抗真菌藥，例如對(duì)羥苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山 梨酸、硫柳汞等完成。在很多情況下，包括等滲試劑，例如糖或氯化鈉是優(yōu)越的?？勺⑸浣M 合物延長(zhǎng)的吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鋁和明膠完成。通過在適當(dāng)?shù)娜軇┲幸孕枰牧渴够钚晕镔|(zhì)根據(jù)需要與上面列舉的多種其它成 份混合，隨后過濾滅菌制備無菌的可注射溶液。通常，通過把多種滅菌活性成分摻入包含基 礎(chǔ)分散介質(zhì)和上面列舉的需要的其它成份的無菌運(yùn)載工具制備分散體。對(duì)于用于無菌可注 射溶液制備的無菌粉劑，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其產(chǎn)生來自其先前 無菌過濾的溶液的活性成分加上任何另外需要的成份的粉劑。還預(yù)期了用于直接注射的更或高濃度溶液的制備，其中設(shè)想DMS0作為溶劑的用 途以產(chǎn)生非?？焖俚拇┩?，遞送高濃度的活化劑至小的腫瘤區(qū)域。依據(jù)劑型，可以以與劑量劑型相適合的方式，以及以可以有效預(yù)防和/或治療的 量給藥。制劑以多種劑型，例如上述可注射溶液類型容易地給藥，但是也可以使用藥物釋放
膠囊等。對(duì)于水溶液中的腸胃外投藥，例如，溶液可以適當(dāng)?shù)鼐彌_并且液體稀釋劑首先用 足夠的鹽水或葡萄糖使其等滲。這些特定的水溶液尤其適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi) 給藥。在這方面，可以使用的無菌水介質(zhì)可以按照本公開為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。例如， 一劑量可以溶于1ml的等滲NaCl溶液和加入1000ml皮下輸液液體或在計(jì)劃的注入位點(diǎn)注 射，(參見例如，“Remington' s Pharmaceutical Sciences〃第 15 版，第 1035-1038 和 1570-1580頁)。取決于治療的受試者的狀況，劑量的一些變化必然發(fā)生。無論如何，決定 給藥的人對(duì)于個(gè)別受試者可以確定適當(dāng)?shù)膭┝俊?br> 15
除用于腸胃外投藥，例如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射配制的化合物之外，其它藥學(xué)上可接 受的形式包括，例如片劑或用于口服的其它固相；定時(shí)釋放膠囊；和當(dāng)前使用的任何其它 形式。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步包括治療性活化劑。本發(fā)明還涉及包括如上面定義的 HVEM配體和進(jìn)一步的治療性活化劑的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中所述治療性活化劑是抗癌劑。例如，所述抗癌劑包括但不限于 氟達(dá)拉濱(fludarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitabine)、氨甲喋呤、 紫杉醇、泰索帝(taxotere)、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、羥基脲、阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、異磷酰胺、亞 硝基脲、鉬復(fù)合物(例如順鉬、卡鉬和奧沙利鉬)、絲裂霉素、氮烯咪胺、procarbizine、依 托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、campathecin、博來霉素、阿霉素、伊達(dá)比星 (idarubicin)、柔紅霉素、放線菌素、普卡霉素(plicamycin)、米托蒽醌、L-天冬酰胺酶、 阿霉素、印imbicm、5-氟尿嘧啶、紫杉烷類(例如紫杉萜和紫杉醇)、亞葉酸、左旋咪唑、依 立替康(irinotecan)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、氮芥、BCNU、亞硝基脲(例如 carmustme和環(huán)己亞硝脲)、長(zhǎng)春花生物堿(例如長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春瑞濱)、imatimb 甲磺酸鹽、hexamethyhnelamine、托泊替康(topotecan)、激酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、ATP 酶抑制劑、酪氨酸磷酸化抑制劑(tyrphostin)、蛋白酶抑制劑、抑制劑herbimycm A、染料木 黃酮、癌基因抑活藥(erbstatin)和薰草菌素A。在一個(gè)實(shí)施方案中，其它抗癌劑可以選自 但不限于以下類別試劑的一種或組合烷化劑、植物生物堿、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、抗葉 酸鹽、嘧啶類似物、嘌呤類似物、DNA抗代謝物、紫杉烷類、鬼白霉素、激素治療、類視黃醇、光 敏劑或光促治療、血管發(fā)生抑制劑、抗有絲分裂劑、異戊二烯化抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、放 線菌素、博來霉素、蒽環(huán)類抗生素、MDR抑制劑和Ca2+ATP酶抑制劑。其它抗癌劑可以選自但不限于細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、發(fā)育抑制因子、激 素、可溶受體、誘餌受體、單克隆或多克隆抗體、單特異性、雙特異性或多特異性抗體、單體、 多體。其它抗癌劑可以選自但不限于生長(zhǎng)或造血因子，例如促紅細(xì)胞生成素和血小板生 成素，以及生長(zhǎng)因子模擬物。在目前用于治療癌癥的方法中進(jìn)一步的治療性活化劑可以是止吐藥。合 適的止吐藥包括但不限于metoclopromide、多潘立酮(domperidone)、丙氯拉嗪 (prochlorperazine)、異丙嗪(promethazine)、氯丙嗪(chlorpromazine)、曲美節(jié) 胺(trimethobenzamide)、昂丹司瓊(ondansetron)、格拉司瓊(granisetron)、輕 P秦(hydroxyzine) > acethylleucine monoemanolamine> P可 AL 必禾(alizapride) > P可 扎司瓊(azasetron)、苯喧胺(benzquinamide)、氛醇醋茶喊(bietanautine)、漠必利 (bromopride)、布克立嗪(buclizine)、氯波必禾丨J (clebopride)、賽克力嗪(cyclizine) > dunenhydrinate> ■^苯喊 F 丁酉享(diphenidol)、多拉司瓊(dolasetron)、meclizme、美 沙拉妥(methallatal)、美托哌丙嗪(metopimazine)、大麻隆(nabilone)、奧昔噴地 (oxypemdyl)、匹哌馬嗪(pipamazine)、東直菪堿(scopolamine)、舒必利(sulpiride)、四 氧大麻 ) (tetrahydrocannabinol) > thiefhylperazine、硫丙拉嚷(thioproperazine)禾口 托烷司瓊(tropisetron)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，止吐藥是格拉司瓊或昂丹司瓊。在另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步的治療性活化劑可以是造血集落刺激因子。合適的造血集落刺激因子包括但不限于非格司亭(filgrastim)、沙格司亭(sargramostim)、莫拉 司亭(molgramostim)禾口 epoietina 。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其它治療性活化劑可以是阿片樣或非阿片樣止痛藥。合適 的阿片樣止痛藥包括但不限于嗎啡、氫嗎啡酮、氫可酮、海洛因、羥嗎啡酮、羥考酮、美托酮、 阿撲嗎啡、nomioiphineetoipbine、丁丙諾啡、哌替啶、lopermide、阿尼利定(anileddine)、 伊索庚嗪(ethoh印tazine)、匹米諾定(piminidine)、倍他羅定、地芬諾酯、芬太尼 (fentanil)、舒芬太尼(sufentanil)、阿芬太尼(alfentanil)、瑞芬太尼(remifentanil)、 左啡諾(levorphanol)、右美沙芬(dextromethorphan)、安他唑啉(phenazodne)、 pemazocine、環(huán)佐辛(cyclazocine)、美沙酮、異美沙酮禾口達(dá)爾豐(propoxyphene)。合適的 非阿片樣止痛藥包括但不限于阿斯匹林、塞來考昔(celecoxib)、羅非考昔(rofecoxib)、 diclofenac、diflusinal、依托度酸(etodolac)、非諾洛芬、氟比洛芬(flurbiprofen)、布 洛芬、酮洛芬(ketoprofen)、消炎痛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯胺苯酸 (meclofenamate)、mefanamic 酸、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、口比羅昔康 (piroxicam)禾口舒林酸(sulindac)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)一步的治療性活化劑可以是抗焦慮藥。合適的抗焦 慮藥包括但不限于丁螺環(huán)酮和苯二氮，例如安定、氯羥去甲安定、去甲羥安定、氯氮卓鹽 (chloraz印ate)、氯硝安定、氯氮卓和阿普唑侖。篩選方法可以通過任何本領(lǐng)域公知的篩選方法選擇在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘 導(dǎo)凋亡的LIGHT片段、抗HVEM抗體或其與表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞(尤其是慢性淋巴細(xì) 胞性白血病B細(xì)胞)結(jié)合并在其中誘導(dǎo)凋亡的片段。例如，用于在表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞中(尤其是在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì) 胞中)誘導(dǎo)凋亡的HVEM配體的體外篩選方法可以包括以下步驟(a)把LIGHT片段、抗HVEM抗體或其片段加到表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞(例如慢 性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞)；(b)選擇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的片段或抗體?？梢匀鐚?shí)驗(yàn)部分公開的，或通過為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何其它方法測(cè)定 LIGHT片段或抗HVEM抗體在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的能力。本發(fā)明將通過以下實(shí)施例、附圖
和表格進(jìn)一步說明。附1 在造血惡性腫瘤上HVEM和LTR的表達(dá)(A)通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)控在慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL) 和急性髓細(xì)胞性白血病(AML)上HVEM和LT 0 R的表面表達(dá)。代表的是9個(gè)CLL病人中的 2個(gè)，2個(gè)MCL病人中的1個(gè)和2個(gè)AML病人中的1個(gè)。未填滿的直方圖代表用特異性不相 關(guān)的同種型匹配的對(duì)照mAb染色的細(xì)胞的熒光。填滿的直方圖代表用特異性HVEM-FITC或 LT 3 R-PE偶聯(lián)的mAb染色。(B)條形圖代表在9個(gè)B-CLL病人上進(jìn)行的HVEM和LT 0 R陽 性細(xì)胞的平均百分?jǐn)?shù)(減去相當(dāng)于同種型匹配的對(duì)照的背景之后)。誤差線表示平均值的 標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。圖2 通過QRT-PCR檢測(cè)的在B-CLL細(xì)胞中HVEM刺激之后322個(gè)基因中顯著誘導(dǎo)的基因在用或沒有用抗HVEM mAb處理24小時(shí)的B-CLL細(xì)胞中通過QRT-PCR定量RNA。 使用肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)源對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)化RNA表達(dá)，通過ACt = Ct目標(biāo)-Ct內(nèi)源對(duì)照計(jì)算 A Ct值。在用或沒有用抗HVEM mAb處理24小時(shí)的B-CLL細(xì)胞上清液中通過CBA或Elisa 確定細(xì)胞因子釋放(如材料和方法中描述的)。用Wilcoxon signed-ranktest (單尾)檢 驗(yàn)HVEM mAb處理的和非處理的條件之間的顯著差異，并且p值存在于該表格中(n代表病 人數(shù)量；ns 非顯著的，nt 沒有檢驗(yàn)的)。圖 3 LIGHT 和 HVEM mAb 誘導(dǎo) B-CLL 細(xì)胞死亡(A)以10個(gè)白血病細(xì)胞1個(gè)轉(zhuǎn)染子的比例把B-CLL細(xì)胞與⑶32 (對(duì)照)或LIGHT 轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞一起孵育。孵育24小時(shí)之后，如材料與方法中描述的用膜聯(lián)蛋白(Armexin) V/PI雙重染色法通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞死亡細(xì)胞誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白V+/PI_ (早期凋亡)和 膜聯(lián)蛋白V+/PI+(晚期凋亡/壞死)細(xì)胞。該圖顯示進(jìn)行的15個(gè)實(shí)驗(yàn)中的一個(gè)代表性的實(shí) 驗(yàn)。(B)把B-CLL細(xì)胞與CD32 (對(duì)照)或LIGHT轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞一起孵育，或者用30 u g/ml 抗HVEM mAb或10g/ml治療性抗CD20 (利妥昔單抗)mAb處理，并且用膜聯(lián)蛋白V/PI染色 分析。條形圖描述了觀察到的死亡細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)士SEM，其中對(duì)于HVEM mAb n = 25，對(duì) 于 LIGHT 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 n = 15，對(duì)于利妥昔單抗 n = 5。< 0. 05 ；**p < 0. 01 ；***p < 0. 001。 (C)與HVEM mAb刺激相比HVEM配體的效應(yīng)。B-CLL細(xì)胞與CD32 (對(duì)照)、⑶40L_、LIGHT_、 ⑶40L/LIGHT-、GpD或BTLA轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，并用膜聯(lián)蛋白V/PI染色分析。 用100%值作為使用HVEM mAb得到的細(xì)胞死亡水平與用HVEM配體轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞殺死的 B-CLL細(xì)胞水平相比。用⑶40L-L細(xì)胞作為陰性對(duì)照。對(duì)于6個(gè)不同的病人，誘導(dǎo)的凋亡 相對(duì)計(jì)算為(轉(zhuǎn)染的細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡百分?jǐn)?shù)+HVEM mAb的凋亡百分?jǐn)?shù)X 100) 士SEM。
< 0. 05。圖4 :HVEM mAb誘導(dǎo)半胱天冬酶(caspase) -3、_8和-9的活化(A)用或者不用20uM pan-半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK在37 °C下預(yù)處理B-CLL 細(xì)胞30分鐘，然后不處理或用抗HVEM mAb刺激。孵育24小時(shí)之后，收集細(xì)胞，透化處理并 且對(duì)活性半胱天冬酶-3染色。并行地，用膜聯(lián)蛋白V/PI雙重染色法分析細(xì)胞。數(shù)據(jù)代表 對(duì)于7個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)觀察到的活性半胱天冬酶-3陽性細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)士SEM(左邊)，和 死亡細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)士SEM(右邊)。、<0.05;、<0.01。(B)把來自兩個(gè)不同病人的 B-CLL細(xì)胞不處理或用抗HVEM mAb刺激。孵育24小時(shí)之后，收集細(xì)胞，并制備溶胞產(chǎn)物。 對(duì)從上述樣品制備的免疫印記膜B-CLL用探針檢測(cè)分裂的半胱天冬酶_3或0 -肌動(dòng)蛋白 (作為蛋白質(zhì)上樣對(duì)照)，指示于每一免疫印記的左邊。把未刺激的或用抗Fas mAb CH11 處理的Jurkat細(xì)胞用作陽性對(duì)照。對(duì)于19和17kDa條帶，刺激的條件對(duì)未刺激的條件的 比值分別為JA16(1. 35-++)，UPN10(0. 76-1. 57)和 UPN11 (1. 2-1. 73)。(C)把 B-CLL 細(xì)胞 不處理或用抗HVEM抗體刺激24小時(shí)。然后把細(xì)胞與特異性半胱天冬酶_8或-9熒光抑制 劑在指定時(shí)間點(diǎn)37°C孵育1小時(shí)，并且用流式細(xì)胞術(shù)分析。數(shù)據(jù)代表對(duì)于6個(gè)不同的病人 觀察到的活性半胱天冬酶-8或_9陽性細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)(在減去相當(dāng)于未處理?xiàng)l件的背景 之后)士 SEM。圖5 :HVEM mAb中斷線粒體膜電位和增加Bax表達(dá)(A)用或者不用20 ii M pan-半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK在37°C下預(yù)處理B-CLL
18細(xì)胞30min，然后不處理或用抗HVEM mAb刺激。孵育24小時(shí)后，收集細(xì)胞，與50nM Di0C2(3) 在37°C下孵育30min，并且用流式細(xì)胞術(shù)分析線粒體膜電位損失(A Vm)。數(shù)據(jù)代表對(duì)于6 個(gè)不同的病人Di0C2(3)綠色熒光陽性細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)士SEM，以對(duì)照條件中的％ Di0C2(3) 綠色熒光設(shè)為100%。*p<0. 05。陽性對(duì)照是去極化劑CCCP(4士 l%Di0C2(3)陽性細(xì)胞，數(shù) 據(jù)未顯示)。⑶不處理或用抗HVEM mAb刺激B-CLL細(xì)胞。孵育24小時(shí)后，收集細(xì)胞，透化 處理并用抗Bax或抗Bcl-2單克隆抗體染色，并且用流式細(xì)胞術(shù)分析。對(duì)于6個(gè)不同的病人 觀察到的結(jié)果以陽性細(xì)胞平均百分?jǐn)?shù)(減去相當(dāng)于同種型匹配的對(duì)照的背景之后)士SEM 表示于此。< 0. 05。圖6 :HVEM細(xì)胞死亡增加FADD表達(dá)并部分依賴TRAIL途徑(A)不處理或用抗HVEM mAb刺激來自兩個(gè)不同病人的B-CLL細(xì)胞。孵育24小時(shí) 后，收集細(xì)胞，并且制備蛋白質(zhì)溶胞產(chǎn)物。對(duì)于從上述樣品制備的免疫印記膜用探針檢測(cè) FADD或肌動(dòng)蛋白(作為蛋白質(zhì)上樣對(duì)照)，指示于每一免疫印記的左邊。用TF1紅白 血病細(xì)胞系作為陽性對(duì)照。對(duì)于27kDa條帶，刺激的條件對(duì)未刺激的條件的比值對(duì)于UPmO 和UPmi分別為2. 39和5。(B)用FasL或TRAIL瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Cos細(xì)胞24小時(shí)，然后在HVEM mAb存在或不存在的情況下加入B-CLL細(xì)胞。然后收集細(xì)胞并用膜聯(lián)蛋白V/PI染色用于流 式細(xì)胞術(shù)分析。對(duì)于3個(gè)不同的病人數(shù)據(jù)以((處理的凋亡百分?jǐn)?shù)_未處理細(xì)胞的凋亡百分 數(shù))+未處理細(xì)胞的凋亡百分?jǐn)?shù)X 100)呈現(xiàn)。(C)在100ng/ml封閉抗TRAIL mAb RIK-2 存在或不存在的情況下不處理或用HVEM mAb刺激B-CLL細(xì)胞24小時(shí)。然后用膜聯(lián)蛋白V/ PI雙重染色法通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。對(duì)于8個(gè)不同的病人數(shù)據(jù)代表死亡細(xì)胞平均百 分?jǐn)?shù)士SEM，以在HVEM mAb條件下誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡設(shè)為100%。然后在封閉條件下誘導(dǎo)的 細(xì)胞死亡相對(duì)計(jì)算為(在封閉條件下的凋亡百分?jǐn)?shù)+HVEM mAb的凋亡百分?jǐn)?shù)X 100)。
< 0. 01。圖7 :HVEM mAb和LIGHT作用機(jī)理示意8 在不同細(xì)胞類型上HVEM表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)分析圖9 正常B細(xì)胞對(duì)HVEM觸發(fā)的細(xì)胞死亡的敏感性分析表表1 在用HVEM mAb刺激的CLL中上調(diào)的趨化因子、細(xì)胞因子和受體基因。在RNA提取前不刺激或用抗HVEM mAb刺激B-CLL細(xì)胞。如材料與方法部分描述的 用qRT-PCR計(jì)算RNA含量。當(dāng)超過1. 5時(shí)RNA表達(dá)被認(rèn)為是陽性的。在4個(gè)不同的B-CLL 樣品上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在用HVEM mAb刺激的CLL中上調(diào)的趨化因子、細(xì)胞因子和受體基因
19
總共分析了 180個(gè)細(xì)胞因子、趨化因子、受體和粘連基因，用肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化 cDNA濃度。表2 :HVEM mAb克隆的特征概要針對(duì)若干方法鑒定了 14個(gè)mAb克隆。該列表表示在3個(gè)mAb克隆上產(chǎn)生的數(shù)據(jù) 亞組的概要。該表中的數(shù)據(jù)包括小鼠重鏈的Ig同種型、輕鏈類型、表示通過流式細(xì)胞術(shù)與 HVEM結(jié)合的50%飽和的EC50值、表位簇和mAb誘導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡的能力。該組mAb的表 位表示用HVEM突變體結(jié)合研究和用LIGHT、BTLA和HSV-gD競(jìng)爭(zhēng)研究確定的5個(gè)中的3個(gè)。 表3 :B細(xì)胞淋巴樣贅生物的WHO分類(Jaffe，E. S. et al. ,2004).前體B細(xì)胞贅生物前體B淋巴細(xì)胞性白血病/淋巴瘤成熟B細(xì)胞贅生物慢性淋巴細(xì)胞性白血病/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤變體具有類漿細(xì)胞分化或單克隆丙種球蛋白病B細(xì)胞前淋巴細(xì)胞性白血病淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤(Lymphoplasmacytic lymphoma)脾邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(士絨毛狀淋巴細(xì)胞)
毛細(xì)胞性白血病變體毛細(xì)胞變體漿細(xì)胞骨髓瘤/漿細(xì)胞瘤MALT型結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤結(jié)邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(士單核細(xì)胞樣B細(xì)胞)濾泡性淋巴瘤變體皮膚濾泡中心淋巴瘤(Cutaneous follicle center lymphoma)發(fā)散濾泡中心淋巴瘤(Diffuse follicle center lymphoma)外套細(xì)胞淋巴瘤變體母細(xì)胞樣(blastoid)發(fā)散大 B 細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma)亞型縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤血管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤原發(fā)性滲出性淋巴瘤形態(tài)學(xué)變體成中心細(xì)胞的成免疫細(xì)胞的退行發(fā)育大B細(xì)胞富T細(xì)胞/組織細(xì)胞成漿細(xì)胞的淋巴瘤樣肉芽腫型Burkitt氏淋巴瘤/Burkitt氏細(xì)胞白血病形態(tài)學(xué)變體典型的非典型的具有類漿細(xì)胞分化(AIDS伴隨的)亞型(臨床和遺傳)地方性散在性免疫缺陷伴隨的不確定惡性潛能的B細(xì)胞增殖淋巴瘤樣肉芽腫(1、2和3級(jí))移植后淋巴增生癥表4 :T細(xì)胞和NK細(xì)胞淋巴樣贅生物的WHO分類(Jaffe，E. S. etal.，2004).前體T細(xì)胞贅生物前體T成淋巴細(xì)胞性淋巴瘤/白血病成熟的(外周的)T細(xì)胞和NK細(xì)胞贅生物
T細(xì)胞前淋巴細(xì)胞性白血病形態(tài)學(xué)變體小細(xì)胞，腦回狀細(xì)胞T細(xì)胞粒狀淋巴細(xì)胞性白血病侵襲性NK細(xì)胞白血病Blastic ‘NK 細(xì)胞，白血病成體T細(xì)胞白血病/淋巴瘤(HTLV-1+)臨床變體急性的淋巴瘤的慢性的SmolderingHodgkin 樣的結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤，鼻型腸病型T細(xì)胞淋巴瘤肝脾性T細(xì)胞淋巴瘤皮下脂膜炎樣T細(xì)胞淋巴瘤蕈樣肉芽腫病/塞扎里綜合癥變體佩吉特樣網(wǎng)狀細(xì)胞增多癥MF伴隨的毛囊皮脂腺粘蛋白沉積癥肉芽腫性皮膚松弛癥原發(fā)性皮膚⑶30+T細(xì)胞淋巴增生性障礙變體淋巴瘤樣丘疹病(A和B型)原發(fā)性皮膚退行發(fā)育大細(xì)胞淋巴瘤邊緣損害(Borderline lesions)外周T細(xì)胞淋巴瘤，無其它特征形態(tài)學(xué)變體淋巴上皮樣(Lermert氏)，T區(qū)血管免疫母細(xì)胞 T 細(xì)胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-celllymphoma)間變性大細(xì)胞淋巴瘤，(ALK+/ALK-)形態(tài)學(xué)變體淋巴細(xì)胞與組織細(xì)胞的，小細(xì)胞
實(shí)施例實(shí)施例1LIGHT和抗HVEM抗體通過與HVEM的相互作用誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞 凋亡和趨化因子釋放摘要通過研究LIGHT在淋巴樣惡性腫瘤的總轉(zhuǎn)錄譜中的效應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)HVEM而不是 LT 3 R刺激誘導(dǎo)趨化因子基因(例如IL-8)的顯著增加和出乎意料的凋亡基因上調(diào)。該凋亡轉(zhuǎn)錄譜與殺死效應(yīng)有關(guān)，因?yàn)長(zhǎng)IGHT或抗HVEM mAb直到為大家所知共刺激T和B細(xì)胞活 化，明顯地誘導(dǎo)慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)細(xì)胞死亡。該細(xì)胞死亡與半胱天冬酶_3、-8 和_9活化，線粒體膜電位下降和前凋亡蛋白質(zhì)Bax上調(diào)有關(guān)。此外，HVEM刺激誘導(dǎo)死亡分 子TRAIL和Fas的上調(diào)，并且HVEM介導(dǎo)的凋亡機(jī)制似乎部分依賴TRAIL途徑。HVEM刺激誘 導(dǎo)B-CLL細(xì)胞凋亡并通過白血病細(xì)胞直接生產(chǎn)趨化因子參與免疫效應(yīng)器的補(bǔ)充。HVEM功能 主要依賴其一種配體LIGHT因?yàn)槠渌潴w如gD HSV1和BTLA大體上是無效的?？傊?，這些 結(jié)果顯示淋巴樣惡性腫瘤中的新的、至今仍未知的LIGHT或抗HVEM抗體通過HVEM的殺傷 效應(yīng)，其與趨化因子釋放結(jié)合，代表癌癥免疫治療的另一種工具。材料和方法細(xì)胞本研究由法國(guó)馬賽Paoli-Calmettes研究院的審查委員會(huì)批準(zhǔn)。告知根據(jù)赫爾 辛基宣言的許可之后，從未處理的根據(jù)臨床和免疫表型標(biāo)準(zhǔn)診斷為慢性淋巴細(xì)胞性白血病 (CLL)的病人獲得外周血樣。通過密度梯度離心(Lymphopr印)分離單核細(xì)胞并在包含10% 二甲亞砜(SIGMA)的胎牛血清(PAN Biotech)中能生存地冷凍。通過用分別編碼人CD40L、LIGHT、GpD 或 BTLA 的 pcDNA3. 1 載體(Invitrogen, Groningen, The Netherlands)電穿孑L 轉(zhuǎn)染(960 u F, 220V, BIO RAD Gene Pulser and Capacitance extender) LTK鼠成纖維細(xì)胞獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞L-CD40L、L-LIGHT、 L-⑶40L/LIGHT、L-GpD和L-BTLA。通過三輪FACS分選選擇由抗生素抗藥性選擇的穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染細(xì)胞。使用藻紅蛋白偶聯(lián)的單克隆抗體(mAb) (R&DSystems)通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證所關(guān)心 的分子的表達(dá)。CD32轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞是來自Schering-Plough (Dardilly，F(xiàn)rance)的友 好的禮物。通過分別轉(zhuǎn)染猴腎Cos細(xì)胞系產(chǎn)生瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的Cos-FasL細(xì)胞和Cos-TRAIL細(xì) 胞。B-CLL細(xì)胞與轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞或抗體共培養(yǎng)以10個(gè)B-CLL細(xì)胞1個(gè)轉(zhuǎn)染子的比例把B-CLL細(xì)胞與50格雷輻射的用人類 LIGHT、⑶40L、GpD或BTLA轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。還在24孔板中用30 u g/ml抗 HVEM單克隆抗體(mAb)或10 y g/ml治療性利妥昔單抗處理細(xì)胞24小時(shí)。在一些實(shí)驗(yàn)中， 把B-CLL細(xì)胞首先與20 y M pan-半胱天冬酶抑制劑N-芐氧羰基-Val-Ala-Asp熒光酮 (Z-VAD-FMK) (BD Biosciences)，或與封閉抗 TRAIL mAb RIK-2 (BD Biosciences)預(yù)孵育。 然后，收集細(xì)胞，檢查成活力，并在使用前于新鮮培養(yǎng)基中重懸浮。細(xì)胞表面抗原的免疫熒光分析借助于FACSCanto 細(xì)胞計(jì)數(shù)器和 FACSDiva 軟件(BectonDickinson，Mountain View, CA)通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行B-CLL細(xì)胞的細(xì)胞表面分析。使用以下mAb于4°C免疫 染色B-CLL細(xì)胞30分鐘異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗CD19 (Beckman Coulter)、 FITC偶聯(lián)的抗HVEM(BD Biosciences)、藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)的抗LT 0 R(R&D)、FITC偶聯(lián) 的抗 Fas (CD95) (Beckman Coulter)、PE 偶聯(lián)的抗 TRAIL (BD Biosciences)、PE 偶聯(lián)的抗 FasL(Biolegend)、PE偶聯(lián)的抗DIM或PE偶聯(lián)的抗DR5 (R&D)。用FITC或PE標(biāo)記的同種型 匹配的Ig作為陰性對(duì)照。在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)加上2% FCS中洗滌2次后，通過流式 細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。膜聯(lián)蛋白V/PI染色
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刺激之后，通過膜聯(lián)蛋白V_Cy5 (BD Biosciences)和碘化丙錠(Propidium Iodide, PI)雙重染色法(BD Biosciences)分析細(xì)胞死亡。膜聯(lián)蛋白V與磷脂酰絲氨酸 特異性結(jié)合，其是在經(jīng)受凋亡的細(xì)胞表面上暴露出的一種磷脂。使用PI的雙重染色能夠 鑒定還沒有喪失膜完整性的早期凋亡細(xì)胞。簡(jiǎn)要地，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)1%FCS洗滌 5 X105細(xì)胞一次并于室溫下暗處在具有5 yl膜聯(lián)蛋白V-Cy5的lOOyl IX結(jié)合緩沖液 (BD Biosciences)中重懸浮lOmin。然后加入200 yl IX結(jié)合緩沖液和3. 5 yl PI，并且 于RT在暗處孵育細(xì)胞5min。然后在FACSCanto細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Becton-Dickinson)上分析細(xì) 胞。使用FACSDiva軟件(Becton-Dickinson)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以膜聯(lián)蛋白V和PI雙重陽 性細(xì)胞測(cè)定死亡細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)確定半胱天冬酶、Bax和Bcl_2活性使用以下細(xì)胞滲透性熒光素化半胱天冬酶抑制劑在不同的時(shí)期測(cè)定半胱天冬酶8 和半胱天冬酶9的活性FAM-LETD-FMK (半胱天冬酶-8抑制劑)和FAM-LEHD-FMK (半胱天 冬酶_9抑制劑)(CaspGLOW試劑盒，Biovision)。于37°C在暗處染色細(xì)胞1小時(shí)，然后洗 滌，在0. 5mL緩沖液中重懸浮，并立即在FACSCanto細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Becton-Dickinson)上通 過流式細(xì)胞術(shù)分析。為了檢測(cè)活化的胞內(nèi)半胱天冬酶-3、Bcl-2和Bax，使用cytofix/cytoperm緩沖 液(BD Biosciences)透化處理細(xì)胞，并使用PE偶聯(lián)的抗活性半胱天冬酶3單克隆抗體(BD Biosciences)、抗 Bax 單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)或抗 Bcl2 單克隆抗 體(BDBiosciences)染色，然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析。確定線粒體膜電位(A Vm)使用陽離子青色素染料Di0C2(3)測(cè)定線粒體膜電位的改變。刺激后，洗滌 B-CLL細(xì)胞，用lml PBS重懸浮，用5iU 10 u M Di0C2 (3)溶液補(bǔ)充，于37°C在暗處孵育 30min (Molecular Probes)。再次洗滌細(xì)胞，用500 yl PBS重懸浮并通過流式細(xì)胞術(shù)分析。 當(dāng)細(xì)胞經(jīng)受凋亡時(shí)Di0C2 (3)熒光減少。陽性對(duì)照是CCCP。細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生刺激24小時(shí)后收獲上清液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)小珠陣列(CytometricBead Array, CBA)人類趨化因子試劑盒(BD Biosciences)測(cè)定細(xì)胞因子，如制造商描述的，其是允許在 相同的樣品中定量檢測(cè)若干細(xì)胞因子(IL-8/CXCL8、RANTES/CCL5、MIG/CXCL9、MCP-l/CCL2、 IP-10/CXCL10)的多路免疫測(cè)定。還遵循制造商描述的流程使用免疫酶測(cè)定定量IL-8，具 有3. 5pg/ml的靈敏度(R&D系統(tǒng))。蛋白質(zhì)印跡分析把來自CLL病人的B細(xì)胞(107細(xì)胞/樣品)與或不與抗HVEMmAb孵育24小時(shí)。 為了制備細(xì)胞溶胞產(chǎn)物，于4°C通過250g離心10分鐘收集細(xì)胞，在冰冷的磷酸緩沖鹽溶液 (PBS)中洗滌一次，然后在 NP-40 裂解緩沖液(50mM HEPES (pH 7.4)、150mM NaCl、lOmMNaF、 lOmM碘乙酰胺、NP-40、lmM苯甲基磺酰氟、lii g/ml蛋白酶抑制劑cocktail)中冰上裂 解15分鐘。于4°C 21000g離心lOmin清除溶胞產(chǎn)物中的不溶碎片，上清液存儲(chǔ)于_20°C。 在變性條件下SDS-PAGE分離后，把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到用tris緩沖液(TBS)中的5%奶4°C封閉 過夜的硝酸纖維素膜上，然后用抗裂解的半胱天冬酶3(CellSignaling)或抗FADD(我們實(shí) 驗(yàn)室產(chǎn)生的)抗體染色。然后用辣根過氧化酶(HRP)偶聯(lián)的抗小鼠或抗兔IgG，以及蛋白質(zhì)印跡化學(xué)發(fā)光試劑(West Pico, Pierce)使條帶顯影。于60°C用包含2% SDS的緩沖液洗 提30分鐘后在相同的印跡上確定肌動(dòng)蛋白表達(dá)。掃描(Powerlook 1000, Umax)每個(gè) 條帶并使用Phoretix ID Advanced軟件(Nonlinear Dynamics)定量。然后把數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成 倍數(shù)改變比，其通過用肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的刺激條件值除以用肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化的未 刺激細(xì)胞確定的值獲得。定量RT-PCR在RNA分離之前，針對(duì)被HVEM mAb殺傷的能力選擇全部細(xì)胞。使用Applied Biosystems 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行QRT-PCR分析。簡(jiǎn)要地，刺激后一天使用標(biāo) 準(zhǔn) TRIzol 試劑流程(Invitrogen LifeTechnologies)從 B-CLL 細(xì)胞分離總 RNA。使 用oligo(dT)15逆轉(zhuǎn)錄RNA。然后，使用下列兩種支持物。在第一種方法中，在光學(xué)平板 (Microamp Fast Optical 96well, Applied Biosystems)上點(diǎn)滴各自編碼粘附、遷移、細(xì) 胞因子或凋亡分子的87個(gè)基因靶。在各孔中以包含2XSYBR Green試劑、200nM引物和 0. 5 ill cDNA(相當(dāng)于10ng總RNA)的20 yl反應(yīng)中進(jìn)行QRT-PCR。熱循環(huán)條件為95°C 15s， 60°C 60s,40個(gè)循環(huán)。在第二種方法中，把各自編碼免疫分子的97個(gè)基因靶點(diǎn)滴進(jìn)TaqMan 低密度陣列(Immune Panel Microfluidic Card, Applied Biosystems)中。簡(jiǎn)要地，把 5ul cDNA(tB^TlOOng^RNA) % 100 u 1 2 X TaqMan universal Mix (Applied Biosystems) M 合并上樣進(jìn)一個(gè)樣品閥口。熱循環(huán)條件為97°C30s，59. 7°C60s，40個(gè)循環(huán)。在ABI Prism 7900HT掃描儀上記錄熒光捕獲，并使用序列檢測(cè)系統(tǒng)軟件2. 1 (Applied Biosystems)對(duì)各 測(cè)定計(jì)算Ct(閾循環(huán))。使用肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)源對(duì)照實(shí)施定量PCR測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化。然 后把數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成倍數(shù)改變比，其由公式2-Ct描述，其中Ct = Ct目標(biāo)-Ct內(nèi)源對(duì)照，而Ct =Ct刺激條件-ct未刺激條件。統(tǒng)計(jì)分析通過無參數(shù)的Wilcoxon signed-rank test比較結(jié)果，以評(píng)估在HVEM mAb處理的 條件和未處理的條件之間的任何統(tǒng)計(jì)顯著差異。當(dāng)p < 0. 05時(shí)差異被認(rèn)為是顯著的。P值 標(biāo)明于附圖的圖例中。結(jié)果造血惡性腫瘤上的HVEM和LT R表達(dá)為了研究LIGHT在造血惡性腫瘤中的作用，因此確定其兩種受體HVEM和LT 0 R的 表達(dá)水平是重要的。我們實(shí)驗(yàn)室Costello RT等先前的結(jié)果顯示HVEM在許多淋巴樣惡性 腫瘤中，尤其是在B起源的白血病上表達(dá)，在測(cè)試的所有慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)和所 有外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)中具有高強(qiáng)度，并往往在急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL)中觀察 到。如圖la所示，我們證實(shí)HVEM在測(cè)試的9個(gè)CLL和2個(gè)MCL中強(qiáng)烈表達(dá)，而在2個(gè)骨髓 起源的白血病(急性髓細(xì)胞性白血病，AML)中HVEM表達(dá)較弱。作為鮮明的對(duì)照，LT 3 R在 AML中表達(dá)，但是在MCL不存在而在CLL中稀少或低。如圖lb所示，在測(cè)試的9個(gè)CLL中， HVEM以一致地高水平表達(dá)，而LT 0 R微弱地或沒有表達(dá)。HVEM刺激誘導(dǎo)測(cè)試的322個(gè)基因中的12個(gè)趨化因子和凋亡基因過表達(dá)因此B-CLL是具有突出的HVEM表達(dá)和微弱或缺乏LT 0 R表達(dá)的研究模型。因此， 為了研究LIGHT在該淋巴樣惡性腫瘤上的影響，我們?cè)?4小時(shí)期間用抗HVEM單克隆抗體 (HVEM mAb)刺激B-CLL細(xì)胞RNA制備之后，我們進(jìn)行了編碼趨化因子、趨化因子受體、細(xì)胞
25因子和在細(xì)胞的基本機(jī)制如粘附、遷移或凋亡中涉及的分子的322個(gè)基因表達(dá)的實(shí)時(shí)定量 PCR整體分析。如圖2所示，測(cè)試的這322個(gè)基因中，我們的結(jié)果顯示21個(gè)基因在所有測(cè)試 的CLL病人中均不表達(dá)，80個(gè)基因微弱地檢測(cè)到，而221個(gè)基因以正確的轉(zhuǎn)錄物水平表達(dá)。 所有這些基因都沒有用HVEM刺激修飾。實(shí)際上，測(cè)試的322個(gè)基因中，僅僅12個(gè)在HVEM刺 激之后顯著地過表達(dá)，暗示在B-CLL細(xì)胞上LIGHT的集中的轉(zhuǎn)錄譜。HVEM刺激上調(diào)3個(gè)編 碼趨化因子的基因的表達(dá)IL_8(白細(xì)胞介素-8)、IP10(IFN誘導(dǎo)蛋白10)和CCR4(趨化因 子(C-C基序)受體4)，各自對(duì)免疫效應(yīng)器的補(bǔ)充都是關(guān)鍵的。使用Wilcoxon signed-rank test, HVEM刺激后這些基因的增加是統(tǒng)計(jì)上顯著的(p值<0.01)。該原炎性譜不令人驚 訝因?yàn)镠VEM-LIGHT信號(hào)已經(jīng)在單核細(xì)胞性細(xì)胞系中與IL-8和TNF-a生產(chǎn)相關(guān)。為了完 整，我們還分析了該轉(zhuǎn)錄效應(yīng)是否與蛋白質(zhì)水平的趨化因子釋放有關(guān)。我們通過細(xì)胞計(jì)數(shù) 小珠陣列或Elisa測(cè)定了刺激的B-CLL細(xì)胞中趨化因子的生產(chǎn)，并且我們顯示HVEM誘導(dǎo) 了趨化因子IL-8在12個(gè)不同的病人中(p < 0. 001)從3到10倍，以及Rantes在9個(gè)病 人中(在活化上調(diào)節(jié)，正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌)(p< 0.01)的較大的顯著釋放。沒有觀察 到IP10釋放的顯著增加。令人驚訝地，HVEM刺激后顯著誘導(dǎo)的9個(gè)其它基因全部相應(yīng)于 編碼凋亡蛋白質(zhì)的基因，他們中的大多數(shù)是原凋亡蛋白質(zhì)Bcl-XS、Bid、FasL, p < 0. 01 ； BNIP3、CARD11、細(xì)胞色素C、p53，p < 0. 05 ；以及一些屬于抗凋亡亞類的其它蛋白質(zhì)BIRC4 和IEX-1，p < 0. 05。已經(jīng)描述了 LIGHT在體外誘導(dǎo)腺癌的凋亡，但是這是由于其與LT 3 R 相互作用，并且該原凋亡效應(yīng)需要IFN-Y的存在。LIGHT和抗HVEM mAb誘導(dǎo)B-CLL細(xì)胞死亡我們?cè)O(shè)法確定該凋亡轉(zhuǎn)錄譜是否與在體外功能相關(guān)連。首先，把B-CLL細(xì)胞與 CD32或LIGHT轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)，然后通過膜聯(lián)蛋白V/PI雙重染色法測(cè)定凋 亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。凋亡細(xì)胞包括膜聯(lián)蛋白V+/PI-(早期凋亡)和膜聯(lián)蛋白V+/PI+(晚期凋亡 /壞死)群。我們發(fā)現(xiàn)在該典型實(shí)驗(yàn)中與CD32對(duì)照條件的8% (自發(fā)的細(xì)胞死亡)相比， 用LIGHT刺激有效地誘導(dǎo)41 %的B-CLL細(xì)胞細(xì)胞死亡。這些結(jié)果在15個(gè)B-CLL樣品中再 現(xiàn)。然后，我們?cè)?4小時(shí)期間用HVEMmAb刺激白血病細(xì)胞。我們先前已經(jīng)顯示該抗體封閉 HVEM及其配體LIGHT之間的相互作用(數(shù)據(jù)未顯示)。圖3b顯示LIGHT和抗HVEM mAb都 能夠誘導(dǎo)CLL細(xì)胞死亡，與⑶32對(duì)照條件下的22 士 2 %相比分別具有42 士 3 %和52 士 3 %死 亡細(xì)胞，相當(dāng)于統(tǒng)計(jì)上高度顯著的(p< 0.001) 1.9和2. 4倍增加。因此，在CLL上由LIGHT 或HVEM觸發(fā)引起的凋亡轉(zhuǎn)錄譜與體外死亡誘導(dǎo)功能有關(guān)。盡管描述了 LIGHT的原凋亡效 應(yīng)在腺癌中由LT0R介導(dǎo)，在我們的研究中該效應(yīng)應(yīng)歸于"共刺激"分子HVEM。HVEM的一 個(gè)作用進(jìn)一步由另一個(gè)LT0R配體rhLT工2的無能推斷，是誘導(dǎo)CLL細(xì)胞死亡。作為HVEM 介入的進(jìn)一步確證的證據(jù)，不表達(dá)LT 0 R的B-CLL細(xì)胞(圖la)仍然被抗HVEM mAb殺傷。 此外，另一種B細(xì)胞淋巴結(jié)病，MCL，其LT3 R表達(dá)也是陰性的，被LIGHT處理殺傷(數(shù)據(jù)未 顯示)。要指出，LIGHT或抗HVEM mAb誘導(dǎo)的CLL細(xì)胞死亡不需要用IFN-Y啟動(dòng)細(xì)胞(數(shù) 據(jù)未顯示)。相應(yīng)于化療、異源干細(xì)胞移植或用單克隆抗體的被動(dòng)免疫治療，用CLL對(duì)病人實(shí) 際處理的選擇是相對(duì)有限的。比較了抗HVEM mAb和利妥昔單抗誘導(dǎo)CLL細(xì)胞死亡的效果 (圖3b)。HVEM誘導(dǎo)的CLL細(xì)胞死亡與pan-B細(xì)胞治療性mAb利妥昔單抗相比是有利的，分 別具有52士3%和46. 2士6%的死亡細(xì)胞。
此外，近年鑒定了若干HVEM配體LIGHT，以及gpD和BTLA。我們把不同HVEM配體 的效應(yīng)與HVEM mAb的效力相比較，在24小時(shí)期間B-CLL細(xì)胞與CD32、LIGHT、GpD或BTLA 轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞共培養(yǎng)，然后用膜聯(lián)蛋白V/PI雙重染色法測(cè)定凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。用CD40L 轉(zhuǎn)染的L-細(xì)胞作為"無配體"陰性對(duì)照。把HVEM mAb細(xì)胞死亡設(shè)為100%。如圖3c所 示，與HVEM mAb相比，L-LIGHT細(xì)胞具有更顯著接近的效應(yīng)(70士 15%，p < 0. 05)，L-GpD 細(xì)胞具有弱的效應(yīng)(41 士 6%of HVEM mAb，p<0. 05)，而L-BTLA細(xì)胞相比HVEMmAb沒有顯 著的效應(yīng)(32士 10% )。用作陰性對(duì)照的L-⑶40L在B-CLL細(xì)胞死亡上沒有效應(yīng)(HVEM mAb 的24士9% )。我們還測(cè)試了 L-⑶40L/LIGHT因?yàn)槲覀兿惹耙呀?jīng)顯示這兩種分子對(duì)于B淋 巴細(xì)胞增殖協(xié)同作用。這里，L-⑶40L/LIGHT細(xì)胞不影響B(tài)-CLL細(xì)胞的L-LIGHT殺傷，因此 ⑶40L和LIGHT在細(xì)胞死亡上似乎沒有協(xié)同作用。HVEM介導(dǎo)的凋亡涉及半胱天冬酶_3、_8和_9活化已經(jīng)描述了由TNFR家族成員(例如Fas、TNFRl以及TRAIL受體DR4和DR5)誘導(dǎo) 的凋亡依賴胞質(zhì)內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域的存在。然而在HVEM中不存在死亡結(jié)構(gòu)域。為了確定HVEM 介導(dǎo)的凋亡機(jī)制，我們首先分析了半胱天冬酶活化。通過胞質(zhì)內(nèi)染色，我們?cè)趫D4a中顯示 用抗HVEM mAb刺激B-CLL細(xì)胞產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的半胱天冬酶-3活化(HVEM mAb條件的 16. 5士2%對(duì)對(duì)照條件的5. 2士 l%，p < 0. 01)。該觀察結(jié)果被蛋白質(zhì)印跡法分析證實(shí)，具有 19和17kDa活化形式的增加(圖4b)。圖4a還顯示HVEM mAb誘導(dǎo)的半胱天冬酶_3活化被 pan-半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理完全撤銷(4士 1 %陽性細(xì)胞，左側(cè)畫面)。相反， 用Z-VAD-FMK預(yù)處理僅僅部分封閉HVEM刺激后觀察到的膜聯(lián)蛋白V/PI染色(分別38 士 4 % 和45士5%細(xì)胞死亡，右側(cè)畫面)。此外，我們用流式細(xì)胞術(shù)(圖3c)分析了效應(yīng)器半胱天 冬酶8和9的活化。半胱天冬酶_8和半胱天冬酶-9都響應(yīng)抗HVEM mAb的CLL細(xì)胞處理 而被活化。有趣地，半胱天冬酶_8和半胱天冬酶-9以相似的動(dòng)力學(xué)被活化，對(duì)于半胱天冬 酶-8 為 0士 1. 5% (t = 3h)、5. 4士2. 5% (t = 6h)、16士3. 2% (t = 12h)、24. 8士3. 1 (t = 24h)，而對(duì)于半胱天冬酶-9 為 0. 88士2. 1% (t = 3h)、4. 7士2. 6% (t = 6h)、18. 4士4. 1% (t = 12h)、31. 4 士 5. 1 (t = 24h)。HVEM介導(dǎo)的凋亡中斷線粒體膜電位(A Vm)并增加Bax表達(dá)線粒體膜去極化是凋亡機(jī)制“內(nèi)在”途徑的一部分。圖5a顯示用抗HVEM mAb處 理B-CLL細(xì)胞產(chǎn)生線粒體膜電位損失，通過Di0C2(3)綠色熒光的顯著減少評(píng)價(jià)(在活化的 細(xì)胞中為70士8%，靜止細(xì)胞設(shè)為100%，p < 0. 05)有趣地，HVEM介導(dǎo)的線粒體去極化不 被pan-半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK抑制(71 士5% Di0C2 (3)陽性細(xì)胞)，暗示該步驟不 依賴半胱天冬酶活化。Bax和Bcl_2之間的平衡對(duì)于線粒體活性的維持是重要的。Bax原凋亡效應(yīng)被 Bcl-2的抗凋亡功能反作用。使用流式細(xì)胞術(shù)分析，我們顯示在靜止?fàn)顟B(tài)，Bcl-2在B-CLL 細(xì)胞中如先前的研究描述的那樣高度表達(dá)。HVEM刺激不改變Bcl-2表達(dá)，但是相反，誘導(dǎo) Bax細(xì)胞溶質(zhì)水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加(圖5b)(在活化條件下39士4%陽性細(xì)胞對(duì)靜止 條件下22士2% )。該增加可能與上述線粒體膜去極化相關(guān)。HVEM細(xì)胞死亡增加FADD表達(dá)并部分依賴TRAIL途徑因?yàn)镠VEM缺乏死亡結(jié)構(gòu)域，在HVEM介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中涉及的途徑是不清楚的?；?于已知的凋亡機(jī)制，我們分析了 FADD的表達(dá)，其是在Fas和TNFR介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中涉及的主要銜接分子。有趣地，用抗HVEM mAb處理B-CLL細(xì)胞引起通過蛋白質(zhì)印跡法分析的FADD 表達(dá)的較大增加(圖6)。對(duì)于出現(xiàn)的兩個(gè)病人該刺激引起27kDa條帶重要的倍增誘導(dǎo)(對(duì) 于upmo為2. 39而對(duì)于UPmi為5)。然后我們檢查了 HVEM連接反應(yīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是否可以通過其它TNF受體或配 體活化迂回。我們分析了在HVEM刺激前后B-CLL細(xì)胞的死亡受體及其配體(Fas和FasL， DR4-DR5和TRAIL)的表達(dá)(圖6b)。在刺激之前各樣品(n = 5)上的各分子的表達(dá)水平可 以忽略。HVEM刺激后DR4、DR5和FasL的表達(dá)不改變。相反，HVEM連接反應(yīng)誘導(dǎo)TRAIL表 達(dá)的顯著增加(P<0. 05)，處理后預(yù)處理平均MFI值179 士 58至375 士81 ；而沒有Fas的顯 著增加，預(yù)處理平均MFI70士22至104士24。要指出，在我們通過QRT-PCR測(cè)試的322個(gè)基 因中TRAIL mRNA出現(xiàn)并且盡管TRAIL基因在CLL中表達(dá)，它在HVEM刺激之后不被修飾，暗 示轉(zhuǎn)錄后的修飾。為了論述HVEM細(xì)胞死亡是否可能受FasL或TRAIL的影響，我們從表達(dá)FasL、 TRAIL或FasL和TRAIL兩者的Cos細(xì)胞生成了人造細(xì)胞毒素效應(yīng)細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù) 驗(yàn)證瞬時(shí)轉(zhuǎn)染之后FasL和TRAIL兩者的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。此外，檢查轉(zhuǎn)染的效應(yīng)細(xì)胞 誘導(dǎo)表達(dá)Fas和DR5兩者的Jurkat T細(xì)胞凋亡的能力。我們把每種Cos效應(yīng)細(xì)胞群在存 在或沒有HVEM mAb的情況下與B-CLL細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)。我們發(fā)現(xiàn)在24小時(shí)的共培養(yǎng) 中，與對(duì)照條件相比，Cos-FasL、Cos-TRAIL、Cos-FasL/TRAIL 分別誘導(dǎo) 47 士 10 %、25 士 7 %、 45士 17%的B-CLL細(xì)胞凋亡。HVEM mAb與Cos-FasL效應(yīng)細(xì)胞聯(lián)合誘導(dǎo)的B-CLL細(xì)胞殺傷 似乎比單獨(dú)用HVEM mAb觀察到的高(分別為80士20%和55士5% )。相反，加入HVEM mAb 的Cos-TRAIL效應(yīng)細(xì)胞不比單獨(dú)的HVEM mAb誘導(dǎo)更多的凋亡(分別是53士 16%與55士5% 相比)。這些數(shù)據(jù)暗示HVEM和FasL通過可能協(xié)同增強(qiáng)的不同途徑誘導(dǎo)B-CLL細(xì)胞殺傷，盡 管HVEM和TRAIL途徑可能涉及共有的介質(zhì)。此外，我們檢查了在HVEM誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡上封閉抗TRAILmAb的效應(yīng)。把B-CLL 細(xì)胞與該封閉mAb預(yù)孵育或不進(jìn)行預(yù)孵育，然后在24小時(shí)中用HVEM mAb處理并評(píng)估膜聯(lián) 蛋白V/PI染色。我們發(fā)現(xiàn)CLL的HVEM殺傷被抗TRAIL mAb顯著地封閉，對(duì)測(cè)試的7個(gè)病 人是部分地而對(duì)1個(gè)病人是完全地(在封閉條件下52士9%的死亡細(xì)胞對(duì)在HVEM mAb條件 下100% ；p < 0.01),暗示HVEM細(xì)胞死亡途徑可能至少部分地涉及TRAIL活化。討論在本研究中我們強(qiáng)調(diào)HVEM和LIGHT在抗腫瘤反應(yīng)上的新作用。在本研究中我們研 究了 LIGHT在造血惡性腫瘤中的效應(yīng)并且考慮到我們?cè)贐淋巴細(xì)胞生理學(xué)中LIGHT的重要 性上先前的結(jié)果，我們決定集中于B-CLL。LIGHT受體的表面表達(dá)分析顯示在B-CLL細(xì)胞中 HVEM以高水平表達(dá)。作為鮮明的對(duì)照，LT0R表達(dá)是微弱的或稀少的；結(jié)果我們可以把CLL 作為具有突出的HVEM表達(dá)的模型。因此，為了研究LIGHT在該淋巴樣惡性腫瘤中的影響，我 們用抗HVEMmAb處理B-CLL細(xì)胞并且我們進(jìn)行了大組編碼趨化因子、細(xì)胞因子和在粘附、遷 移或凋亡中涉及的關(guān)鍵分子的基因的QRT-PCR整體表達(dá)分析。在測(cè)試的322個(gè)基因中，僅僅 12個(gè)在HVEM刺激之后顯著地過表達(dá)，暗示在B-CLL細(xì)胞上HVEM的集中的轉(zhuǎn)錄譜。HVEM連接 反應(yīng)上調(diào)3個(gè)編碼趨化因子的基因的表達(dá)IL-8 (白細(xì)胞介素-8)、IP10 (IFN誘導(dǎo)蛋白10) 和CCR4(趨化因子(C-C基序)受體4)，各自對(duì)免疫效應(yīng)器的補(bǔ)充都是關(guān)鍵的。IL-8是炎性 反應(yīng)的一種主要介質(zhì)，它起化學(xué)引誘物的作用，而且也是有效的生血管(aniwenic)因子；IPlO與單核細(xì)胞(monocytes)和T細(xì)胞(T cell)的化學(xué)引誘,T細(xì)胞(T cell)的促進(jìn)與 內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial)的粘附以及抗癌活性有牽連；而CCR4是在二級(jí)淋巴器官中產(chǎn)生的 TARC (胸腺和活化調(diào)節(jié)趨化因子)和MDC (巨噬細(xì)胞衍生的趨化因子)受體。我們通過測(cè)定 響應(yīng)HVEM的趨化因子產(chǎn)生完成了這些結(jié)果，并且我們證實(shí)HVEM誘導(dǎo)IL-8和Rantes (對(duì)T 細(xì)胞(T cell)、嗜酸件粒細(xì)胞(eosinophils)和嗜堿件粒細(xì)胞(basophils)趨化性的，并且 在補(bǔ)充白細(xì)胞(leukocytes)講入炎件位點(diǎn)中扮演積極作用)兩者的顯著釋放。IL_8的產(chǎn)牛 似乎是HVEM反應(yīng)中的關(guān)鍵元件，因?yàn)樗谌舾杉?xì)胞系中描述，包括單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì) 胞和這里在白血病細(xì)胞中。在分析對(duì)HVEM刺激的這個(gè)大的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前，考慮到LIGHT及 其受體HVEM在共刺激反應(yīng)中確定的功能，我們可以預(yù)期與免疫活化相關(guān)基因的上調(diào)。但是 令人驚訝地，HVEM刺激后顯著誘導(dǎo)的9個(gè)其它基因都相應(yīng)于編碼凋亡蛋白質(zhì)的基因，他們 中的大多數(shù)是原凋亡蛋白質(zhì)Bcl-XS、Bid、BNIP3，Bcl-2家族的所有成員，以及FasL、CARD 11、細(xì)胞色素c、p53 ；以及屬于抗凋亡亞類的一些其它蛋白質(zhì)BIRC4和IEX-1。這個(gè)清楚的 凋亡轉(zhuǎn)錄譜是出乎意外的因?yàn)镠VEM至今仍被描述為共刺激受體而LIGHT的原凋亡效應(yīng)已 知僅僅由LT β R介導(dǎo)。為了論述該凋亡轉(zhuǎn)錄譜是否與體外功能性效應(yīng)相關(guān)連，我們用LIGHT轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 或用HVEM mAb培養(yǎng)B-CLL細(xì)胞，兩者都有效地增加膜聯(lián)蛋白V+細(xì)胞。此外，在實(shí)驗(yàn)室中的 其它觀察結(jié)果證實(shí)B-CLL細(xì)胞上的LIGHT原凋亡效應(yīng)通過其與HVEM的相互作用介導(dǎo)，通過 以下證據(jù)證明1)另一個(gè)！ 2對(duì)誘導(dǎo)CLL細(xì)胞死亡無能，2)不表達(dá)LT β R 的B-CLL細(xì)胞仍然被抗HVEM mAb殺傷，以及3)另一種B細(xì)胞淋巴結(jié)病，外套細(xì)胞淋巴瘤， 其對(duì)LTiiR表達(dá)也是陰性的，被LIGHT處理殺傷(數(shù)據(jù)未顯示)。從來沒有描述過淋巴樣惡 性腫瘤上的這種HVEM直接殺傷效應(yīng)。HVEM屬于TNFR分子(例如CD40和CD30)亞類，其不包含死亡結(jié)構(gòu)域(DD)并且 主要在細(xì)胞存活和共刺激反應(yīng)中涉及。實(shí)際上，與凋亡有牽連的大部分TNFR家族成員，例 如Fas、DR4、DR5，通過它們胞質(zhì)內(nèi)的DD誘導(dǎo)半胱天冬酶信號(hào)。然而，現(xiàn)在似乎清楚了不包 含死亡結(jié)構(gòu)域的TNFR成員也可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。例如，CD27誘導(dǎo)伯基特氏淋巴瘤細(xì)胞系 的凋亡，CD30與胸腺負(fù)選擇的細(xì)胞死亡信號(hào)有關(guān)，CD40連接反應(yīng)引起間充質(zhì)細(xì)胞和上皮起 源的轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的凋亡性細(xì)胞死亡，而LIGHT在一些腺癌中通過與LT β R相互作用誘導(dǎo)細(xì) 胞死亡。我們的結(jié)果包括該亞類中的HVEM。不過，缺少死亡結(jié)構(gòu)域使了解與HVEM有牽連的 途徑復(fù)雜化。然后我們進(jìn)行了不同的分析以鑒定在CLL中通過HVEM誘導(dǎo)的死亡機(jī)制。已經(jīng)鑒定了兩種主要的凋亡途徑內(nèi)在和外在途徑，其可以通過前者中對(duì)線粒體 的顯著作用以及后者途徑中死亡受體和半胱天冬酶-8的活化來鑒別。我們發(fā)現(xiàn)HVEM刺激 誘導(dǎo)半胱天冬酶_3、-8和-9的活化。B-CLL細(xì)胞與pan-半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK的 預(yù)孵育完全撤銷了半胱天冬酶_3活化，而不是細(xì)胞死亡，暗示牽涉獨(dú)立于半胱天冬酶的機(jī) 制。此外，HVEM刺激減少線粒體膜電位并誘導(dǎo)原凋亡Bax蛋白質(zhì)表達(dá)的上調(diào)。相反，抗凋亡 Bcl-2蛋白質(zhì)未改變。線粒體活性已經(jīng)被證明是被這些Bcl-2家族成員之間的平衡嚴(yán)格控 制的。此外，膜電位的損失不被pan-半胱天冬酶抑制劑Z-VAD-FMK封閉，暗示該步驟不依 賴半胱天冬酶活化。Bax的上調(diào)可能與觀察到的線粒體電位損失有關(guān)并且這些結(jié)果共同暗 示內(nèi)在凋亡途徑的牽連。因此HVEM介導(dǎo)的凋亡顯然包含在死亡受體途徑(半胱天冬酶-8 活化)和線粒體途徑(線粒體膜電位減少和Bax上調(diào))兩者中。此外，因?yàn)榘腚滋於?8
29和半胱天冬酶_9在大約相同的時(shí)間活化，在經(jīng)HVEM刺激的B-CLL細(xì)胞中死亡受體途徑和 線粒體途徑也許是并行的途徑。總而言之，這些數(shù)據(jù)暗示HVEM誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡一方面涉及 一種凋亡機(jī)制中半胱天冬酶的活化；和另一方面一種獨(dú)立于半胱天冬酶的途徑。LIGHT的兩種受體顯然通過不同的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。當(dāng)與LIGHT結(jié)合時(shí)，LT β R 補(bǔ)充若干TNFR相關(guān)因子(TRAF)，其是觸發(fā)多重信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的偶聯(lián)適配器。進(jìn)一步的研究 已經(jīng)表明TRAF3偶聯(lián)主要在調(diào)節(jié)LT β R誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中涉及；而TRAF2和TRAF5締合在 NF-B的活化中起重要作用。通過LT β R的原凋亡特征不同于我們?cè)贖VEM上的觀察結(jié)果，因 為L(zhǎng)T β R細(xì)胞死亡不在ΗΤ29結(jié)腸癌細(xì)胞中引起半胱天冬酶活化。此外，甚至在MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞上觀察到廣泛的半胱天冬酶活化，LIGHT介導(dǎo)的凋亡似乎是半胱天冬酶獨(dú)立的。 在兩種情況下都觀察到減少的線粒體膜電位。LIGHT誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡需要被IFNy致 敏，其在我們?cè)贐-CLL細(xì)胞上進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中不是必須的，因此暗示對(duì)于兩種受體的原凋亡 途徑有不同的機(jī)制。值得注意的，HVEM誘導(dǎo)的CLL細(xì)胞死亡與pan-B細(xì)胞治療性mAb利妥昔單抗相比 較是有利的。因此HVEM可能增強(qiáng)治療劑，例如氟達(dá)拉濱的效力，如同它被證明對(duì)于利妥昔 單抗和阿侖單抗那樣。其它研究發(fā)現(xiàn)用CD40L預(yù)活化可能使B-CLL細(xì)胞對(duì)FasL和TRAIL介導(dǎo)的凋亡敏 感。此外，對(duì)于樹突細(xì)胞成熟、B淋巴細(xì)胞表面的LIGHT蛋白質(zhì)誘導(dǎo)或B細(xì)胞增殖已經(jīng)觀察 到⑶40L和LIGHT之間的協(xié)作。這些數(shù)據(jù)提示我們分析⑶40L是否可能增加或封閉HVEM 介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但是我們沒能檢測(cè)到CD40L預(yù)活化的任何效應(yīng)(數(shù)據(jù)未顯示)。有趣地， 這些觀察結(jié)果暗示活化的B-CLL存在于二級(jí)淋巴器官，其是活化的細(xì)胞，也可以被HVEM處 理殺傷。這里，我們的數(shù)據(jù)顯示LIGHT或抗HVEM抗體可以直接通過HVEM誘導(dǎo)B淋巴樣惡性 腫瘤的細(xì)胞死亡，部分通過凋亡途徑而部分通過壞死機(jī)制。這影響半胱天冬酶活化、線粒體 膜電位和原凋亡蛋白質(zhì)上調(diào)。我們的結(jié)果強(qiáng)烈暗示TRAIL介入HVEM誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在 HVEM新鑒定的作用之外，LIGHT也通過HVEM誘導(dǎo)白血病細(xì)胞直接釋放趨化因子。這后面的 事件將被期望在先天(NK細(xì)胞、單核細(xì)胞)和適應(yīng)性(T細(xì)胞)免疫系統(tǒng)的細(xì)胞補(bǔ)充中扮演 關(guān)鍵角色，其隨后可以被期望在B-CLL細(xì)胞上發(fā)揮另外的控制(cf.圖7)。LIGHT-HVEi^f 號(hào)代表癌癥治療的新治療靶?？扇艿腖IGHT或抗HVEM mAb呈現(xiàn)把表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì) 胞通過例如凋亡誘導(dǎo)機(jī)制的直接殺傷與免疫效應(yīng)細(xì)胞通過趨化因子產(chǎn)生的補(bǔ)充相結(jié)合的 吸引人的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例2抗HVEM mAb克隆的鑒定mAbs 通過IP注射人類HVEM-Ig融合蛋白免疫BALB/c小鼠，最后一次注射后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 程序把脾細(xì)胞與X63Ag8骨髓瘤細(xì)胞融合。通過人類HVEM細(xì)胞系的細(xì)胞表面染色篩選雜交 瘤上清液。針對(duì)若干方法鑒定了 14個(gè)mAb克隆，包括i)小鼠免疫球蛋白重和輕鏈類型的分 型，ii)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)合細(xì)胞表面HVEM并測(cè)定平均熒光強(qiáng)度(MFI)值、最大結(jié)合飽和度 和50%結(jié)合飽和度(EC50值)，iii)使用LIGHT、BTLA和HSV-gD的競(jìng)爭(zhēng)封閉研究，iv)通
30過把mAb結(jié)合至一組HVEM突變體的誘變分析，和ν) mAb誘導(dǎo)CLL細(xì)胞凋亡的能力?；诟?jìng) 爭(zhēng)性封閉和誘變實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，鑒定了 6個(gè)表位簇為表位I、II、III、IV、V和VI。表2中顯示 的數(shù)據(jù)是3種mAb的概要亞組。實(shí)施例3HVEM在造血惡性腫瘤中的表達(dá)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示HVEM如確定的在B細(xì)胞淋巴樣贅生物(參見圖8)和T細(xì)胞 淋巴樣贅生物、非Hodgkin淋巴瘤(NHL)、B-NHL、T_NHL、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、小淋 巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)、外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、NK細(xì)胞淋巴樣贅生物和骨髓細(xì)胞譜系贅生 物(數(shù)據(jù)未顯示)上表達(dá)。冷凍不同的白血病骨髓瘤和骨髓瘤樣本并用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)試HVEM的細(xì)胞表面表 達(dá)。數(shù)據(jù)表示為與陰性對(duì)照相比的倍數(shù)平均熒光強(qiáng)度。CLL相應(yīng)于慢性B細(xì)胞白血病，ALL 相應(yīng)于急性淋巴細(xì)胞性白血病，MM相應(yīng)于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，MCL相應(yīng)于外套細(xì)胞淋巴瘤， FL相應(yīng)于濾泡性淋巴瘤而發(fā)散LBCL相應(yīng)于發(fā)散大B細(xì)胞淋巴瘤。實(shí)施例4 HVEM觸發(fā)誘導(dǎo)B細(xì)胞死亡HVEM信號(hào)與多種B細(xì)胞血液惡性腫瘤的細(xì)胞死亡相聯(lián)系(cf.實(shí)施例3)。我們測(cè) 試了 HVEM刺激是否也可以誘導(dǎo)正常B細(xì)胞死亡。在聚蔗糖-泛景i鈉(Ficoll-Hypaque)梯度(Amersham Biosciences, Saclay, France)上分離來自健康供體的PBMC。遵循制造商的推薦使用MACS⑶19小珠分離試劑盒 (Miltenyi Biotec,Bergisch Gladbach,Germany)把 B 淋巴細(xì)胞分離為 CD19+PBMC 群。通 過流式細(xì)胞術(shù)分析檢查制劑純度，在所有實(shí)驗(yàn)中都> 98% (數(shù)據(jù)未顯示)。用30 μ g/ml 抗 HVEM 單克隆抗體(mAb) (SmithKline Beecham)處理 B 淋巴細(xì)胞 24小時(shí)或不處理。然后，收集細(xì)胞并且通過膜聯(lián)蛋白V_Cy5 (BD Biosciences)和碘化丙錠 (PI)雙重染色法(BDBiosciences)分析細(xì)胞死亡。簡(jiǎn)要地，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 1 % FCS洗滌5 X IO5細(xì)胞一次并且室溫下于暗處在具有5 μ 1膜聯(lián)蛋白V-Cy5的100 μ 11 X結(jié) 合緩沖液(BD Biosciences)中重懸浮10分鐘。然后加入200 μ IlX結(jié)合緩沖液和3. 5 μ 1 PI，于RT在暗處孵育細(xì)胞5min。然后在FACSCanto細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Becton Dickinson)上分 析細(xì)胞。使用FACS Diva軟件(Becton Dickinson)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。以膜聯(lián)蛋白V和PI雙 重陽性細(xì)胞測(cè)定死亡細(xì)胞。如圖9所示，正常B細(xì)胞對(duì)HVEM觸發(fā)敏感，其引起正常B細(xì)胞死亡。這個(gè)觀察結(jié)果是有趣的因?yàn)楝F(xiàn)在B細(xì)胞已知為自身免疫疾病(AID)治療的重 要靶，以⑶20mAb在例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的疾病中證明的治療應(yīng)用證明。有趣地，盡管 ⑶20mAb是B細(xì)胞死亡的弱誘導(dǎo)物，它們?nèi)匀灰呀?jīng)有效地用于治療自身免疫疾病。因此，我 們已經(jīng)在正常B細(xì)胞中鑒定的HVEM性質(zhì)使HVEM成為治療AID用途的吸引人的靶。因此， 選自LIGHT或在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的LIGHT片段、抗HVEM抗體及其 與HVEM結(jié)合的片段的HVEM配體可以用于治療自身免疫疾病。參考文獻(xiàn)Throughout this application,various references describe the state ofthe art to which this invention pertains. 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<120>治療血液惡性腫瘤和自身免疫疾病的HVEM配體
<130>BCT080098 QT
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1 <211>25 <212>PRT <213>Artificial
<220>
<223>epitope
<400>1 Cys Pro Lys 1
Leu Thr Gly
Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu
51015
Thr Val Cys Glu Pro Cys 202權(quán)利要求
一種用于治療用途的HVEM配體，其特征在于，所述HVEM配體選自LIGHT或作為抗HVEM抗體的LIGHT片斷組成的組，其中，所述片斷在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，且所述LIGHT的片段與HVEM結(jié)合。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的HVEM配體，其用于治療血液惡性腫瘤。
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的HVEM配體，其用于治療自身免疫性疾病。
4.HVEM配體用于制備治療血液惡性腫瘤或自身免疫性疾病的藥劑，其特征在于，所述HVEM配體選自L工GHT、作為抗HVEM抗體的L工GHT片段組成的組，其中，所述片斷在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡，且所述L工GHT片斷與HVEM結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HVEM配體或根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，血液惡性腫瘤選自B細(xì)胞淋巴樣贅生物、T細(xì)胞淋巴樣贅生物、非H。dgkin淋巴瘤(NHL)、B—NHL、T—NHL、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)、外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、NK細(xì)胞淋巴樣贅生物和骨髓樣細(xì)胞譜系贅生物組成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3和5中任一項(xiàng)所述的HVEM配體或權(quán)利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述HVEM配體是L工GHT或其片斷，其中，所述片斷在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的HVEM配體或用途，其特征在于，所述HVEM配體是可溶形式的L工GHT。
8.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3和5中任一項(xiàng)所述的HVEM配體或根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述HVEM配體是抗HVEM抗體或與HVEM結(jié)合的片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的HVEM配體或用途，其特征在于，所述抗HVEM抗體或所述L工GHT的片段通過凋亡誘導(dǎo)、抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和／或經(jīng)由細(xì)胞因子和／或趨化因子產(chǎn)生的免疫效應(yīng)器細(xì)胞的激活來誘導(dǎo)表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞死亡和／或消除。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的HVEM配體或用途，其特征在于，所述抗HVEM抗體或所述L工GHT的片段在惡性淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
11.根據(jù)權(quán)利要求lo所述的HVEM配體或用途，其特征在于，所述惡性淋巴細(xì)胞是慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任一項(xiàng)所述的HVEM配體或用途，其特征在于，所述HVEM抗體是識(shí)別選自組工、II、II工、IV、V或V工的表位的抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求8至12中任一項(xiàng)所述的HVEM配體或用途，其特征在于，所述HVEM抗體是單克隆抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述HVEM配體或用途，其特征在于，所述單克隆抗體獲得自保藏在C。LLECT工。N NAT工。NALE DE CULTURES DEM工CR。。RGAN工SMES(CNCM)、選臼CNCM 工一3752、CNCM I一3753和CNCMI一3754組成的組的雜交瘤。
15.一種適于獲得抗HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，所述抗HVEM單克隆抗體通過凋亡誘導(dǎo)、抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和／或經(jīng)由細(xì)胞因子和／或趨化因子產(chǎn)生的免疫效應(yīng)器細(xì)胞激活來誘導(dǎo)表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞死亡和／或消除。
16.一種適于獲得抗HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，所述抗HVEM單克隆抗體誘導(dǎo)表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞凋亡。
17.—種適于獲得抗HVEM單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，所述抗HVEM單克隆抗體在慢性 淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
18.根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的雜交瘤細(xì)胞系，其特征在于，所述抗HVEM單 克隆抗體識(shí)別選自組I、II、III、IV、V或VI的表位。
19.一種選自CNCM 1-3752、CNCM 1-3753和CNCM 1-3754組成的組的雜交瘤細(xì)胞系。
20.一種抗HVEM抗體或與HVEM結(jié)合的LIGHT的片段，其特征在于，所述抗體或所述 LIGHT的片段通過凋亡誘導(dǎo)、抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和/或經(jīng)由 細(xì)胞因子和/或趨化因子產(chǎn)生的免疫效應(yīng)器細(xì)胞的激活來誘導(dǎo)表達(dá)HVEM的惡性淋巴細(xì)胞 死亡和/或消除。
21.一種抗HVEM抗體或與HVEM結(jié)合的LIGHT的片段，其特征在于，所述抗體或所述 LIGHT的片段在惡性淋巴細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
22.—種抗HVEM抗體或與HVEM結(jié)合的LIGHT的片段，其特征在于，所述抗體或所述 LIGHT的片段在慢性淋巴細(xì)胞性白血病B細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡。
23.根據(jù)權(quán)利要求20至22中任一項(xiàng)所述的抗HVEM抗體或所述LIGHT的片段，其特征 在于，所述抗體識(shí)別選自組I、II、III、IV、V或VI的表位。
24.根據(jù)權(quán)利要求20至23中任一項(xiàng)所述的抗HVEM抗體，其特征在于，所述抗體是單克 隆抗體。
25.一種單克隆抗體，其可從保藏在COLLECTION NAT IONALE DECULTURES DE MICR00RGANISMES (CNCM)、選自 CNCM 1-3752,CNCM 1-3753 和 CNCM 1-3754 組成的組的雜交瘤獲得。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療血液惡性腫瘤，尤其是慢性淋巴細(xì)胞性白血病，以及治療自身免疫性疾病的HVEM配體。
文檔編號(hào)A61P35/02GK101896198SQ200880101907
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2008年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者丹尼爾·奧麗芙, 克里斯廷·帕撒洛, 阿萊姆塞吉德·特恩 申請(qǐng)人:法國(guó)國(guó)家健康和醫(yī)學(xué)研究院;馬賽第二大學(xué)(地中海岸大學(xué))