專利名稱：：酶促?；椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及制備式I的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基?；颷(2Z，4Z，7E)-羧酸3，7-二甲基-6-羥基-9-[2′，2′，6′-三甲基-環(huán)己-6′-烯-1′-基]壬-2，4，7-三烯基酯]的新方法其中R表示C1-23烷基或C2-23鏈烯基(如下文更詳細(xì)的定義)，方法是通過式II的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇[(2Z，4Z，7E)-3，7-二甲基-9-[2′，2′，6′-三甲基-環(huán)己-6′-烯-1′-基]壬-2，4，7-三烯-1，6-二醇]的酶催化選擇性單?；饔?11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基?；锸侵苽鋵?duì)應(yīng)的維生素A酰化物的起始原料，即用已知方法通過水的解離及同時(shí)的順反異構(gòu)化作用來進(jìn)行反應(yīng)。利用常見的標(biāo)準(zhǔn)酯化方法，例如通過(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇乙酰化，除了得到所需的，尤為重要的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯外，還生成不同量的、式III的副產(chǎn)物(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-乙酸基-視黃基乙酸酯[(2Z，4Z，7E)-乙酸6-乙酸基-3，7-二甲基-9-[2′，2′，6′-三甲基-環(huán)己-6′-烯-1′-基]壬-2，4，7-三烯基酯]。式III的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-乙酸基-視黃基乙酸酯在催化脫水的條件下呈惰性，因此不僅在制備(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯(式I，其中R表示甲基)、而且在制備維生素A乙酸酯時(shí)，它的存在是挺討厭的。所以，從工業(yè)角度來看，不但選擇性單乙?；⒍彝ǔ５剡x擇性單?；絀I的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇是很有意義的。本發(fā)明的目的在于，提出通過(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇的酯化反應(yīng)而制備式I的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基酰化物的方法，它沒有已知方法的缺點(diǎn)(例如產(chǎn)生如式III的、不需要的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-乙酸基-視黃基乙酸酯)。為此有必要采用嚴(yán)格選擇性地進(jìn)行的、高產(chǎn)率的酶催化反應(yīng)，且酶甚至在低用量時(shí)也應(yīng)表現(xiàn)出催化活性、易于分離及可被重復(fù)使用數(shù)次。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，在脂酶(酶分類EC3.1.1.3)的存在下及在十分專一的預(yù)反應(yīng)與反應(yīng)條件下，通過進(jìn)行式II的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇的?；磻?yīng)實(shí)現(xiàn)了該目的。因此，本發(fā)明涉及前述式I的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基?；锏闹苽浞椒ǎ渲蠷表示C1-23的烷基或含1-3個(gè)雙鍵的C2-23的鏈烯基，該方法包括在?；瘎┐嬖谙碌挠袡C(jī)溶劑中、用以懸浮液形式存在的脂酶選擇性地單酰化前述式II的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇。在脂酶存在下，除仲羥基之外，伯羥基的選擇性酰化可從文獻(xiàn)得知。所以，例如按J.Org.Chem.55，2366-2369(1990)苯基取代的短鏈脂族二醇、通過與三氟乙基?；锘颦h(huán)狀酸酐的酯化而進(jìn)行的酰化作用，是利用從圓弧假單胞菌(Pseudomonascyclopium)分離的脂酶來實(shí)施的，其產(chǎn)率分別為83％和64％，未給出純度。TetrahedronAsymmetry4，757-760(1993)敘述了在固定化脂酶PS的存在下通過與乙酸乙烯酯的酯化反應(yīng)而進(jìn)行2-甲基-5-(4-甲氧基苯基)-戊烷-1，3-二醇的外消旋物拆開，單酰化產(chǎn)品的產(chǎn)率為66％，而其旋光純度為42％e.e.。Appl.Biochem.Biotechnol.11，401-407(1985)報(bào)道了用得自豬胰腺的脂酶將一系列1，2-和1，3-二醇(溶于乙基酰化物中)?；?，產(chǎn)率≤97％。按J.Chem.Soc.，Chem.Commun.，1989，1535-1536，用得自豬胰腺的脂酶將2-乙基-己烷-1，3-二醇?；?，產(chǎn)率為60％。TetrahedronLett.31，3405-3408(1990)，敘述了在得自豬胰腺的脂酶的存在下，用酸酐對(duì)脂族1，n-二醇的選擇性?；磻?yīng)，選擇性≤98％而產(chǎn)率≤95％。Ind.J.Chem.32，30-34(1993)敘述了用正癸酸及得自Chromobact-eriumviscosum的脂酶進(jìn)行1，5-己二醇的選擇性?；?98％的選擇性)。所有上述已知方法都有一定的缺點(diǎn)即所有的這些方法生產(chǎn)所需的產(chǎn)品，但選擇性以及純度和/或產(chǎn)率還有許多有待改進(jìn)之處。此外，這些文獻(xiàn)均未涉及所采用的脂酶的重復(fù)利用，即脂酶的穩(wěn)定性，更不用說底物的同時(shí)純化。如前所述，在酰化劑存在下的有機(jī)溶劑(優(yōu)選是幾乎無水的)中，用以懸浮液形式存在的脂酶實(shí)施式II的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇的酰化作用。適于本發(fā)明的目的的脂酶是酶分類EC3.1.1.3的那些酶，它們表現(xiàn)出良好的活性及選擇性，尤其是得自產(chǎn)堿菌(Alcaligenessp.)的脂酶PL，其固定化形式脂酶PLC及脂酶PLG，以及得自Candidacylindracea(又名皺落假絲酵母(Candidarugosa))(MeitoSangyo，Tokyo，Japan)的脂酶MY-30、得自米黑毛霉(Mucormiehei)(又名Rhizomucormiehei)(NovoNordisk，Bagsvaerd，Denmark)的Lipozyme1M-20、得自胎毛腐質(zhì)霉(Humicolalanuginosa)的脂酶CE-5及得自圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)的脂酶G(都得自AmanoPharmaceuticalCo.Ltd.，Nagoya，Japan)以及得自南極假絲酵母(Candidaantarctica)的ChirazymeL-2(BoehringerMannheimGmbH，Germany；formerlyNovozymSP435fromNovoNordisk)。脂酶PL、脂酶PLC、脂酶PLG、Lipozyme1M-20及ChriazymeL-2是優(yōu)選的，而脂酶PL、脂酶PLC、脂酶PLG及ChirazymeL-2是特別優(yōu)選的。“C1-23的烷基”或“含1～3個(gè)雙鍵的C2-23的鏈烯基”(R)應(yīng)理解為依碳原子數(shù)而定，不僅指直鏈結(jié)構(gòu)的、還可以是支鏈的烷基或鏈烯基。C1-23的烷基實(shí)例有甲基、乙基、丙基、戊基、庚基、十一烷基、十五烷基及十七烷基，而C2-23的鏈烯基有8-十七碳烯基及十七碳-8，11-二烯基。對(duì)應(yīng)的鏈烷酰基及鏈烯?；?RCO)分別有乙酰基、丙?；?、丁?；?、月桂?；⒓乎；⒐秕；?、十六烷酰、十八烷酰，以及油酰與亞油酰。最優(yōu)選地R是指甲基，此時(shí)按本發(fā)明的方法是酶催化的、選擇性單乙酰化。在間歇法中可商購的脂酶以粉狀、粒狀或微小的小珠狀形式存在，其用量達(dá)20wt％(wt./wt.基于(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇)，但脂酶的用量?jī)?yōu)選是約0.1wt.％～約10wt.％，特別是約1wt.％～5wt.％。適用于本發(fā)明的有機(jī)溶劑可以是含5-8個(gè)碳原子的脂肪烴，如乙烷和庚烷；含6-10個(gè)碳原子的脂環(huán)烴，如環(huán)己烷、甲基環(huán)己烷和萘烷；氯化脂肪烴，如二氯甲烷、氯仿和四氯化碳；硝基取代的脂肪烴如硝基甲烷；芳烴，如甲苯和二甲苯；脂族醚，如1，2-二甲氧基乙烷、乙醚、二異丙醚及叔丁基甲基醚；環(huán)醚，如四氫呋喃、甲基呋喃及1，4-二噁烷；脂族酯，如原甲酸三甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯及乙酸異丙烯酯；脂族酮，如丙酮；脂族腈，如乙腈；脂族胺，如三乙胺；脂族縮醛，如甲醛縮二甲醇；以及這些溶劑的混合物。優(yōu)選的有己烷、環(huán)己烷、二氯甲烷、四氯化碳、甲苯、二異丙醚、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、四氫呋喃、甲基呋喃及甲醛縮二甲醇，特別是二氯甲烷、二異丙醚、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、四氫呋喃、甲醛縮二甲醇，以及這些溶劑的混合物?？捎米黪；瘎┑挠懈鞣N常見的烷基?；锛版溝┗；?，如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸乙烯酯、乙酸烯丙酯、乙酸異丙烯酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯和丙酸乙烯酯以及長鏈脂肪酸的酯如月桂酸乙烯酯。優(yōu)選地，乙酸乙酯、乙酸丁酯或乙酸乙烯酯，尤其是乙酸乙烯酯將被用于乙?；饔?。制備丙酸酯(R＝乙基)時(shí)，丙酸乙烯酯是優(yōu)選的，而制備長鏈酰化物時(shí)，對(duì)應(yīng)的脂肪酸的乙烯酯也是優(yōu)選的。酰化劑的用量可以在1摩爾當(dāng)量到過量數(shù)倍之間，尤其是當(dāng)?；瘎┩瑫r(shí)用作溶劑時(shí)如用烷基或鏈烯基酰化物作?；瘎瑒t?；瘎┯昧恳^量。(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇的濃度適宜地為10％～50％，優(yōu)選是20～45％[以重量/體積(wt./vol.)表示]。離析物的溶解度通過溶劑或溶劑混合物和/或溫度的選擇來控制。所以，反應(yīng)溫度最好是在約10℃到反應(yīng)混合物的回流溫度之間，優(yōu)選是在室溫～約90℃之間，特別優(yōu)選是在室溫～約60℃之間。在間歇法中，(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇在反應(yīng)開始時(shí)不必是溶液形式的；在反應(yīng)開始時(shí)它倒是還可以懸浮液形式存在。為了改善對(duì)脂酶的可得到性及其重復(fù)使用性，可將它固定于各種載體材料上。可通過形成共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵而實(shí)現(xiàn)該固定化作用，優(yōu)選是非共價(jià)鍵地、通過簡(jiǎn)單地吸附于具有大的表面的適當(dāng)?shù)妮d體材料上。由于脂酶及載體材料都不溶于有機(jī)溶劑，所以反應(yīng)期間不發(fā)生可檢測(cè)出的解吸現(xiàn)象。合適的載體材料是多種通用的、價(jià)廉的助濾劑，吸附劑，離子交換劑及色譜原料如Florisil、硅藻土、皂土、纖維素、分子篩、Amberlite、Amberlyst、硅膠或氧化鋁等等，以及其它的具有大的表面積的廉價(jià)材料如砂、燒結(jié)玻璃或空心絲等等。硅藻土及海砂的利用是優(yōu)選的。此外，還可使用可商購的業(yè)已固定化的脂酶制劑，例如得自MeitoSangyo及BoehringerMannheimGmbH的脂酶制劑·脂酶PLC固定于硅藻土上的脂酶PL；·脂酶PLG固定于粒狀硅藻土上的脂酶PL；ChirazymeL-2(原名NovozymSP435)固定于大孔聚丙烯酸系物(polyacryl)上的得自南極假絲酵母的脂酶。需要的話，也可在“膽酸鹽”(“cholanicsalt”)存在下實(shí)施脂酶的固定化(共固定化作用)，通過該方法可以在某種程度上控制酶活性(活化劑)。適宜的膽酸鹽例如有膽酸鈉及脫氧膽酸鈉。為了排除其實(shí)從開始反應(yīng)時(shí)就可能出現(xiàn)的副反應(yīng)，利用脂酶的反應(yīng)適宜于在惰性氣氛如氮?dú)饣驓鍤庵?，且?yīng)避光及/或在自由基消除劑如氫醌或2，6-二(叔丁基)-對(duì)甲酚的存在下實(shí)施。間歇法中，使用一次后可以過濾出催化劑再用。反應(yīng)液中及酯酶中的水含量對(duì)脂酶的穩(wěn)定性及活性起重要作用。加入少量的水(＜反應(yīng)液的0.2％)對(duì)于脂酶的活性有正的影響；弱堿溶液如碳酸氫銨或氫氧化銨溶液，或有機(jī)堿如三乙胺或乙基二異丙胺，具有更佳效果。水也可以定期地加入或在平衡步驟的意義上加入。至于脂酶有效的再使用，對(duì)于本方法的經(jīng)濟(jì)性尤為重要；離析物的純度也是決定性因素早期的離析物特別是還含有重金屬，適當(dāng)?shù)丶兓x析物可顯著提高脂酶制劑的長期穩(wěn)定性?？稍诟鞣N助劑如硅藻土、硅膠、乙二胺四乙酸(EDTA)鹽及氧化鋁上過濾，而用pH值約為8的EDTA水溶液洗滌是簡(jiǎn)單而有效的純化方法，利用該方法特別是可降低離析物中重金屬的含量因而可提高脂酶制劑的功效。本發(fā)明的方法可用重復(fù)的間歇法或用連續(xù)法實(shí)施，即利用常見的反應(yīng)器如固體床反應(yīng)器、立式反應(yīng)器、直熱式反應(yīng)器、滾筒式反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器(有一假底)或淤漿反應(yīng)器來實(shí)施。前述的按本發(fā)明制得的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基?；?、優(yōu)選是乙酸酯在制備對(duì)應(yīng)的維生素A?；锘蚓S生素A乙酸酯方面的應(yīng)用，代表本發(fā)明的另一方面。下列通過(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇的酶催化、選擇性單?；饔弥苽涓鞣N(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃基酰化物的實(shí)施例闡述了本發(fā)明的方法有利的實(shí)施方案，但在任何意義上都不表示對(duì)本發(fā)明的限制。所有的溫度都以攝氏度表示。圖1表示實(shí)施例11的結(jié)果；圖2表示實(shí)施例12的結(jié)果；圖3表示實(shí)施例13的結(jié)果；圖4表示實(shí)施例14的結(jié)果；圖5表示實(shí)施例16的結(jié)果。實(shí)施例1將10.0g(32.8mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇及10mg2，6-二(叔丁基)-對(duì)甲酚(BHT)溶于30ml甲苯及5ml乙酸乙烯酯(54.1mmol)的混合液中。加入500mg脂酶PLC(MeitoSangyo)開始反應(yīng)，于室溫下用滾軸將該懸浮液緩慢地?cái)嚢?7小時(shí)。然后過濾出脂酶并用甲苯洗滌，將濾液蒸發(fā)。在高真空中干燥一天后得11.4g(33mmol)的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯，其產(chǎn)率為100.6％、純度＞99％[按超臨界流體色譜法(SFC)的面積百分?jǐn)?shù)計(jì)算]。實(shí)施例2將10.0g(32.8mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于6.8ml甲苯與3.2ml(34.6mmol)乙酸乙烯酯的混合液中。加入500mg脂酶PLC(MeitoSangyo)開始反應(yīng)，于室溫下將該反應(yīng)混合物緩慢地?cái)嚢?6小時(shí)。然后過濾出脂酶并用甲苯洗滌，將濾液蒸發(fā)濃縮。在高真空中干燥并攪拌一天后得11.23g(32.4mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯，其產(chǎn)率為98.8％、純度為97.2％(SFC面積百分?jǐn)?shù))。實(shí)施例3將20.0g(65.7mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇及20mgBHT溶于56ml甲苯、56ml叔丁基甲基醚(TBME)及7.5ml(81.2mmol)乙酸乙烯酯。加入1.0g脂酶PLC(MeitoSangyo)開始反應(yīng)并在40℃下將該懸浮液緩慢地?cái)嚢?6小時(shí)。然后過濾出脂酶并用甲苯洗滌，將濾液蒸發(fā)。在高真空中干燥一天后得23.1g(66.7mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯，其產(chǎn)率為101.5％、純度＞99％(SFC面積百分?jǐn)?shù))。實(shí)施例4A)固定于各種載體材料上將2.0ml的脂酶PL溶液(25mg/ml二次蒸餾水)加到2.5ml載體材料上并在室溫下將所得懸浮液小心地?cái)嚢?。將類似地潤濕的載體通過漸漸地、小心地提高真空度(起泡)而干燥。最后，在高真空中將該載體干燥2天并如下文所述應(yīng)用。B)固定于多孔玻璃珠上將2.0ml脂酶PL溶液(20mg/ml二次蒸餾水)加到2.0gSiranCarrierSikug041/02/120/A(得自SchottGlaswerke，Mainz，Germany的多孔燒結(jié)玻璃)上，然后按上述A)中的方法干燥所得懸浮液。將含1.0g(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇、以2∶2∶1混合的己烷、叔丁基甲基醚(TBME)及乙酸乙烯酯混合物的8ml等分試樣加入如上述制得的干脂酶制劑，然后在室溫下用滾軸將該反應(yīng)液緩慢地?cái)嚢?。?小時(shí)及27小時(shí)后取出25μl試樣進(jìn)行HPLC分析。將結(jié)果編入下文的表1中，其中A表示(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇而B表示(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯。表1</tables>實(shí)施例5將1.0g(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于2∶2∶1己烷、TBME及乙酸乙烯酯混合液中的溶液8ml，用30mg脂酶PLC或30mg脂酶PLG處理，然后在室溫的黑暗處在氬氣氣氛中用滾軸緩慢地?cái)嚢柙搼腋∫骸?4小時(shí)后(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇的殘余量小于1％(HPLC)。若用51mg脂酶PLC或51mg脂酶PLG，則24小時(shí)后再也檢不出(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇。實(shí)施例6將25mg脂酶PL及0.5mg膽酸鹽(膽酸鈉，脫氧膽酸鈉)溶于2.0ml二次蒸餾水并加入2.5gDICALITESpeedex或海砂的6ml二次蒸餾水的懸浮液中。按實(shí)施例4中所述方法將該懸浮液小心地干燥，然后如果需要的話，將干燥的物料磨成粉。按實(shí)施例5中所述方法用8ml(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶液測(cè)試所制得的脂酶制劑。每種情況下的HPLC分析在24小時(shí)后實(shí)施。將測(cè)得結(jié)果編入下文的表2中，其中A表示(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇。表2<p>實(shí)施例7將50.0g(164.2mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于140ml己烷、140mlTBME、70ml乙酸乙烯酯及50mgBHT的混合液中。加入2.5g脂酶PLC，接著于暗處在室溫下的氬氣氣氛中用滾軸將該懸浮液緩慢地?cái)嚢?4小時(shí)。然后過濾出脂酶催化劑，用乙醚洗滌后干燥以備再用。然后合并濾液與洗滌液并將其蒸發(fā)濃縮；接著先與兩份各300ml己烷后與300ml戊烷蒸發(fā)濃縮，這樣做是為了除去生成的恒沸乙酸微量物。在35℃下的高真空中干燥約16小時(shí)后得56.73g(163.7mmol，99％)的淺黃色油狀(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯。分析＞99％的純度(SFC面積百分?jǐn)?shù))；由250MHz-1H-NMR(CDCl3)、EI-MS(m/e346)、IR(膜)及微量分析所證實(shí)計(jì)算值C76.26％；H9.89％；實(shí)測(cè)值C76.07％；H9.73％。實(shí)施例8將1.0g(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇及1mgBHT溶于以2∶2∶1混合的己烷、TBME及乙酸乙烯酯混合液中的溶液的8.0ml等分試樣加入50mg脂酶PLC中，該脂酶在相同的條件下業(yè)已被用過4次(以單釜形式)并在每?jī)膳g僅用己烷與TBME的1∶1混合液洗滌過。然后將各種水溶液加入各試樣中，并用滾軸將反應(yīng)懸浮液緩慢地?cái)嚢?7小時(shí)；然后用HPLC分析。將結(jié)果編入下文的表3，其中B表示(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯。表3<p>實(shí)施例9A.將1kg(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于8l乙酸乙酯，并在室溫下用每份3l的pH值為8.0的50mmolarEDTA溶液洗滌2次。然后用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相并蒸發(fā)濃縮，接著在高真空中將殘余物干燥。B.將50ml等分試樣的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃醇溶于400ml乙酸乙酯中，分別用5g的堿性氧化鋁、DICALITESpeedex或硅膠過濾。將濾液蒸發(fā)濃縮后在高真空中干燥。C.將按A.或B.純化過的3.5g(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇試樣溶于25ml甲苯、TBME及乙酸乙烯酯的2∶2∶1混合液中。從每種溶液中各取出8ml試樣三份(3次試驗(yàn))，每份用2.5mg脂酶PLC處理。在室溫下用滾軸將該反應(yīng)懸浮液緩慢地?cái)嚢?4小時(shí)，然后用SFC分析。將結(jié)果編入下文的表4，其中A和B分別表示(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇和(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯。表4<p>實(shí)施例10將5.0g脂酶PLC置于裝填玻璃料的2l色譜柱中。然后將100.0g(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇、280ml己烷、280mlTBME、140ml乙酸乙烯酯(可任意含500μl的0.1M碳酸氫銨溶液或1％氫氧化銨溶液)及100mgBHT依次加入，通過旋轉(zhuǎn)(電動(dòng)攪拌器)緩慢地?cái)嚢枭V柱，讓柱子的出口向上傾斜使得玻璃料不與溶液接觸。在室溫下保溫17小時(shí)后將反應(yīng)液放出并用SFC分析。殘留的脂酶制劑先用100ml1∶1混合的己烷與TBME的混合液洗滌3次(每次洗15分鐘)，接著用50ml己烷洗滌，于是又可用于新的操作循環(huán)。將結(jié)果編入下文的表5中，其中A和B分別表示(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇及(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯。表5實(shí)施例11用實(shí)施例9A中所述方法純化(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇，然后將其用于如實(shí)施例10中所述的重復(fù)間歇法，但應(yīng)用3.0g脂酶PLC、90.0g(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇、250ml甲苯、250mlTBME及125ml乙酸乙烯酯(含450μl1％的氫氧化銨溶液)。反應(yīng)時(shí)間是23小時(shí)。在反應(yīng)操作循環(huán)之間，將脂酶制劑用含1‰(vol./vol.)的1％氫氧化銨溶液的100ml1∶1混合的甲苯及TBME混合液洗滌兩次，在每4次操作循環(huán)之后將脂酶制劑置于甲苯中室溫下放置3天。結(jié)果如圖1所示，圖1中B是(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯。實(shí)施例12實(shí)驗(yàn)操作按實(shí)施例11中所述方法實(shí)施，不同的是用實(shí)施例9B中所述方法，用DICALITESpeedex純化(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇。將結(jié)果列于圖2，其中B為(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基乙酸酯。實(shí)施例13用連續(xù)法實(shí)驗(yàn)研究溫度對(duì)反應(yīng)的影響。將18.0g(59.1mmol，14.4％wt./vol.)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于含300ppm水的100ml甲苯與25ml乙酸乙烯酯的混合液中。將該均勻的混合物用膜濾器[RC60，1μm，Schleicher&amp;SchuellAG，Dassel，Germany(S&amp;S)]過濾，然后用泵以0.5ml/分的物料通過速度將其抽過接連地裝填7gDICALITESpeedex及600mg脂酶PLC(MeitoSangyo)的直徑為10mm的柱子。溫度在20～50°之間變化。取出反應(yīng)試樣用SFC及HPLC分析。結(jié)果列于圖3中。實(shí)施例14用間歇法實(shí)驗(yàn)，也是研究溫度對(duì)反應(yīng)的影響。將48.0g(157.6mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于含20％(wt./vol.)乙酸乙烯酯的足夠的甲苯中，使所得混合物的體積為240ml。用膜濾器(RC60，1μmS&amp;S)將該均勻的混合物過濾并在不斷攪拌(100～110轉(zhuǎn)/分)下維持在50°。加入3.0g脂酶PLC(MeitoSangyo)開始反應(yīng)，接著用HPLC分析。將結(jié)果列于下表(表6)及圖4中表6</tables>實(shí)施例15用間歇法實(shí)驗(yàn)研究溶劑對(duì)反應(yīng)的影響。將48.0g(157.6mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于含20％(wt./vol.)乙酸乙烯酯的足夠的溶劑中，使所得混合物的體積為240ml。用膜濾器(RC60，1μm，S&amp;S)將該均勻的混合物過濾并在不斷攪拌(100～110轉(zhuǎn)/分)下維持在50°。加入3.0g脂酶PLC(MeitoSangyo)開始反應(yīng)，接著用HPLC分析。將結(jié)果編入下文的表7中表7</tables>實(shí)施例16用間歇法實(shí)驗(yàn)研究乙?；瘎?duì)反應(yīng)的影響。將48.0g(157.6mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于含20％(wt./vol.)乙酸乙烯酯的足夠的溶劑中，使所得混合物的體積為240ml。然后用膜濾器(RC60，1μmS&amp;S)將該均勻的混合物過濾并在不斷攪拌(100～110轉(zhuǎn)/分)下維持在50°。加入3.0g脂酶PLC(MeitoSangyo)開始反應(yīng)，接著用HPLC分析。將結(jié)果列于下述表(表8)及圖5中表8實(shí)施例17用間歇法實(shí)驗(yàn)研究?；瘎?duì)反應(yīng)的影響。將0.5g(1.64mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于或懸浮于5ml乙烯基酯中。加入12.5mg脂酶PLC(MeitoSangyo)開始反應(yīng)，在室溫下將該混合物攪拌(輥式攪拌機(jī))17小時(shí)，然后用HPLC分析。將結(jié)果編入下文的表9中。表9</tables>實(shí)施例18用間歇法實(shí)驗(yàn)研究酰化劑對(duì)反應(yīng)的影響。將0.5g(1.64mmol)(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇溶于或懸浮于5ml乙烯基酯中。加入12.5mgChirazymeL2(BoehringerMannheimGmbH，exNovozym435fromNovoNordisk)開始反應(yīng)，在室溫下將該混合物攪拌(輥式攪拌機(jī))17小時(shí)，然后用HPLC分析。將結(jié)果編入下文的表10。表10</tables>權(quán)利要求1.制備式I的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基酰化物的方法其中R表示C1-23的烷基或含1～3個(gè)雙鍵的C2-23的鏈烯基，該方法包括在?；瘎┐嬖诘挠袡C(jī)溶劑中用以懸浮液形式存在的脂酶將式II的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇選擇性地單酰化2.按權(quán)利要求1的方法，其中的脂酶是得自產(chǎn)堿菌的脂酶PL、脂酶PLC、脂酶PLG、得自皺落假絲酵母的脂酶MY-30、得自米黑毛霉的LipozymeIM-20、得自胎毛腐質(zhì)霉的脂酶CE-5或得自圓弧青霉的脂酶G，優(yōu)選是脂酶PL、脂酶PLC、脂酶PLG或LipozymeIM-20，特別是脂酶PL、脂酶PLC或脂酶PLG。3.按權(quán)利要求1的方法，其中的脂酶是得自南極假絲酵母(Candidaantarctica)的ChirazymeL-2。4.按權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的方法，其中式I中的R表示甲基，這樣式II的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇就被選擇性單乙?；?。5.按權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)的方法，其中脂酶的用量達(dá)基于(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇的20wt.％，優(yōu)選是約0.1wt.％～約10wt.％，特別是約1wt.％～5wt.％。6.按權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)的方法，其中的脂酶以固定化形式存在。7.按權(quán)利要求6的方法，其中的脂酶是在膽酸鹽、優(yōu)選是膽酸鈉或脫氧膽酸鈉的存在下被固定化。8.按權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)的方法，其中的反應(yīng)是在惰性氣體氣氛中及避光和/或在自由基消除劑的存在下進(jìn)行的。9.按權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)的方法，其中含5-8個(gè)碳原子的脂肪烴、含6-10個(gè)碳原子的環(huán)烴、氯化脂肪烴、硝基取代的脂肪烴、芳烴、脂族醚、環(huán)醚、脂族酯、脂族酮、脂族腈、脂族胺、脂族縮醛或這些溶劑的混合物被用作溶劑。10.按權(quán)利要求9的方法，其中使用正己烷、環(huán)己烷、二氯甲烷、四氯化碳、甲苯、二異丙醚、四氫呋喃、甲基呋喃、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯或甲醛縮二甲醇或這些溶劑的混合物，優(yōu)選是二氯甲烷、二異丙醚、四氫呋喃、乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、甲基呋喃或甲醛縮二甲醇或這些溶劑的混合物。11.按權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)的方法，其中的乙酸烷基酯或乙酸鏈烯基酯，優(yōu)選是乙酸乙酯、乙酸丁酯或乙酸乙烯酯，特別是乙酸乙烯酯被用作乙酰化劑。12.按權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)的方法，其中(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇的濃度是10％～50％，優(yōu)選是20％～40％，(wt./vol.)。13.按權(quán)利要求1～12中任一項(xiàng)的方法，其中的反應(yīng)溫度是在約10℃與反應(yīng)混合物的回流溫度之間，優(yōu)選是在室溫與約90℃之間，特別是約為室溫與約60℃之間。14.按權(quán)利要求1～13中任一項(xiàng)的方法，其中往反應(yīng)液中加入少量(＜0.2％)的水或弱堿液。15.按權(quán)利要求1～14中任一項(xiàng)的方法，其中的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基視黃醇用優(yōu)選是硅藻土、乙二胺四乙酸鹽、硅膠或氧化鋁的助濾劑過濾，或用pH值約為8的乙二胺四乙酸水溶液洗滌以除去有害雜質(zhì)。16.按權(quán)利要求1～15中任一項(xiàng)的方法，其中的方法用重復(fù)的間歇法或用連續(xù)法實(shí)施。17.按權(quán)利要求1～16中任一項(xiàng)的方法獲得的(11Z，13Z)-7，10-二氫-10-羥基-視黃基?；?、優(yōu)選是乙酸酯在制備相應(yīng)的維生素A酰化物或維生素A乙酸酯方面的應(yīng)用。全文摘要制備(11Z,13Z)－7,10－二氫－10－羥基—視黃基酰化物的方法,包括:在?；瘎┐嬖谙碌挠袡C(jī)溶劑中,用以懸浮液形式存在的脂酶、尤其是酶類EC3.1.1.3選擇性地單?；?11Z,13Z)－7,10－二氫－10－羥基視黃醇。為提高對(duì)脂酶的可獲得性及其重復(fù)使用,可將脂酶固定于各種載體材料上。本發(fā)明方法適合于制備用于生產(chǎn)維生素A乙酸酯的原料即(11Z,13Z)－7,10－二氫－10－羥基—視黃基乙酸酯,該應(yīng)用以及按本發(fā)明獲得的(11Z,13Z)－7,10－二氫－10－羥基—視黃基?；镌谏a(chǎn)對(duì)應(yīng)的維生素A?；锓矫娴膽?yīng)用是本發(fā)明另一方面。文檔編號(hào)C12P7/64GK1169473SQ9711055公開日1998年1月7日申請(qǐng)日期1997年4月17日優(yōu)先權(quán)日1996年4月18日發(fā)明者B·奧薩特,P·斯普爾,B·威爾茲申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司