專利名稱：一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種聚合物載體的制備方法，尤其是涉及一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法及其用途。
背景技術：
青霉素?；讣碢GA是生產(chǎn)半合成β -內(nèi)酰胺類抗生素的工業(yè)用酶，其重要的應用在于催化青霉素G生產(chǎn)半合成β -內(nèi)酰胺類抗生素所需的關鍵中間體6-氨基青霉烷酸即6-ΑΡΑ。目前，世界范圍內(nèi)近90%的6-ΑΡΑ是利用固定于天然高分子或合成樹脂載體的青霉素?；干锎呋瘎┥a(chǎn)的。盡管固定化PGA在醫(yī)藥工業(yè)中的應用已有近三十年，但新型適合于工業(yè)化應用的固定化PGA載體的制備研究仍具有一定的挑戰(zhàn)性。磁性載體制備固定化酶，固定化酶分離、洗滌和回收操作簡便，有利于實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，而利用外 部磁場控制磁性固定化酶的運動方式和方向，替代傳統(tǒng)的機械攪拌方式，能夠有效地提高固定化酶的催化效率。目前制備聚合物磁性微球的方法主要有高分子包埋法，單體聚合法和原位法，其中單體聚合法是在磁性粒子和有機單體存在的條件下，采用不同的聚合方式，在引發(fā)劑作用下聚合制備高分子磁性微球。與包埋法相比，單體聚合法合成磁性聚合物微球的尺度易控制，且球形規(guī)整。利用原位法制備高分子磁性微球，微球的磁響應性較弱，且工藝過程復雜，實用性較低。美國專利公告號為US 4339337公開了一種懸浮聚合制備磁性聚合物微球的方法，是將經(jīng)親油化處理的磁性Fe3O4微粒和親油性烯類單體及油性引發(fā)劑組成的油相分散在含表面活性劑的水相中，形成水包油型懸浮液，加熱引發(fā)聚合形成磁性微球。實驗結(jié)果表明，僅管Fe3O4微粒表面經(jīng)過烴油親油性處理，但在聚合過程中仍出現(xiàn)團聚，部分Fe3O4微粒與烯類單體相發(fā)生分離，得到的微球磁性弱，均質(zhì)性差。中國專利公告號為CN 1566169Α公開了微懸浮聚合法是用油酸類表面活性劑包覆Fe3O4微粒后分散于苯乙烯中形成磁流體，磁流體與二乙烯苯和油性引發(fā)劑過氧化苯甲酰混合，滴加到含十二烷基硫酸鈉和十六醇乳化劑的水溶液中，先引發(fā)聚合反應一段時間后，再滴加甲基丙烯酸等功能性單體與水溶性引發(fā)劑過硫酸鉀水溶液，再進行二次聚合，形成復合微球。分析上述制備過程和實驗可知，該發(fā)明存在一些不足(1)采取二次引發(fā)聚合，制備程序多，過程長。(2)所制備的磁性微球缺少特異的功能性基團，不利于在生物醫(yī)學、特別是在固定化酶及細胞分離等領域的應用。目前還沒有一種合成成本低、過程簡捷、省去了Fe3O4的制備和表面修飾程序、有利于工業(yè)化應用的大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種方法獨特、合成成本低、過程簡捷、省去了 Fe3O4的制備和表面修飾程序、有利于工業(yè)化應用、可以獲得磁性、珠狀、大孔青霉素?；腹潭ɑd體的大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法。本發(fā)明的另一目的是該大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體用于青霉素酰化酶固定化制備高活性易分離的固定化酶。本發(fā)明通過如下方式實現(xiàn)
一種大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠狀聚合物載體的制備方法，其特征在于該方法為將Fe2+、Fe3+鹽作為磁源前驅(qū)物，通氮下溶解于極性有機溶劑甲酰胺中，用濃氨水調(diào)節(jié)溶液PH值為8-11后，60-90°C熟化30-60 min,在堿性條件下形成磁流體，表面活性劑作為分散劑，乙烯基化合物為單體，非極性有機物作分散介質(zhì)，引發(fā)劑作用下采用反相懸浮技術進行交聯(lián)聚合，產(chǎn)物在磁場中用丙酮洗滌分離后用有機溶劑清洗，室溫下真空干燥即得該載體；
所述Fe2+和Fe3+的摩爾比為I : O. 5-2，所述Fe2+、Fe3+鐵鹽為FeCl2、FeCl3 'FeSO4和·Fe2(SCM)3中二種或兩種以上，甲酰胺磁流體溶液中Fe2+、Fe3+離子總的質(zhì)量濃度為2_10% ；所述分散介質(zhì)為疏水性有機物，其為四氯乙烯與環(huán)正庚烷、己烷、正己烷中的任意一種的混合物，二者體積比為I: I - 1:5 ；
所述分散劑是復合表面活性劑，由司班類表面活性劑與聚乙二醇、乙基纖維素、硬脂酸鈣和十二烷基硫酸鈉中的任意一種或兩種復配而成，分散劑中司班類表面活性劑與任意一種或任意兩種的重量配比為1:10-1:80，分散劑的質(zhì)量是分散介質(zhì)質(zhì)量的5-40% ；
所述乙烯基化合物單體為丙烯酰胺、N-乙烯吡咯烷酮、丙烯醇、丙烯醛、丙烯酸及其衍生物、甲基丙烯酸縮水甘油酯、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺或二乙烯基苯的任意兩種或三種的混合物，任意兩種的重量配比1:1-1:4,三種的重量配比為1:1:1-2:1:5;
所述引發(fā)劑為偶氮類引發(fā)劑或過氧化物類引發(fā)劑，引發(fā)劑加入的質(zhì)量為乙烯基化合物單體質(zhì)量的2 - 20% ；
所述分散介質(zhì)的質(zhì)量為乙烯基化合物單體的10 - 60倍；
所述聚合反應在攪拌機轉(zhuǎn)速為400 - 700 r/min,反應溫度50 - 70°C，時間4-10 h ；所述大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體用于青霉素?；腹潭ɑ苽涓呋钚砸追蛛x的固定化酶。本發(fā)明有如下效果
I)方法獨特、合成成本低、過程簡捷本發(fā)明提供的方法為將Fe2+、Fe3+鹽作為磁源前驅(qū)物，通氮下溶解于極性有機溶劑甲酰胺中，用濃氨水調(diào)節(jié)溶液PH值為8-11后，60-90°C熟化30-60 min，在堿性條件下形成磁流體，表面活性劑作為分散劑，乙烯基化合物為單體，非極性有機物作分散介質(zhì)，引發(fā)劑作用下采用反相懸浮技術進行交聯(lián)聚合，產(chǎn)物在磁場中用丙酮洗滌分離后用有機溶劑清洗，室溫下真空干燥即得該載體。2)獲得磁性、珠狀、大孔青霉素?；腹潭ɑd體本發(fā)明提供的方法Fe3O4粒子被包裹于聚合物的網(wǎng)絡中，珠狀載體平均孔徑在20-50 nm,孔體積在O. 2-1.0 cm3/g范圍，比飽和磁化強度在5-20 emu/g范圍，研究發(fā)現(xiàn)，分散劑的用量、分散介質(zhì)的配比、Fe2+、Fe3+離子濃度、引發(fā)劑用量、聚合反應溫度對產(chǎn)物的孔徑、粒徑、球形和磁性能均有不同程度的影響。在一定范圍內(nèi)，增加Fe2+、Fe3+甲酰胺磁流體和引發(fā)劑用量，提高聚合溫度，降低分散介質(zhì)中正庚烷與四氯乙烯的配比，以獲得磁性、珠狀、大孔青霉素?；腹潭ɑd體。
3)制備的載體性能好采用本發(fā)明提供的方法制備的載體的微球具有大孔結(jié)構(gòu)，平均孔徑在20-50 nm，，孔體積在O. 2-1. O cm3/g范圍，其含有環(huán)氧基和酰胺基等功能性基團，F(xiàn)e3O4粒子主要被包裹于聚合物的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中。其中，環(huán)氧基團含量在O. 1-1.0 mmol/g范圍；球形規(guī)整，微球之間沒有出現(xiàn)粘連，微球磁響應性強，具有超順磁性，比飽和磁化強度(s )在 5-20 emu/g 范圍。4)省去了 Fe3O4的制備和表面修飾程序、有利于工業(yè)化應用在相同的固定化條件下制備固定化PGA，結(jié)果表明，不同聚合條件制備的磁性載體對固定化酶的活性有顯著的影響，本發(fā)明公開的是Fe2+、Fe3+甲酰胺磁流體存在下，反相懸浮聚合技術一步制備珠狀、大孔徑、含環(huán)氧基團的磁性聚合物載體的方法，這對于獲得活性高、易分離控制和適宜于工業(yè)化應用。5)用其制得的固定化酶催化活性高，在磁場作用下快速分離回收和重復使用，避免了生物催化劑在使用過程中的操作損失。如用本方法合成的載體固定化PGA后，催化青霉素G鉀水解反應制備6-APA的表觀活性可達785 IU/g以上，以干重計。本發(fā)明磁性聚合
物的特征之四在于，用其制備的固定化PGA的催化活性高，在操作過程中易分離回收和重復使用，且不發(fā)生磁聚集現(xiàn)象。
具體實施例方式實施例I :
將O. 66 g FeCl2 · 4H20和I. 82 g FeCl3 · 6H20置于15 mL甲酰胺中，60°C恒溫加熱下劇烈攪拌10 min時升溫至90°C，加入氨水調(diào)節(jié)pH為8 9，熟化I h后形成磁流體。在裝有恒速攪拌機、氮氣管和冷凝管的反應器中加入40 mL四氯乙烯和110 mL的正庚烷，水浴加熱至60°C后,在攪拌、通入氮氣下依次加入O. 20 g司班-60和9. O g硬脂酸韓，再加入2. Sg甲基丙烯酸縮水甘油酯、3.8 g N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺和上述制備的磁流體，攪拌30 min后加入I. O g偶氮二異丁腈,控制攪拌機轉(zhuǎn)速為450 r/min,在氮氣保護下聚合7 h。產(chǎn)物在磁場中經(jīng)分離、丙酮和正庚烷洗滌后，真空干燥至恒重，測得其平均孔徑為32. I nm,孔體積為O. 53 cm3/g,s值為7. 8 emu/g,環(huán)氧基團含量0.45 mmol/g。以合成的磁性珠狀載體固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為 635 IU/g。實施例2:
I.32 g FeCl2 ·4Η20和I. 82 g FeCl3 ·6H20，其余組分的用量和制備條件與實施例I相同。合成樣品的平均孔徑為30. O nm,孔體積為O. 60 cm3/g,s值為8. 3 emu/g,環(huán)氧基團含量0.38 mmol/g。以合成的磁性珠狀含環(huán)氧基載體固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為612 IU/g。實施例3:
甲酰胺為30 mL，其余組分的用量和制備條件與實施例I相同。合成樣品的平均孔徑為39.4 nm,孔體積為O. 51 cm3/g,s值為6. 3 emu/g,環(huán)氧基團含量0.43 mmol/g。以合成的磁性珠狀含環(huán)氧基載體固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為662 IU/g。實施例4:司班-60的用量為O. 40 g，其余組分的用量和制備條件與實施例I相同。合成樣品的平均孔徑為31. 2 nm,孔體積為O. 58 cm3/g, s值為6. 9 emu/g,環(huán)氧基團含量O. 47 mmol/go以合成的磁性珠狀含環(huán)氧基載體固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為674 IU/g。實施例5:
硬脂酸鈣的用量為13.5 g，其余組分的用量和制備條件與實施例I相同。合成樣品的平均孔徑為30. 4 nm,孔體積為O. 66 cm3/g, s值為5. 7 emu/g,環(huán)氧基團含量0.56 mmol/go以合成的磁性珠狀載體固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為604 IU/g。實施例6
正庚烷的用量為150 mL，其余組分的用量和制備條件與實施例I相同。合成樣品的平均孔徑為30. 7 nm，孔體積為O. 50 cm3/g, s值為5. O emu/g,環(huán)氧基團含量O. 41 mmol/g。以合成的磁性珠狀載體固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為654 IU/g。實施例7:
控制攪拌轉(zhuǎn)速為600 r/min，其余組分的用量和制備條件與實施例I相同。合成樣品的平均孔徑為34. 6 nm,孔體積為0. 52 cm3/g, s值為5. 3 emu/g,環(huán)氧基團含量0. 44 mmol/go以合成的磁性珠狀含環(huán)氧基載體固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為630 IU/g。實施例8
聚合溫度為70°C，其余組分的用量和制備條件與實施例I相同。合成樣品的平均孔徑為30. 7 nm,孔體積為0.58 cm3/g,s值為5. 6 emu/g,環(huán)氧基團含量0.42 mmol/g。以合成的磁性珠狀含環(huán)氧基載體固定化青霉素酰化酶，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為622 IU/g。實施例9
甲基丙烯酸縮水甘油酯用量為2. O g、N-乙烯吡咯烷酮為I. O g,N, N'-亞甲基雙丙烯酰胺為3. 6 g，其余組分的用量和制備條件與實施例4相同。合成樣品的平均孔徑為30. 8nm,孔體積為0.69 cm3/g, s值為5. 8 emu/g,環(huán)氧基團含量0.32 mmol/g。以合成的磁性珠狀含環(huán)氧基載體固定化青霉素?；?，用于催化青霉素G鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為785 IU/g。實施例10
甲基丙烯酸縮水甘油酯用量為2.0 g、甲基丙烯酸羥乙酯為1.0 g，N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺為3. 6 g，其余組分的用量和制備條件與實施例4相同。合成樣品的平均孔徑為30.7 nm,孔體積為0.64 cm3/g,s值為5. 6 emu/g,環(huán)氧基團含量0.34 mmol/g。以合成的磁性珠狀含環(huán)氧基載體固定化青霉素?；福糜诖呋嗝顾谿鉀制備6-APA水解反應，固定化酶的表觀活性為745 IU/g。
權(quán)利要求
1.一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法，其特征在于該方法為將Fe2+、Fe3+鹽作為磁源前驅(qū)物，通氮下溶解于極性有機溶劑甲酰胺中，用濃氨水調(diào)節(jié)溶液PH值為8-11后，60-90°C熟化30-60 min,在堿性條件下形成磁流體，表面活性劑作為分散劑，乙烯基化合物為單體，非極性有機物作分散介質(zhì)，引發(fā)劑作用下采用反相懸浮技術進行交聯(lián)聚合，產(chǎn)物在磁場中用丙酮洗滌分離后用有機溶劑清洗，室溫下真空干燥即得該載體。
2 如權(quán)利要求I所述的一種大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠狀聚合物載體的制備方法，其特征在于所述Fe2+和Fe3+的摩爾比為I : O. 5-2，所述Fe2+、Fe3+鐵鹽為FeCl2^FeCl3、FeSO4和Fe2(SCM)3中二種或兩種以上，甲酰胺磁流體溶液中Fe2+、Fe3+離子總的質(zhì)量濃度為 2-10%ο
3.如權(quán)利要求I所述的一種大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠狀聚合物載體的制備方法，其特征在于所述分散介質(zhì)為疏水性有機物，其為四氯乙烯與環(huán)正庚烷、己烷、正己烷中的任意一種的混合物，二者體積比為1:1 - 1:5。
4.如權(quán)利要求I所述的一種大孔青霉素酰化酶固定化磁性珠狀聚合物載體的制備方法，其特征在于所述分散劑是復合表面活性劑，由司班類表面活性劑與聚乙二醇、乙基纖維素、硬脂酸鈣和十二烷基硫酸鈉中的任意一種或兩種復配而成，分散劑中司班類表面活性劑與任意一種或任意兩種的重量配比為1:10 -1:80,分散劑的質(zhì)量是分散介質(zhì)質(zhì)量的5-40%ο
5.如權(quán)利要求I所述的一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法，其特征在于所述乙烯基化合物單體為丙烯酰胺、N-乙烯吡咯烷酮、丙烯醇、丙烯醛、丙烯酸及其衍生物、甲基丙烯酸縮水甘油酯、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺或二乙烯基苯的任意兩種或三種的混合物，任意兩種的重量配比1:1-1:4,三種的重量配比為1:1:1 - 2:1:5。
6.如權(quán)利要求I所述的一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法，其特征在于所述引發(fā)劑為偶氮類引發(fā)劑或過氧化物類引發(fā)劑，引發(fā)劑加入的質(zhì)量為乙烯基化合物單體質(zhì)量的2 - 20%。
7.如權(quán)利要求I所述的一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法，其特征在于所述分散介質(zhì)的質(zhì)量為乙烯基化合物單體的10 - 60倍。
8.如權(quán)利要求I所述的一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法，其特征在于所述聚合反應在攪拌機轉(zhuǎn)速為400 - 700 r/min，反應溫度50 - 70°C，時間4- 10 h0
9.如權(quán)利要求I所述的一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的用途，其特征在于所述大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體用于青霉素酰化酶固定化制備高活性易分離的固定化酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聚合物載體的制備方法，尤其是涉及一種大孔青霉素?；腹潭ɑ判灾闋罹酆衔镙d體的制備方法，該方法為將Fe2+、Fe3+鹽作為磁源前驅(qū)物，通氮下溶解于極性有機溶劑甲酰胺中，用濃氨水調(diào)節(jié)溶液pH值為8-11后，60-90℃熟化30-60min，在堿性條件下形成磁流體，表面活性劑作為分散劑，乙烯基化合物為單體，非極性有機物作分散介質(zhì)，引發(fā)劑作用下采用反相懸浮技術進行交聯(lián)聚合，產(chǎn)物在磁場中用丙酮洗滌分離后用有機溶劑清洗，室溫下真空干燥即得該載體；本發(fā)明方法獨特、合成成本低、過程簡捷、省去了Fe3O4的制備和表面修飾程序、有利于工業(yè)化應用、可以獲得磁性、珠狀、大孔青霉素?；腹潭ɑd體，其用途用于青霉素?；腹潭ɑ苽涓呋钚砸追蛛x的固定化酶。
文檔編號C08F220/28GK102875731SQ20121042139
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月30日
發(fā)明者薛屏, 李新燕, 夏維濤, 王居蘭, 宋肖單, 李鵬 申請人:寧夏大學