專利名稱：蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的ptp-d亞家族的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)和細(xì)胞以及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及作為蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPases)新亞家族成員的PTP蛋白質(zhì)或糖蛋白，編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核酸構(gòu)建體，攜帶核酸構(gòu)建體的重組表達(dá)載體，含重組表達(dá)載體的細(xì)胞，生產(chǎn)并鑒定PTP-D蛋白質(zhì)和糖蛋白質(zhì)以及為此編碼的DNA構(gòu)建體的方法，PTP-D蛋白質(zhì)和糖蛋白特異性的抗體，篩選能結(jié)合并抑制或刺激PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法。
蛋白質(zhì)的磷酸化是調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過程的基本機(jī)制。大部分的蛋白質(zhì)磷酸化作用發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸殘基，由于發(fā)現(xiàn)許多致腫瘤基因產(chǎn)物和生長因子受體具有內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性，所以在酪氨酸殘基上的磷酸化作用很令人感興趣。已經(jīng)證實(shí)了蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化在生長因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞周期演化以及腫瘤變態(tài)方面的重要性
(Hunter et al.，Ann.Rev.Biochem.54∶987-930(1985)，Ullrich et al.，Cell 61∶203-212(1990)，Nurse，Nature 344∶503-508(1990)，Cantley et al.，Cell 64∶281-302(1991))。
生化研究已經(jīng)表明，在各種細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸殘基上的磷酸化作用是涉及競爭磷酸化和去磷酸化反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過程。由蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTKases)和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPases)的相應(yīng)作用介導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)酪氨酸的磷酸化作用。由PTKases催化酪氨酸磷酸化反應(yīng)。通過PTPases的作用可以特異性地將酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)去磷酸化。通過平衡PTKases和PTPases的活性，確定細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化水平。(Hunter，T.，Cell 58∶1013-1016(1989))。
蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTKases)是一個(gè)大的蛋白質(zhì)家族，包括許多生長因子受體和潛在的致腫瘤基因。(Hanks et al.，Science 241∶42-52(1988))。已經(jīng)將許多PTKases與誘發(fā)細(xì)胞周期所需的起始信號(hào)(Weaver et al.，Mol.and cell.Biol.11(9)∶4415-4422(1991))連接在一起。PTKases包括不同家族的，與絲氨酸/蘇氨酸-特異性蛋白質(zhì)激酶有共同祖先，但與其有很大差別的酶(Hanks， et al.，同上文)。在具有跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的受體-型PTKases的情況下，更能清楚地理解導(dǎo)致PTKases活性改變的機(jī)制(Ullrich et al.(1990)同上文)。據(jù)認(rèn)為特異性配體與受體-型PTKases成員細(xì)胞外區(qū)的結(jié)合是為了誘發(fā)其導(dǎo)致酪氨酸激酶活性增加和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活的低聚化作用(Ullrich et al.，(1990)同上文)。通過突變或過度表達(dá)而去調(diào)節(jié)激酶活性可以很好地證實(shí)細(xì)胞變形的機(jī)制(Hunter et al.，(1985)同上文;Ullrich et al.，(1990)同上文)。
蛋白質(zhì)磷酸酶至少由兩種獨(dú)立的且性質(zhì)截然不同的家族(Hunter，T.(1989)同上文)，蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPases)組成。
蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPases)是一個(gè)已經(jīng)被分為兩個(gè)亞組的蛋白質(zhì)家族。第一亞組由低分子量的細(xì)胞內(nèi)酶組成，所述酶含有單個(gè)保守的催化性磷酸酶區(qū)域。所有已知的胞內(nèi)型PTPases含有單個(gè)保守的催化性磷酸酶區(qū)。第一組PTPases的實(shí)例包括(1)胎盤PTPases 1B(Charbonneau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86∶5252-5256(1989);Chernoff et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87∶2735-2789(1989))，(2)T細(xì)胞PTPase(Cool et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86∶5257-5261(1989));(3)大鼠腦PTPase(Guan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87∶1501-1502(1990))，(4)神經(jīng)元磷酸酶(STEP)(Lombrosoet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88∶7242-7246(1991))，和(5)含有一個(gè)與細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)同源的區(qū)域的細(xì)胞質(zhì)磷酸酶(Guet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88∶5867-57871(1991);Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88∶5949-5953(1991))。
第二亞組由高分子量，稱為R-PTPases的連接至PTPase上的受體組成。R-PTPase由(a)細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)，(b)單個(gè)跨膜片段，和(c)一個(gè)推測的配體-結(jié)合細(xì)胞外區(qū)組成(Gebbink et al.，同上文)。
R-PTPases的(c)推測的配體-結(jié)合的細(xì)胞外“受體”區(qū)的結(jié)構(gòu)和大小有很大不同。相反，(a)R-PTPases的細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)是高度同源的。所有R-PTPases有兩個(gè)串聯(lián)復(fù)制的催化磷酸酶同源區(qū)，除稱為HPTP β的R-PTPase外，它只有一個(gè)催化磷酸酶區(qū)。(Tsai et al.，Journal of Biol.Chem.266(16)∶10534-10543(1991))。
R-PTPases的一個(gè)實(shí)例是白細(xì)胞共同抗原(LCA)(Ralph，S.J.，EMBO J.6∶1251-1257(1987))。LCA是在所有白細(xì)胞和其造血細(xì)胞前身表面上表達(dá)的一個(gè)高分子量糖蛋白家族(Thomas，Ann.Rev.Immunol.7∶339-369(1989))。用幾個(gè)種的LCA序列檢測顯著的相似程度(Charbonneau et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85∶7182-7186(1988))。在文獻(xiàn)中，將LCA以不同的名字命名，包括T200(Trowbridge et al.，Eur.J.Immunol.6∶557-562(1962))，B細(xì)胞形式的B220(Coffman et al.，Nature 289∶681-683(1981))，小鼠的同種異型標(biāo)記Ly-5(Komuro et al.，Immunogenetics 1∶452-456(1975)，及最近的CD45(Cobbold et al.，Leucocyte Typing Ⅲ，ed.A.J.McMichael at al.，pp.788-803(1987))。
幾種研究表明CD45在T細(xì)胞激活中起重要作用。在Weiss A.，Ann.Rev.Genet.25∶487-510(1991)中總結(jié)了這些研究。在一個(gè)研究中，經(jīng)NSG誘變處理并經(jīng)選擇不能表達(dá)CD45的T細(xì)胞克隆對(duì)T細(xì)胞刺激產(chǎn)物應(yīng)答，(Weaver et al.，(1991)同上文)。這些T細(xì)胞克隆在其對(duì)通過T細(xì)胞抗原受體轉(zhuǎn)移的信號(hào)應(yīng)答，包括適當(dāng)靶的細(xì)胞溶解，增殖，產(chǎn)生淋巴激活素方面是功能缺陷的(Weaver et al.，(1991)同上文)。
其它研究表明，CD45的PTPase活性在pp56lck，一種淋巴細(xì)胞-特異的PTKase的激活中起作用(Mustelin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86∶6302-6306(1989);Ostergaard et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86∶8959-8963(1989))。這些作者假設(shè)CD45的磷酸酶活性通過使C末端的酪氨酸殘基去磷酸化而激活pp56lck，這可能依次與T細(xì)胞激活有關(guān)。
R-PTPases的另一實(shí)例是白細(xì)胞共同抗原相關(guān)分子(LAR)(Streuli et al.，J.Exp.Med.168∶1523-1530(1988))。開始，將LAR鑒別成LCA的同系物(Streuli et al.，同上文)。雖然(a)LAR分子的細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)含兩個(gè)催化磷酸酶同源區(qū)域(區(qū)域Ⅰ和區(qū)域Ⅱ)，但突變分析表明，僅區(qū)域Ⅰ有催化磷酸酶活性，而區(qū)域Ⅱ是酶失活的(Streuli et al.，EMBO J.9(8)∶2399-2407(1990))。在氨基酸1379位的酪氨酸變成苯丙氨酸的化學(xué)誘導(dǎo)的LAR突變體是溫度敏感的(Tsai et al.，J.Biol.Chem.266(16)∶10534-10543(1991))。
已經(jīng)克隆了一種新的小鼠R-PTP，叫做mRPTPμ，它具有與LAR共享某些結(jié)構(gòu)motifs的(a)細(xì)胞外區(qū)域(Gebbink et al.，(1991)同上文)。另外，這些作者已經(jīng)克隆了RPTPμ的人類同系物，并將其定位于人染色體18上的基因。
以cDNA克隆的序列為基礎(chǔ)，已經(jīng)預(yù)測了兩個(gè)果蠅PTPases，稱為DLAR和DPTP(Streuli et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86∶8698-8702(1989))。已經(jīng)克隆了編碼另一果蠅R-PTPase稱為DPTP99A的cDNA并鑒定其特定(Hariharan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88∶11266-11270(1991))。
R-PTPases的其它實(shí)例包括R-PTPase-α，β，γ，和ζ(Krueger et al.，EMBO J.9∶3241-3252(1990)，Sap et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87∶6112-6116(1990)，Kaplan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87∶7000-7004(1990)，Jirik et al.，F(xiàn)EBS Lett.273∶239-242(1990)，Mathews et al.，Nucl.Acids Res.18∶7159(1990))。公開的申請(qǐng)WO 92/01050公開了人R-PTPase-α，β，和γ，并報(bào)告了有關(guān)這三種R-PTPases及該蛋白質(zhì)家族其它成員的保守區(qū)之間存在的結(jié)構(gòu)同源性特點(diǎn)。鼠R-PTPase-α有794個(gè)氨基酸，而人R-PTPase-α有802個(gè)氨基酸。R-PTPase-α有一個(gè)與其它酪氨酸磷酸酶的催化區(qū)同源的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域。142個(gè)氨基酸的細(xì)胞外區(qū)域(包括R-PTPase-α的信號(hào)肽)有很高的絲氨酸和蘇氨酸含量(32%)和8個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。已經(jīng)生產(chǎn)出編碼R-PTPase-α的cDNA克隆，并從真核宿主中表達(dá)了R-PTPase-α。已經(jīng)用Northern分析鑒別各種細(xì)胞和組織中天然表達(dá)的R-PTPase-α。通過用合成的R-PTPase-α肽免疫接種，已經(jīng)生產(chǎn)了R-PTPase-α的多克隆抗體，用編碼部分R-PTPase-α的cDNA克隆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，該抗體可鑒別一個(gè)130KDa的蛋白質(zhì)。
R-PTPases的另一實(shí)例是HePTP(Jirik et al.，F(xiàn)ASEB J.4∶82082(1990)Abstract 2253)。Jirik等人用編碼LCA的兩個(gè)磷酸酶區(qū)的探針從肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系，HepG2中篩選cDNA文庫，并發(fā)現(xiàn)了一個(gè)編碼新R-PTPase，命名為HePTP的cDNA克隆?？磥?，HePTP基因在各種人和鼠細(xì)胞系及組織中都表達(dá)。
由于初步進(jìn)行了PTPase的純化，定序、以及克隆，因此，可以迅速地鑒別其它的潛在的PTPases。已經(jīng)鑒別的大量不同的PTPases正在穩(wěn)步增加，因此推測該家族可能與PTKase家族一樣大(Hunter(1989)同上文)。
已經(jīng)鑒別并定義了在已知PTPases催化區(qū)中的保守氨基酸序列(Krueger et al.，EMBO J.9∶3241-3252(1990)和Yi et al.，Mol.Cell.Biol.12∶836-846(1992)，該文獻(xiàn)插入本文作為參考)。本文將這些氨基酸序列稱為“一致序列”。
Yi等人列出了下列PTPasesLCA，PTPIB，TCPTP，LAR，DLAR和HPTPα，HPTPβ和HPTPγ的催化磷酸酶區(qū)序列。該組合包括下列“一致序列”(Yi et al.，同上文，圖2(A)，行1和2)
1.DYINAS/N [SEQ ID NO1]
2.CXXYWP [SEQ ID NO2]
3.I/VVMXXXXE [SEQ ID NO3]
Krueger等人列出了PTPIB，TCPTP，LAR，LCA，HPTPα，β，δ，ε和ζ，及DLAR和DPTP的催化磷酸酶區(qū)序列。該排列包括下列“一致序列”(Krueger et al.，同上文，圖7，行1和2)
1.D/NYINAS/N [SEQ ID NO4]
2.CXXYWP [SEQ ID NO2]
3.I/VVMXXXXE [SEQ ID NO3]
越來越清楚，酪氨酸殘基的去磷酸化可能作為一種重要的調(diào)節(jié)機(jī)制單獨(dú)起作用。已經(jīng)表明，就酪氨酸激酶的src家族來說，c末端酪氨酸殘基的去磷酸化可激活酪氨酸激酶活性(Hunter，T.Cell 49∶1-4(1987))。認(rèn)為酪氨酸的去磷酸化是成熟-促進(jìn)因子(MPF)激酶的有絲分裂激活中的專性步驟(Morla et al.，Cell58∶193-203(1989))。這些觀察結(jié)果滿足了本領(lǐng)域關(guān)于了解調(diào)節(jié)酪氨酸磷酸酶活性機(jī)制的需要。
很清楚需要進(jìn)一步分析PTPases之間結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系，以增進(jìn)對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)變，細(xì)胞周期演化和細(xì)胞生長，以及腫瘤變態(tài)的了解的重要性。
表Ⅰ給出了蛋白質(zhì)化學(xué)家普遍使用且本文所用的氨基酸的一個(gè)字母縮寫。
氨基酸名稱 符號(hào)
甘氨酸 G
丙氨酸 A
纈氨酸 V
亮氨酸 L
異亮氨酸 I
絲氨酸 S
蘇氨酸 T
半胱氨酸 C
甲硫氨酸 M
天冬氨酸 D
天冬酰胺 N
谷氨酸 E
谷氨酰胺 Q
精氨酸 R
賴氨酸 K
組氨酸 H
苯丙氨酸 F
酪氨酸 Y
色氨酸 W
脯氨酸 P
絲氨酸或天冬酰胺 S/N
天冬氨酸或天冬酰胺 D/N
異亮氨酸或纈氨酸 I/V
(非特定的氨基酸) X
本發(fā)明人在本文中描述了蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的新亞家族(PTP-D)的鑒別。該新亞家族(下文稱“PTP-D亞家族”)在結(jié)構(gòu)上可與以前報(bào)告的PTPases有顯著的不同。本發(fā)明因此提供來自PTP-D亞家族PTPases的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。
最好，PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白含有來自具有催化磷酸酶區(qū)的PTPases的PTP-D亞家族的PTPase，其中氨基酸序列選自
1.GYINAS/N [SEQ ID NO.5]
2.SXXYWP [SEQ ID NO.6]
3.IAMVXXXXE [SEQ ID NO.7]
選自
1.GYINAS/N [SEQ ID NO.5]
2.SXXYWP [SEQ ID NO.6]
3.IAMVXXXXE [SEQ ID NO.7]
的氨基酸序列與前文在PTPases催化磷酸酶區(qū)域中定義的氨基酸一致序列有下列氨基酸不同(劃線處表示不同)
1.PTP-DGYINAS/N [SEQ ID NO.5]
一致序列DYINAS/N [SEQ ID NO.1]
NYINAS/N [SEQ ID NO.8]
2.PTP-D1/D2SXXYWP [SEQ ID NO.6]
一致序列 CXXYWP [SEQ ID NO.2]
3.PTP-D1/D2IAMVXXXXE [SEQ ID NO.7]
一致序列(I/V/L)V(M/I/L)(V/L/I/M)XXXXE
若本發(fā)明的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白是天然產(chǎn)生的，則其基本上沒有與其天然相連的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白?？梢酝ㄟ^糖蛋白的生化純化作用生產(chǎn)基本上純的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。另外，可通過化學(xué)方法或原核或真核宿主中的重組方法制備本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白并提供基本上沒有與其天然相關(guān)和/或已修飾氨基酸的其它蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白片段，含有其它氨基酸的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，含有取代氨基酸的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，以及具有任何缺失，附加，或取代氨基酸組合的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，這些PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白具有所需的生物活性。
本發(fā)明還涉及核酸構(gòu)建體，含有cDNA或基因組DNA形式的，編碼本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及表達(dá)載體形式的核酸構(gòu)建體，以及含表達(dá)載體的原核和真核宿主細(xì)胞。
制備本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的方法也包括在本發(fā)明內(nèi)，該方法包括
(a)在培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)能表達(dá)PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的宿主，
(b)表達(dá)PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白;和
(c)從培養(yǎng)物中回收PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。
本發(fā)明也涉及特異于PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白或特異于PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的抗原決定簇的抗體，多克隆抗體，單克隆抗體，或嵌合抗體。
本發(fā)明還涉及檢測細(xì)胞或受試體中PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白存在，或檢測其數(shù)量的方法，包括
(a)將所述的細(xì)胞或其提取物與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的抗原決定簇特異性抗體接觸;和
(b)檢測與細(xì)胞或其提取物結(jié)合的抗體，或測量結(jié)合的抗體數(shù)量。
由此檢測PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在或測量其數(shù)量。
本發(fā)明也涉及檢測細(xì)胞或受試體中核酸構(gòu)建體存在的方法，該構(gòu)建體編碼正常或突變PTP-D或糖蛋白，該方法包括
(a)在雜交條件下，將來自受試體的細(xì)胞或提取物與編碼至少部分正?；蛲蛔働TP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的寡核苷酸探針接觸;和
(b)測量與細(xì)胞核酸雜交的探針，
由此檢測核酸構(gòu)建體的存在。
檢測前，可以用多聚酶鏈反應(yīng)選擇性地?cái)U(kuò)增細(xì)胞的核酸。
本發(fā)明也涉及鑒別并分離化學(xué)或生物制品中，能與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括
(a)將PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白或其化合物-結(jié)合的部分吸附到固相基質(zhì)上;
(b)將化學(xué)或生物制品與固相基質(zhì)接觸以便使化合物進(jìn)行結(jié)合，并洗滌掉任何未結(jié)合的物質(zhì);
(c)檢測與固相結(jié)合的化合物的存在，且用于分離目的，
(d)洗脫結(jié)合的化合物，
由此分離該化合物。
最后，本發(fā)明包括一種鑒別分子的方法，該分子能刺激或抑制PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的酶活性，該方法包括
(a)將化合物與純化形式，膜制品中或整個(gè)活的或固定細(xì)胞中的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白接觸;
(b)將步驟(a)中的混合物培養(yǎng)足夠的時(shí)間間隔;
(c)測量PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的酶活性;
(d)與沒有該化合物存在時(shí)培養(yǎng)的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白蛋白的酶活性進(jìn)行比較，
由此確定該分子是刺激還是抑制活性。在該方法中，也可以用PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白片段鑒別能刺激或抑制該活性的分子。


圖1表示PTP-D1的部分cDNA序列和推測的氨基酸序列，它是PCR片段。
圖2表示PTP-D2的部分cDNA序列和推測的氨基酸序列，它是PCR片段。
圖3A表示PTP-D1和PTP-D2的推測氨基酸序列與PTPase1B氨基酸序列的比較，使用了CLUSTAL程序(Higgins，C.Fuch，R.and Bleasby，D.，Multiple Sequence Alignment;CABIOS(1991)(在印刷))。
圖3B表示PTP-D1和PTP-D2之間核苷酸的比較。
圖3C表示PTP-D1和PTP-D2之間氨基酸的比較。
圖4表示PTP-D1的部分cDNA序列和推測的氨基酸序列。
該部分cDNA序列包括圖1所示的PCR片段的cDNA序列。
本發(fā)明定義了結(jié)構(gòu)與以前報(bào)告的PTPases明顯不同的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(PTPases)的新亞家族(PTP-D亞家族)。與以前定義的PTPases催化磷酸酶區(qū)的氨基酸一致序列相比，該P(yáng)TP-D亞家族成員的特征在于有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)下列氨基酸不同(劃線的不同)
1.PTP-DGYINAS/N [SEQ ID NO.5]
一致序列DYINAS/N [SEQ ID NO.1]
NYINAS/N [SEQ ID NO.8]
2.PTP-D1/D2SXXYWP [SEQ ID NO.6]
一致序列 CXXYWP [SEQ ID NO.2]
3.PTP-D1/D2IAMVXXXXE [SEQ ID NO.7]
一致序列(I/V/L)V(M/I/L)(V/L/I/M)XXXXE
術(shù)語“亞家族”用于說明一組結(jié)構(gòu)上與上文限定的特定氨基酸殘基相關(guān)的PTPases。
以前定義的氨基酸一致序列是指Krueger等人，(EMBO J.9∶3241-3252(1990)和Yi等人(Mol.Cell.Biol.12∶836-846(1992)中所述的已知PTPases催化磷酸酶區(qū)中的保守氨基酸序列，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，含有來自PTPases的PTP-D亞家族的PTPases，具有含1、2、或3個(gè)選自下列氨基酸序列的催化磷酸酶區(qū)
1.GYINAS/N [SEQ ID NO.5]
2.SXXYWP [SEQ ID NO.6]
3.IAMVXXXXE [SEQ ID NO.7]
目前，還不知道PTPases的新PTP-D亞家族的PTP-D蛋白質(zhì)和糖蛋白是否受體結(jié)合的PTPases還是細(xì)胞內(nèi)PTPases。
一方面，本發(fā)明涉及一種天然產(chǎn)生的哺乳動(dòng)物PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。另一方面，本發(fā)明涉及一種重組哺乳動(dòng)物PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。另一方面，本發(fā)明涉及一種化學(xué)合成的哺乳動(dòng)物PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。本發(fā)明優(yōu)選的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白是來自人的。
本發(fā)明提供一種基本上沒有與其天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白的天然產(chǎn)生的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白?！盎旧蠜]有其它蛋白質(zhì)或糖蛋白”是指將PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白純化，去掉至少90%(以重量計(jì))，如果需要甚至至少99%的與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白天然相連的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白，且因此基本上沒有它們。這可以經(jīng)過將含PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的細(xì)胞、組織或液體經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)如帶與該蛋白質(zhì)特定反應(yīng)的單克隆抗體的免疫吸附柱完成。其它形式的親和純化可利用能結(jié)合催化磷酸酶區(qū)的固相基質(zhì)或與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白中存在的受體區(qū)結(jié)合的配體來完成。另外，可以用組合的標(biāo)準(zhǔn)方法，如硫酸銨沉淀，分子篩層析，和離子交換層析完成純化。
可以理解，可以從各種細(xì)胞和組織中，用生化方法純化本發(fā)明的哺乳動(dòng)物PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。為了制備天然產(chǎn)生的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，組織如骨骼肌，特別是人的，是優(yōu)選的。可以使用細(xì)胞系，如橫紋肌肉瘤細(xì)胞系(RD)。
另外，由于可以分離或合成編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的基因，所以如果需要，可以在原核生物或非哺乳動(dòng)物真核生物中合成基本上沒有其它哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)或糖蛋白的PTP-D蛋白質(zhì)。按本發(fā)明的設(shè)想，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如轉(zhuǎn)染的COS，NIH-373或CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的重組PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，例如要么是天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列，要么是修飾的蛋白質(zhì)序列，其中有氨基酸缺失和/或插入和/或取代。用重組方法生產(chǎn)天然產(chǎn)生的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白時(shí)，基本上沒有與其天然相連的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白。
另外，在固相支持物上合成所需序列的多肽并隨后將其從支持物上分離出來的方法是已知的。
另一方面，本發(fā)明提供PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的片段。術(shù)語“片段”用于說明通過適當(dāng)修飾該編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的DNA序列，導(dǎo)致C-末端，N-末端一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上和天然序列內(nèi)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，而從具有天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)序列的PTP-D或糖蛋白中得到的多肽。用PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的片段篩選作為拮抗劑或興奮劑(如下文所定義的)的化合物。應(yīng)明白，上述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白片段可保留天然PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的特征部分。特別是，上述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白片段應(yīng)保留作為完整PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白特征的一種或多種生物活性或功能。(不以任何方式限制本發(fā)明要求的范圍的)PTP-D片段的實(shí)例是a)催化區(qū);b)在完整細(xì)胞內(nèi)，與其它分子相互作用的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白區(qū)域;c)PTP-D的調(diào)節(jié)區(qū)。
另一方面，本發(fā)明通過適當(dāng)修飾編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的DNA序列，導(dǎo)致C末端，N末端的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上和天然序列內(nèi)，增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，提供從天然產(chǎn)生的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白質(zhì)中得到具有附加氨基酸的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。應(yīng)理解，上述含有附加氨基酸的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白可以保留天然PTP-D或糖蛋白的特征部分。尤其是，含附加氨基酸的上述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白應(yīng)保留作為完整PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白特征的一種或多種生物活性或功能。至少應(yīng)被保留的上述特征的實(shí)例是a)催化活性;b)底物特異性;c)與完整細(xì)胞內(nèi)其它分子的相互作用;d)PTP-D的調(diào)節(jié)功能。這些實(shí)例不以任何方式限制本發(fā)明要求的范圍。
另一方面，本發(fā)明通過適當(dāng)修飾或突變編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的DNA序列，導(dǎo)致C末端，N末端，一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上，和天然氨基酸序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，而提供了從天然產(chǎn)生的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白中得到的含取代氨基酸的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。應(yīng)明白，含取代氨基酸的上述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白可保留PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的特征部分。尤其是，含取代氨基酸的上述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白應(yīng)保留作為完整PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白特征的一種或多種生物活性或功能。至少應(yīng)保留的上述特征的實(shí)例是a)催化活性;b)底物特異性;c)在完整細(xì)胞內(nèi)與其它分子的相互作用;d)PTP-D的調(diào)節(jié)功能。這些實(shí)例不以任何方式限制本發(fā)明所要求的范圍。
也可以將缺失、插入和取代的方法結(jié)合進(jìn)行以得到PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的最終構(gòu)建體，提供的最終構(gòu)建體具有完整PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白中所存在的所需活性或功能。上述活性和功能的實(shí)例是a)催化活性;b)底物特異性;c)在體外和體內(nèi)與其它分子的相互作用;d)調(diào)節(jié)功能。在缺失、插入和取代任意組合后，必需僅保留上述活性或功能之一。這些實(shí)例不以任何方式限制本發(fā)明所要求的范圍。顯然，在編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的DNA中進(jìn)行的修飾或突變必須不改變閱讀框架并且最好不產(chǎn)生改變二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)(參見歐洲專利申請(qǐng)No.EP75，444)。
在遺傳水平上，通過位點(diǎn)特異誘變(如Adelman et al.，DNA2∶183(1983)舉征的)編碼肽分子的DNA中的核苷酸，由此生產(chǎn)編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，此后在重組細(xì)胞培養(yǎng)中表達(dá)DNA(見下文)，從而制備含氨基酸缺失，和/或插入，和/或取代的這些PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。含氨基酸的典型缺失和/或插入和/或疊加的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白在通常情況表現(xiàn)出與天然PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白性質(zhì)一樣的生物活性。
另外，用本領(lǐng)域已知的方法，通過直接的化學(xué)合成常規(guī)制備具有氨基酸缺失和/或插入和/或取代的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。
另一方面，本發(fā)明提供由其它PTPases組成的所謂嵌合分子，其中用來自PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的同源序列代替一個(gè)或多個(gè)特定的氨基酸序列。嵌合分子包括，如，具有另一個(gè)PTPase的配體-結(jié)合的細(xì)胞外區(qū)的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，所述的細(xì)胞外區(qū)被移到PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的一部分上。其它嵌合分子包括a)已經(jīng)用PTP-D蛋白質(zhì)的磷酸酶區(qū)取代了其催化磷酸酶區(qū)的其它PTPases。這種情況下，優(yōu)選的氨基酸數(shù)是220到260之間。b)用其它PTPases的同源部分取代了其一部分或幾部分催化區(qū)的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。c)由一個(gè)PTP-D亞家族成員取代的嵌合分子，其中，其一部分或幾部分已被PTP-D亞家族一個(gè)(或幾個(gè))其它成員的同源部分取代。
將“同源序列”定義為在兩種或多種PTPases中，位于一級(jí)序列中的相似位置且可表現(xiàn)序列同源性的序列。應(yīng)強(qiáng)調(diào)，“同源序列”不應(yīng)限定為具有高度同源性的情況。嵌合分子是闡明結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系和鑒別特定化合物(藥物)的重要工具。因此，最有用的嵌合體經(jīng)常是(但不總是)其中分子的一部分已被另一分子中位于相似位置(但相異)的序列(換句話說，同源的)取代的分子。因此，交換的部位經(jīng)常代表分子中區(qū)別最大的部分。
PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白可含有不是正常PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白部分的其他化學(xué)部分。共價(jià)修飾物也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。通過使PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的靶氨基酸殘基與能與所選擇的側(cè)鏈或末端殘基反應(yīng)的有機(jī)衍生劑反應(yīng)，將上述修飾物導(dǎo)入PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白中。
半胱氨酰殘基通常都與α-鹵代乙酸基(和相應(yīng)的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)以得到羧甲基或羧酰胺甲基衍生物。也可以通過與溴三氟丙酮，α-溴-β-(5-imidozoyl)丙酸，氯乙酰磷酸酯(或鹽)，N-烷基馬來酰亞胺，3-硝基-2-吡啶二硫化物，甲基-2-吡啶二硫化物，對(duì)氯高汞苯甲酸，2-氯汞基-4-硝基苯酚，或氯-7-2-噁-1，3-二唑反應(yīng)衍生半胱氨酰殘基。
通過與焦碳酸二乙酯在PH5.5-7.0反應(yīng)，衍生組氨酰殘基，這是由于這種試劑對(duì)于組氨酰基側(cè)鏈?zhǔn)翘禺愋韵嚓P(guān)的。對(duì)-溴苯甲酰甲基溴也是有用的，最好是在卡可酸鈉，PH6.0完成反應(yīng)。
賴氨酰和氨末端殘基與琥珀或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑衍生之后，影響或逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷。衍生含α-氨基殘基的其它適宜的試劑包括亞氨酸酯如methyl picolinimidate，磷酸吡哆醛;吡哆醛;氯氫硼化物;三硝基苯磺酸;鄰甲基異脲;2，4戊二酮;和轉(zhuǎn)酰氨基酶-催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
通過與一種或幾種常規(guī)試劑，包括苯甲酰甲醛，2，3-丁二酮，1，2-環(huán)己二酮，和茚三酮反應(yīng)，修飾精氨酰殘基。由于胍功能基團(tuán)的高pKa，所以精氨酸殘基的衍生要求在堿性條件下完成。此外，這些試劑可以與賴氨酸以及精氨酸ε-氨基的基團(tuán)反應(yīng)。
特別有興趣地在于將光譜標(biāo)記導(dǎo)入酪氨酰殘基，通過與芳香重氮化合物或四硝基甲烷反應(yīng)，已經(jīng)廣泛地研究了酪氨酰殘基本身的特定改變。通常，用N-乙?；溥蚝退南趸淄榉謩e形成鄰-乙?；野滨：?-硝基衍生物。
通過反應(yīng)碳化二亞胺(R1-N-C-N-R1)如環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-(4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基苯基)碳化二亞胺，可選擇性地修飾羧基側(cè)基團(tuán)(天冬氨?；蚬劝滨；?。此外，通過與銨離子反應(yīng)，可將天冬氨酰和谷氨酰殘基變成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。
經(jīng)常將谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基再酰胺化變成相應(yīng)的谷氨酰和天冬氨酰殘基。另外，在弱酸條件下再酰胺化這些殘基。這些殘基的兩種形式都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
將雙功能試劑的衍生作用用于將肽交聯(lián)到水不溶的支持物基質(zhì)或其它大分子載體上。一般使用的交聯(lián)劑包括如，1，1-雙(重氮基乙?；?-2-苯乙烷，戊二醛，N-羥琥珀酰亞胺酯，例如，含疊氮基水楊酸的酯，同雙官能亞氨酸酯，包括二琥珀酰亞胺酯如，3′3-二硫雙(琥珀酰亞胺-丙酸酯)和雙官能馬來酰亞胺如雙-N-馬來酰亞胺基-1，8-辛烷。象甲基-3-[對(duì)-疊氮基苯基)二硫]丙酰亞胺酯這樣的衍生劑產(chǎn)生在光存在下能形成交聯(lián)的可光敏化中間產(chǎn)物。將美國專利Nos.3，969，287;3，691，016;4，195，128;4，247，642;4，229，537;和4，330，440中描述的易反應(yīng)的水不溶基質(zhì)用于蛋白質(zhì)固定。
其它修飾作用包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基羥基的磷酸化，賴氨酸，精氨酸和組氨酸側(cè)鏈α-氨基的甲基化(Creighton，T.E.，ProteinsStructure and Molecule Properties，W.H.Freeman ＆ Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N末端胺的乙?；?，以及某些情況下，C末端羧基的酰胺化。
上述衍生的部分可提高溶解性，吸附作用，生物半周期，等。這些部分可以可變地消除或減弱蛋白質(zhì)等的任何不需的副作用。已公開了能介導(dǎo)上述作用的部分，如，在Remington′s PharmaceuticalSciences，16th.ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1980)。
另一方面，本發(fā)明涉及與(如圖1和圖2分別提供的)PTP-D1或PTP-D2的氨基酸序列有70%或更多相同性的如上文定義的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。PTP-D1和PTP-D2是在人骨骼肌中表達(dá)的PTP-D亞家族成員的PTP-D蛋白質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明涉及含有PTP-D1或PTP-D2的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。
已經(jīng)證明，PTP-D亞家族的成員，PTP-D1和PTP-D2在人的骨骼肌中表達(dá)。因此，本發(fā)明涉及(但不以任何方式限制)在該組織中表達(dá)的PTP-D1和PTP-D2 PTP-D亞家族的成員。
另一方面，本發(fā)明涉及核酸構(gòu)建體，它含有編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，或編碼具有氨基酸缺失和/或插入和/或取代的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及表達(dá)載體如重組表達(dá)載體形式的核酸序列，以及含表達(dá)載體的原核和真核宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供表達(dá)核酸構(gòu)建體的方法，該構(gòu)建體編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。通過在促進(jìn)上述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白表達(dá)的條件下，在適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞從而生產(chǎn)PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。本領(lǐng)域任一普通專業(yè)人員可以知道用未充分實(shí)驗(yàn)的本發(fā)明核酸構(gòu)建體和寡核苷酸如何鑒別并克隆與本文所述的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白有序列同源性的人或其他哺乳動(dòng)物種的其他PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。此外，本發(fā)明的核酸操作可以將來自特定PTPase的配體-結(jié)合的細(xì)胞外區(qū)移到PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白部分上，得到嵌合PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。上述嵌合分子的非限制實(shí)例包括含是一種表皮生長因子受體，成纖維細(xì)胞生長因子受體等配體-結(jié)合細(xì)胞外區(qū)的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。遺傳工程方法加工的嵌合受體是現(xiàn)有技術(shù)已知的(參見，如Riedel et al.，Nature 324∶628-670(1986))。在基因治療中，可以使用如上述的，編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，以及編碼含氨基酸缺失和/或插入和/或取代的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，和編碼嵌合PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核酸構(gòu)建體。通過融合用正常PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白轉(zhuǎn)染的所需譜系的細(xì)胞(如造血細(xì)胞，)代替導(dǎo)致疾病的不正常或機(jī)能障礙的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。另外，可將攜帶所選配體(如EGF)受體的嵌合PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的細(xì)胞用于上述基因治療。
可通過各種方法，如DNA或RNA合成，或更好的，通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)作為本發(fā)明重組分子的核酸構(gòu)建體。由，例如，Wu等人(Prog.Nucl.Acid.Res，Molec.Biol.21∶101-141(1978))公開了有關(guān)合成上述分子的技術(shù)。由Sambrook等人(Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))公開了按上述方法生產(chǎn)構(gòu)建重組分子的過程。
最好處理本發(fā)明重組DNA分子的3′末端，使其不適合于聚合作用。通過用化學(xué)方法封阻末端，或修飾末端堿基使得它們從空間上干擾多聚酶反應(yīng)，從而完成上述處理。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過固定3′末端，如將其與固體支持物(如玻璃，塑料，乳汁，等)結(jié)合完成上述處理。支持物可以是任何形式的，如片，棒條，球形，卵形體等。上述固定的方法是本領(lǐng)域普通專業(yè)人員已知的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重組DNA分子的3′末端共價(jià)地結(jié)合到固體支持物上?？梢杂瞄g隔區(qū)域?qū)⑻结樠由斓焦腆w支持物外，只有(1)它不會(huì)從空間上妨礙重組分子的功能或特征，和(2)間隔區(qū)的序列不參予檢測中的雜交或聚合反應(yīng)。通常需將數(shù)個(gè)，且最好大量的上述重組DNA分子固定到支持物上。
將代表PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白一部分的寡核苷酸用于篩選編碼上述PTP-D蛋白質(zhì)和糖蛋白的存在以及篩選PTP-D基因克隆。由，例如，Wu等人(同上文)公開了合成上述寡核苷酸的技術(shù)。
用溴化氰，或蛋白酶如木瓜蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶等(Oike et al.，J.Biol.Chem.257∶9751-9758(1982);Liu et al.，Int.J.Pept.Protein Res.21∶209-215(1983))將蛋白質(zhì)分子切成片段。由于遺傳密碼是簡并的，可以用一種以上密碼子編碼一種特定的氨基酸(Watson，J.D.，InMolecular Biology of Gene，4th.ed.Benjamin/Cummings Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，CA(1987))。用遺傳密碼，可以鑒別一種或多種不同的寡核苷酸，其每一種均能編碼氨基酸。在真核細(xì)胞中考慮不正常的堿基配對(duì)關(guān)系，和其中一種特定密碼子實(shí)際使用(以編碼一種特定氨基酸)的頻率?？梢怨烙?jì)事實(shí)上一種特定寡核苷酸組成實(shí)際XXX-編碼序列的可能性。由Lathe等人(J.Molec.Biol.183∶1-12(1985)公開了上述“密碼使用原則”。用Lathe的“密碼使用原則”，可鑒別含理論上“最大可能的”能編碼PTP-D序列的核苷酸序列的一種寡核苷酸，或一組寡核苷酸。
雖然偶然地，一種氨基酸序列可以僅由一種寡核苷酸編碼，但經(jīng)常地，氨基酸序列可以由任何一組相似的寡核苷酸編碼。重要的是，該組的所有成員都含有能編碼肽片段的寡核苷酸，因此，潛在地含有與編碼肽片段的基團(tuán)相同的寡核苷酸序列，而這組中僅有一個(gè)成員含有與上述基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。由于該成員存在于該組內(nèi)，并且，甚至該組其它成員存在的情況下能與DNA雜交，因此，可以在相同的方法中，使用未分離的一組寡核苷酸，其中只有1種作為一種寡核苷酸，以克隆編碼該肽的基因。
將含理論上能編碼PTP-D片段的“最可能的”序列的寡核苷酸，或一組寡核苷酸用于鑒別能與“最可能的”序列，或一組序列雜交的互補(bǔ)寡核苷酸或一組寡核苷酸序列?？梢詫⒑鲜龌パa(bǔ)序列的寡核苷酸用作探針以鑒別并分離PTP-D基因(Sambrook et al.，同上文)。
鑒別(用上述方法)，合成并用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法與DNA或最好是從能表達(dá)PTP-D基因的細(xì)胞中得到的cDNA制劑雜交能編碼PTP-D基因片段的(或與所述寡核苷酸、或一組寡核苷酸互補(bǔ)的)適宜的寡核苷酸，或一組寡核苷酸?？梢杂帽绢I(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法(Belagaje et al.，J.Biol.Chem.254∶5765-5780(1979);Maniatis et al.，In∶Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression，Nierlich et al.，Ed.，Acad.Press，NY(1976);Wu et al.，Prog.Nucl.Acid Res.Molec.Biol.21∶101-141(1978);Khorana，R.G.Science 203∶614-625(1979))合成互補(bǔ)至“最可能”PTP-D肽編碼序列的單鏈寡核苷酸分子。另外，用自動(dòng)的合成儀器可以完成DNA合成。由Sambrook等人，(同上文)，和由Haymes等人(In∶Nucleic Acid Hybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985))(所述文獻(xiàn)引入本文作為參考)公開了核酸雜交技術(shù)。如，或與上述那些相似的技術(shù)已經(jīng)足夠確保人醛脫氫酶(Hsu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82∶3771-3775(1985))，粘連蛋白(Suzuki et al.，EMBO J.4∶2519-2524(1985))，人雌激素受體基因(Walter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82∶7889-7893(1985))，組織型血纖維蛋白溶酶原激活劑(Pennica et al.，Nature 301∶214-221(1983))和人末期胎盤堿性磷酸酶互補(bǔ)DNA(Kam et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82∶(715-8719(1985))的克隆。
在其它克隆PTP-D基因途徑中，通過將DNA或最好cDNA(來自能表達(dá)PTP-D的細(xì)胞)克隆到表達(dá)載體中，制備表達(dá)載體文庫。然后從該文庫中篩選能表達(dá)蛋白質(zhì)的成員，所述蛋白能與抗-PTP-D抗體結(jié)合，并含有能編碼多肽的核苷酸序列。所述多肽與PTP-D或其片段有相同的核苷酸序列。在該實(shí)施方案中，從能表達(dá)PTP-D蛋白質(zhì)的細(xì)胞中提取并純化DNA，或最好是cDNA。將純化的cDNA制成片段(經(jīng)切割，內(nèi)切酶消化，等)以得到DNA或cDNA片段庫。然后將來自該庫的DNA或cDNA片段克隆到表達(dá)載體中，以便得到其每個(gè)成員含唯一一個(gè)克隆DNA或DNA片段的表達(dá)載體基因文庫。
“表達(dá)載體”是一種(由于存在適宜的轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)譯控制序列)能表達(dá)克隆到載體中的DNA(或cDNA)分子并由此能生產(chǎn)多肽或蛋白質(zhì)的載體。當(dāng)將表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，則會(huì)發(fā)生克隆序列的表達(dá)。如果使用原核表達(dá)載體，則適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞可以是任何能表達(dá)克隆序列的原核細(xì)胞。相似地，如果使用真核表達(dá)載體，則適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞可以是任何能表達(dá)克隆序列的真核細(xì)胞。重要的是，由于真核DNA可含有插入序列，且由于在原核細(xì)胞中不能正確地加工上述序列，所以，最好使用能表達(dá)PTP-D的細(xì)胞的cDNA以便生產(chǎn)原核基因表達(dá)載體文庫。由Sambrook等人(同上文)公開了制備cDNA和生產(chǎn)基因文庫的方法。
用常規(guī)技術(shù)，包括用于連接的平整末端或交錯(cuò)末端，限制酶消化以提供適當(dāng)?shù)哪┒?，按適當(dāng)?shù)模瑝A性磷酸酶處理填平粘性末端，從而避免不必要的連接，并用適當(dāng)?shù)倪B接酶連接，可以將編碼本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，或編碼本發(fā)明有氨基酸缺失和/或插入和/或取代的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，或編碼本發(fā)明嵌合分子的DNA序列與載體DNA重組。上述操作技術(shù)是由Sambrook等人(同上文)公開的并且是本領(lǐng)域已知的。
如果核酸構(gòu)建體包含了含轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信息的核苷酸序列并將上述序列“可操作地連接”到編碼多肽的核苷酸序列中，則該核酸構(gòu)建體，如DNA是能表達(dá)多肽的。一種可操作連接是其中以上述方法將調(diào)節(jié)DNA序列與需表達(dá)的DNA序列連接以便進(jìn)行基因表達(dá)?；虮磉_(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)的精確性質(zhì)隨生物不同而不同，但通過應(yīng)包括一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，在原核細(xì)胞中，它含有啟動(dòng)子(引起RNA轉(zhuǎn)錄開始)以及，轉(zhuǎn)錄成RNA后，將發(fā)生蛋白質(zhì)合成開始信號(hào)的DNA序列。上述區(qū)域通常包括涉及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯開始的5′-非編碼序列，如TATA盒，帽序列，CAAT序列，等。
如果需要，用上述方法也可以得到3′到蛋白質(zhì)編碼基因序列的非編碼區(qū)。保留該區(qū)域作為轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)序列，如終止和聚腺苷作用。因此，通過保留編碼蛋白質(zhì)DNA序列的天然鄰接的3′區(qū)，可以提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。若在表達(dá)宿主細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的功能不能令人滿意，則可取代宿主細(xì)胞中的3′功能區(qū)。
如果兩個(gè)DNA序列之間連接的性質(zhì)不(1)導(dǎo)致導(dǎo)入框移突變，(2)干擾啟動(dòng)子區(qū)序列指導(dǎo)PTP-D基因序列轉(zhuǎn)錄的能力，或(3)干擾由啟動(dòng)子區(qū)序列轉(zhuǎn)錄PTP-D基因序列的能力，則就說這兩個(gè)DNA序列(如一種啟動(dòng)子區(qū)序列和一種PTPase編碼區(qū))是可操作連接的。如果啟動(dòng)子可影響該DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則可將啟動(dòng)子區(qū)操作連接到DNA上。因此，為了表達(dá)蛋白質(zhì)，由適當(dāng)宿主識(shí)別的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯信號(hào)是必需的。
啟動(dòng)子是一種能結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)“可操作連接的”核酸序列轉(zhuǎn)錄的雙鏈DNA或RNA。按本文所用的，“啟動(dòng)子序列”是在由RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的DNA或RNA鏈上存在的啟動(dòng)子序列?！皢?dòng)子序列補(bǔ)體”是其序列為“啟動(dòng)子序列”補(bǔ)充物的核酸分子。因此，如果朝“啟動(dòng)子序列”或“啟動(dòng)子序列補(bǔ)體”延伸，則將毗連單鏈“啟動(dòng)子序列補(bǔ)碼”的引物DNA或RNA或“啟動(dòng)子序列”延伸時(shí)，產(chǎn)生含功能啟動(dòng)子的雙鏈分子。該功能啟動(dòng)子將指導(dǎo)與含“啟動(dòng)子序列”的雙鏈分子的那條鏈(并不是含“啟動(dòng)子序列補(bǔ)體”的那條分子鏈)可操作相連的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。
特定的RNA聚合酶對(duì)上述啟動(dòng)子表現(xiàn)出高度的特異性。已非常詳細(xì)地定性了噬菌體T7，T3和SP-6的RNA聚合酶的特征，且它們表現(xiàn)出高度的啟動(dòng)子特異性。對(duì)每個(gè)RNA聚合酶特異的啟動(dòng)子序列也直接控制聚合酶只利用雙螺旋DNA模板兩個(gè)鏈中的一條鏈。由啟動(dòng)子序列的定向決定選擇哪條鏈轉(zhuǎn)錄。由于通過將核苷酸5′磷酸加到3′羥基末端，僅僅是酶聚合RNA，所以這種選擇確定了轉(zhuǎn)錄的方向。
若以要么使兩個(gè)序列都被轉(zhuǎn)錄到相同的RNA轉(zhuǎn)錄本上，要么允許轉(zhuǎn)錄一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本，在一個(gè)序列中開始，延伸到第二個(gè)序列中的方式將核酸分子的兩個(gè)序列互相連接起來，則稱這兩個(gè)序列是“可操作連接的”。如果在啟動(dòng)子序列中開始的轉(zhuǎn)錄會(huì)產(chǎn)生一個(gè)可操作連接的第二序列的RNA轉(zhuǎn)錄本，則，這兩個(gè)序列，如一個(gè)啟動(dòng)子序列和任何其它的DNA或RNA“第二”序列是可操作連接的。為了進(jìn)行“可操作連接”，這兩個(gè)序列與另一個(gè)不必是緊密鄰近的。
因此，如上文所述，為了起啟動(dòng)子的作用，啟動(dòng)子序列必須作為雙鏈分子存在。為了本發(fā)明的目的，功能啟動(dòng)子序列的兩個(gè)鏈一個(gè)叫做“轉(zhuǎn)錄本”鏈，一個(gè)叫“互補(bǔ)鏈”?！稗D(zhuǎn)錄本”鏈?zhǔn)怯蒖NA聚合酶轉(zhuǎn)錄的雙螺旋的那條鏈(即作為轉(zhuǎn)錄模板的)?！盎パa(bǔ)”鏈?zhǔn)蔷哂信c“轉(zhuǎn)錄本”互補(bǔ)的序列且必須存在的，與“轉(zhuǎn)錄本”鏈雜交的鏈以便發(fā)生轉(zhuǎn)錄。因此，當(dāng)啟動(dòng)子序列的“轉(zhuǎn)錄本”鏈與第二序列是可操作連接時(shí)，在聚合酶存在的情況下，“轉(zhuǎn)錄本”鏈與“互補(bǔ)”鏈的雜交可引起“轉(zhuǎn)錄本”鏈的轉(zhuǎn)錄，并且用“轉(zhuǎn)錄本”鏈作為模板可產(chǎn)生一個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本。
本發(fā)明的啟動(dòng)子序列可以是原核的，真核的或病毒的。適宜的啟動(dòng)子是可抑制的，或最好是組成型的。適宜的原核啟動(dòng)子的實(shí)例包括能識(shí)別T4(Malik et al.，J.Biol.Chem.263∶1174-1181(1984);Rosenberg et al.，Gene 59∶191-200(1987);Shinedling et al.，J.Molec.Biol.195∶471-480(1987);Hu et al.，Gene 42∶21-30(1986)).T3，Sp6，和T7(Chamberlin et al.，Nature 228∶227-231(1970);Bailey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A)80∶2814-2818(1983);Davanlook et al.，Proc.Natl.Acad.Sci(U.S.A)81∶2035-2039(1984))聚合酶的啟動(dòng)子;噬菌體λ的PR和PL啟動(dòng)子(The Bacteriophage Lambda，Hershey，A.D.Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1973);Lambda Ⅱ，Hendrix，R.W.Ed.，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1980));大腸桿菌的trp，recA，熱激活，和lacZ啟動(dòng)子，枯草桿菌的α淀粉酶(Ulmanen et al.，J.Bacteriol.162∶176-182(1985))和ζ-28-特異性啟動(dòng)子(Gilman et al.，Gene 32∶11-20(1984));芽孢桿菌的噬菌體啟動(dòng)子(Gryczan，T.J.，In∶The Molecular Biology of the Bacilli Academic Press，Inc.NY(1982));鏈霉菌啟動(dòng)子(Ward et al.，Mol.Gen.Genet.203∶468-478(1986));λ噬菌體的int啟動(dòng)子;pBR322β-乳糖酶的bla啟動(dòng)子，(pRB325的乙酰氯霉素轉(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動(dòng)子);等。由Glick，B.R.(J.Ind.Microbiol.1∶277-282(1987));Cenatiempo，Y.(Biochimie 68∶505-516(1986));Watson等人(In∶Molecular Biology of Gene，F(xiàn)ourth.Edition.Benjamin Cummins，Menlo Park，CA(1987));和Gottesman，S.(Ann.Rev.Genet.18∶415-442(1984))綜述了原核啟動(dòng)子。優(yōu)選的真核啟動(dòng)子包括小鼠金屬硫蛋白Ⅰ基因的啟動(dòng)子(Hamer et al.，J.Mol.Appl.Gen.1∶273-288(1982));SV40早期啟動(dòng)子(Benoist et al.，Nature(London)290∶304-310(1981));和酵母gal4基因啟動(dòng)子(Johnston et al.，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)79∶6971-6975(1982);Silveret al.，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)81∶5951-5955(1984))。
上文所列的所有文獻(xiàn)均插入本文作為參考。
強(qiáng)啟動(dòng)子是優(yōu)選的。上述優(yōu)選的啟動(dòng)子的實(shí)例是識(shí)別T3，SP6和T7聚合酶的啟動(dòng)子，小鼠金屬硫蛋白Ⅰ基因的PL啟動(dòng)子。用于PTP-D真核表達(dá)最優(yōu)選的啟動(dòng)子如在pLSV載體中啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的SV40啟動(dòng)子(Livneh et al.，(1986)J.Biol.Chem.261∶12490-12497)。由Watson等人(In∶Molecular Biology of the Gene，F(xiàn)ourth Edition，Benjamin/Cummings Publishing Co.，Inc.，Menlo Park，(1987))公開了上述聚合酶識(shí)別位點(diǎn)的序列。
另一方面，本發(fā)明涉及能特異性識(shí)別PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白或者能特異性識(shí)別PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的抗原決定簇的抗體。
可以在PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白不正常表達(dá)或激活引起的疾病診斷方法中使用重組表達(dá)或天然產(chǎn)生的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，和/或識(shí)別PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的抗體。本發(fā)明提供判斷主體中正?；蛲蛔働TP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在或水平的方法。個(gè)體中，PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的缺乏，或更典型地，低水平表達(dá)，突變PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在可以作為對(duì)致腫瘤基因變態(tài)和癌癥發(fā)生敏感度的重要預(yù)測指標(biāo)。另外，可能歸因于對(duì)負(fù)調(diào)節(jié)不敏感的突變受體/酶系統(tǒng)，或歸因于體內(nèi)刺激配體過多而產(chǎn)生的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的過度表達(dá)，可作為對(duì)糖尿病敏感度的重要預(yù)測指標(biāo)。
本發(fā)明也涉及用上述抗體檢測細(xì)胞，細(xì)胞或組織提取物，或生物體液中PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在，或測量其數(shù)量或其濃度。
一方面，本發(fā)明涉及檢測細(xì)胞中PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在或測量其數(shù)量的方法，包括
(a)將所述細(xì)胞或其提取物與對(duì)PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的抗原決定簇特異性的抗體接觸;和
(b)檢測所述抗體與所述細(xì)胞或其提取物的結(jié)合，或測量結(jié)合的抗體量。
由此，檢測所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在或測量其數(shù)量。
術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體，單克隆抗體(mAbs)，嵌合抗體，抗個(gè)體基因型(抗-Ⅰd)抗體。
多克隆抗體是從抗原免疫接種的動(dòng)物血清中得到的抗體分子異源種群。
單克隆抗體(mAbs)是針對(duì)特異性抗原的抗體的基本同源的種群。可以用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的方法得到MAbs參見，如，Kohler等人，(Nature 256∶495-497(1975))和美國專利No.4，376，110。上述抗體可以是包括IgG，IgM，IgE，IgA，GILD的任何免疫球蛋白型和其任何亞型的。可在體外或體內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)本發(fā)明mAbs的雜交瘤。高滴定度mAbs產(chǎn)品的體內(nèi)生產(chǎn)使其成為目前優(yōu)選的生產(chǎn)方法。總之，將來自個(gè)體雜交瘤的細(xì)胞經(jīng)腹膜內(nèi)注射到姥鮫烷灌注的BALB/C小鼠中，以得到含高濃度所需mAbs的腹水。用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的柱層析法，可以從腹水，或培養(yǎng)上清液中純化同型IgM或IgG的MAbs。
嵌合抗體是其不同部分來自不同動(dòng)物種的分子，如含有鼠MAbs的可變區(qū)和人免疫球蛋白不變區(qū)的抗體。嵌合抗體和其生產(chǎn)方法是現(xiàn)有技術(shù)已知的(Cabilly et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 71∶3273-3277(1984);Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.SciUSA 81∶6851-6855(1984);Boulianne et al.，Nature 312∶643-646(1984);Cabilly et al.，歐洲專利申請(qǐng)125023(1984年11月14日公開);Neuberger et al.，Nature 314∶268-270(1985);Taniguchi et al.，歐洲專利申請(qǐng)171496(1985年2月19日公開);Morrison et al.，歐洲專利申請(qǐng)173494(1986年3月5日公開);Neuberger et al.，PCT申請(qǐng)WO 86/01533(1986年3月13日公開);Kudo et al.，歐洲專利申請(qǐng)184187(1986年6月11日公開);Sahagan et al.，J.Immunol.137∶1066-1074(1986);Robinson et al.，國際專利申請(qǐng)＃PCT/US86/02269(1987年5月7日公開);Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84∶3439-3443(1987);Sun et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84∶214-218(1987);Better et al.，Science 140∶1041-1043(1988))。這些文獻(xiàn)由此插入本文作為參考。
抗個(gè)體基因型(抗-Ⅰd)抗體是一種抗體，它識(shí)別通常與抗體的抗原-結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的獨(dú)特的決定簇。針對(duì)所要用制備的抗-Ⅰd的mAb，通過免疫接種與mAb源相同種和基因型的動(dòng)物(如小鼠種)，可以制備抗-Ⅰd抗體。通過產(chǎn)生針對(duì)這些個(gè)體基團(tuán)型的決定簇(抗-Ⅰd抗體)，被免疫的動(dòng)物將識(shí)別并應(yīng)答免疫抗體的個(gè)體基因型決定簇。
也可以用抗-Ⅰd抗體作為“免疫原”以誘導(dǎo)另一動(dòng)物中的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生所謂的抗-抗-Ⅰd抗體。抗-抗-Ⅰd可以與誘導(dǎo)抗-Ⅰd的最初mAb是抗原決定基相同的。因此，使用針對(duì)mAb個(gè)體基因型決定簇的抗體，可以鑒別表達(dá)相同特異性抗體的其它克隆。
相應(yīng)地，可以在適當(dāng)?shù)膭?dòng)物，如BALB/c小鼠中，使用產(chǎn)生的抗本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的mAbs，以誘導(dǎo)抗-Ⅰd抗體。可以用上述免疫小鼠的脾細(xì)胞以生產(chǎn)分泌抗-Ⅰd mAbs的抗-Ⅰd雜交瘤。此外，可以將抗-Ⅰd mAbs與載體如匙孔
形血蘭蛋白(KLH)結(jié)合，并可將其用于免疫接種其它的BALB/c小鼠。這些小鼠的血清將含有抗-抗-Ⅰd抗體，所述抗體具有對(duì)PTP-D抗原決定基特異性的最初mAb的結(jié)合特性。
因此抗-Ⅰd mAbs有其自己的個(gè)體基因型抗原決定基，或具有與所判斷的，如PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白抗原決定基結(jié)構(gòu)相似的“idiotopes”。
術(shù)語“抗體”意思是包括能結(jié)合抗原的完整分子及其片段，如Fab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段沒有完整抗體的Fc片段，能更快速地從循環(huán)中清除，且比完整抗體有更低的非特異性組織結(jié)合(Wahl et al.，J.Nucl.Med.24∶316-325(1983))。
應(yīng)知道，按本文公開的用于完整抗體分子的方法，可以將本發(fā)明中使用的Fab和F(ab′)2以及抗體的其它片段用于檢測并定量PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。用酶，如木瓜酶(以生產(chǎn)Fab片段)或胃蛋白酶(以生產(chǎn)F(ab′)2片段)，經(jīng)蛋白水解裂解，通常產(chǎn)生上述片段。
可以將本發(fā)明中使用的抗體，或抗體片段用于定量或定性地檢測是否存在表達(dá)PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的細(xì)胞。通過使用與光學(xué)顯微鏡、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或熒光檢測相結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體(見下文)的免疫熒光技術(shù)，達(dá)到上述目的。
可以將本發(fā)明中使用的抗體(或其片段)用于組織學(xué)上，如在免疫熒光或免疫電子顯微鏡檢查中，原位檢測PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。從患者中取出組織學(xué)樣品，并將本發(fā)明的標(biāo)記抗體提供給上述樣品，從而可完成原位檢測。最好通過將標(biāo)記抗體(或片段)用于或覆蓋在生物學(xué)樣品上，從而提供抗體(或片段)。通過使用上述方法，不僅可確定PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在，而且可確定其在檢測組織上的分布。使用本發(fā)明，普通技術(shù)人員可以很容易理解，可改變?nèi)魏胃鞣N組織學(xué)方法(如染色方法)以便完成上述原位檢測。用于PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的上述檢測方法，一般包括存在能鑒別PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的可檢測標(biāo)記抗體的情況下，培養(yǎng)生物樣品，如生物體液，組織提取物，新鮮收集的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞，或已在組織培養(yǎng)中培養(yǎng)的細(xì)胞，并用本領(lǐng)域許多已知技術(shù)中的任一種方法檢測抗體。
可以用固相支持物如硝酸纖維素，或其它能固定細(xì)胞，細(xì)胞顆?；蚩扇艿鞍踪|(zhì)的固體支持物處理生物樣品。然后，可以用適當(dāng)?shù)木彌_液洗滌支持物，接著用可檢測標(biāo)記的PTP-D特異性抗體處理。然后可以用緩沖液第二次洗滌固相支持物以除去未結(jié)合的抗體。用常規(guī)方法可以檢測在所述固體支持物上結(jié)合的標(biāo)記量。
“固相支持物”是指能結(jié)合抗原或抗體的任何支持物。已知的支持物，或載體包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龍，淀粉酶，天然和改性的纖維素，聚丙烯酰胺，輝長巖，及磁鐵礦。從本發(fā)明目的來說，載體的性質(zhì)可以是溶解到一定程度或不可溶的。支持物可以有實(shí)質(zhì)上任何可能的結(jié)構(gòu)形狀，只要被結(jié)合的分子能夠與抗原或抗體結(jié)合。因此，支持物的形狀可以是球形的，如小珠，或圓柱體，如檢測試管的內(nèi)表面或棒的外表面。另外，表面可以是平的，如片，檢測條，等。優(yōu)選的支持物包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員還知道許多其它的適用于結(jié)合抗體或抗原的載體，或者通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)的使用，可以確定它們。
按已知的方法，可以確定所得的許多抗-PTP-D抗體的結(jié)合活性。使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可以確定每個(gè)檢測的可操作和最佳檢測條件。
按具體情況是常規(guī)的還是必需，可將其它步驟如洗滌、攪拌、搖動(dòng)、過濾等加到檢測分析中。
一個(gè)方法是將PTP-D特異性抗體結(jié)合到酶上并在酶免疫檢測(EIA)中使用，其中PTP-D特異性抗體是可檢測標(biāo)記的。若此后與適當(dāng)?shù)牡孜锝佑|，酶依次以上述方法與底物反應(yīng)以產(chǎn)生如，用分光光度，熒光或肉眼法可檢測的化學(xué)部分?？捎糜跈z測標(biāo)記的酶包括，但不限于，蘋果酸脫氫酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-甾類異構(gòu)酶，酵母醇脫氫酶，α-磷酸甘油脫氫酶，磷酸丙糖異構(gòu)酶，辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，過氧化氫酶，葡糖-6-磷酸脫氫酶，葡糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。通過使用有關(guān)酶生色底物的比色方法完成檢測。與相似制備的標(biāo)準(zhǔn)物比較，通過肉眼比較底物的酶反應(yīng)程度，完成檢測。
可以用任何各種其它的免疫檢測法完成檢測。例如，用放射性標(biāo)記的抗體或抗體片段，通過使用放射免疫檢測法(RIA)(參見，如Work et al.，Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，North Holland Publishing Company New York，(1978)，該文獻(xiàn)引入本文作為參考)可檢測PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。借助于如γ計(jì)數(shù)器或閃爍計(jì)數(shù)器的方法或放射自顯影檢測放射性同位素。
也可以用熒光化合物標(biāo)記抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體與適當(dāng)波長的光接觸量，由于熒光可檢測其存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物是熒光素異硫氰酸鹽，若丹明，藻紅素，藻青素，別藻蘭蛋白，鄰-苯二醛和熒光胺。
用熒光發(fā)射金屬如152Eu或鑭系的其它金屬，也可以可檢測性標(biāo)記抗體。用上述金屬螯合基團(tuán)如二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)，可將這些金屬吸附到抗體上。
通過與化學(xué)發(fā)光化合物結(jié)合，也可以標(biāo)記抗體使之可檢測。檢測化學(xué)反應(yīng)期間產(chǎn)生的發(fā)光，可以確定化學(xué)發(fā)光-標(biāo)記抗體的存在。特別有用的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的實(shí)例是魯米諾，異魯米諾，
theromatic acridinium ester，咪唑，acridinium鹽和草酸酯。
同樣地，也可以用生物發(fā)光化合物標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是生物系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種化學(xué)發(fā)光類型，其中催化蛋白質(zhì)提高了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過檢測是否存在發(fā)光可以確定生物發(fā)光蛋白質(zhì)的存在。用于標(biāo)記目的的重要發(fā)光化合物是熒光素，熒光素酶和
aeluorin。
本發(fā)明也涉及檢測主體中是否存在編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核酸構(gòu)建體，或編碼突變PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核酸構(gòu)建體的方法，包括
(a)在雜交條件下，將所述主體的細(xì)胞或其提取物與編碼至少部分所述正常或突變PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的寡核苷酸探針接觸，和
(b)測量所述探針與所述細(xì)胞核酸進(jìn)行雜交，由此檢測所述核酸構(gòu)建體的存在。
該方法在步驟(a)前可包括步驟(c)。步驟(c)用于經(jīng)多聚酶鏈反應(yīng)，選擇性地?cái)U(kuò)增所述細(xì)胞編碼所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核酸數(shù)量。
用編碼各種PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白(見上文)部分的寡核苷酸探針檢測來自主體的細(xì)胞是否存在編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的DNA或RNA序列。由，例如Wu等人(Prog.Nucl.Acid Res.Molec.Biol.21∶101-141(1978))公開了合成上述探針的技術(shù)。優(yōu)選的探針是指向核酸序列的探針，該核酸序列編碼本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的至少4個(gè)氨基酸殘基，且最好是5個(gè)氨基酸殘基(參見下文實(shí)施例4)。用上述探針可進(jìn)行定性或定量的檢測。例如，用Northern分析(見下文實(shí)施例3)測量細(xì)胞或組織制品中PTP-D mRNA，如PTP-D1 mRNA和PTP-D2 mRNA的表達(dá)。
甚至用從個(gè)體中得到的很少量的DNA，接著使用選擇性擴(kuò)增技術(shù)，完成上述方法。能擴(kuò)增純化核酸片段的重組DNA方法已被認(rèn)識(shí)很久了。一般，上述方法涉及將核酸片段導(dǎo)入DNA或RNA載體中，載體的克隆擴(kuò)增，擴(kuò)增核酸片段的回收。由Cohen等人(美國專利No.4，237，224);和Sambrook等人(同上文)(上述文獻(xiàn)引入本文作為參考)提供上述方法的實(shí)施例。
最近，已經(jīng)描述了能增加上述所需核酸分子濃度的體外酶法。該方法叫做“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”(Mullis et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51∶263-273(1986);Erlich，EP50，424;EP84，796;EP258，017;EP237，362;Mullis，K.，EP201，184;Mullis et al.，US.4，683，202;Erlich，H.U.S.4，582，788;和Saiki et al.，U.S.4，683，194)。
本發(fā)明也涉及鑒別化學(xué)或生物制品中能與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白結(jié)合的化合物的方法，該方法包括
(a)將所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白或其化合物結(jié)合的部分附著到固相基質(zhì)上;
(b)將所述化學(xué)或生物制品與所述固相基質(zhì)接觸以使所述化合物結(jié)合，并洗滌掉未結(jié)合的物質(zhì);和
(c)檢測與所述固相結(jié)合的所述化合物的存在。
本發(fā)明也涉及從復(fù)合混合物中分離能與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白結(jié)合的化合物的方法，該方法包括
(a)將所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，或化合物結(jié)合的部分附著到固相基質(zhì)上;
(b)將所述的復(fù)合混合物與所述固相基質(zhì)接觸以使所述化合物結(jié)合，并洗滌掉任何未結(jié)合的物質(zhì);和
(c)洗脫所結(jié)合的化合物。
由此分離所述的化合物。
“能與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白結(jié)合的化合物”是指與PTP-D外的磷酸酶區(qū)催化位點(diǎn)相互作用的天然產(chǎn)生或合成生產(chǎn)的分子?！按呋稽c(diǎn)”是指含磷酸酶活性的PTP-D的最小鄰近的部分。所述化合物可直接或間接地調(diào)整PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的酶活性。上述化合物的實(shí)施是(ⅰ)與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白相互作用且由PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白去磷酸化的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，(ⅱ)由其它類型細(xì)胞生產(chǎn)的天然產(chǎn)生的分子。
PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的“化合物結(jié)合部分”是指催化位點(diǎn)外的分子部分。不是催化位點(diǎn)部分的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的任何部分都可以是化合物結(jié)合部分。通過蛋白水解裂解，接著用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的常規(guī)純化方法，可以從天然產(chǎn)生或重組表達(dá)的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白中制備“化合物結(jié)合的部分”。另外，可以用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的重組技術(shù)，通過在適當(dāng)細(xì)胞中只表達(dá)PTP-D的這些部分來制備PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的化合物結(jié)合的部分。
另一方面，本發(fā)明涉及篩選定義為直接或間接抑制PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白酶活性或激活的分子的拮抗劑的方法。另一方面，本發(fā)明涉及篩選定義為直接或間接提高PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的酶活性或激活作用的興奮劑的方法。
在篩選能激活或抑制磷酸酶活性，并由此影響細(xì)胞代謝主要途徑的藥物和其它試劑的方法中，使用本發(fā)明的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。通過將完整的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白或PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白片段附著到固相基質(zhì)上，產(chǎn)生一種親和探針，可以用該探針，基于它的自結(jié)合活性，篩選與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白有相互作用能力的生物產(chǎn)品或化學(xué)試劑。然后從親和探針上洗脫純化形式的結(jié)合物質(zhì)。
可以用PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，或者有氨基酸缺失和/或插入和/或取代以及有酶活性的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白檢測能增強(qiáng)或抑制磷酸酶活性的化合物?？梢栽隗w外系統(tǒng)檢測所檢測化合物改變磷酸酶活性的能力，其中將檢測化合物加到純化PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，或者有氨基酸缺失和/或插入和/或取代并有酶活性的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白中，用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)酶法測定對(duì)酶活性的影響。
通過有限的蛋白水解處理天然產(chǎn)生的或重組表達(dá)的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，可以制備篩選中所用的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的適當(dāng)片段。另外，通過重組技術(shù)可以生產(chǎn)PTP-D的適當(dāng)片段。作為一個(gè)實(shí)例(該實(shí)例不以任何方式限制本發(fā)明所要求的范圍)，可以最好只使用用于篩選目的的催化區(qū)。可以用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員已知的重組技術(shù)，在適宜的宿主(如大腸桿菌)中，生產(chǎn)單獨(dú)或作為融合蛋白的一部分的上述催化區(qū)，它們只由對(duì)于酶活性所必需的最小數(shù)目的氨基酸組成。
另外，用活的或固定細(xì)胞，或從活的或固定細(xì)胞中得到的膜部分測定在整個(gè)細(xì)胞制劑中，一種化合物對(duì)PTPase活性的影響。該方法用于篩選直接對(duì)PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的酶活性部分起作用的化合物。如果PTP-D分子或糖蛋白有細(xì)胞外受體部分，則該方法可用于篩選經(jīng)細(xì)胞外受體部分起作用的化合物。將檢測化合物與(表達(dá)大量本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的)細(xì)胞，如轉(zhuǎn)染的COS或NIH-3T3細(xì)胞或從中得到的膜制劑一起培養(yǎng)。然后用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法(Honegger，et al.，Cell 51∶199-209(1987);Margolis et al.，Cell 57∶1101-1107(1989))測量細(xì)胞磷酸酪氨酸的數(shù)量。將結(jié)果與沒有要檢測化合物，或沒有或有已知的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白激活劑時(shí)得到的結(jié)果比較。在上述研究中，也可以測定在酪氨酸激酶激活劑存在的條件下，檢測化合物的作用。
刺激PTPase活性的化合物會(huì)引起磷酸酪氨酸量的凈減少，而抑制PTPase活性的化合物會(huì)引起磷酸酪氨酸量的增加。
生長因子受體是酪氨酸激酶的情況下，如表皮生長因子(EGF)和血小板-衍生的生長因子(PDGF)的受體，酪氨酸磷酸化都與細(xì)胞生長和腫瘤基因變態(tài)有關(guān)。導(dǎo)致去磷酸化的PTPase激活可作為防止或抑制生長的反調(diào)節(jié)機(jī)制，并可能作為抵抗癌癥的內(nèi)源調(diào)節(jié)機(jī)制。因此，這種受體酶系統(tǒng)的突變或不良調(diào)節(jié)可能促進(jìn)對(duì)癌癥的敏感性。
胰島素受體也是一種酪氨酸激酶，攜帶胰島素受體的細(xì)胞中，酪氨酸的磷酸化可能與正常的生理功能有關(guān)。與細(xì)胞生長和癌癥的情況相反PTPase的激活會(huì)抵消胰島素的作用。次正常的PTPase水平或酶活性會(huì)起作用以除去正常的反調(diào)節(jié)機(jī)制?？赡芨匾氖牵Ｍㄟ^PTPase的超-活性，或不適宜的激活，可抑制或完全阻止胰島素對(duì)細(xì)胞的作用而導(dǎo)致糖尿病(胰島素-抗性變種)。因此，對(duì)糖尿病敏感可能與PTPase失調(diào)有關(guān)。
因此，本發(fā)明中鑒別正常或突變PTP-D基因，或測量與細(xì)胞或組織有關(guān)的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的數(shù)量或活性的方法，可作為鑒別易感癌癥，糖尿病，或其它與細(xì)胞磷酸酪氨酸代謝改變有關(guān)的疾病的方法。
本發(fā)明也涉及使用藥物組合物中的上述所鑒別的拮抗劑或興奮劑，所述藥物組合物用于治療帶有正?；虿徽TP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白表達(dá)的疾病。該組合物一般可以是用于系統(tǒng)化或局部的注射或輸液的形式，并且例如，也可與適當(dāng)?shù)妮d體配制在一起用于注射或輸液。
本發(fā)明也涉及預(yù)防或治療與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的激活有關(guān)的方法，該方法包括，給患者施用其需要的，有效劑量的本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白或本發(fā)明的抗體或者刺激或抑制本發(fā)明PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白酶活性的分子。
在下文所示的實(shí)施例中將進(jìn)一步說明本發(fā)明。這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)鑒別新的PTPase亞家族
用硫氰酸胍/CsCl方法(Chirgwin et al.，Biochem.18∶5293-5299(1979))從人骨骼肌中分離總的RNA。在寡(dT)纖維素柱上分離Poly(A+)RNA(Aviv et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 58∶1408-1412(1972))。用寡(dT)引發(fā)和來自Gibco BRL 的Moloney Murine Leukemia Virus RNase H逆轉(zhuǎn)錄酶(Gaithersburg MD 20877 U.S.A)按制造商的說明，從2μg poly(A)+合成第一條cDNA鏈。
用多聚酶鏈反應(yīng)(Saiki et al.，Science 239∶487-491(1988))分離相當(dāng)于骨骼肌中所表達(dá)的PTPases的cDNA?？傊?，用Gene Amp Kit(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT，U.S.A)用下列一組簡并的寡核苷酸引物擴(kuò)增從上文得到的人肌肉第一條cDNA鏈(相當(dāng)于約50mg)。
有意義引物(寡核苷酸 no.58)
5'A(CT)TT(CT)TGG(ACG)(AG)AGATG(AG)T(TCGA)TGG 3'
有意義引物(寡核苷酸 no.57)
5'CC(TCGA)A(CT)(AGT)CC(ATC)GC(AG)CT(GA)CAGTG 3'
相當(dāng)于下列氨基酸一致序列的引物
有意義引物(寡核苷酸＃58)FWXMXW
反意義引物(寡核苷酸＃57)HCSAG(S/I/V/)G
每個(gè)PCR循環(huán)包括在94℃經(jīng)1分鐘的變性步驟，37℃經(jīng)2分鐘的退火步驟，72℃，2分鐘的延伸步驟。完成30到40個(gè)循環(huán)。將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。分離所期望大小的片段(以已經(jīng)描述的PTPases的結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ))，用T4克隆系統(tǒng)(Invitrogen，San Diego，California)亞克隆并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如在Current Protocols in Molecular Biology，eds.F.M.Ausubel et al.，John Wiley ＆ Sons，New York，(1988)中描述的)，用Sanger等人描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶5463-5467(1977))的酶鏈終止法定序(Sequenase，U.S.Biochemicals)。在圖1和圖2中分別列出了兩個(gè)PCR片段的部分DNA序列和推測的氨基酸序列，叫做PTP-D1和PTP-D2。用CLUSTAL程度
(Higgins，C.，F(xiàn)uch，R.，and Bleasby，D.，Multiple Sequence Alignment;CABIOS(1991)(在印刷))將推測的氨基酸序列與圖3A中的PTPase 1B比較。
看起來，兩個(gè)片段都與其它已知的PTPases有明顯的同源性，但令人驚奇的是，還有有關(guān)該酶類的未描述的特征(用University of Wisconsin，Genetics Computer Group Program分析)。
下面列出了與以前描述的已知PTPases的一致序列相比，PTP-D1和PTP-D2的特有特征(劃線處表示不同)
1.PTP-D1/D2SXXYWP [SEQ ID NO.6]
一致序列 CXXYWP [SEQ ID NO.2]
3.PTP-D1/D2IAMVXXXXE [SEQ ID NO.7]
一致序列(I/V/L)V(M/I/L)(V/L/I/M)XXXXE
實(shí)施例2
PTP-D亞家族成員的cDNA克隆
按實(shí)施例1中所述，從人骨骼肌中制備mRNA。用Okayama和Berg(Mol.Cell.Biol.2∶161-170(1982);Okayama and Berg，Mol.Cell.Biol.3∶280-289(1983))描述的方法構(gòu)建cDNA文庫。用pCDVI-PL制備引物片段(Noma et al.，Nature 319∶640-646(1986))。按最近的描述(Boel et al.，Bio Techniques 11∶xx(1991))用一個(gè)短的合成連接物作為第二條鏈的引物。按H.Inuoue等人(Gene 96∶23-28(1990))的方案，將大腸桿菌DH52(Gibco BRL，Gaithersburg，MD 20877，U.S.A)用于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，將細(xì)胞以每板15，000-20，000個(gè)菌落的密度在LB平板(含50μg氨芐青霉素/ml)上培養(yǎng)。
用標(biāo)準(zhǔn)菌落雜交技術(shù)(Maniatis et al.，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，second edition(1988))篩選硝酸纖維素復(fù)制物濾膜(Scleicher ＆ Schuell，BA85)。合成下列的寡核苷酸，用T4多核苷酸激酶和[γ-32P]ATP(Amersham)在5′末端標(biāo)記，并用于篩選cDNA文庫
5′ATA GCA ATG GTG ACA GCA GAA 3′[SEQ.ID NO.14]
該寡核苷酸相當(dāng)于實(shí)施例1中第1個(gè)PCR片段的氨基酸序列Ile-Ala-Met-Val-Thr-Ala-Glu。將50ml雜交溶液(6×SSC，5×Denhardt′s溶液，0.05%SDS(Current Protoco)s in Molecular Biology，eds.F.M.Ausubel et al.，John Wiley ＆ Sons，New York(1988))中的10皮摩爾標(biāo)記的寡核苷酸加到復(fù)制硝酸纖維濾膜中，并在42℃雜交3小時(shí)。在室溫用6×SSC，0.05%SDS將濾膜洗滌3次，在42℃洗一次，最后在48℃洗一次。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Maniatis et al.，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，second edition(1988))分離經(jīng)放射自顯影鑒別的陽性菌落。在圖4中顯示了稱為PTP-D1的一個(gè)陽性克隆的部分序列以及推測的氨基酸序列。該部分序列包括上述第1號(hào)PCR片段的序列，從而證明所分離的cDNA克隆的等同性。再者，與前面描述的PTPases比較結(jié)果表明PTP-D1至少有一個(gè)額外的獨(dú)有特征(不同處劃線表示)
3.PTP-D1 GYINAS [SEQ ID NO.5]
一致序列 N/DYINAS/N [SEQ ID NO.4]
實(shí)施例3
PTP-D1和PTP-D2的Northern印跡分析
按Puissant等人(Bio Techniques 8∶148-149(1990))描述的酸性硫氰酸胍-酚-氯仿提取法，從人骨骼肌中分離總RNA。在寡(dT)柱(Avir et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69∶1408-1412(1972))上分離poly(A)+RNA。將15μgpoly(A)+RNA放在檢測PTP-D表達(dá)的泳道中，將7.5μg放在分析PTP-D2表達(dá)的泳道中，在瓊脂糖-甲醛凝膠中分離RNA并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Bilolgy，eds.F.M.Ausubel et al.，John Wiley ＆ Sons，New York(1988))吸印到硝酸纖維濾膜上。將濾膜與相當(dāng)于PTP-D1和PTP-D2所示序列的32P-標(biāo)記的cDNA片段雜交。用Randon Primers DNA Labeling System(Cat.no.8187SA，Bethesda Reasearch Laboratories，Gaithersburg，MD 20877，U.S.A)按制造商的說明，完成32P-標(biāo)記。隨后，將濾膜暴露于X射線膠片。Northern印跡分析表明，骨骼肌中PTP-D1和PTP-D的主要轉(zhuǎn)錄物分別為6.5Kb和11kb。
實(shí)施例4
鑒別PTP-D亞家族的新成員
分別從下列組織和細(xì)胞系骨骼肌、肝、胎盤，HepG2(美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC)HB8065)RD(ATCC CCL 136)(Puissant et al.，Biotechniques 8∶148-149(1990))中分離總RNA。在寡(dT)柱(Aviv et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69∶1408-1412(1972))上分離poly(A)+RNA。按實(shí)施例1中的描述完成第一條cDNA鏈的合成。用標(biāo)準(zhǔn)條件(PCR Technology-Principles and Applications for DNA Amplification，Erlich，H.E.ed.，Stockton Press，New York(1989))，將來自上述組織和細(xì)胞系中的cDNA制劑單獨(dú)進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)。用下列引物進(jìn)行擴(kuò)增
有意義引物
(寡核苷酸no.58，參見本發(fā)明實(shí)施例1)與另兩個(gè)反意義引物結(jié)合
寡核苷酸no.250(相當(dāng)于PTP-D1和PTP-D2的氨基酸序列CYATTG[SEQ ID NO.15])
C 5'AG(TCGA)CC(TCGA)GT(TCGA)GT(TCGA)GC(AG)TA(AG)CA
FR[SEQ. ID NO. 16]
寡核苷酸no.251(相當(dāng)于PTP-D1的氨基酸序列QERTVW[SEQ ID NO.17])
5'GGT(TCGA)AC(TCGA)GT(TCGA)C(TG)(TC)TC(TC)T
完成30到40個(gè)PCR循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。分離所期望大小的片段(寡核苷酸nos.58和250結(jié)合物約為190bp左右;寡核苷酸的Nos.58和251結(jié)合物約為235bp左右)，切成平整末端，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons，New York，(1988))亞克隆到pGEM3載體(Promega)中。用測序酶(United States Biochemical，Cleveland.Ohio 44122，U.S.A)經(jīng)酶鏈終止方法(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶5463-5467(1977))測定亞克隆PCR片段的序列。將核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列與PTP-D1和PTP-D2的序列比較。將與PTP-D1/PTP-D2和/或PTP-D1/D2序列相比表現(xiàn)出70%或更多相同性的克隆鑒定為本發(fā)明的PTP-D亞家族成員。
實(shí)施例5
檢測編碼PTP-D蛋白質(zhì)的核酸的存在
從細(xì)胞系HepG 2(美國典型培養(yǎng)物收集中心(ATCC)HB8065)和RD(ATCC CCL 136)(Puissant et al.，Biotechniques 8∶148-149(1990))中分離總RNA。在寡(dT)柱(Aviv ＆ Leder，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69∶1408-1412(1972))上分離poly(A)+RNA。按實(shí)施例1中所述，完成第一條cDNA鏈的合成。用標(biāo)準(zhǔn)條件(PCR Technology-Principles and Application for DNA Amplification，Erlich，H.E.ed.，Stockton Press，New York(1988))，使cDNA進(jìn)行多聚酶鏈反應(yīng)。用下列引物進(jìn)行擴(kuò)增
有意義引物
5'ATAGCAATGGTGACAGCAGAA 3'
反意義引物
5'CGCCC(A/G)A(C/T)(T/C/G/A)CC(T/C/G/A)GC(T/C/G/A)CT
(G/A)CAGTG [SEQ. ID NO. 20]3'
完成35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。分離所需大小的片段(360bp)，切成平整末端，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆Sons，New York，(1988))亞克隆到pGEM3載體(Promega)中。用測序酶(United States Biochemical，Cleveland.Ohio 44122，U.S.A)吸收使用酶鏈終止法(Sanger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74∶5463-5467(1977))進(jìn)行定序。確定亞克隆PCR片段的PTP-D的相同性。
實(shí)施例6
檢測細(xì)胞中PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在并對(duì)其定量
原核表達(dá)載體pGEX的改變
為了提供來自PTP D1(見下文)的cDNA片段，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology，eds.F.M.Ausubel et al.，John Wiley ＆ Sons，New York，1988)改變pGEX2T載體(Pharmacia，Uppsala，Sweden)克隆位點(diǎn)。用限制酶BamHI和EcoRI消化pGEX 2T載體，并分離。將下列寡核苷酸連接到消化的pGEX 2T載體中。
5'GATCTCCGAATTCCATGGATCCAGGCCTCTAGAAGCTTAC 3'
3'AGGCTTAAGGTACCTAGGTCCGGAGATCTTCGAATGTTAA 5'
由此得到有下列克隆位點(diǎn)的載體pGEX-AK2
5′EcoR I，NcoI，BamH I，StuI，XbaI，HindⅢ 3′在大腸桿菌中表達(dá)GST-PTP D1融合蛋白
用限制酶EcoRI和Bgl Ⅱ消化編碼PTP D1的cDNA(實(shí)施例2)。消化后，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Current Protocols in Molecular Biology，eds.F.M.Ausubel et al.，John Wiley ＆ Sons，New York，1988)分離一個(gè)約1600bp的片段并將其連接到pGEX-AK2(用EcoRI和BamHI消化)。插入片段相當(dāng)于本發(fā)明圖4中所示PTP D1的編碼區(qū)(即它編碼272個(gè)氨基酸)和3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)的約800bp。將編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和PTP D1(Smith et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83∶8703-8707(1988))的pGEX-AK2/PTP D1載體構(gòu)建體導(dǎo)入大腸桿菌的DH5α菌株(Cat.No.8263SA，Bethesda Researeh Laboratories，Gaithersburg，MD)和SURETM(Cat.No.200294，Stratagene，La Jolla，CA 92037)中。
使培養(yǎng)過夜的已轉(zhuǎn)化大腸桿菌在LB培養(yǎng)基中生長并用新鮮的培養(yǎng)基以1∶10稀釋，并生長1小時(shí)。加入異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)以達(dá)到0.5mM(DH5α)和5mM(SURE)的最終濃度，并進(jìn)一步培養(yǎng)4小時(shí)。對(duì)照1)含或不含IPTG的pGEX-AK2;2)不加入IPTG的pGEX-AK2/PTP D1。從包含體中將GST-PTP D1融合蛋白分離為一種不可溶產(chǎn)物(在含1.0%(體積/體積)Triton×100的50mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)緩沖液，PH，7.5中洗滌3次)或者按制造商說明用谷胱甘肽-Sepharose 4B親和層析(Cat.No.17-0756-01 Pharmacia，Uppsala，Sweden)分離為一種可溶蛋白。
生產(chǎn)對(duì)PTP D1特異性的抗體
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Practical Immunology 3rd.Edition，L.Hudson ＆ F.C.Hay，Blackwell，Oxford(1989))生產(chǎn)對(duì)PTP D1特異性的抗血清。簡而言之，將在200μl磷酸緩沖鹽中的200μg GST-PTP D1融合蛋白與等體積弗氏完全佐劑(Sigma，Cat.No.F5881)結(jié)合，并肌肉內(nèi)注射到兩只新西蘭兔的大腿肌肉中。每個(gè)兔接受100μg的融合蛋白。第一次注射兩個(gè)星期后，進(jìn)行輔助注射(與開始免疫的方法一樣，但沒有弗氏佐劑)。再過2個(gè)星期后，從每個(gè)兔中取20ml血液。在玻璃試管中，使血液在室溫凝集1小時(shí)，從試管孔，將凝塊弄松散后，離心。將血清轉(zhuǎn)移到新試管中并在-20℃貯存至使用。
為了除去與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)反應(yīng)的抗體，用上述方法(在大腸桿菌中表達(dá)GST-PTP D1融合蛋白)，使血清通過已用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶飽和的谷胱甘肽-Sepharose 4B柱。利用pGEX-AK2構(gòu)建體生產(chǎn)GST蛋白質(zhì)。使血清通過柱3次以確保完全除去抗-GST抗體。按下文所述(“檢測細(xì)胞系中PTP-D1的存在并測量其數(shù)量”)通過Western印跡評(píng)估除去的效率。
檢測細(xì)胞系中PTP-D1的存在并測量其數(shù)量
用抗-PTP D1抗體檢測哺乳動(dòng)物細(xì)胞中PTP D1的表達(dá)。按標(biāo)準(zhǔn)方法的熒光免疫將提供有關(guān)在特定細(xì)胞系和組織中表達(dá)的資料。甚至更重要的是，可以用抗體制劑確定細(xì)胞系和組織中的數(shù)量。作為抗-PTP D1抗體的后面申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施例，下文將描述RD細(xì)胞系(美國典型培養(yǎng)物收集中心CCL136)中PTP D1的檢測。應(yīng)強(qiáng)調(diào)，該實(shí)施例不以任何方式限制使用可用于檢測其它細(xì)胞和組織中存在的PTP D1的抗體。同樣地，在純化PTP D1和確定其它類型的檢測方法時(shí)，該抗體制劑也是有用的。
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在含有帶Hank′s平衡鹽溶液的2倍正常濃度的氨基酸和維生素以及10%(V/V)胎牛血清(Gibco-BRL)的基本培養(yǎng)基(Eagle，Cat No.041-022570，Gibco，Life Technologies Ltd Paisley，Scotland)中培養(yǎng)RD(胚胎橫紋肌肉瘤;人)細(xì)胞系。
用磷酸緩沖鹽將細(xì)胞洗滌2次并除去上清液。將一個(gè)10cm組織培養(yǎng)平板上的細(xì)胞溶解于800μl Triton×100溶菌緩沖液(20mM HEPES PH 7.5，50mM NaCl，10%甘油，1.0%Triton×100，1.5mM MgCl2，4mM乙二醇雙(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA，Sigma ED2SS)，10μg/ml抑肽酶，1mM氟化苯基乙基磺酰(PMSF))，離心并將上清液以等分貯存在-80℃，直到使用。將1到50μl的這種溶菌產(chǎn)物與25μl SDS樣品緩沖液(62.5mM Tris-Cl PH7.0，3.0%(W/V)SDS，10%(V/V)甘油，10%2-巰基乙醇，和0.05%(W/V)溴酚藍(lán))混合，煮沸5分鐘，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(7.5%)分離，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Burnette，W.N.(1981)Anlyt.Biochem.112∶195-201)吸印在硝酸纖維素上。通過使用來自與RD細(xì)胞溶解產(chǎn)物平行的大腸桿菌生產(chǎn)的GST-PTP D1融合蛋白的限定量。制定定量確定PTP D1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將硝酸纖維濾膜與每升磷酸緩沖鹽(PBS)中2克奶粉(Carnation，脫脂干牛奶，Carnation，Los Angeles)一起培養(yǎng)30分鐘以阻斷非特異性結(jié)合，用含0.02%(V/V)Tween 20(Sigma P1379)(PBS-Tween)和0.2%(W/V)明膠(BioRad Cat.No.170-6537，Richmond，California)的PBS洗滌2次，用PBS-Tween洗滌3次，最后與1∶200稀釋(用PBS-Tween)的上述抗-PTP D1抗體制劑一起培養(yǎng)4小時(shí)。用PBS-Tween洗滌3次后，將濾膜與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗-兔IgG(Cat.No.170-6525，BioRad)一起培養(yǎng)。用PBS-Tween將濾膜洗滌3次，按制造商的說明(Cat.No.RPN 2106，Amersham，UK)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的技術(shù)(ECL)確定兔抗的數(shù)量，由此確定PTP D1的數(shù)量。通過將RD細(xì)胞中得到的信號(hào)與用大腸桿菌產(chǎn)生的GST-PTP D1融合蛋白得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可以確定RD細(xì)胞系生產(chǎn)的PTP D1量。
實(shí)施例7
鑒別刺激或抑制PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白酶活性的分子
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons，New York，(1988))，將含PTP D1完整編碼區(qū)或其功能部分的cDNA插入到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA Ⅰ(Cat.No.V490-20，Invitrogen，San Diego)中。用由Gorman等人(Virology 171∶377-385(1989))描述的293細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)有酶活性的PTP D1。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，在5%CO2，37℃時(shí)在用10%(V/V)胎牛血清(Gibco)補(bǔ)充的Dulbecco′s Modified Eagle Medium(Cat.No.0041-02430，Gibco，Life Technologies Ltd.，Paisley，Scotland)中培養(yǎng)293細(xì)胞。
將10μg質(zhì)粒載體PTP-D1/pcDNA I與0.5ml 0.25M CaCl2和0.5ml 2×BBS(50mM N，N-雙(羥乙基)-2-氨基乙烷-磺酸(BES)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4)混合，并如Chen ＆ Okayama(Mol.Cell.Biol.7∶2745-2752(1987))描述，將其用于轉(zhuǎn)染在10cm培養(yǎng)皿中的1.5×106203細(xì)胞。加入Ca-磷酸鹽DNA沉淀后，細(xì)胞在3%CO2下，于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，并用由10%胎牛血清補(bǔ)充的DMEM洗滌一次，并在5%CO2下，在新鮮培養(yǎng)基中于37℃再培養(yǎng)24小時(shí)。除去培養(yǎng)基，并將細(xì)胞溶解在1.0ml的溶解緩沖液(20mM HEPES PH 7.5，150mM NaCl，10%甘油，1.0%Triton×100，1.5mM MgCl2，4mM乙二醇雙(β-乙氨醚)N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA，Sigma ED2SS)，10μg/ml抑肽酶，1mM PMSF)中。在4℃將細(xì)胞溶解物以2500×g離心2分鐘。除去上清液，將100μl等分樣品迅速冷凍在液氮中并在-70℃貯存至使用。
用不同的底物估算PTP-D1磷酸酶活性的潛在抑制劑或刺激劑1)磷酸對(duì)硝基苯酯(pNP-P;Sigma 104-0);2)32P-標(biāo)記的Raytide(Oncogene Science Inc.Manhasset，NY);3)32P-標(biāo)記的牛髓磷脂堿性蛋白(MBP)。進(jìn)一步分析可降低或增加PTP-D1對(duì)一種或多種這些底物的活性的底物。
基本按N.K Tonks等人(J.Biol.Chem.236∶6731-6737(1988)))所述測定PTP-D1對(duì)pNP-P的活性。用微滴定板，在室溫，將10μl上述293溶解產(chǎn)物與100μl pNP-P(分別30，和100mM)一起培養(yǎng)。用Dynatech MR500讀數(shù)器每隔一分鐘讀一次吸收值。在加入pNP-P前5分鐘，將需分析具刺激或抑制活性的底物加到PTP-D1/293細(xì)胞溶解產(chǎn)物中。
用32P標(biāo)記Raytide和髓磷酯堿性蛋白
基本按Krueger等人(EMBO J.9∶3241-3252(1990))所述測量PTP-D1對(duì)32P-標(biāo)記的Raytide的活性。按制造商的說明(Oncogene Science)作微小改變，使用酪氨酸激酶p60c-arc將合成的肽Raytide進(jìn)行32P標(biāo)記。簡而言而，將2μl的p60c-arc與20μl Raytide(1mg/ml)和108μl的激酶緩沖液(含10mM MgCl2，0.2%(V/V)β-巰基乙醇，30μM ATP和50μCi[γ-32P]ATP的50mM HEPES PH7.5)混合。將混合物在37℃培養(yǎng)16小時(shí)，并通過加入500μl溶于20mM Na2HPO4和100μl 5mg/ml的乙酰化牛血清白蛋白中的20%(W/V)三氯乙酸(TCA)，來停止反應(yīng)。將混合物離心，用20%TCA/20mM NaH2PO4將沉淀洗滌3次，最后，重新溶解于0.2M Tris-Cl pH8.0中。
按Guan等人(Nature 350∶359-362(1991))所述，用與標(biāo)記Raytide相似的方法標(biāo)記髓磷脂堿性蛋白(Sigma)。在含下列組成的60μl反應(yīng)物中標(biāo)記30μg MBP50mM HEPES緩沖液，PH7.5，10mM MgCl2，0.067%β-巰基乙醇;包括150μCi[γ-32P]ATP的0.05mM ATP，和4U p43v-abl激酶(Oncogene Science)。在30℃，將混合物培養(yǎng)60分鐘，通過加入冰-冷三氯乙酸以達(dá)到20%的終濃度而停止反應(yīng)。在冰上30分鐘后，用20%TCA洗滌3次并重新溶于100μl H2O中。
使用Raytide或MBP檢測PTPase活性
將5μl 10xPTPase緩沖液(25mM HEPES PH7.3，5mMEDTA，10mM二硫蘇糖醇)與a)5μl32P-標(biāo)記的Raytide或MBP(相當(dāng)于每分鐘10-20×104計(jì)算)，b)分別為5，10和25μl的PTP-D1/293細(xì)胞溶解產(chǎn)物，和c)H2O混合以達(dá)到50μl的終體積。在37℃培養(yǎng)30分鐘后停止反應(yīng)。如果是Raytide，通過加入0.75ml的酸性活性炭混合物(Krueger et al.，EMBO J.9∶3241-3252(1990)0.9M HCl，90mM焦磷酸鈉，2mM NaH2PO4，4%(V/V)Norit A(Sigma))終止反應(yīng)。混合并離心后，除去400μl的上清液，并測量放射性活性量。若用MBP作為底物，則加入20%TCA(最終體積)停止反應(yīng)。測量上清液中的32P量。
在開始檢測前5分鐘，將需分析其刺激或抑制活性的底物加到PTP-D1/293細(xì)胞中。
序列目錄
1.一般資料
(ⅰ)申請(qǐng)人Ullrich，Axel
Moller，Niels P.H.
Moller，Karin B.
(ⅱ)發(fā)明的題目蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的PTP-D亞家族
(ⅲ)序列數(shù)38
(ⅳ)有關(guān)的地址
(A)收信人Sterne，Kessler，Goldstein ＆ Fox
(B)街道1225Connecticut Avenun，N.W.
(C)城市華盛頓
(D)州D.C
(E)國家U.S.A
(F)郵政編碼20036
(V)計(jì)算機(jī)可讀形式
(A)介質(zhì)類型Floppy disk
(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容性
(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS
(D)軟件Patent In Release ＃1.0，Version ＃1.25
(ⅵ)目前的申請(qǐng)資料
(A)申請(qǐng)?zhí)柎谟?br> (B)申請(qǐng)日
(C)分類號(hào)
(ⅷ)代理人/代理資料
(A)姓名Shaffer，Robin E.
(B)登記號(hào)34，249
(C)證明/公文號(hào)1406.0150000
(ⅸ)通訊資料
(A)電話(202)833-7533
(B)傳真(202)833-8716
2.SEQ ID NO1的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)湮镄蛢煞N都有
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置6
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可以由天冬酰氨取代”。
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO1
Asp Tyr Ile Asn Ala Ser
1 5
(2)SEQ ID NO2的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)二種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO2
Cys Xaa Xaa Tyr Trp Pro
1 5
(2)SEQ ID NO3的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度8個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)二種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可以由纈氨酸取代”。
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO3
Ile Val Met Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
1 5
(2)SEQ ID NO4的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可以由天冬酰胺取代”。
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置6
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可以由天冬酰胺取代”。
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO4
Asp Tyr Ile Asn Ala Ser
(2)SEQ ID NO5的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置6
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可以由天冬酰胺取代”。
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO5
Gly Tyr Ile Asn Ala Ser
(2)SEQ ID NO∶6的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO6
Ser Xaa Xaa Tyr Trp Pro
(2)SEQ ID NO∶7的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度9個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO7
Ile Ala Met Val Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
(2)SEQ ID NO8的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置6
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可以由天冬酰胺取代”。
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO8
Asn Tyr Ile Asn Ala Ser
(2)SEQ ID NO9的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度9個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置1
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可以由纈氨酸或亮氨酸取代”。
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置3
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可由亮氨酸或異亮氨酸取代”。
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置4
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可由亮氨酸，異亮氨酸或甲硫氨酸取代”。
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO9
Ile Val Met Val Xaa Xaa Xaa Xaa Glu
1 5
(2)SEQ ID NO10的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度30個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO10
ACTTTCTTGG ACGAGAGATG AGTTCGATGG 30
(2)SEQ ID NO11的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度30個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO11
CCTCGAACTA GTCCATCGCA GCTGACAGTG 30
(2)SEQ ID NO12的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO12
Phe Trp Xaa Met Xaa Trp
1 5
(2)SEQ ID NO13的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度7個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞肽
(B)位置6
(D)其它資料/注＝“該氨基酸可由異亮氨酸或纈氨酸取代”。
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO13
His Cys Ser Ala Gly Ser Gly
1 5
(2)SEQ ID NO14的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度21個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO14
ATAGCAATGG TGACAGCAGA A 21
(2)SEQ ID NO15的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO15
Cys Tyr Ala Thr Thr Gly
(2)SEQ ID NO16的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度34個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO16
AGTCGACCTC GAGTTCGAGT TCGAGCAGTA AGCA 34
(2)SEQ ID NO17的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度6個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO17
Gln Glu Arg Thr Val Trp
(2)SEQ ID NO18的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度29個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO18
GGTTCGAACT CGAGTTCGAC TGTCTCTCT 29
(2)SEQ ID NO19的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度21個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO19
ATAGCAATGG TGACAGCAGA A 21
(2)SEQ ID NO20的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度23個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞混合特征
(B)位置6
(D)其它資料/注＝“該核苷酸可以由鳥嘌呤取代”
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞混合特征
(B)位置8
(D)其它資料/注＝“該核苷酸可以由胸腺嘧啶取代”
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞混合特征
(B)位置9
(D)其它資料/注＝“該核苷酸可以由胞嘧啶，鳥嘌呤或腺嘌呤取代”
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞混合特征
(B)位置12
(D)其它資料/注＝“該核苷酸可以由胞嘧啶，鳥嘌呤或腺嘌呤取代”
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞混合特征
(B)位置15
(D)其它資料/注＝“該核苷酸可以由胞嘧啶，鳥嘌呤或腺嘌呤取代”
(ⅸ)特征
(A)名稱/關(guān)鍵詞混合特征
(B)位置18
(D)其它資料/注＝“該核苷酸可以由腺嘌呤取代”
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO20
CGCCCAACTC CTGCTCTGCA CTG 23
(2)SEQ ID NO21的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度40個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO21
GATCTCCGAA TTCCATGGAT CCAGGCCTCT AGAAGCTTAC 40
(2)SEQ ID NO22的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度40個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO22
AATTGTAAGC TTCTAGAGGC CTGGATCCAT GGAATTCGGA 40
(2)SEQ ID NO23的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度261個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO23
(2)SEQ ID NO24的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度87個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO24
(2)SEQ ID NO25的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度270個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO25
(2)SEQ ID NO26的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度90個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO26
(2)SEQ ID NO27的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度60個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO27
(2)SEQ ID NO28的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度60個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO28
(2)SEQ ID NO29的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度60個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO29
(2)SEQ ID NO30的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度60個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO30
(2)SEQ ID NO31的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度29個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO31
(2)SEQ ID NO32的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度27個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO32
(2)SEQ ID NO33的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度300個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO33
(2)SEQ ID NO34的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度270個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO34
(2)SEQ ID NO35的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度150個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO35
(2)SEQ ID NO36的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度90個(gè)氨基酸
(B)類型氨基酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO36
(2)SEQ ID NO37的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度877個(gè)堿基對(duì)
(B)類型核酸
(C)鏈型兩種
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型DNA
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO37
(2)SEQ ID NO38的資料
(ⅰ)序列特征
(A)長度272個(gè)氨基酸
(B)類型核酸
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種
(ⅱ)分子類型肽
(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO38
權(quán)利要求
1、一種PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，其中若所述的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白是天然產(chǎn)物，則所述的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白基本沒有與其天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，含有包括一個(gè)，2個(gè)或3個(gè)選自下列氨基酸序列的催化磷酸酶區(qū)
1.GYINAS/N [SEQ ID NO.5]
2.SXXYWP [SEQ ID NO.6]
3.IAMVXXXXE [SEQ ID NO.7]。
3、根據(jù)權(quán)利要求1的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，它不是天然存在的。
4、根據(jù)權(quán)利要求3的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，它有缺失的氨基酸。
5、根據(jù)權(quán)利要求3的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，有額外的氨基酸。
6、根據(jù)權(quán)利要求3的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，它有取代的氨基酸。
7、根據(jù)權(quán)利要求1的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，它是天然產(chǎn)生的，且基本沒有與其相關(guān)的其它蛋白質(zhì)或糖蛋白。
8、根據(jù)權(quán)利要求1的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，含有與圖1中所示的PTP-D1的氨基酸序列有70%或更多同源性的氨基酸序列。
9、根據(jù)權(quán)利要求8的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，是PTP-D1。
10、根據(jù)權(quán)利要求1的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，含有與圖2所示的PTP-D2的氨基酸序列有70%或更多相同性的氨基酸序列。
11、根據(jù)權(quán)利要求10的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，它是PTP-D2。
12、一種含編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核苷酸序列的重組核酸構(gòu)建體。
13、根據(jù)權(quán)利要求12的重組核酸構(gòu)建體，是cDNA序列。
14、根據(jù)權(quán)利要求12的重組核酸構(gòu)建體，它是基因組DNA序列。
15、根據(jù)權(quán)利要求12的重組核酸構(gòu)建體，有SEQ ID NO.23的核苷酸序列(圖1)。
16、根據(jù)權(quán)利要求12的重組核酸構(gòu)建體，有SEQ ID NO.25的核苷酸序列(圖2)。
17、根據(jù)權(quán)利要求12的重組核酸構(gòu)建體，它是表達(dá)載體。
18、權(quán)利要求17的重組核酸構(gòu)建體，是載體。
19、權(quán)利要求17的重組核酸構(gòu)建體，是質(zhì)粒。
20、一種分離和純化的核酸構(gòu)建體，含有一個(gè)編碼PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核苷酸序列。
21、根據(jù)權(quán)利要求20的分離的和純化的核酸構(gòu)建體，含有SEQ ID NO.23的核苷酸序列(圖1)。
22、根據(jù)權(quán)利要求20的分離的和純化的核酸構(gòu)建體，含有SEQ ID NO.25的核苷酸序列(圖2)。
23、用權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞。
24、根據(jù)權(quán)利要求23的原核宿主細(xì)胞，是細(xì)菌。
25、用權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞。
26、根據(jù)權(quán)利要求25的真核細(xì)胞，是酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
27、一種制備PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的方法，包括
(a)在培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)能表達(dá)所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的宿主細(xì)胞;
(b)表達(dá)所述的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白;和
(c)從所述培養(yǎng)物中回收所述的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。
28、根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。
29、根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
30、一種PTP-D分子特異性的抗體。
31、根據(jù)權(quán)利要求30的抗體，是單克隆的。
32、根據(jù)權(quán)利要求30的抗體，是多克隆的。
33、一種檢測細(xì)胞中PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的存在或測量其數(shù)量的方法，所述方法包括
(a)將所述細(xì)胞或其提取物與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的抗原決定基特異性的抗體接觸;和
(b)檢測所述抗體與所述細(xì)胞或其提取物的結(jié)合，或測量結(jié)合的抗體數(shù)量。
由此檢測PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的數(shù)量。
34、一種檢測細(xì)胞或主體中編碼PTP-D蛋白的核酸序列，或編碼突變PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的核酸構(gòu)建體的存在的方法，包括
(a)在雜交條件下，將所述主體的細(xì)胞或其提取物與編碼至少部分所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白或至少部分所述突變PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的寡核苷酸探針接觸;和
(b)檢測所述探針與所述細(xì)胞核酸的雜交，由此檢測所述核酸構(gòu)建體的存在。
35、權(quán)利要求34的方法，在步驟(a)之前還包括
(c)選擇性地?cái)U(kuò)增編碼所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的所述細(xì)胞的所述核酸的數(shù)量。
36、一種鑒別化學(xué)或生物制備中，能與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括
(a)將所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，或結(jié)合其部分的化合物附著到固相基質(zhì)上;
(b)將所述的化學(xué)或生物制品與所述固相基質(zhì)接觸以便使所述化合物結(jié)合，洗滌掉未結(jié)合的物質(zhì);和
(c)檢測與所述固相結(jié)合的所述化合物的存在。
37、一種從復(fù)合混合物中分離能與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白結(jié)合的化合物的方法，所述方法包括
(a)將所述的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白，或結(jié)合其部分的化合物附著到固相基質(zhì)上;
(b)將所述復(fù)合混合物與所述固相基質(zhì)接觸以使所述化合物結(jié)合，并洗滌掉未結(jié)合的物質(zhì);和
(c)洗脫所述結(jié)合的化合物，
由此分離所述化合物。
38、一種鑒別能刺激或抑制PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白酶活性的方法，所述方法包括
(a)將所述化合物與純化形式的，膜制劑中的，或完整活的細(xì)胞或固定細(xì)胞中的所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白接觸;
(b)將步驟(a)的所述混合物培養(yǎng)足夠的時(shí)間;
(c)測定所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的酶活性;
(d)與沒有所述化合物培養(yǎng)的所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的酶活性進(jìn)行比較，
由此，檢測所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白是否刺激或抑制所述活性。
39、根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中步驟(a)中的所述PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白是PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的片段。
40、一種治療或防止帶有不正常PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的疾病的藥物組合物，所述組合物含有PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白和藥物學(xué)可接受的載體。
41、一種治療或防止帶有不正常PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的疾病的藥物組合物，所述組合物含有一種以刺激或抑制PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的酶活性有效量的分子。
42、一種治療或防止主體中，帶有不正常PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的疾病的方法，包括給所述主體施用權(quán)利要求40的所述組合物。
43、一種治療或防止主體中，帶有不正常PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的疾病的方法，包括給所述主體施用權(quán)利要求41的所述組合物。
44、一種藥物組合物，含有PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白和藥物學(xué)可接受的載體。
45、一種藥物組合物，含有一種以刺激或抑制PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白有效量的分子。
46、一種治療或防止主體中疾病的方法，包括給所述主體施用權(quán)利要求44的所述組合物。
47、一種治療或防止主體中疾病的方法，包括給所述主體施用權(quán)利要求45的所述組合物。
全文摘要
鑒別一種蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的新亞家族(PTP-D)。該家族中包括的是，已知蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶的催化磷酸酶區(qū)，以前定義的一致序列中，有一個(gè)，兩個(gè)，或3個(gè)所鑒定的氨基酸變化的PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白?？梢杂弥亟M方法生產(chǎn)PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白。提供抗PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白的抗體以及為其編碼的核酸構(gòu)建體，篩選能與PTP-D蛋白質(zhì)或糖蛋白結(jié)合并抑制或刺激其酶活性的分子的方法。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1091139SQ93117790
公開日1994年8月24日 申請(qǐng)日期1993年8月5日 優(yōu)先權(quán)日1992年8月5日
發(fā)明者A·鳥爾里希, N·P·H·莫勒, K·B·莫勒 申請(qǐng)人:馬克斯普朗克科學(xué)促進(jìn)協(xié)會(huì)