專利名稱：生物漂白用木聚糖酶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種得自變鉛青鏈霉菌(Streptomyceslividans)的高比活性木聚糖酶，尤其是這些酶在木質纖維材料方面的應用。
植物細胞壁的內聚現象首先是由于其主要成分的存在;結晶聚合物、纖維素和三維大分子、木質素一起構成一種木質纖維材料。該木質纖維材料嵌在果膠和各種性質的半纖維多糖的基質中。
通常認為這些不同的聚合物之間存在的各種關系是由不同化學性質的鍵確定的。例如，木質素塊是通過半纖維素鏈結合的。半纖維素(木質纖維材料的另一主要成分)大多由4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖組成，它包括D-木糖的β-1，4-連接聚合物，本文稱作木聚糖。通常，硬木紙漿的木聚糖含量較軟木紙漿高。該木聚糖可通過內-木聚糖酶、β-1，4-D-木聚糖的木聚糖水解酶(指EC3.2.1.8)酶催化水解成木糖。
以前已證實木質纖維材料中所含的木聚糖可通過使用內-木聚糖酶而部分或全部分解，這為生產紙漿的物理和/或化學方法均能提供有吸引力的選擇方案，它能改善紙漿性質，例如，改善漂白率或提高白度。用木聚糖酶改善紙漿性能，尤其是提高白度，稱為“生物漂白”。
現已表明用木聚糖酶處理紙漿，尤其是化學紙漿具有生物漂白作用，它能提高經處理紙漿的白度和粘度，同時能減少后續(xù)漂白步驟中氯和其它漂白劑的消耗。因此，與不用內-木聚糖酶處理的普通紙漿漂白工藝相比，已證明用木聚糖酶處理能改善紙漿性能，并能減少漂白過程的環(huán)境影響。
而且，也已證明通過半纖維素裂解而致使木質素釋放對于防止某些紙漿性能如粘度降低是有特效的，其原因是由于纖維素酶，通常最好是基本上游離纖維素酶木聚糖酶混合物而使纖維素水解。
各種生產木聚糖酶的方法在生物漂白工業(yè)中是公知的。然而，優(yōu)選的方法是使用如鏈霉菌(Streptomyces)屬的重組微生物，它能進行培養(yǎng)以用于生產游離纖維素酶、內-木聚糖酶。
盡管生物漂白具有許多優(yōu)點，但目前未能在工業(yè)上實施，因為酶處理的成本很高。通常，這種高處理成本是由于目前所能得到的內-木聚糖酶的活性低造成的。
酶是生物反應中能起催化劑作用的蛋白質。說明酶催化活性的一種簡單方法是用以IU/mg表示的其比活性，即每單位酶用量所生成的產品量。術語IU(國際單位)指在確定PH和溫度條件下，每分鐘催化轉化1質量單位底物酶的量。
至今，文獻中描述的木聚糖酶具有的比活性范圍為已純化酶的8-3500IU/mg。在此活性范圍內，達到所要效果需用的酶量，其價格是相當高的。
意想不到的是，現在我們已發(fā)現并純化得到一種內-木聚糖酶，它得自鏈霉菌(Streptomyces)屬。更確切地說，它得自變鉛青鏈霉菌種，該菌種具有比以前已知的內-木聚糖酶高得多的比活性。
尤其是，本發(fā)明的內-木聚糖酶能使用于生物漂白過程的木聚糖酶用量大大減少。
因此，最好能提供一種內-木聚糖酶，其比活性高于以前公知的內-木聚糖酶。而且，還希望能提供一種鏈霉菌屬重組微生物，它能進行培養(yǎng)以生產游離纖維素酶、高活性內-木聚糖酶。還進一步希望提供一種用高比活性內-木聚糖酶處理木質纖維材料，尤其是化學紙漿的方法。
因此，本發(fā)明提供的一種高活性內-木聚糖酶自然由鏈霉菌屬菌株得到，或由將雜交質粒引入鏈霉菌屬的寄主微生物突變菌株而產生的重組微生物而得到，所述雜交質粒是通過將一種新木聚糖酶基因(以xlnC表示)插入載體質粒而構建的，這種新木聚糖酶基因得自鏈霉菌屬含木聚糖酶基因的微生物。
最好該載體質粒從鏈霉菌屬的微生物中得到。用于本發(fā)明的優(yōu)選鏈霉菌種是變鉛青鏈霉菌。
高活性內-木聚糖酶的定義為根據BioRadTM的蛋白質測定方法，比活性大于已純化蛋白質(5000IU/mg)的一種木聚糖酶。較好的是內-木聚糖酶的比活性大于20000，更好的是大于30000IU/mg，最好的是大于40000IU/mg。
雖然測得的木聚糖酶比活性會隨所用特定測試方法而變化，但應該注意，如下所述，生物漂白所需的木聚糖酶用量低于以前的用量。
最好，該內-木聚糖酶是基本上游離的纖維素酶。術語“基本上游離的纖維素酶”意思是指那些體系，當酶與纖維素紙漿相接觸時，其所含纖維素酶的量不足以使纖維素中存在的糖苷鍵發(fā)生不適宜的水解。
該內-木聚糖酶也最好是從寄主微生物中得到的，其中寄主微生物突變菌株的特征是具有負纖維素酶活性。負纖維素酶，當用于本文時其定義為能產生游離纖維素酶木聚糖酶的菌株，它基本上不含胞外纖維素酶。
另外，優(yōu)選的內-木聚糖酶是從寄主微生物中得到的，其中寄主微生物突變菌株的特征是具有負木聚糖酶活性。與寄主微生物有關的負木聚糖酶活性定義為一種菌株，它在引入雜交質粒前能產生基本上不含木聚糖酶的酶。
最好內-木聚糖酶是從寄主微生物中得到，其中寄主微生物特征是既具有負纖維素酶又有負木聚糖酶活性。
第二方面，本發(fā)明提供的一種重組微生物含有載帶xlnC基因的雜交質粒，該基因編碼以產生高活性木聚糖酶C酶，其中所述質粒能誘導高活性內-木聚糖酶在該質粒已引入的寄主微生物內胞外產生。
最好，重組微生物含有的雜交質粒能誘導游離纖維素酶、高活性內-木聚糖酶，不含胞外纖維素酶的胞外產生。
此外，重組微生物由寄主微生物得到，其中所述寄主微生物是一種鏈霉菌屬的突變菌株，最好從變鉛青鏈霉菌種得到。
本發(fā)明還提供一種得自寄主微生物的重組微生物，其中寄主微生物特征是具有負纖維素酶和/或負木聚糖酶活性。
因此，寄主微生物最好是變鉛青鏈霉菌種的突變菌株，其中所述寄主微生物特征是具有負纖維素酶活性。更優(yōu)選的是，寄主微生物是鏈霉菌屬的一種雙突變菌株，其中所述寄主微生物特征是具有負木聚糖酶活性。
最好該寄主微生物是變鉛青鏈霉菌種的雙突變菌株，該菌株特征是它也具有負木聚糖酶活性。
更優(yōu)選的是寄主微生物是變鉛青鏈霉菌10-164的雙突變菌株，且寄主微生物特征是負纖維素酶和負木聚糖酶活性。
應該注意，與本發(fā)明有關的上述寄主微生物突變菌株(其特征為具有負木聚糖酶和/或負纖維素酶活性)包括也可能具有其它負酶活性的那些突變菌株。
第三方面，本發(fā)明提供一種雜交質粒，它是通過將木聚糖酶C(xlnC)基因插入載體質粒而構建的。優(yōu)選方案是所述基因和所述載體質粒或二者均由鏈霉菌屬的微生物獲得。更優(yōu)選的是木聚糖酶C(xlnC)或載體質?；蚨呔勺冦U青鏈霉菌種微生物獲得。最優(yōu)選的是木聚糖酶C(xlnC)基因由變鉛青鏈霉菌1326菌株獲得和/或載體是得自變鉛青鏈霉菌3131菌株的PIJ702。
第四方面，本發(fā)明提供一種木聚糖酶基因，表示為xlnC，該基因編碼的DNA順序基本上包括表1所列的順序。
第五方面，本發(fā)明提供一種如上定義的重組微生物的生產方法，它包括將與本發(fā)明有關的如上定義的雜交質粒引入如上定義的寄主微生物中。
用原生質體融合或電-融合方法，優(yōu)選用轉導或更優(yōu)選用轉化方法，將雜交質粒引入寄主微生物中。
認為木聚糖酶C(xlnC)基因在其引入如上定義的寄主微生物時已被克隆，由此提供的重組微生物特征是至少其高活性內-木聚糖酶具有負纖維素酶活性。xlnC基因在重組微生物中的表達導致游離纖維素酶、高活性內-木聚糖酶的產生。
借助于分子克隆和先進的發(fā)酵技術，使這種新酶在游離纖維素酶變鉛青鏈霉菌寄主中的形成得以改善，而且發(fā)現產生的酶對紙漿處理是有用的。
表1木聚糖酶C DNA順序
在含適于酶表達碳源的合適菌種生長培養(yǎng)基存在條件下，內-木聚糖酶胞外分泌進入重組微生物的培養(yǎng)基。最好該木聚糖酶是內-木聚糖酶，也稱為木聚糖酶或β-1，4-D-木聚糖的木聚糖水解酶，用EC3.2.1.8表示，其特征是基本上游離纖維素酶，并具有高比活性。
由木聚糖鍵水解引起木聚糖的酶降解是局部的，因此不會從紙漿中激烈釋放木糖和木二糖。
按本發(fā)明，用游離纖維素酶的高活性內-木聚糖酶處理木質纖維材料(最好是化學紙漿)結果能改進去木質作用(用已處理紙漿卡伯數值減少說明)、白度和粘度。而且，上述處理可提供更為松弛的纖維，結果使后續(xù)處理，如溶脹、打漿、排水、或紙漿的化學漂白操作得以改進，所用能源和藥品均減少。
由于本發(fā)明木聚糖酶的活性高，它特別適用于紙漿的生物漂白。因此，本發(fā)明的第六方面是提供一種處理紙漿(最好是具有可水解木聚糖酶β-1，4-D-木糖苷鍵的化學紙漿)的方法，該方法包括將所述紙漿與上述高活性內-木聚糖酶相接觸，以使所述鍵水解。最好，該鍵的水解能導致所述紙漿生物漂白。
生物漂白所需內-木聚糖酶的用量明顯低于現有技術方法所需木聚糖酶的量。本發(fā)明內-木聚糖酶用量優(yōu)選為每克紙漿(以烘干紙漿的重量計)少于0.1mg木聚糖酶(w/w)。更優(yōu)選的內-木聚糖酶用量少于0.01mg/g紙漿，最優(yōu)選的內-木聚糖酶用量少于0.005mg/g紙漿。
本發(fā)明方法也可用于處理含水的北方或南方硬木紙漿料，采用兩種不同的游離纖維素酶木聚糖酶。
盡管最好使用牛皮紙漿，但也能用其它經化學浸煮的紙漿。處理前該紙漿也能先用氧處理。未漂白的牛皮紙漿可一步或分多步進行處理，并且可結合使用低活性酶處理步驟。例如，第一步用得自變鉛青鏈霉菌的低比活性內-木聚糖酶，第二步例如用本發(fā)明得自變鉛青鏈霉菌的高活性木聚糖酶，如〔PIAF20〕，如下所述。
處理過程中酶的濃度范圍通常約為0.01-500IU/g已處理紙漿，優(yōu)選為1-500IU/g，這取決于所要生物漂白和/或去木質化程度，進行處理的溫度約為20-80℃，優(yōu)選為50℃。兩種上清液最好都不含纖維素酶活性，因此能用于紙漿中所含木聚糖的特殊浸蝕。
在用內-木聚糖酶處理過程中，紙漿稠度優(yōu)選約為0.1%-30%(以紙漿的烘干重量計)。該稠度最好約為2%-12%。該混合物可用各種混合裝置以不同的速度進行攪拌。然后按所要成品紙類型，用不同方法處理紙漿。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，由變鉛青鏈霉菌66產生的胞外高活性內-木聚糖酶(本文稱作木聚糖酶C)用陰離子交換色譜進行純化，用上述Morosoli等人，Biochem.J.，239，587，1986的DNA方法測定它在得自樺木或燕麥屬斯佩爾特小麥的木聚糖中的活性。編碼生成木聚糖酶C的基因也能用多復制載體PIJ702通過負木聚糖酶和負纖維素酶突變體的功能互補進行克隆。新克隆，一旦在發(fā)酵罐內生長，就會產生胞外木聚糖酶C，但未檢測到纖維素酶。按BioRadTM的蛋白質測定方法，測得新酶的活性為45450IU/mg已純化蛋白質。該酶活性的極大提高超過至今報導的所有其它木聚糖酶。
這種新酶可用于漂白實驗中，并能與稱作木聚糖酶A的低比活性內-木聚糖酶類酶相比較，如Morosoli等人的Biochem.J.，239，587，1989所述，木聚糖酶A也可用變鉛青鏈霉菌66表示，它具有的活性為733IU/mg已純化酶，在現有技術中，這是典型的酶。
意想不到的是，木聚糖酶C與低比活性酶相比，能使紙漿的木質素含量降至更低值，即其用量為0.0019mg酶/g已處理紙漿，與之相比，低比活性內-木聚糖酶(木聚糖酶A)的用量為0.12mg酶/g已處理紙漿。這樣，木聚糖酶C酶與木聚糖酶A(兩者均得自變鉛青鏈霉菌)相比效率提高61倍。
高活性內-木聚糖酶的純化方法及其特征如下。將變鉛青鏈霉菌66菌株保持在用過7天的瓊脂斜面培養(yǎng)物中，它含有改性的酵母一提取麥芽-提取介質，其中葡萄糖用0.4%的麥芽糖取代。由這種斜面培養(yǎng)制備的孢子懸浮液可用作接種物以用于胰蛋白酶大豆肉湯(TrypticaseSoyBroth)中的營養(yǎng)培養(yǎng)(TSB)(DifcoLaboratories，Detroit，MI)。在34℃，在旋轉振蕩器中以240轉/分的速率使該瓶狀培養(yǎng)物保溫24-30小時。
在含有100mlM-13培養(yǎng)基的500ml錐形燒瓶中，如Bertrand等人(Biotechnol，Bioeng.，33，791，1989)所述，用1%得自燕麥屬斯佩爾特小麥的木聚糖作主要碳源可進行酶的生產。接種物規(guī)格為5%的營養(yǎng)TSB培養(yǎng)物，培育時間定為72小時。在轉速為11000g的BeckmanJ2-21離心機中離心發(fā)酵肉湯，從上清液中回收粗酶。用三倍體積的冷乙醇從該上清液中沉淀木聚糖酶C。沉降過夜后，以11000g轉速通過離心回收沉淀。
回收沉積的粗酶，用丙酮充分洗滌，在真空下干燥過夜。用這種方法得到的干燥粉末可在4℃下貯存數月不會失去活性。為純化木聚糖酶C，將制得的30克粗酶慢慢攪拌10分鐘，使其溶于PH為7.4的500ml50mM磷酸鈉緩沖液中，再以11000g轉速離心以除去殘余的未溶解物。
該溶液于冰上冷卻，用45%硫酸銨沉淀可得到木聚糖酶C部分。使該沉淀再溶于磷酸鈉緩沖液中，在玻璃管中以蒸餾水為對照進行透析，同時切下6000-8000Da，于100℃下，用1mMEDTA和2%碳酸氫鈉處理10分鐘。該酶溶液通過冷凍干燥而濃縮，再溶于PH為8.5的20mM Tris-HCl緩沖液中，經AcroTM0.2μm可自由使用的過濾裝置(Gelman Sciences，inc.，Ann Arbor MI)進行過濾。使濾液直接吸附在陰離子交換DEAE蛋白質Pak 5 Pw半-制備H.P.L.C柱(Waters-Millipore Inc.，st.Laurent，Que)上，該柱用相同的Tris-HCl緩沖液平衡。用呈線性梯度的1M NaCl進行淋洗，用280nm的U.V記錄器進行監(jiān)測。收集各餾份，用Remazol亮蘭測定酶的活性(Kluepfel，RBB法，在Enzymology，Vol，160，P180，1988中的各方法)。收集活性餾份，在4℃對照水透析65小時。將該含水溶液冷凍干燥后回收純酶。為檢驗同質性，使酶通過用PH6.0的0.1M乙酸銨平衡過的兩種Superose 6TM凝膠柱。胞外高活性木聚糖酶C的表觀Mr為22000道爾頓，PI超過10.5。該蛋白質明顯未糖基化。
用得自樺木(Sigmachem.Co.，St.Louis，MO)的溶于50mM檸檬酸鈉緩沖液的木聚糖測定酶的活性，用二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖。
所有酶活性均用國際單位(IU)表示，1單位定義為1分鐘內釋放1μmol還原糖(用木糖表示)的酶量。
含高活性內-木聚糖酶C的變鉛青鏈霉菌(PIAF20)是通過用變鉛青鏈霉菌10-164、負木聚糖酶和負纖維素酶突變體(用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍使野生型菌株1326突變而得到)中功能互補的多復制載體PIJ702克隆變鉛青鏈霉菌66(菌株1326)的xlnC基因而得到的。通過在含木聚糖的陪氏平板上形成透明區(qū)可檢測含木聚糖C的克隆變鉛青鏈霉菌(PIAF20)。用Kendall和Cullum的堿法(Gene;29，315，1984)純化質粒DNA，用Thompson等人的微量分析方法(Mol.Gen.Genet.;195，39，1982)分析雜交質粒?？寺『蟮玫降闹亟M質粒含有長度為7.5kb的大DNA插入物。亞克隆和編序實驗使該基因更精確地固定在Pst1-BamH1片段上。
現在僅通過實施例來說明雜交質粒的構建及用高活性木聚糖酶處理木質纖維材料的方法，參見下面實施例。
實施例1按下列程序制備生產A木聚糖酶的克隆。
按Hopwood等人的方法(GeneticManipulationofStreptomyces，Alaboratorymanual.，TheJohnInnesFoundation，Norwich，UK1985)從變鉛青鏈霉菌66(菌株1326)中提取染色體DNA。用Tris-硼酸鹽-EDTA緩沖液進行限制性片段的瓊脂糖凝膠電泳(Maniatis等人.，Molecularcloning，ALaboratoryManual，ColdspringHarbor，NewYork，1982)，Soutnern印跡和雜交條件如Hopwood等人所述(1985)。然后用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍使變鉛青鏈霉菌菌株1326突變(Delic等人.，MutationRes.;9，167(1970)，選出雙突變體β-1，4-D-葡聚糖的負葡聚糖水解酶(內纖維素酶)和負木聚糖酶。在含1%羧甲基纖維素作主要碳源的固體基本培養(yǎng)基中選擇該雙突變體。
按Teather和Wood的CongoRed染色法完成內纖維素酶活性的檢驗(ApplEnvironMicrobiol.;43，7771982)。用同樣方法(只是羧甲基纖維素用1%燕麥屬斯佩爾特小麥木聚糖代替)可檢測負-木聚糖酶突變體。已發(fā)現CongoRed染色也能用于檢測木聚糖酶活性。在兩種情況下，認為不存在脫色區(qū)就表示沒有酶產生。
已發(fā)現雙突變體(稱為變鉛青鏈霉菌10-164)是很穩(wěn)定的，看來能得到最高轉化效率。因此選它作寄主微生物用以發(fā)育的表達體系。雙突變體變鉛青鏈霉菌10-164的原生質體化(Protoplasting)和轉化是按Chater等人所述方法進行的(Curr.TopicsMicrobiolImmunol.，97，69，1982)。
選擇產生A木聚糖酶的克隆，并稱為變鉛青鏈霉菌(PIAF20)。其限制性圖譜和Southern印跡以及DNA雜交均表明它不同于以前報道的木聚糖酶A和木聚糖酶B基因(分別參見Mondou等人，Gene49，323，1986和Vats-Mehta等人，Gene;86，119，1990)。對于木聚糖酶B的情況，有關野生型變鉛青鏈霉菌菌株1326的早期研究未揭示其上清液中存在木聚糖酶C。
它在該菌株中的生物合成僅用Western印跡即可證實，只要使用抗-(木聚糖酶C)抗體，該抗體在含有酶的兔中產生，該酶是從克隆變鉛青鏈霉菌〔PIAF20〕的培養(yǎng)濾液分離的。
實施例2xlnC基因是在質粒PIAF20中的2.3Pst1片段上被克隆的。標準DNA重組技術和克隆成M13噬菌體如Hopwood等人(1985)和/或Maniatis等人(1982)所述。將感興趣的片段亞克隆成M13mp18或M13mp19噬菌體。
Nt順序測定是按Sanger等人的鏈一終止二脫氧法進行的(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A;74，5463，1977)，使用由Dale等人的方法所得到的插入物的缺失片段(Plasmid;13，31，1985)。用即時合成的低聚核苷酸作引物，用7-deaza-dGTP減弱譜帶壓縮。采用國際生物技術公司(NewHaven，Connecticut，U.S.A)的Pustell順序分析程序進行DNA順序的計算機分析。
如上所述，木聚糖酶CDNA順序如表1所示。
實施例3用兩種重組變鉛青鏈霉菌克隆的上清液處理牛皮硬木紙漿樣品，該上清液分別含有由xlnC基因產生的高活性內-木聚糖酶和由xlnA基因產生的低活性內-木聚糖酶(兩種基因均得自變鉛青鏈霉菌和兩種B-1，4-D-木聚糖的木聚糖水解酶EC3.2.1.8)。
處理條件如下起始卡伯數13.5酶用量木聚糖酶A為0.116mg/g紙漿木聚糖酶C為0.0019mg/g紙漿將處理過的樣品和對照樣品(各為5gO.D)懸浮在PH為6.0的83.3ml4.5mM檸檬酸/16mM磷酸鹽緩沖液中，并于50℃下，在轉速為300轉/分的旋轉振動器中保溫2小時。當木聚糖酶處理完成時，用蒸餾水洗滌紙漿樣品。用標準TAPPI檢測法測定表示去木質作用的卡伯數。結果與未處理紙漿的卡伯數一起列于表2中。用只經緩沖液處理的紙漿樣品作對照。
表2在牛皮紙漿處理中木聚糖酶A和C的比較處理卡伯值原始紙漿13.5緩沖液空白對照12.312.4木聚糖酶A10.310.3木聚糖酶C9.69.8由此證明用量(IU/g紙漿)相同的兩種酶，對于木質素含量(以測得的卡伯值計)降低的作用大致相同。然而，所需木聚糖酶C的重量明顯低于所需木聚糖酶A的量實施例4硬木牛皮紙漿先用85IU/g的木聚糖酶A進行處理，然后用DcEoDED程序漂白。酶處理條件為稠度6%，溫度50℃，處理時間2小時，PH5.5-6.0，作為對照，將相同紙漿的未處理物用相同程序進行漂白以達到相同的白度。漂白和生物漂白工序所用條件列于表3中。
表3漂白條件非酶處理條件 Dc*Eo D E D進料(按紙漿%計)2.40.41.20.60.4稠度(以W/W%計)3.510100.610溫度(℃)5065806580時間(分)2060756075酶處理條件 Dc*Eo D E D進料(按紙漿%計)1.30.41.20.60.4稠度(以W/W%計)3.510100.610溫度(℃)5065806580時間(分)2060756075＊ 用-70%ClO2;30%Cl2代替氯進料從0.86降至0.36，二氧化氯進料從2.36降至1.01。
近來的研究已連系到伴隨化學品進料，尤其是氯，所生成的Aox(可吸收的有機鹵化物)的量。Aox是工業(yè)上測定漂白工廠廢水中氯化有機物含量認可的標準度量。這類化合物與環(huán)境毒性有關，并且認為廢水中所含Aox的濃度與漂白工藝中所用氯化漂白化合物的量直接有關。目前，全球共同目標在于制定最大允許限度以降低現有濃度。因此，降低Aox的方法是合乎需要的。
可按Reeve，D.W.和Earl.P.I.提出的下列方程式(Proc.TappiEnvironConf，Atlanta，P.385，1989)計算生成的Aox量Aox＝0.1(Cl2+0.526＊ClO2)kg Cl/te紙漿因此，對于酶處理的紙漿繼之以程序DcEoDED(其中Dc是用30%氯代替的二氧化氯步驟，E是堿提取步驟)而言，Aox用量為0.89kgCl/te紙漿，而對非酶處理紙漿而言，Aox用量為2.10kgCl/te。所以，使用木聚糖酶會導致Aox用量降低2倍以上。
實施例3清楚說明，本發(fā)明可用于降低漂白劑的總消耗量及其后的Aox濃度。
包含質粒PIJ702的變鉛青鏈霉菌3131寄存在美國典型培養(yǎng)物收集中心，登記號為ATCC35287。變鉛青鏈霉菌1326和雙突變體菌株變鉛青鏈霉菌10-164寄存于國家工業(yè)和海生細菌收集有限公司，Aberdeen，UK，1990，2.8，登記號分別為NCIMB40257和NCIMB40258。
上面已描述了本發(fā)明的具體實施例，應該明白，本領域技術人員可提出各種變更，但所有這些變更將落在所附權利要求的范圍內。
權利要求
1.一種高活性內-木聚糖酶，它得自鏈霉菌屬菌株，或由通過將雜交質粒引入鏈霉菌屬寄主微生物突變菌株而產生的重組微生物得到，該雜交質粒是通過將新木聚糖酶基因插入載體質粒而構建的，該新木聚糖酶用xlnC表示，它由鏈霉菌屬含木聚糖酶基因的微生物得到。
2.權利要求1所述的一種高活性內-木聚糖酶，它具有的比活性大于5000IU/mg已純化蛋白質。
3.權利要求2所述的一種高活性內-木聚糖酶，它具有的比活性大于20000IU/mg。
4.權利要求2所述的一種高活性內-木聚糖酶，它具有的比活性大于30000IU/mg。
5.權利要求2所述的一種高活性內-木聚糖酶，它具有的比活性大于40000IU/mg。
6.權利要求1-5之任一項所述的一種高活性內-木聚糖酶，其中所述載體質粒是由鏈霉菌屬的一種微生物得到的。
7.權利要求1-5之任一項所述的一種高活性內-木聚糖酶，它基本上是游離纖維素酶。
8.權利要求1-5之任一項所述的一種高活性內-木聚糖酶，其中寄主微生物突變菌株特征是它具有負纖維素酶活性。
9.權利要求1-5之任一項所述的一種高活性內-木聚糖酶，其中寄主微生物突變菌株特征是它具有負木聚糖酶活性。
10.權利要求1-5之任一項所述的一種高活性內-木聚糖酶，其中寄主微生物突變菌株特征是它具有負纖維素酶和負木聚糖酶活性。
11.權利要求1-5之任一項所述的一種高活性內-木聚糖酶，其中所述內-木聚糖酶是由來自變鉛青鏈霉菌種的一種菌株得到的。
12.一種重組微生物，它含有載帶xln C基因的雜交質粒，xln C基因編碼產生高活性木聚糖酶C酶，其中所述質粒能誘導權利要求1-5之任一項所述的高活性內-木聚糖酶在已引入該質粒的寄主微生物中胞外產生。
13.權利要求12所述的一種重組微生物，其中所述質粒能誘導游離纖維素、高活性內-木聚糖酶的胞外產生。
14.權利要求12所述的一種重組微生物，其中所述寄主微生物是鏈霉菌屬的突變菌株。
15.權利要求12所述的一種重組微生物，其中寄主微生物是鏈霉菌屬的一種雙突變菌株。
16.權利要求15所述的一種重組微生物，其中所述寄主微生物是變鉛青鏈霉菌種的雙突變菌株。
17.權利要求12所述的一種重組微生物，其中所述寄主微生物特征是具有負木聚糖酶活性。
18.權利要求12所述的一種重組微生物，其中所述寄主微生物特征是具有負纖維素酶活性。
19.權利要求12所述的一種重組微生物，其中所述寄主微生物特征是具有負木聚糖酶和負纖維素酶活性。
20.權利要求12所述的一種重組微生物，其中寄主微生物是雙突變菌株變鉛青鏈霉菌10-164，并且該寄主微生物特征是負纖維素酶和負木聚糖酶活性。
21.一種雜交質粒，它是通過將xln C基因插入一種載體質粒而構建的。
22.權利要求21所述的一種雜交質粒，其中所述基因和/或所述載體質粒均由鏈霉菌屬的微生物得到。
23.權利要求21所述的一種雜交質粒，其中所述xln C基因和/或所述載體質粒均由變鉛青鏈霉菌種的微生物得到。
24.權利要求21所述的一種雜交質粒，其中xln C基因是由變鉛青鏈霉菌的菌株1326得到，和/或所述載體是由變鉛青鏈霉菌菌株3131得到的PIJ702。
25.一種木聚糖酶基因，用xln C表示，它可編碼DNA順序，該順序基本上包括
26.權利要求12所述的一種重組微生物的生產方法，它包括將權利要求21所述的雜交質粒引入寄主微生物中。
27.權利要求26所述的一種方法，其中用原生質體融合或電一融合方法將該雜交質粒引入寄主微生物中。
28.權利要求26所述的一種方法，其中所述雜交質粒通過轉導或轉化被引入所述寄主微生物。
29.一種具有可水解木聚糖酶β-1，4-D-木糖苷鍵的紙漿處理方法，它包括使該紙漿與權利要求1-5之任一項所述的高活性內-木聚糖酶相接觸，使所述鍵水解。
30.權利要求29所述的一種方法，其中所述鍵的水解能導致所述紙漿生物漂白。
31.權利要求29所述的一種方法，其中所述紙漿是一種化學紙漿。
32.權利要求29所述的一種方法，其中所述木聚糖酶用量低于0.1mg/g(w/w)紙漿。
33.權利要求32所述的一種方法，其中所述木聚糖酶用量低于0.01mg/g。
34.權利要求32所述的一種方法，其中所述木聚糖酶用量低于0.005mg/g。
全文摘要
本發(fā)明描述一種高比活性木聚糖酶生產和在化學紙漿處理和/或生物漂白中的使用方法。該酶可用于紙漿和一般木質纖維材料的更大批量處理工藝。該方法在去木質作用和增白效果方面均優(yōu)于普通漂白方法，同時可減少漂白用藥品的消耗及對環(huán)境的影響。
文檔編號C12N1/21GK1074935SQ9211045
公開日1993年8月4日 申請日期1992年8月8日 優(yōu)先權日1991年8月8日
發(fā)明者D·克呂費爾, R·莫羅索里, F·謝列克 申請人:阿爾芒-弗拉皮耶研究所